TÌM HIỂU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG CÓ THÀNH PHẦN KHOÁNG ĐA LƯỢNG VÀ TỶ LỆ KHOÁNG N, P2O5, K2O, MgO, CaO CÓ NGUỒN GỐC XUẤT PHÁT TỪ MÔI TRƯỜNG MS VỚI CÙNG TỶ LỆ KHOÁNG ĐA LƯỢNG ĐẾN SỰ BIỆT HÓA PHÔI SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) THÀNH CÂ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG CÓ THÀNH PHẦN KHOÁNG ĐA LƯỢNG VÀ TỶ LỆ KHOÁNG N, P2O5,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÌM HIỂU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG CÓ THÀNH PHẦN KHOÁNG ĐA LƯỢNG VÀ TỶ LỆ KHOÁNG

N, P2O5, K2O, MgO, CaO CÓ NGUỒN GỐC XUẤT PHÁT

TỪ MÔI TRƯỜNG MS VỚI CÙNG TỶ LỆ KHOÁNG

ĐA LƯỢNG ĐẾN SỰ BIỆT HÓA PHÔI SÂM

NGỌC LINH (Panax vietnamensis) THÀNH

CÂY HOÀN CHỈNH TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY INVITRO

Họ và tên sinh viên: TRẦN THỊ QUỲNH TRANG

Ngành: LÂM NGHIỆP

Niên khóa: 2006 – 2010

Tháng 07/2010

i

TÌM HIỂU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG CÓ THÀNH PHẦN KHOÁNG ĐA LƯỢNG VÀ TỶ LỆ KHOÁNG

N, P2O5, K2O, MgO, CaO CÓ NGUỒN GỐC XUẤT PHÁT

TỪ MÔI TRƯỜNG MS VỚI CÙNG TỶ LỆ KHOÁNG

ĐA LƯỢNG ĐẾN SỰ BIỆT HÓA PHÔI SÂM

NGỌC LINH (Panax vietnamensis) THÀNH

CÂY HOÀN CHỈNH TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY INVITRO

ii

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

iii

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM Xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm khoa và toàn thể thầy cô khoa Lâm Nghiệp đã tận tình truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho chúng em trong suốt quá trình học tập tại trường

Đặc biệt cho em bày tỏ lòng biết ơn đến thầy Trần Trọng Nghĩa – giáo viên khoa Lâm Nghiệp đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành đề tài này

Xin gửi lời cảm ơn đến Ông Hồ Thái Hòa – chủ tịch hội đồng quản trị, các cô chú, anh chị Công ty cổ phần Sài Gòn Măng Đen – Kon Tum đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực tập

Sau hết, em muốn gởi lời cảm ơn đến các bạn trong tập thể lớp DH06LN Sự giúp đỡ, động viên của các bạn đã giúp em hoàn thành đề tài này

TP.HCM, ngày 30 tháng 07 năm 2010

Sinh viên thực hiện

TRẦN THỊ QUỲNH TRANG

v

TÓM TẮT

Đề tài “Tìm hiểu ảnh hưởng của một số môi trường có thành phần khoáng đa

lượng và tỷ lệ khoáng N, P 2 O 5 , K 2 O, MgO, CaO, có nguồn gốc xuất phát từ môi trường MS cùng với tỷ lệ khoáng đa lượng đến sự biệt hóa phôi sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thành cây hoàn chỉnh trong môi trường nuôi cấy invitro”

Thời gian từ tháng 4 đến tháng 7 Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên (RCBD)

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là:

+ Tìm môi trường thích hợp cho sự tái sinh chồi trong số 17 môi trường biến thiên từ môi trường MS

+ Đánh giá được các chỉ tiêu sinh lý từ các nghiệm thức để chứng minh sự tái sinh thuận lợi của phôi sâm Ngọc Linh

Để thực hiện mục tiêu nghiên cứu trên, phương pháp nghiên cứu được tiến hành như sau:

+ Chọn mẫu cấy có kích cỡ từ 2 – 3mm từ những bình giống cây sâm Ngọc Linh có sẵn trong phòng thí nghiệm

+ Từ môi trường MS phân tích ra tỷ lệ N : P : K Từ tỷ lệ này em tiến hành lập các công thức khác nhau dựa trên sự thay đổi của các thành phần khoáng đa lượng nhưng vẫn giữ nguyên nồng độ Môi trường MS làm đối chứng, tiến hành thành lập 17 môi trường cải tiến (kí hiệu CT0,…,CT19) từ môi trường MS

Từ đó, đề tài đã thu được những kết quả sau:

1 Tìm ra được môi trường thích hợp cho sự tái sinh chồi trong 17 môi trường biến thiên từ môi trường MS

2 Đã đánh giá được các chỉ tiêu sinh lý chứng minh sự tái sinh thuận lợi của phôi sâm Ngọc Linh

vi

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Lời cảm ơn iv

Tóm tắt v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các hình ix

Danh sách các bảng x

Danh sách các biểu xii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 2

1.1 Đặt vấn đề 2

1.2 Mục đích, mục tiêu, ý nghĩa đề tài 5

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

2.1 Các loại sâm trên thế giới và ở Việt Nam 6

2.1.1 Các loại sâm trên thế giới 6

2.1.1.1 Sâm Triều Tiên, Panax ginseng C.A.Meyer, Korean ginseng 6

2.1.1.2 Sâm Tam Thất, Panax notoginseng (Burk) F H Chen (sanchi ginseng) 8

2.1.1.3 Sâm Mỹ, Panax quinqueflolius L (American ginseng) 9

2.1.2 Các loại sâm ở Việt Nam 10

2.2 Sâm Ngọc Linh 11

2.2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển 11

2.2.2 Đặc điểm sinh học và phân bố cây sâm Ngọc Linh 11

2.3 Kỹ thuật nhân giống invitro 17

2.3.1 Những triển vọng nuôi cấy các cây họ nhân sâm 17

2.3.2 Một số nghiên cứu về sâm Ngọc Linh ở Việt Nam 19

2.3.2.1 Thành lập trại dược liệu Trà Linh nhân giống cây sâm Ngọc Linh 19

2.3.2.2 Sản xuất sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh 19

2.3.2.3 Ứng dụng công nghệ Biomass tạo sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh 20

vii

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

3.2 Điều kiện thí nghiệm 22

3.3 Cơ sở tiến hành thí nghiệm 22

3.3.1 Mẫu cấy 22

3.3.2 Môi trường nuôi cấy 23

3.4 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 24

3.4.1 Thí nghiệm 1: Thay đổi muối KNO3 trong môi trường MS thành các loại muối khác ở các cấp khác nhau 24

3.4.2 Thí nghiệm 2: Thay đổi muối KNO3 và muối NH4NO3 từ môi trường MS thành các loại muối khác ở các cấp khác nhau 25

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Thí nghiệm 1: Thay đổi muối KNO3 từ môi trường MS thành các loại muối khác ở các cấp khác nhau 29

4.1.1 Phân tích chỉ tiêu trọng lượng tươi 30

4.1.2 Phân tích chỉ tiêu số chồi tái sinh 32

4.1.3 Phân tích chỉ tiêu số lượng rễ 34

4.1.4 Phân tích chỉ tiêu chiều dài rễ 36

4.2 Thí nghiệm 2: Thay đổi muối KNO3 và muối NH4NO3 từ môi trường MS thành các loại muối khác ở các cấp khác nhau 39

4.2.1 Phân tích chỉ tiêu trọng lượng tươi 40

4.2.2 Phân tích chỉ tiêu số chồi tái sinh 42

4.2.3 Phân tích chỉ tiêu số lượng rễ 44

4.2.4 Phân tích chỉ tiêu chiều dài rễ 46

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

5.1 Kết luận 49

5.2 Đề nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

viii

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

GS : Giáo sư

TS : Tiến sĩ PTS : Phó tiến sĩ

KS : Kỹ sư

BS : Bác sĩ

DS : Dược Sĩ UBND : Uỷ ban nhân dân TPHCM : Thành phố Hồ Chí Minh

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et Grutzv 12

Hình 3.1: Bình giống cây sâm Ngọc Linh 27 Hình 3.2: Mẫu cây sâm Ngọc Linh sau khi cấy (hình chụp ở cự ly gần) 28 Hình 4.1: Kết quả thí nghiệm trên cây sâm Ngọc Linh (từ nghiệm thức CT0 đến CT9)

x

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1: Bảng kết quả bình quân các chỉ tiêu trọng lượng tươi, số chồi tái sinh, số lượng rễ, chiều dài rễ (từ nghiệm thức CT0 đến CT9) theo sự thay đổi thành phần khoáng 29

Bảng 4.2: Bảng phân tích ANOVA trọng lượng tươi của phôi sâm Ngọc Linh (từ

nghiệm thức CT0 đến CT9) 30

Bảng 4.3: Bảng hiệu số trung bình về trọng lượng tươi của phôi sâm Ngọc Linh giữa

các nghiệm thức trên môi trường MS (từ nghiệm thức CT0 đến CT9) 31

Bảng 4.5: Bảng hiệu số trung bình về số chồi tái sinh của phôi sâm Ngọc Linh giữa

các nghiệm thức trên môi trường MS (từ nghiệm thức CT0 đến CT9) 33

Bảng 4.6: Bảng phân tích ANOVA số lượng rễ của phôi sâm Ngọc Linh (từ nghiệm

thức CT0 đến CT9) 34

Bảng 4.7: Bảng hiệu số trung bình về số lượng rễ của phôi sâm Ngọc Linh giữa các

nghiệm thức trên môi trường MS (từ nghiệm thức CT0 đến CT9) 35

Bảng 4.8: Bảng phân tích ANOVA chiều dài rễ của phôi sâm Ngọc Linh (từ nghiệm

thức CT0 đến CT9) 36

Bảng 4.9: Bảng hiệu số trung bình về chiều dài rễ của phôi sâm Ngọc Linh giữa các

nghiệm thức trên môi trường MS (từ nghiệm thức CT0 đến CT9) 37

Bảng 4.10: Bảng kết quả bình quân các chỉ tiêu trọng lượng tươi, số chồi tái sinh, số

lượng rễ, chiều dài rễ (từ nghiệm thức CT11 đến CT19) theo sự thay đổi thành phần khoáng 39

Bảng 4.11: Bảng phân tích ANOVA trọng lượng tươi của phôi sâm Ngọc Linh (từ

nghiệm thức CT11 đến CT19) 40

Bảng 4.12: Bảng hiệu số trung bình về trọng lượng tươi của phôi sâm Ngọc Linh giữa

các nghiệm thức trên môi trường MS (từ nghiệm thức CT11 đến CT19) 41

Bảng 4.13: Bảng phân tích ANOVA số chồi tái sinh của phôi sâm Ngọc Linh (từ

nghiệm thức CT11 đến CT19) 42

Bảng 4.14: Bảng hiệu số trung bình về số chồi tái sinh của phôi sâm Ngọc Linh giữa

các nghiệm thức trên môi trường MS (từ nghiệm thức CT11 đến CT19) 43

xi

Bảng 4.15: Bảng phân tích ANOVA số lượng rễ của phôi sâm Ngọc Linh (từ nghiệm

thức CT11 đến CT19) 44

Bảng 4.16: Bảng hiệu số trung bình về số lượng rễ của phôi sâm Ngọc Linh giữa các

nghiệm thức trên môi trường MS (từ nghiệm thức CT11 đến CT19) 45

Bảng 4.17: Bảng phân tích ANOVA chiều dài rễ của phôi sâm Ngọc Linh (từ nghiệm

thức CT11 đến CT19) 46

Bảng 4.18: Bảng hiệu số trung bình về chiều dài rễ của phôi sâm Ngọc Linh giữa các

nghiệm thức trên môi trường MS (từ nghiệm thức CT11 đến CT19) 47

xii

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1: Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của các nghiệm thức đến trọng lượng

tươi của phôi sâm Ngọc Linh (từ nghiệm thức CT0 đến CT9) 30

Biểu đồ 4.2: Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của các nghiệm thức đến số chồi tái sinh

của phôi sâm Ngọc Linh (từ nghiệm thức CT0 đến CT9) 32

Biểu đồ 4.3: Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của các nghiệm thức đến số lượng rễ 34 Biểu đồ 4.4: Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của các nghiệm thức đến chiều dài rễ của

phôi sâm Ngọc Linh (từ nghiệm thức CT0 đến CT9) 36

Biểu đồ 4.5: Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của các nghiệm thức đến trọng lượng

tươi của phôi sâm Ngọc Linh (từ nghiệm thức CT11 đến CT19) 40

Biểu đồ 4.6: Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của các nghiệm thức đến số chồi tái sinh

của phôi sâm Ngọc Linh (từ nghiệm thức CT11 đến CT19) 42

Biểu đồ 4.7: Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của các nghiệm thức đến số lượng rễ của

phôi sâm Ngọc Linh (từ nghiệm thức CT11 đến CT19) 44

Biểu đồ 4.8: Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của các nghiệm thức đến chiều dài rễ của

phôi sâm Ngọc Linh (từ nghiệm thức CT11 đến CT19) 46

1

LỜI MỞ ĐẦU

Nhân sâm là một vị thuốc đứng hàng đầu trong các vị thuốc bổ, có hình dáng hao hao giống hình người, vị ngọt, mùi hăng hăng Mang một củ sâm trong túi đối với người còn có ý mang lại nhiều may mắn

Việt Nam có rất nhiều loài sâm nhưng xét về giá trị thành phần và hàm lượng hoạt chất saponin thì không thể so sánh được với sâm Triều Tiên Nhưng đến năm

1968, loại “thần dược” của người Xê Đăng được KS Vũ Đức Minh phát hiện một cách tình cờ, trong một chuyến công tác ở vùng núi Ngọc Linh KS Minh đã tìm được một vài củ đem về để chữa vết thương cho cán bộ, chiến sỹ trong đơn vị và cho kết quả tốt

Ngày 18/3/1973, DS Đào Kim Long, Nguyễn Châu Giang và DS Nguyễn Thị

Lê (người của Ban Y Tế Kon Tum), đã phát hiện cá thể loài cây dược liệu này ở độ cao khoảng 1.800m trên vùng núi Ngọc Linh Quá trình nghiên cứu đã đưa ra kết luận: cây dược liệu đó là một loại nhân sâm vô cùng quý hiếm

Đến năm 1988, TS Hà Thị Dụng và GS Grushvisky xác định đây là một loài

nhân sâm mới của thế giới và đặt tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv,

mà mọi người thường gọi là sâm Việt Nam hay sâm K5

Nếu như trước kia việc dùng sâm Ngọc Linh để sản xuất dược liệu rất hiếm thì ngày nay việc dùng sâm để sản xuất đã dễ dàng hơn, đáp ứng nhu cầu của nhiều người

Để thực hiện được tiềm năng đó chúng ta phải không ngừng sản xuất đại trà, nâng cao

số lượng, chất lượng trong đó nguồn giống sâm Ngọc Linh là yếu tố rất quan trọng Trong những năm gần đây với những thành tựu của nuôi cấy mô, đã cho phép khả năng nhân nhanh giống các loại cây trồng sạch bệnh với số lượng lớn trong thời gian ngắn

Để góp phần vào việc nhân nhanh giống cây sâm Ngọc Linh em tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Tìm hiểu ảnh hưởng của một số môi trường có thành phần

khoáng đa lượng và tỷ lệ khoáng N, P 2 O 5 , K 2 O, MgO, CaO, có nguồn gốc xuất phát

từ môi trường MS cùng với tỷ lệ khoáng đa lượng đến sự biệt hóa phôi sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thành cây hoàn chỉnh trong môi trường nuôi cấy invitro”

Ở Việt Nam, cây sâm Ngọc Linh được tìm thấy khá muộn tại núi Ngọc Linh, tuy đã có nhiều cố gắng để phát triển cây dược liệu quý giá này nhưng tiềm năng của cây sâm Ngọc Linh vẫn còn chưa được đánh thức Cộng với địa bàn phân bố hẹp, ở độ cao 1500 đến 2100m, cây mọc thành đám dưới tán rừng dọc theo các suối, sống trên đất nhiều mùn, ẩm (Trà My, Quảng Nam và ĐăkTô, Kon Tum), bị người dân địa phương khai thác một cách bừa bãi nên cây sâm Ngọc Linh đang sớm đứng trước nguy

cơ bị tuyệt chủng (Sách đỏ, 2002) Do đó, tại địa phương nơi có cây sâm Ngọc Linh phân bố đã thành lập trung tâm sâm để quản lý 80ha trên đỉnh núi Ngọc Linh nên hiện nay loài dược liệu này đã tránh được nguy cơ bị tuyệt chủng

Trước tình hình trên cần phải có những biện pháp cấp thiết để bảo vệ, nuôi trồng và phát triển cây sâm Ngọc Linh Để làm được việc này phải giải quyết nhiều vấn đề, cấp bách là vấn đề trồng trọt như nhân giống, bón phân, kỹ thuật trồng và chǎm sóc Đặc biệt, với cây sâm quý này yêu cầu trồng và chǎm sóc rất đặc trưng Vì vậy cần phải chú ý nghiên cứu chế độ phân bón đa lượng, vi lượng, các yếu tố kỹ thuật

để nâng cao nǎng suất, rút ngắn thời gian thu hoạch như phá thời kỳ ngủ đông, nhổ cây trồng lại hàng nǎm

Để nhân giống sản xuất sâm ta có thể trồng sâm trong rừng, trồng sâm chủ động nghiên cứu và trồng sâm trong ống nghiệm Muốn phát triển cây sâm Ngọc Linh theo hướng hiện đại mang lại hiệu quả kinh tế cao thì không thể bỏ qua kỹ thuật nuôi

+ Sâm Ngọc Linh là cây có giá trị kinh tế, y dược cao Hiện tại nguồn cây tự nhiên đã cạn kiệt Việc dùng phương pháp lấy hạt nhân giống hiệu quả không cao khi lượng hạt rất ít Hạt không đảm bảo tỷ lệ sống và đặc tính di truyền vì vậy đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu nhân giống vô tính và sản xuất sinh khối rễ sâm Ngọc Linh” đã được triển khai tại Tỉnh Kon Tum từ năm 2008 và dự kiến kết thúc vào năm 2011, bước đầu đã thành công Với phương pháp cấy mô này, mỗi năm Tỉnh Kon Tum có thể sản xuất được hàng trăm ngàn cây giống đáp ứng nhu cầu thị trường

+ Từ một số tế bào gốc bằng công nghệ sinh khối tế bào, nhóm nghiên cứu của Học viện Quân y đã thành công trong việc nuối cấy tế bào cây sâm Ngọc Linh với số lượng lớn Toàn bộ quy trình này chỉ kéo dài từ 10 - 20 ngày Đây là một thành công rất đáng ghi nhận, bởi bình thường phải mất khoảng 6 năm cây sâm Ngọc Linh mới cho thu hoạch Chương trình được sự đầu tư của Bộ Khoa Học và Công Nghệ, Bộ Quốc Phòng và các nhà khoa học Hàn Quốc

Một quy trình nuôi cấy mô hoàn chỉnh phải qua các bước:

+ Tạo mẫu vô trùng

+ Nhân nhanh giống bằng cách tạo mô sẹo hoặc cắt đốt

+ Tạo cây con hoàn chỉnh

+ Đưa cây con từ ống nghiệm ra trồng ngoài

Vì thời gian có hạn, nên trong đề tài này em chỉ nghiên cứu sự sinh trưởng của cây sâm Ngọc Linh trong ống nghiệm và đã trồng thành công ngoài thực tiễn invivo Đó

là sự gia tăng về trọng lượng tươi, số chồi tái sinh, số lượng rễ và chiều dài rễ

4

Sơ lược quá trình nhân giống của cây trong invitro như sau:

Mẫu cấy (phôi) => Chồi tái sinh => Cụm chồi => Cây hoàn chỉnh

(I) (II) (III) (IV)

Nhân giống thành công một loài nào đó trong invitro cần tìm các phương pháp sao cho đảm bảo các khâu từ (I) đến (IV) trong thế chủ động mang lại hiệu quả cao Trong điều kiện nhiệt độ ánh sáng thích hợp thì dinh dưỡng là nhân tố ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của cây trong invitro, trong đó khoáng đa lượng là thành phần quan trọng không thể thiếu được của chế độ dinh dưỡng

Qua nhiều kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy khoáng đa lượng

có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của cây trong invitro, là cơ sở để tìm hiểu các giai đoạn từ (I) đến (IV)

Ảnh hưởng của khoáng đa lượng trong các môi trường thể hiện qua 3 yếu tố: + Tỷ lệ N : P : K (1)

+ Thành phần khoáng đa lượng (2) + Nồng độ các khoáng đa lượng (3) Các môi trường khác nhau có các yếu tố (1), (2), (3) khác nhau nó ảnh hưởng khác nhau đến môi trường nghiên cứu Có môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của loài cây này nhưng lại không thích hợp ở loài cây khác, trong đó thành phần khoáng đa lượng đóng vai trò quan trọng hàng đầu Tỷ lệ N : P : K đóng vai trò quan trọng trong tái sinh chồi thành cây con Mẫu cấy có kích cỡ (1 x 0.5)cm mới có khả năng tạo chồi, hoàn chỉnh cây con tái sinh Cho đến tháng 3/2010 việc sản xuất cây sâm con vẫn chưa đạt cơ số triệu cây cung cấp cho nhu cầu cấp bách về cây giống

Theo KS Trần Trọng Nghĩa, môi trường MS (Murashige – Skoog, 1962) là môi trường thích hợp cho nhiều loài cây trong nuôi cấy mô, tuy nhiên nó không phải là môi trường duy nhất thích hợp cho mọi loài cây Từ đó ta thấy sự chuyển đổi giai đoạn nuôi cấy từ (I) đến (III) hay từ (III) đến (IV) của một loài nào đó trong điều kiện invitro phụ thuộc mạnh mẽ vào thành phần khoáng đa lượng tham gia

Hiện nay đã có nhiều cơ sở nghiên cứu khoa học đang tiến hành nghiên cứu nhân nhanh sinh khối tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh, trong đó có phòng nuôi cấy mô Nam Anh thuộc Công ty Nam An nơi em tiến hành nghiên cứu sự phát triển của phôi

5

sâm Ngọc Linh Tháng 4/2010 qua phân tích phôi sâm Ngọc Linh của Công ty Nam

An tại Viện nghiên cứu dược liệu đã cho thấy hàm lượng hoạt chất saponin gấp 12 lần

so với Học viện Quân y đã phân tích trước đó

Để đánh thức tiềm năng của cây dược liệu quý giá này, Việt Nam cần mạnh dạn nghiên cứu cũng như sản xuất để đánh thức các giá trị y học cũng như giá trị kinh

tế của chúng Xuất phát từ các vấn đề trên, trong giới hạn một khóa luận tốt nghiệp

chuyên ngành Lâm Nghiệp em tiến hành thực hiện đề tài: “Tìm hiểu ảnh hưởng của

một số môi trường có thành phần khoáng đa lượng và tỷ lệ khoáng N, P 2 O 5 , K 2 O, MgO, CaO, có nguồn gốc xuất phát từ môi trường MS cùng với tỷ lệ khoáng đa lượng đến sự biệt hóa phôi sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thành cây hoàn chỉnh trong môi trường nuôi cấy invitro”

1.2 Mục đích, mục tiêu, ý nghĩa đề tài

6

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Các loại sâm trên thế giới và ở Việt Nam

2.1.1 Các loại sâm trên thế giới

2.1.1.1 Sâm Triều Tiên, Panax ginseng C.A.Meyer, Korean ginseng

Sâm Triều Tiên được phân ra làm 2 loại là Hồng sâm và Bạch sâm, mỗi loại

có nhiều hạng tốt xấu khác nhau

Hồng sâm: là loại củ sâm to (nặng ít nhất 37g), rửa sạch đất cát ,cho vào nồi chưng

chín trong khoảng 2 giờ, sau đó sấy hoặc phơi khô Đầu sâm (tức cổ rễ) đôi khi thấy như có vết sẹo của thân, rễ có thể phân nhánh trông như cánh tay, phần dưới có 2 hoặc 3 nhánh trông như chân Toàn bộ củ sâm trông giống hình người nên gọi là Nhân sâm

Bạch sâm: Những củ sâm không đủ tiêu chuẩn để chế biến thành hồng sâm thì

chế thành bạch sâm Rễ chính hình trụ, mập và ngắn, phần đỉnh có thân rễ dài nhỏ, phía trên nó có các chỗ lõm hình xoắn ốc đan xen nhau, tuổi đời càng lâu thì thân rễ càng dài Bên cạnh thân rễ thường mọc một hoặc vài sợi rễ, đầu trên của rễ chính có vằn dày, phía dưới thường phân nhánh

Thành phần chủ yếu

Dược chất chính của Nhân sâm Panax ginseng là ginsenosid Hai nhóm

ginsenosid chính là Rb và Rg Ginsenosid của nhóm Rb là Rb1, Rb2, Rc, Rd Ginsenosid của nhóm Rg là Re, Rf, Rg1

Thành phần hóa học của Nhân sâm rất phong phú, hoạt chất chính của Nhân sâm là hỗn hợp saponin, gọi chung là ginsenosid, được coi là một trong những dược liệu quý để điều trị một số bệnh hiểm nghèo, tăng cường thể lực

Hoạt chất saponin Nhân sâm làm tăng chuyển hóa lipid, tăng cường sự hợp thành sinh vật học cholesterol và lipoprotein trong gan chuột cống thực nghiệm Theo các thí nghiệm, Nhân sâm có thể ngăn ngừa sự phát sinh cholesterol cao ở thỏ vì vậy

mà ngăn ngừa sự hình thành xơ vữa động mạch Khi nghiên cứu trên thỏ và chuột cho thấy, Nhân sâm có tác dụng bảo vệ gan, gia tăng chức năng giải độc của gan Nhân sâm còn có tác dụng nâng cao thị lực và làm tăng khả năng thích nghi của thị giác đối với bóng tối

Nhân sâm có khả năng làm giảm tác hại của chất phóng xạ Hoạt chất saponin trong Nhân sâm Rh2 có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của tế bào ung thư

Tác dụng đối với sức khỏe

Y học cổ truyền phương Đông đã chứng minh sâm Triều Tiên đóng vai trò quan trọng trong việc dự phòng và điều trị những bệnh lý mãn tính, cần điều trị dài ngày như bệnh tiểu đường, ung thư, bệnh sơ vỡ động mạch, huyết khối, cao huyết áp, thiểu năng tuần hoàn não… Y học hiện đại đã chứng minh sâm Triều Tiên duy trì hằng định nội môi của hệ thần kinh trung ương, hệ nội tiết và hệ miễn dịch

Một số người dùng Nhân sâm và chế phẩm của nó với liều quá cao, hoặc quá dài ngày, dẫn đến ngộ độc với biểu hiện tăng huyết áp, chảy máu mũi, thần kinh hưng phấn quá độ (gây ra phiền não, không yên, mất ngủ, dễ bị kích thích, đau đầu, chóng mặt, nổi mề đay, mẩn ngứa, thậm chí co giật ) Y học gọi những triệu chứng này là

“hội chứng ngộ độc Nhân sâm”

Nhân sâm giúp cơ thể tăng khả năng thích nghi, phòng vệ đối với những kích thích có hại Nó vừa làm hồi phục huyết áp ở cơ thể choáng do mất máu, vừa có thể

8

làm hạ huyết áp ở người huyết áp cao, chống corticoid làm teo thượng thận Nhân sâm vừa có thể làm hạ đường huyết cao do ăn uống, vừa có thể nâng cao trạng thái đường huyết hạ do insulin gây nên

2.1.1.2 Sâm Tam Thất, Panax notoginseng (Burk) F H Chen (sanchi ginseng)

Sâm Tam Thất còn có tên khác là Kim bất hoán, Điền thất, Sơn thất, Nhân

sâm tam thất là rễ phơi khô của cây Tam thất (Panax notoginseng (Burk) F.H Chen

hoặc Panax repens Maxim) thuộc họ Ngũ gia bì ( Araliaceae)

Thành phần chủ yếu

Theo sách Trung dược học, thành phần chủ yếu của sâm Tam Thất gồm có: Hoạt chất saponin Tam Thất tương tự như hoạt chất saponin của Nhân sâm, chủ yếu có hoạt chất saponin Nhân sâm Rb1, Rd, Re, Rg1, Rg2, Rh1 và hoạt chất saponin Tam Thất

C3, D1, D2, E2, R1, R2, R3, R4 Hoạt chất cầm máu trong sâm Tam Thất là chất Decichine Ngoài ra còn có alkaloit, protid, saccharide, lipid, tinh dầu, các axit amin tự

do, caroten và calci

là triterpenoid saponin, mà sâm Tam Thất lại có hàm lượng chất này cao hơn Nhân sâm có tác dụng cầm máu và bổ dưỡng Các flavonoid chứa trong sâm Tam Thất có tác dụng điều tiết huyết áp, giãn động mạch vành, tăng lưu lượng máu mạch vành, làm giảm tiêu hao oxy của tim, bớt gánh nặng cho cơ tim Qua thử nghiệm lâm sàng, chứng minh sâm Tam Thất có hiệu quả tốt trong điều trị tức ngực, đau thắt ngực do bệnh mạch vành gây ra, công năng của sâm Tam Thất đối với việc giảm cholesterol và

mỡ máu cũng rất rõ

Tác dụng đối với sức khỏe

Công dụng của sâm Tam Thất, trong y học dân gian lưu truyền 6 chữ: chỉ huyết, tán ứ, định thống (tức cầm máu, tan máu bầm, giảm đau)

9

Theo dược điển Việt Nam, sâm Tam Thất còn dùng trị thổ huyết, băng huyết, tan huyết ứ, thiếu máu nặng, mệt mỏi, hoa mắt, chóng mặt, nhức đầu, ít ngủ Theo một số tài liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), sâm Tam Thất giúp lưu thông tuần hoàn máu, giảm lượng cholesterol trong máu, hạ đường huyết, kích thích hệ miễn dịch, ức chế vi khuẩn Do đó, sâm Tam Thất được dùng trong các trường hợp tăng huyết áp, đau thắt ngực, đái tháo đường, các chấn thương sưng tấy đau nhức, suy giảm trí nhớ, tăng tuần hoàn não, ăn uống kém, ra mồ hôi trộm, lao động quá sức

2.1.1.3 Sâm Mỹ, Panax quinqueflolius L (American ginseng)

Sâm Mỹ có hai loại:

Panax qinquefolius (năm lá): Là loại thường thấy, 90 - 95 % thu hoạch từ

những cây mọc dại (gọi là dã sơn sâm Hoa Kỳ) hay được trồng tại Mỹ và Canada

Hồng sâm Hoa Kỳ (Red American ginseng) Rumex hymenosepalus

(polygonaceae): Cây này nguồn gốc ở vùng Tây Nam Hoa Kỳ, sau đó được trồng ở nhiều nơi Rễ củ trông giống củ thược dược màu vàng Loài này có nguy cơ tuyệt chủng, ăn thú vị và ngày càng hiếm

Thành phần chủ yếu

Giống như Nhân sâm (Panax ginseng), sâm Mỹ có chứa dammarane - type

ginsenosides là thành phần lớn hoạt tính sinh học Dammarane ginsenosides bao gồm hai phân loại: 20 (S) - protopanaxadiol (PPD phân loại) và 20 (S) - protopanaxatriol (ppt phân loại) Sâm Mỹ có chứa hàm lượng cao Rb1, Rd (PPD phân loại) và Re (ppt phân loại) ginsenosides - cao hơn P

Thành phần chủ yếu của sâm Mỹ (Panax quinquefolius) gồm các chất

gingenosides, panaxosides và saponin là 3 hoạt chất chính của sâm Mỹ, nhưng chính chất gingenosides mới tác động thật sự vào việc làm giảm đường huyết

Tác dụng dược lý

Sâm Mỹ có tác dụng chống oxy hóa theo hai cơ chế: chelat hóa các ion kim loại

và các gốc tự do, chúng có tác dụng bảo vệ tế bào não trong trường hợp thiểu năng tuần hoàn não, đột quỵ

10

Tác dụng làm gia tăng nhận thức ghi nhớ của ginsenoisid – Rb1 trong sâm Mỹ thông qua cơ chế tăng sinh sản acetylcholin trong não, tăng sự hấp thụ tiền chất cholin

ở đầu dây thần kinh

Pseudoginsenosid – F11 có tác dụng đối kháng với morphin ở mức độ tế bào, do

đó có hiệu lực đối kháng với các tác dụng của morphin trên rối loạn hành vi và tâm thần

Sâm Mỹ (40 – 80 mg/kg thể trọng) ức chế sự tăng chỉ số loét dạ dày, tăng trọng lượng tuyến thượng thận, tăng hàm lượng aspartat aminotrasferase AST và creatin kinase gây bởi stress mãn tính

Hoạt chất saponin của sâm Mỹ có tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim chuột cống trắng trước sự chết tế bào (apoptosis) trong nhồi máu cơ tim

Tác dụng đối với sức khỏe

Sâm Mỹ rất được dân chúng Trung Hoa ưa thích vì tính chất bổ âm (âm/dương) của nó và ngọt dịu hơn sâm Á châu Theo quan niệm Á châu, sự hài hòa giữa âm, dương trong vũ trụ, trong con người đưa tới sự ổn định môi trường và sự khỏe mạnh của con người Sâm Á châu có nhiều dương tính, nóng, làm hưng phấn cơ thể, làm tăng cường sức lực Ngược lại, sâm Mỹ châu có nhiều âm tính, lạnh, làm giảm căng thẳng, làm mạnh nội tạng

Sâm Mỹ được thổ dân dùng để chữa chảy máu cam, khó thở, tăng cường sự sinh sản nữ giới, làm tăng trí tuệ, sức khỏe thể xác, chống mỏi mệt

2.1.2 Các loại sâm ở Việt Nam

Bố sâm chính: (Hibiscus sagittifolius var quinquelobus họ Malvaceae) thường

thấy mọc ở Quảng Bình, Phú Yên Hải Thượng Lãn Ông dùng phối hợp với thuốc khác để trị ho, sốt, gầy yếu Hiện nay dùng làm thuốc bổ khí, thông tiểu tiện, hạ sốt Sâm cau: (Curculigo orchiodes họ Hypoxidaceae) mọc nhiều dưới tán rừng xanh Lạng Sơn, Hòa Bình đến Đồng Nai Có tác dụng bổ thận, tráng dương, dùng để chữa nam giới tinh lạnh, liệt dương, phụ nữ bạch đới, người già tiểu són

Sâm đại hành: (Eleutherine subaphylla họ Iridaceae) mọc hoang ở khắp nơi tại Việt Nam, thường được dùng để trị ho, đinh nhọt, lở ngứa ngoài da, chốc đầu, tổ đĩa

Sâm hoàn dương: mọc nhiều ở vùng núi cao nguyên Việt Nam, dùng để trị viêm phế quản, phổi, mụn nhọt, ho, tắc tia sữa

11

Sâm mây: mọc nhiều ở Bắc Việt Nam, Bình Thuận, Đồng Nai Người dân thường sử dụng làm thuốc bổ

Sâm Ngọc Linh:còn gọi là sâm Việt Nam, sâm Khu Năm (Panax vietnamensis,

Araliaceae) mọc tập trung tập trung ở các huyện miền núi Ngọc Linh thuộc Kon Tum

và Quảng Nam ở độ cao 1500m đến 2100m, cây mọc dày thành đám dưới tán rừng dọc theo các suối ẩm trên đất nhiều mùn

2.2 Sâm Ngọc Linh

2.2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển

Trước khi có sự phát hiện từ phía các nhà khoa học, cây sâm Ngọc Linh đã được các đồng bào dân tộc thiểu số Trung Trung Bộ Việt Nam, đặc biệt là dân tộc Xê Đăng sử dụng như một loại củ rừng, mà họ gọi là củ “ngải rọm con” hay cây “thuốc giấu”, chữa nhiều loại bệnh theo các phương thuốc cổ truyền

Năm 1973, khu Y tế Trung Trung Bộ cử một tổ 4 cán bộ do DS Đào Kim Long làm trưởng đoàn, KS Nguyễn Bá Hoạt, DS Nguyễn Châu Giang, DS Trần Thanh Dân là thành viên, đi điều tra phát hiện cây sâm theo hướng chân núi Ngọc Linh thuộc huyện ĐăkTô, Tỉnh Kon Tum Khi đoàn lên Tỉnh Kon Tum, Ban Dân Y Kon Tum cử thêm dược tá Nguyễn Thị Lê trợ giúp cho đoàn dẫn đường lên núi Ngọc Linh Sau nhiều ngày vượt suối băng rừng, đến 9 giờ sáng ngày 19 tháng 03 năm 1973, ở độ cao 1.800 mét so với mặt biển, đoàn đã phát hiện hai cây sâm đầu tiên và ngay buổi chiều cùng ngày đã phát hiện được một vùng sâm rộng lớn thuộc phía Tây núi Ngọc Linh Sau 15 ngày nghiên cứu toàn diện về hình thái, sinh thái, quần thể, quần lạc, phân bố, di cư và phát tán, DS Đào Kim Long đã xác định núi Ngọc Linh là quê hương của cây sâm mới, đặc biệt quý hiếm chưa từng xuất hiện tại bất cứ nơi nào khác

trên thế giới và đặt tên là “sâm đốt trúc” với tên khoa học xác định sơ bộ là Panax

articulatus L , họ nhân sâm (Araliaceae)

Trải qua hơn 30 năm, sâm K5 còn gọi là sâm Ngọc Linh hay sâm Việt Nam,

một loài sâm đặc hữu của nước ta đã được thế giới biết đến với tên khoa học là Panax

vietnamensis Ha et Grushv (Hà Thị Dung và Grushvisky, 1985)

2.2.2 Đặc điểm sinh học và phân bố cây sâm Ngọc Linh

Tên khoa học: Panax vietnamensis Ha et Grutzv

12

Tên thường gọi: Sâm Ngọc Linh, sâm Việt Nam, sâm Khu Năm (sâm K5), sâm trúc (sâm đốt trúc, trúc tiết nhân sâm), củ ngải rọm con hay cây thuốc giấu

Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng

Hình 2.1: Sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et Grutzv

Phân loại khoa học

Sâm Ngọc Linh có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ,

có đường kính thân độ 4 - 8mm Cây thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40

- 60cm, đôi khi trên 1m

Thân rễ nạc có đường kính 1 - 3,5cm, mọc bò ngang như củ hoàng tinh trên hoặc dưới mặt đất độ 1 - 3cm, mang nhiều rễ con và những vết nhăn dọc, dễ bẽ gãy, mùi thơm nhẹ, vị đắng hơi ngọt Ở cuối thân rễ có rễ củ thường ít phát triển, rễ có dạng con quay, hình trụ, đôi khi có dạng hình người, màu vàng nhạt, mang nhiều rễ con và

13

có vân ngang Lá kép hình chân vịt mọc vòng với 3 - 5 nhánh lá ở đỉnh thân Cuống lá kép dài 2 – 12cm, mỗi kép thường mang 5 lá chét hình trứng ngược, hình mác hoặc bầu dục, mé khía răng cưa, đầu lá nhọn, đôi khi có mũi nhọn, gốc lá hình nêm Gân lá hình lông chim, thường có 10 cặp, gân phụ hình mạng Phiến lá màu xanh lục, mảnh,

dễ rách, có nhiều lông cứng dài 1 - 2cm, mặt dưới ít hơn Cây nảy mầm từ hạt chỉ có 1

lá kép với 5 lá chét, năm thứ 3 đa số 2 lá kép, năm thứ 4 đa số 3 lá kép

Hoa màu vàng lục nhạt, đường kính 3 – 4mm, gồm 5 lá đài hợp thành hình chuông hoặc hình tên chia thành 5 răng nhỏ, hình tam giác, dài 1 – 1,5mm, 5 cánh hoa,

5 nhị màu trắng, dài 1,5 - 2mm Bao phấn hình xoan, đính lưng, đĩa hoa hơi lồi Bầu cao 1 - 1,5mm, có 2 lá noãn nhưng thường chỉ có một lá noãn phát triển Hoa thường

nở vào buổi sáng từ 9 – 10 giờ Lúc này nhiệt độ không khí khoảng 18 – 20OC và độ

ẩm 85 – 95% Hoa nở dần từ ngoài vào và từ dưới lên Đài hoa rụng 1 – 2 ngày sau khi

nở và tán bắt đầu kết quả

Quả mọng mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8cm - 1cm và rộng khoảng 0,5cm - 0,6cm, sau hai tháng bắt đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm, vàng lục, khi chín ngả màu đỏ cam với một chấm đen không đều ở đỉnh quả Thỉnh thoảng gặp quả khi chín không có chấm đen giống như quả của Nhân sâm Hạt màu trắng hay màu vàng nhạt, dài 6 – 8mm, rộng 5 – 6mm, dày 2mm, bề mặt có nhiều chỗ lồi lõm Mùa hoa nở từ tháng 4 đến tháng 7, mùa ra quả từ tháng 9 đến tháng 10 hàng năm

Vào đầu tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành có 1 tán hoa Từ tháng 4 đến tháng 6, cây

nở hoa và kết thành quả Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9 Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức trên củ có một sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm

Đặc điểm sinh thái

Mọc dưới tán rừng già ẩm, nhiều mùn, ít ánh sáng, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20°C - 25°C, ban đêm 15°C - 18°C, thường mọc thành những quần thể nhỏ

14

ven hai bên bờ suối có độ ẩm trên 80%, tỷ lệ mùn hữu cơ trong đất rất cao Sâm Ngọc Linh là cây ưa ẩm chịu bóng, có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng

lá và rễ con Sâm Ngọc Linh tăng trưởng mạnh trong mùa xuân – hè Sau khi quả chín rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông khoảng trên 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau

Phân bố

Đến nay, sâm Ngoc Linh mới chỉ phát hiện được duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai Tỉnh Quảng Nam và Kon Tum Tọa độ địa lý từ 107050’- 10807’ kinh tuyến Đông và từ 1500’- 15010’ vĩ tuyến Bắc Những điểm vốn trước đây có cây sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500m đến 2200m, chủ yếu tập trung ở

1800 – 2000m, thuộc địa bàn của hai huyện ĐăkTô (Kon Tum) và Trà My (Quảng Nam)

Năm 1894, Nhà nước quy hoạch vùng sâm thành vùng cấm quốc gia nhằm bảo

vệ và phát triển cây thuốc quý này Tuy nhiên trong hai thập kỷ qua, do khai thác quá mức nên sâm Ngọc Linh đang có nguy cơ tuyệt chủng Cây đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam Hiện nay vùng sâm Việt Nam được xem là vùng sâm thuộc khu vực nhiệt đới độc nhất còn lại trên thế giới Ngoài Ngọc Linh, sâm còn phân bố tại núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn và còn có thể có ở đỉnh Ngọc Am Tỉnh Quảng Nam theo những kết quả điều tra mới nhất Trên độ cao 1.200 - 2.100m, sâm Ngọc Linh mọc dày thành đám dưới tán rừng dọc theo các suối ẩm trên đất nhiều mùn

Thành phần hóa học: hoạt chất saponin

Hoạt chất saponin triterpen xác định là những hoạt chất chính, có tác dụng sinh học chủ yếu của sâm Ngọc Linh

Tổng số hoạt chất saponin được phân lập lên đến 34 hoạt chất, trong đó 24 hoạt chất đã xác định được cấu trúc Thành phần hoạt chất saponin của sâm Ngọc Linh hoang dại tạo ra các điều mới lạ cho các nhà nghiên cứu về Sâm và nơi những cây đồng chủng làm cho giá trị của sâm Ngọc Linh có thể so sánh với các cây sâm quý nhất hiện nay trên thế giới như sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Trung Quốc, ở các điểm:

yếu và quan trọng, 11 hoạt chất saponin còn lại chưa được phát hiện ở Panax ginseng

và 3 hoạt chất saponin mới của các hợp chất tự nhiên lần đầu tiên được phát hiện ở

Panax vietnamensis

Tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh

Tính vị: Có vị đắng kéo dài, không độc

Dược tính

Sâm Ngọc Linh cũng là loại Nhân sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới và có tác dụng rất giống Nhân sâm Theo kết quả nghiên cứu từ năm 1978 của Bộ Y Tế Việt Nam, phần thân rễ của cây sâm Ngọc Linh Việt Nam chứa 26 hoạt chất saponin có cấu trúc hóa học đã biết (thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật), trong khi sâm Triều Tiên có khoảng 25 hoạt chất saponin

Từ thân và rễ sâm Ngọc Linh, người ta đã chiết xuất và xác định được hơn 50 hoạt chất saponin, trong đó có 24 hoạt chất saponin có cấu trúc mới (Nguyễn Thời Nhâm và Herba, 1989; Nguyễn Văn Đức và cộng sự, 1993,1994,1996,1998) Các hoạt chất saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenoside-R1 > R24

Sâm Ngọc Linh là một trong những loài cây dược liệu quý hiếm, có giá trị sử dụng cũng như giá trị kinh tế cao Theo đánh giá của các nhà khoa học, sâm Ngọc

Linh có giá trị trị liệu ngang hàng với sâm Triều Tiên (Panax ginseng), sâm Nhật (Panax japonicus), sâm Mỹ (Panax quinquefolius) (Nguyễn Văn Đức và Nguyễn Thời

Nhâm, 1998)

Hàm lượng hoạt chất saponin toàn phần của sâm Ngọc Linh cao hơn nhiều so với các loài sâm khác Ngoài thành phần chính là hoạt chất saponin, trong sâm Ngọc Linh còn xác định 17 axit amin (trong đó có 8 axit amin không thay thế được), 14 axit béo, 20 chất khoáng vi lượng và hàm lượng tinh dầu là 0,1% (Nguyễn Bá Hoạt, 2004)

16

Tác dụng đối với sức khỏe

Trước khi có những nghiên cứu kỹ lưỡng về tác dụng đối với sức khỏe của sâm Ngọc Linh, sâm đã được các dân tộc thiểu số Việt Nam như người Xê Đăng, dùng như một loại thuốc trong những bài thuốc cổ truyền cầm máu, lành vết thương, làm thuốc

bổ, sốt rét, đau bụng

Theo TS Nguyễn Bá Hoạt, những kết quả nghiên cứu dược lý thực nghiệm sâm Ngọc Linh đã chứng minh tác dụng chống stress vật lý, stress tâm lý và trầm cảm, kích thích miễn dịch, chống oxy hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan Nghiên cứu dược lý lâm sàng của sâm Ngọc Linh cũng cho kết quả tốt, bệnh nhân ăn ngon, ngủ tốt, lên cân, tăng thị lực, hoạt động trí tuệ và thể lực cải thiện, gia tăng sức

đề kháng, cải thiện các trường hợp suy nhược thần kinh và suy nhược sinh dục, nâng cao huyết áp ở người bị huyết áp thấp

Theo DS Đào Kim Long, sâm Ngọc Linh còn có những tính năng tuyệt hảo như tăng lực, phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình trạng của cơ thể trở lại bình thường, kháng các độc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài sự sống của tế bào và tăng các tế bào mới

Những tác dụng chính của sâm Ngọc Linh gồm: bổ chung, tăng lực và sinh thích nghi, phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình trạng của cơ thể trở lại bình thường (hồi dương), chống lão hóa, kháng các độc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài sự sống của tế bào, tăng các tế bào mới

Ưu thế đặc biệt của sâm Việt Nam là tính kháng khuẩn, tác dụng chống stress tâm lý, chống trầm cảm, giảm lo âu, chống oxi hóa, và hiệp lực tốt với thuốc kháng sinh, thuốc trị bệnh tiểu đường mà sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc không thể hiện

Hiện trạng và tiềm năng của sâm Ngọc Linh

Sau khi dược tính và tác dụng đối với sức khỏe của sâm Ngọc Linh được công

bố công khai trên các phương tiện thông tin đại chúng, những năm 80 của thế kỷ 20, trên thị trường tự do giá sâm Ngọc Linh tương đương giá sâm Triều Tiên và vào những năm 90, giá sâm Ngọc Linh còn đắt hơn sâm Triều Tiên nhiều lần Việc khai thác, mua bán và sử dụng tràn lan chưa có quy định quản lý, bảo vệ cùng các chính

17

sách, giải pháp đầu tư, quy hoạch phát triển khiến trên 108 vùng sâm mọc tự nhiên giữa Quảng Nam và Kon Tum dần cạn kiệt, kéo theo hàng ngàn hecta rừng nguyên sinh bị tàn phá nặng nề

Trước nguy cơ tuyệt chủng của giống sâm quý, Chính phủ Việt Nam đã quyết định thành lập vùng cấm quốc gia ở khu vực có sâm mọc tập trung tại 2 Tỉnh Kon Tum và Quảng Nam, đồng thời xếp sâm Ngọc Linh vào danh sách các loại cây cấm khai thác, mua bán bất hợp pháp

Sâm Ngọc Linh và các sản phẩm từ sâm Ngọc Linh rất có giá trị kinh tế Tinh sâm Khu Năm chiết xuất từ sâm Ngọc Linh của Công Ty Dược, Vật Tư Thiết bị y tế Kon Tum là một trong không nhiều mặt hàng của Kon Tum có thị trường đặc biệt ổn định Từ 1992 đến nay, giá một lọ tinh sâm tăng hơn 10 lần mà vẫn có thị trường tiêu thụ Thế nhưng từ tháng 8 năm 2003, công ty không còn được phép sản xuất sản xuất sản phẩm này do nguồn nguyên liệu bị cạn kiệt Giá 1 kg sâm củ loại thường năm

2003 là 10 triệu đồng Năm 2005, giá sâm khô khoảng 14 – 15 triệu đồng/kg, nhưng rất hiếm

Tuy cây sâm Ngọc Linh đã thoát nguy cơ tuyệt chủng nhưng độ an toàn còn thấp và mức độ đe dọa vẫn ở bậc E trong sách đỏ Việt Nam

Sâm Ngọc Linh là một dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao, cần thiết ứng dụng những kỹ thuật mới trong sản xuất để nâng cao giá trị thương mại, xây dựng thương hiệu sâm Ngọc Linh trên thị trường thế giới Trong nhiều biện pháp, nuôi cấy

mô là một kỹ thuật tiên tiến có thể ứng dụng tốt cho sản xuất các sản phẩm sâm Ngọc Linh

2.3 Kỹ thuật nhân giống invitro

2.3.1 Những triển vọng nuôi cấy các cây họ nhân sâm

Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được ứng dụng ngày càng nhiều trong sản xuất nguồn dược liệu và nhân giống cây thuốc Viện nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu các loài sâm quý trên thế giới đã được nhiều tác giả tiến hành trong nhiều năm và đã chứng minh tính hiện thực của khả năng tạo nguồn sâm bằng con đường nuôi cấy mô

Năm 1966, Metz và Lang nhận bằng sáng chế của Đức về việc tạo hoạt chất saponin bằng nuôi cấy rễ Nhân sâm

18

Năm 1970, Furuya và cộng sự đã chiết tách được Panaxadiol từ callus Nhân sâm và nhận bằng sáng chế của Đức về tạo hoạt chất saponin bằng phương pháp nuôi cấy mô Nhân sâm

Năm 1973, ông lại thành công trong việc chiết tách Panaxadiol, Panaxatrid, axit oleanlic, dauscoterin, dauscoterin từ callus cuống lá Nhân sâm

Năm 1974, Smotodin và Butenko nhận bằng sáng chế của Nga về tạo được dòng mô sâm Triều Tiên có hoạt chất và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

Năm 1982, Việt Nam đã thành công nuôi cấy sâm Tam Thất, nhận được dòng

mô sẹo và thành công nghiên cứu tái sinh cây sâm Tam Thất

Năm 1983, Furuya và cộng sự (Nhật) đã công bố môi trường, điều kiện tối ưu

để tạo hoạt chất saponin từ callus sâm Triều Tiên

Năm 1987, Furuya và các cộng sự đã công bố sự tạo hoạt chất saponin của dòng

mô sẹo từ rễ của sâm Triều Tiên sau khi thực hiện cấy vào dòng mô này Agrobacterium rihizogenes lượng hoạt chất saponin toàn phần tạo thành lớn hơn 2 – 4 lần so với rễ tự nhiên và 2 lần so với dòng mô rễ tái sinh nuôi cấy ở điều kiện bình thường

Hiện nay nguồn sâm Việt Nam đã cạn kiệt dần và có nguy cơ tuyệt chủng vì bên cạnh việc khai thác bừa bãi, lại chưa có biện pháp khai thác bảo vệ và phát triển hợp lý Trong 5 năm qua, tại Viện sinh học nhiệt đới, PTS Nguyễn Ngọc Dung đã nghiên cứu thành công được 2 dòng sâm Ngọc Linh tái sinh invitro ổn định từ đầu mầm, thân, rễ và lá sâm Việt Nam qua con đường tạo phôi soma Giai đoạn đầu tiên của quá trình nghiên cứu là nghiên cứu môi trường đặc thù thích hợp cho quá trình phát sinh hình thái cây sâm Môi trường đặc thù này được rút ra từ kết quả nuôi cấy trên 12 môi trường cơ bản khác nhau với rất nhiều tổ hợp hoocmon khác nhau, đồng thời dựa trên kết quả phân tích các thành phần nguyên tố đa vi lượng của đất và cây sâm trên vùng sâm tự nhiên được phân tích tại Viện vật lý hạt nhân Đà Lạt bằng phương pháp kích hoạt neutron và huỳnh quan tia X (method of Neutron activation analysis and X ray flourescence) Từ kết quả này đã định hướng xây dựng được thành phần và nồng độ các nguyên tố đa vi lượng của môi trường sâm

19

2.3.2 Một số nghiên cứu về sâm Ngọc Linh ở Việt Nam

2.3.2.1 Thành lập trại dược liệu Trà Linh nhân giống cây sâm Ngọc Linh

Để bảo vệ và phát triển cây thuốc quý này cùng với một số cây ôn đới khác, UBND Tỉnh Quảng Nam đã cho thành lập trại dược liệu Trà Linh Tính đến tháng 4 nǎm 1987, trại đã thu được 53,3 kg thân rễ, trồng được 81 ngàn cây Đến tháng 9 nǎm

1992, trại đã có 100.000 cây Từ nǎm 1985, trại đã áp dụng các biện pháp bón phân và chǎm sóc để tǎng nǎng suất thân rễ, tǎng tỷ lệ nảy mầm, tǎng tỷ lệ cây sống Nhưng chỉ

từ tháng 1 nǎm 1995, việc nghiên cứu mới tiến hành một cách hệ thống hơn, hướng vào việc nhân giống và tǎng diện tích trồng, đã làm các thí nghiệm nhân giống cây bằng lai hữu tính và vô tính, vận động bà con dân tộc thiểu số trong vùng nhân giống

về trồng với một kinh phí khá lớn Kết quả bước đầu là số lượng hạt thu được trên một cây sâm đã tǎng từ 6,7 hạt lên 10,2 hạt Tỷ lệ nảy mầm của hạt gieo trên nền đất đạt 75% nhờ cách chọn hạt tốt ở những cây trên 1 nǎm tuổi khoẻ mạnh Tỷ lệ nảy mầm của hạt gieo trên túi polyethylen cũng không khác tỷ lệ hạt gieo trên nền đất Tỷ lệ cây sống khi trồng đại trà là 95%

Về nhân giống vô tính, trạị đã chọn cách ươm đoạn đầu của thân rễ trong túi polyethylen và ươm đoạn thân rễ trên mặt đất Kết quả bước đầu cho thấy tỷ lệ sống và đâm chồi của đoạn đầu thân rễ cây sâm là 65% Đáng chú ý là cây nhân giống theo cách này mọc khoẻ, nhanh, ra hoa sớm, nǎng suất thân rễ và củ cao hơn so với cây mọc từ hạt Trong nhân giống cây sâm Ngọc Linh, vị trí của phân bón và các yếu tố đa lượng và vi lượng rất quan trọng Bằng cách nhân giống hữu tính và vô tính, trại dược liệu đã có 223.000 cây con Trại đã xây dựng quy trình trồng cây sâm Ngọc Linh và phổ biến cho nhân dân trong vùng thực hiện

2.3.2.2 Sản xuất sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh

Số bằng sáng chế 1 - 0007523, ngày cấp: 11/02/2009 tại Việt Nam, tác giả: Lê Bách Quang, Hoàng Văn Lương, Nguyễn Văn Dự, Vũ Hà, Lê Văn Đông, Nguyễn Văn Long, Vũ Bình Dương, Nguyễn Hoàng Ngân, Chử Văn Mến, Nguyễn Văn Minh, Nguyễn Tùng Linh, Đào Văn Đôn, Nguyễn Văn Thư, Sang Yo Byun, chủ sở hữu Học Viện Quân Y (Việt Nam)

20

Sâm Ngọc Linh có tác dụng tăng lực, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan và có tác dụng chống viêm được dùng làm thuốc chữa ung thư, thuốc kháng khuẩn, làm hương liệu…là loại cây sinh trưởng chậm, hơn 6 năm mới có thể sử dụng được Loại sâm này được đưa vào sách đỏ Việt Nam vì diện tích tự nhiên bị thu hẹp do khai thác quá mức và sinh thái tự nhiên ngày càng thay đổi, ảnh hưởng đến sự phát triển của sâm Sáng chế này đề xuất phương pháp sản xuất sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh

đã mở ra hướng sản xuất dược liệu quý từ sâm Ngọc Linh mà không phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trường và thời gian

Phương pháp sản xuất sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh được nghiên cứu gồm việc nuôi cấy tạo sinh khối tế bào rễ sâm trong môi trường cấy phù hợp với đặc tính của tế bào sâm Ngọc Linh Môi trường nuôi cấy tế bào rễ sâm là môi trường Murashige Skoog và môi trường Gamborg được bổ sung chất điều tiết sinh trưởng, kinetin, nước dừa và dịch chiết hoài sơn (củ mài) Việc bổ sung các dưỡng chất này làm cho tế bào phát triển tốt, dẫn đến kết quả thu được sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh nhiều hơn

Sự ra đời và phát triển của công nghệ nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đã đáp ứng được nhu cầu cả về số lượng và chất lượng cây

giống Trên thế giới, cây Nhân Sâm Panax ginseng C A Meyer đã được nhân giống

thành công bằng nuôi cấy mô Vì vậy, nhân giống vô tính cây sâm Ngọc Linh bằng nuôi cấy mô invitro là một kỹ thuật tiên tiến có thể ứng dụng tốt cho sản xuất sản phẩm sâm Ngọc Linh

2.3.2.3 Ứng dụng công nghệ Biomass tạo sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh

Năm 2006 Sở Khoa học Công nghệ Kon Tum đã đề xuất với TS Dương Tấn Nhựt (Phó Viện trưởng Viện Sinh học Tây Nguyên) xây dựng đề án nghiên cứu nhân giống vô tính và sản xuất sinh khối rễ cây sâm Ngọc Linh Tổng kinh phí cho dự án là 1,7 tỷ đồng trong 4 năm (2008 - 2011), nhằm xây dựng quy trình nhân giống với số lượng lớn và sản xuất sinh khối invitro

Trung tâm Sâm và dược liệu TPHCM đã phân tích hàm lượng hoạt chất có trong sinh khối rễ và các nguồn sinh khối invitro khác, kết quả thu được cho thấy các

Chỉ với một vài tế bào từ rễ của sâm Ngọc Linh, bằng kỹ thuật sinh khối tế bào, các nhà khoa học của Học Viện Quân Y đã có thể sản xuất sâm Ngọc Linh với số lượng lớn trong vòng 10- 20 ngày Các hoạt chất có trong sâm Ngọc Linh sinh khối cũng có chất lượng tương đương với sâm Ngọc Linh trong tự nhiên

Theo một số nhà khoa học, ngoài vùng núi Ngọc Linh sâm còn có thể mọc ở vùng núi Ngọc Lum Heo thuộc địa phận huyện Phước Sơn (Quảng Nam), Langbiang (Lâm Đồng) Tuy nhiên hiện vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào của các nhà khoa học được công khai về các điều kiện để trồng, chăm sóc sâm Ngọc Linh ở các vùng đất khác Viện nghiên cứu nhiệt đới đã thử nghiệm thành công trồng sâm Ngọc Linh bằng phương pháp cấy mô, nhưng khi đem ra trồng lại không phát triển, kể cả việc trồng ở

Đà Lạt, nơi có khí hậu khá tốt Kết quả khả quan nhất là hàng ngàn cây sâm được trồng ở các huyện thuộc tỉnh Quảng Nam như Tây Giang, Phước Sơn bước đầu cho kết quả tốt

22

CHƯƠNG 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Nam Anh thuộc công ty Nam An (946 Xa Lộ Trường Sơn – Thủ Đức – TPHCM)

Thời gian: 01/04/2010 – 01/07/2010

3.2 Điều kiện thí nghiệm

Điều kiện ngoại cảnh

+ Nhiệt độ: nhiệt độ của phòng nuôi cấy thí nghiệm là 20 – 25oC

+ Ánh sáng: sử dụng ánh sáng khuếch tán tự nhiên khoảng 15.000lux

Điều kiện kiện kỹ thuật

Tất cả các vấn đề có liên quan đến điều kiện invitro đều được tiến hành theo quy định nghiêm ngặt của phòng thí nghiệm

+ Dụng cụ và trang thiết bị đều được khử trùng

+ Môi trường nuôi cấy được hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1,5 atm trong thời gian 3 tiếng bằng nồi hấp Autoclave

+ Các mẫu sau khi cấy được nuôi dưỡng đồng nhất về điều kiện ngoại cảnh

3.3 Cơ sở tiến hành thí nghiệm

3.3.1 Mẫu cấy

Mẫu cấy được chọn từ những bình giống có sẵn trong phòng thí nghiệm Chỉ chọn ra những phôi đồng kích cỡ nhau sau đó dùng pance vô trùng tách phôi rời ra từng hột có kích cỡ từ 2 – 3mm, chọn lựa những hột đều Những hột không đều hay cây mầm được loại bỏ

Mỗi chai môi trường 500cc chứa 15 hột phôi

23

3.3.2 Môi trường nuôi cấy

Sự sinh trưởng của cây trong nuôi cấy mô chịu ảnh hưởng rất lớn bởi môi trường nuôi cấy Khi môi trường nuôi cấy thích hợp sẽ giúp cho cây sinh trưởng tốt,

rút ngắn thời gian nuôi cấy trong chai, giảm chi phí sản xuất Dựa trên lý luận thành phần khoáng đa lượng là yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của cây trong invitro, chúng tôi tiến hành nghiên cứu môi trường nuôi dưỡng cây dựa trên sự thay đổi thành phần khoáng đa lượng Nhìn chung, ở hầu hết các môi trường được công bố

đều có các thành phần chính là:

+ Hữu cơ

+ Khoáng đa lượng (Macrolent)

+ Khoáng vi lượng (Microlent)

+ Các vitamin

+ Chất kích thích sinh trưởng

+ Chất kết đông (Agar), chất giải độc, than hoạt tính

Trong đó thành phần ảnh hưởng lớn nhất đến sự phát triển của cây là khoáng đa

lượng Các khoáng đa lượng cần phải được cung cấp là Nitrogen, Phosphor, Kali, Magie, Calci Các loại khoáng này khi tổ hợp thành môi trường nuôi cấy phải phù hợp

với từng loại cây và trạng thái phát triển của mô cấy

Hiện nay, môi trường MS ( Murashige – Skoog, 1962 ) được coi như là một

môi trường thích hợp với nhiều loài cây trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, do giàu

và cân bằng về chất dinh dưỡng, thích hợp cho giai đoạn đầu nuôi cấy Vì vậy chúng tôi chọn môi trường MS làm môi trường đối chứng để cấy mẫu, tuy nhiên nó không thể là môi trường duy nhất thích hợp cho mọi loại cây Do đó, từ môi trường MS cơ

bản chúng tôi còn tiến hành thành lập 17 môi trường cải tiến (kí hiệu CT0,…,CT19)

Bảng 3.1: Thành phần khoáng đa lượng của môi trường MS (môi trường đối chứng)

24

Từ môi trường MS phân tích ra tỷ lệ N : P : K (xem bảng phụ lục) Từ tỷ lệ này chúng tôi tiến hành lập các công thức khác nhau dựa trên sự thay đổi của các thành phần khoáng đạm và kali, nhưng vẫn giữ nguyên nồng độ

3.4 Phương pháp tiến hành thí nghiệm

3.4.1 Thí nghiệm 1: Thay đổi muối KNO 3 trong môi trường MS thành các loại

muối khác ở các cấp khác nhau

Đối tượng – vật liệu thí nghiệm

Đối tượng: Mẫu phôi sâm Ngọc Linh có kích cỡ từ 2 – 3mm cấy vào môi trường

Vật liệu thí nghiệm: Môi trường MS (CT0), (CT11) làm nghiệm thức đối chứng

và 17 môi trường cải biên ( CT0,…,CT19 ) trong đó có cùng tỷ lệ N : P : K chỉ thay đổi thành phần khoáng đa lượng

Bảng 3.2: Bảng thành phần khoáng đa lượng của các nghiệm thức (từ nghiệm thức

Phương pháp bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên (RCBD)

Số nghiệm thức: 10

Số khối bằng số lần lặp lại: 3

25

Số đơn vị thí nghiệm: 10*3= 30

Số chai trên đơn vị thí nghiệm: 5

Tổng số chai: 5*30= 150

Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 14/4/2010 đến ngày 14/7/2010

3.4.2 Thí nghiệm 2: Thay đổi muối KNO 3 và muối NH 4 NO 3 từ môi trường MS

thành các loại muối khác ở các cấp khác nhau

Bảng 3.3: Bảng thành phần khoáng đa lượng của các nghiệm thức (từ nghiệm thức

Chỉ tiêu theo dõi:

+ Trọng lượng tươi (tính bằng gam (g))