LUẬN VĂN THẠC SỸ GHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN SỰ TẠO THÀNH LIGNAN TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus Schum. & Thonn.) NUÔI CẤY IN VITRO

Nghiên cứu sự tích lũy hợp chất lignan của cây DHCĐ nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng dưới ảnh hưởng của một số yếu tố vật lý của môi trường – Nồng độ CO2 – Nhiệt độ – Cường độ ánh sán

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ

ĐẾN SỰ TẠO THÀNH LIGNAN TRONG CÂY

DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus Schum & Thonn.) NUÔI CẤY IN VITRO

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Nguyễn Thị Quỳnh

Phạm Minh Duy

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm – Hướng Hóa sinh

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây DHCĐ (Phyllanthus amarus (Schum & Thonn.)) có chứa các lignan với

nhiều dược tính quý giá

Nhu cầu sản xuất tăng cao

Sản xuất trên đồng ruộng gặp nhiều

trở ngại về thời tiết, sâu bệnh, v.v

Sản xuất lignan từ cây DHCĐ bằng

nuôi cấy mô quang tự dưỡng

Nghiên cứu các yếu tố vật lý/hóa học

Một số dược tính chỉ được khảo sát ở mức độ cao chiết thô

Khảo sát các dược tính này ở mức độ từng hợp chất cụ thể

Loài Phyllanthus amarus

(Schum & Thonn.)

Tên quốc tế: Chance Piedra

Tên Việt Nam: Diệp hạ châu đắng, Chó đẻ thân xanh, v.v.

Hình 1 Cây Diệp hạ châu đắng.

 Ngoài nước

- Phát hiện và chứng minh nhiều dược tính, đặc biệt là khả

năng ức chế virus HBV

- Ly trích được nhiều nhóm hợp chất thứ cấp từ cây DHCĐ,

trong đó các lignan có nhiều dược tính quan trọng

Tình hình nghiên cứu

Phyllanthin Hypophyllanthin Niranthin

Hình 2 Các hợp chất lignan chính trong cây Diệp hạ châu đắng.

 Chưa có nghiên cứu về ảnh hưởng các yếu tố môi

trường lên sự tích lũy lignan của cây DHCĐ in vitro.

Giới thiệu về lignan

• Là các dimer từ 2 đơn vị phenylpropanoid nối với nhau bằng liên kết của 2 carbon 8-8’.

• Có quan hệ mật thiết với lignin.

• Có nhiều dược tính quan trọng: chống ung thư, kháng viêm, giảm đau, giảm huyết áp, kháng oxy hóa, v.v.

tổng hợp lignan

DIR

Coniferyl alcohol p-coumaryl alcohol Sinapyl alcohol

Con đường phenylpropanoid

Lignan

Phenylalanine ammonia

lyase

Tyrosine ammonia lyase

Carbohydrate

Tổng hợp protein

Biến dưỡng thứ cấp

Lignin

Hình 5 Con đường sinh tổng hợp lignan

Coniferyl alcohol p-coumaryl alcohol Sinapyl alcohol

Con đường phenylpropanoid

Phenylalanine ammonia

lyase

Tyrosine ammonia lyase

Quang hợp

Carbohydrate

Tổng hợp protein Biến dưỡng sơ cấp

Phenylalanine ammonia lyase

Lignan

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nội dung 1 Nghiên cứu sự tích lũy hợp chất lignan của

cây DHCĐ nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng dưới ảnh

hưởng của một số yếu tố vật lý của môi trường

– Nồng độ CO2

– Nhiệt độ

– Cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng

• Phương pháp

– Nuôi cấy đốt thân trong hộp Magenta (4 đốt/hộp), nắp có 2 lỗ trao đổi khí (Φ = 1 cm) dán màng millipore.

– Môi trường MS với khoáng đa lượng 1/2,

– Giá thể: perlite

Thí nghiệm 1 Đánh giá mối tương quan giữa hàm

lượng hợp chất lignan tích lũy trong cây DHCĐ in vitro

• Môi trường: 65 ml/hộp + 15 ml/hộp (ngày thứ 30)

• Giá thể: 110 ml/hộp

• Cường độ ánh sáng: 160 µmol m-2 s-1

• Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày

• Nhiệt độ giai đoạn sáng/tối: 27/22 oC

• Độ ẩm tương đối: 50%

Chỉ tiêu theo dõi ngày thứ 45

• Các chỉ tiêu tăng trưởng

• Hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin

(mg/g thân lá khô), so sánh với cây ngoài đồng 45 ngày (Phú Yên)

Thí nghiệm 2 Vai trò của stress nhiệt độ trong sự tích lũy

một số hợp chất lignan của cây Diệp hạ châu đắng in vitro

Chỉ tiêu theo dõi ngày thứ 45

• Các chỉ tiêu tăng trưởng

• Hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin

(mg/g thân lá khô), so sánh với cây ngoài đồng 45 ngày (Phú Yên)

Thí nghiệm 3 Khảo sát sự tích lũy hợp chất lignan của

cây Diệp hạ châu đắng in vitro dưới các cường độ ánh

sáng và thời gian chiếu sáng khác nhau

Chỉ tiêu theo dõi ngày thứ 40

• Các chỉ tiêu tăng trưởng

• Hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin

(mg/g thân lá khô), so sánh với cây ngoài đồng 45 ngày (Phú Yên)

Thí nghiệm 4 Vai trò của tiền chất phenylalanine trong sự tích

lũy một số hợp chất lignan của cây Diệp hạ châu đắng khi được

bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các giai đoạn khác nhau

Nội dung 2 Tìm hiểu tác động của tiền chất lên sự tích lũy

các hợp chất lignan ở cây Diệp hạ châu đắng in vitro

Điều kiện thí nghiệm

• Thời gian nuôi cấy: 45 ngày

• Môi trường: 55 ml/hộp + 15 ml/hộp (ngày thứ 25)

• Giá thể: 90 ml/hộp

• Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày

• Độ ẩm tương đối: 50%

Chỉ tiêu theo dõi ngày thứ 45

• Các chỉ tiêu tăng trưởng

• Hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin (mg/g thân lá khô), so sánh cây ngoài đồng 45 ngày (Phú Yên)

Nội dung 3 Khảo sát đặc tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của

các hợp chất lignan trong cây Diệp hạ châu đắng in vitro

• Vật liệu

– Cao chiết thô methanol cây DHCĐ

– Phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin phân tách bằng sắc

ký cột từ cao trên

• Phương pháp

– Kháng khuẩn: phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (Kirby-Bauer Agar Disk Diffusion)

EPEC Salmonella spp S aureus

Điều kiện thí nghiệm

• Đĩa nuôi cấy: đĩa Petri (Φ = 80 mm)

• Môi trường: Mϋller Hinton Agar (20 ml/đĩa)

• Nồng độ vi sinh vật: 1,5 x 107 cfu/đĩa Petri

• Lượng chất thử: 10 mg/ml, 5 µl/đĩa giấy (Φ = 6 mm)

• Nhiệt độ ủ: 37 oC

• Thời gian ủ: 24 giờ

Chỉ tiêu theo dõi sau 24 giờ

• Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 6 Cây Diệp hạ châu

đắng nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng ở các nồng độ CO2 khác nhau vào ngày thứ 45

Nghiệm

thức

GTTLT thân lá (mg/cây)

TLT rễ (mg/cây)

GTTLK thân lá (mg/cây)

TLK rễ (mg/cây)

Hình 7 Sự tích lũy phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin

trong cây Diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng

ở các nồng độ CO2 khác nhau

Thí nghiệm 2 Vai trò của stress nhiệt độ trong sự tích lũy

một số hợp chất lignan của cây Diệp hạ châu đắng in vitro

Hình 10 Cây Diệp hạ châu đắng in vitro được nuôi cấy dưới các

chế độ ánh sáng khác nhau vào ngày thứ 40

Bảng 8 Tác động của cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng lên gia tăng trọng lượng tươi và khô thân lá và rễ của cây

Diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng

4.8

3.3 3.3

2.3

4.1

3.8

5.0 6.6

2.0

1.8 2.8

Thí nghiệm 4 Vai trò của tiền chất phenylalanine trong sự tích

lũy một số hợp chất lignan của cây Diệp hạ châu đắng khi được

bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các giai đoạn khác nhau

Hình 12 Cây Diệp hạ

châu đắng nuôi cấy mô quang tự dưỡng ở ngày thứ 45 được bổ sung phenylalanine với các nồng độ và thời điểm khác nhau

Bảng 10 Hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin trong cây Diệp hạ châu đắng ở ngày thứ 45 sau khi được bổ sung phenylalanine với các nồng độ khác nhau vào ngày đầu tiên hoặc ngày 25

Phenylalanine

Lignan

Cường độ ánh sáng

& thời gian chiếu sáng

Cây ngoài đồng ruộng

Nhiệt độ

Lignan

 Sử dụng điều kiện thích hợp để tập trung gia tăng một loại

lignan mong muốn.

Nội dung 3 Khảo sát đặc tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của các hợp chất lignan trong cây Diệp hạ châu đắng

Hình 14 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thô và các

lignan chính trong cây Diệp hạ châu đắng trên E coli EPEC.

Bảng 11 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) hình thành ở các nghiệm thức

Loài vi khuẩn Chất khảo sát

E Coli

EPEC Salmonella spp S aureus

Phyllanthin Hypophyllanthin Niranthin

Trolox Cao thô

Phyllanthin Hypophyllanthin Niranthin

y = -7.3333x + 0.175

R2 = 0.9977

0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2

Chất khảo sát

Đương lượng Trolox (µmol/mg chất khảo sát)Lực khử sắt

(FRAP)

Loại điện tử DPPH

Cao chiết thô cây DHCĐ 2,89 2,55

KẾT LUẬN

• Hàm lượng ba loại hợp chất lignan chính (phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin) trong cây DHCĐ gia tăng khi nuôi cấy dưới nồng độ CO 2 cao (1200 µmol mol -1 ) so với khi nuôi cấy dưới

• Chế độ nhiệt độ giai đoạn sáng tối 33/23 o C giúp cho cây DHCĐ tổng hợp được nhiều niranthin nhất, trong khi chế độ nhiệt độ thay

lũy được nhiều phyllanthin và hypophyllanthin nhất.

16 giờ/ngày là thích hợp nhất cho sự tích lũy lignan ở cây DHCĐ.

• Bổ sung phenylalanine 13 µmol/ml vào ngày nuôi cấy thứ 25 giúp

• Cao chiết methanol thô cây DHCĐ ở nồng độ 10 mg/ml có khả năng

ức chế vi khuẩn E coli EPEC nhưng không kháng được Salmonella spp và S aureus Cả ba loại lignan phyllanthin, hypophyllanthin và

niranthin ở nồng độ 10 mg/ml đều không có tác dụng ức chế trên cả

ba loại vi khuẩn khảo sát.

• Cao chiết methanol thô cây DHCĐ có khả năng kháng oxy hóa in

vitro tốt Cả ba loại lignan phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin

đều không có hoạt tính kháng oxy hóa khi sử dụng riêng lẻ.

ĐỀ NGHỊ

• Nghiên cứu áp dụng việc nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng đối

với cây Diệp hạ châu đắng, trong đó các yếu tố vật lý (ánh sáng, nhiệt độ) sẽ được điều chỉnh cho phù hợp nhu cầu sản xuất hợp chất lignan cần thiết

51