Triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu trên động vật thí nghiệm

Để đánh giá tác dụng điều trị sỏi của thuốc cần tiến hành nghiên cứu trên động vật đã được gây sỏi tiết niệu.. Các phương pháp và mô hình nghiên cứu thuốc điều trị sỏi tiết niệu Các ph

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM ĐỨC VỊNH

TRIỂN KHAI MÔ HÌNH GÂY SỎI TIẾT

NIỆU TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

- TS Nguyễn Thùy Dương, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận tốt ngiệp

- TS Nguyễn Hoàng Anh, người thầy đã định hướng, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Lòng nhiệt huyết và say mê nghiên cứu của thầy cô là nguồn động viên, khích lệ lớn lao đối với tôi trong công việc

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới:

- Các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên trong bộ môn Dược lực đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận tại Bộ môn

- Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, rèn luyện và tiếp thu những kiến thức bổ ích trong suốt 5 năm học vừa qua

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè tôi, những người thân yêu đã luôn quan tâm, chăm sóc, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn trong học tập và cuộc sống

Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên

Phạm Đức Vịnh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ iii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Sinh lí bệnh sỏi tiết niệu 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh sỏi tiết niệu 2

1.1.3 Phân loại sỏi tiết niệu 3

1.1.4 Nguyên nhân và cơ chế hình thành sỏi tiết niệu 4

1.1.5 Diễn tiến của bệnh sỏi tiết niệu 7

1.1.6 Điều trị và dự phòng sỏi tiết niệu 7

1.2 Các phương pháp và mô hình nghiên cứu thuốc điều trị sỏi tiết niệu 9

1.2.1 Các phương pháp in vitro trong nghiên cứu thuốc điều trị sỏi tiết niệu 9

1.2.2 Các mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo và đánh giá tác dụng điều trị sỏi tiết niệu của thuốc 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 17

2.1.1 Hóa chất 17

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 17

2.1.3 Động vật thí nghiệm 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

trắng 19

2.3.2 Triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng bằng ethylen glycol, amoni clorid với nồng độ và thời gian đã chọn 22

2.4 Xử lí số liệu 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 25

3.1 Kết quả thực nghiệm khảo sát nồng độ của hóa chất và thời gian gây sỏi 25

3.1.1 Thể trạng của chuột thí nghệm khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng độ khác nhau 25

3.1.2 Khối lượng cơ thể chuột thí nghiệm khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng độ khác nhau 25

3.1.3 Tinh thể calci oxalat trong nước tiểu khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng độ khác nhau 27

3.1.4 Sự kết tập tinh thể trong thận khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng độ khác nhau 29

3.2 Kết quả triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu bằng EG 1% và AC 0,5% 32

3.2.1 Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến khối lượng cơ thể chuột thí nghiệm 33

3.2.2 Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến thể tích nước tiểu của các nhóm 34

3.2.3 Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến pH nước tiểu của các nhóm 34

3.2.4 Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến sự hình thành tinh thể calci oxalat trong nước tiểu 35

3.1.4 Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến các thông số hóa sinh nước tiểu 39

3.1.5 Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến các thông số liên quan tới thận 39

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 43

4.1 Bàn luận về liều của hóa chất gây sỏi và thời gian gây sỏi 43

4.2 Bàn luận về việc triển khai mô hình gây sỏi bằng EG 1% và AC 0,5% 45

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Hình Nội dung Trang

1.1 Hình dạng tinh thể COD và COM dưới kính hiển vi quang học 3

2.1 Sơ đồ quy trình thực nghiệm thăm dò liều của hóa chất và thời gian gây sỏi 19

2.2 Sơ đồ quy trình triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu 22

3.1 Khối lượng cơ thể chuột của 3 nhóm nghiên cứu trong 4 tuần thí nghiệm 25

3.2 Hình ảnh tinh thể calci oxalat niệu dưới kính hiển vi quang học (X 400) 27

3.3 Hình ảnh tiêu bản mô bệnh học thận dưới kính hiển vi phân cực (x 100 ) 29

3.4 Hình ảnh tiêu bản mô bệnh học thận dưới kính hiển vi phân cực (x 400) 30

3.5 Khối lượng cơ thể chuột của các nhóm trong thời gian thí nghiệm 32

3.6

Số lượng tinh thể COD và COM trong nước tiểu của các nhóm trong quá trình thí nghiệm

36

3.7 Hình ảnh tinh thể calci oxalat trong nước tiểu của các nhóm 37

3.8 Hình ảnh vùng nhu mô thận dưới kính hiển vi phân cực (x100) 40

3.9 Hình ảnh vi thể vùng nhú thận dưới kính hiển vi phân cực ( x100) 41

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sỏi tiết niệu là một trong những bệnh được biết đến sớm nhất trên thế giới, ước tính ảnh hưởng đến khoảng 12% dân số toàn cầu [32] Cùng với sự phát triển của y học hiện đại, nhiều phương pháp trị liệu mới đã được nghiên cứu và ứng dụng trong quá trình điều trị sỏi tiết niệu Các phương pháp ngoại khoa mới được áp dụng trong thời gian gần đây như tán sỏi ngoài cơ thể (ESWL), tán sỏi qua da, tán sỏi qua nội soi … là những phương pháp hiệu quả để loại bỏ sỏi khỏi đường tiết niệu Tuy nhiên, khi bệnh nhân sử dụng các phương pháp này có thể gặp phải những tai biến trong quá trình điều trị [23] Các thuốc tân dược điều trị sỏi tiết niệu hiện nay vẫn rất hạn chế về hiệu quả, đặc biệt là ở khả năng phòng sỏi tái phát [18] Trước thực trạng đó, xu hướng sử dụng các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu trong điều trị sỏi tiết niệu đang ngày càng được quan tâm Các thuốc từ dược liệu thường bao gồm nhiều thành phần, tác dụng thông qua nhiều cơ chế Do đó, để sử dụng các thuốc này một cách hiệu quả cần làm sáng tỏ tác dụng, cơ chế tác dụng của chúng Để đánh giá tác dụng điều trị sỏi của thuốc cần tiến hành nghiên cứu trên động vật đã được gây sỏi tiết niệu Các mô hình gây sỏi trên động vật đã được nghiên cứu khá phổ biến trên thế giới, tuy nhiên vẫn còn tồn tại nhiều điểm chưa thống nhất giữa các tác giả Ở Việt Nam, đã có một số phương pháp nghiên

cứu sỏi in vitro nhưng chưa có tác giả nào tiến hành gây sỏi trên động vật thí nghiệm

Với mong muốn tìm ra một mô hình gây sỏi tiết niệu chính xác, ổn định và phù hợp

với điều kiện Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu trên động vật thực nghiệm” với mục tiêu: Triển khai được mô hình gây

sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng

1.1.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh sỏi tiết niệu

Bệnh sỏi tiết niệu là bệnh phổ biến thứ ba trong các bệnh thuộc hệ thống đường tiết niệu, ảnh hưởng đến 10 - 12% dân số thế giới [51] Tỉ lệ mắc bệnh khác nhau theo vùng phụ thuộc vào khí hậu, chế độ ăn, lối sống: 2 - 5% ở châu Á, 8-15% ở châu Âu và châu Mĩ, khoảng 20% ở Trung Đông [42], [43] Bệnh gặp ở nam nhiều gấp hai đến ba lần ở nữ bởi vì khả năng thúc đẩy của testosteron và khả năng ức chế của oestrogen lên quá trình hình thành sỏi tiết niệu [28], [42] Sỏi tiết niệu là bệnh có tỉ lệ tái phát rất cao, khoảng 40% trong vòng 3 năm đầu tiên, 75% trong vòng 10 năm tiếp theo và trong vòng 25 năm, hầu hết bệnh nhân sẽ tái phát sỏi tiết niệu ít nhất một lần nếu không áp dụng các liệu pháp phòng bệnh thích hợp [42], [51] Tỉ lệ tái phát sỏi ở nam giới cũng cao hơn nữ giới: 70 - 81% ở nam so với 47 - 60% ở nữ [38]

Tuổi mắc bệnh phổ biến là từ 35 - 55 tuổi, thời điểm mắc bệnh khác nhau tùy theo loại sỏi, tuổi mắc bệnh trung bình đối với sỏi calci là 48,7 tuổi, sỏi struvit là 46,7 tuổi, sỏi urat là 59,4 tuổi, sỏi cystein là 27,9 tuổi Ở Việt Nam sỏi thận chiếm 40 %, sỏi niệu quản chiếm 28,27%, sỏi bàng quang chiếm 28,3%, sỏi niệu đạo chiếm 5,4% trong tổng

số bệnh nhân bị sỏi thận nói chung, sỏi tiết niệu gặp ở nam nhiều gấp 2 lần ở nữ, gặp nhiều ở người trên 30 tuổi Sỏi struvit chiếm tỉ lệ cao kèm theo nhiễm khuẩn [1]

1.1.3 Phân loại sỏi tiết niệu

1.1.3.1 Phân loại theo thành phần sỏi

Dựa vào thành phần cấu tạo, sỏi tiết niệu được phân loại như sau [13], [26]:

 Sỏi calci: khoảng 80% sỏi tiết niệu là sỏi calci, bao gồm:

- Sỏi calci oxalat

- Sỏi calci phosphat

- Kết hợp calci oxalat và calci phosphat

 Sỏi không calci

- Sỏi nhiễm khuẩn: struvit, carbonat apatit hoặc amoni urat

- Sỏi urat (acid uric/amoni urat/natri urat)

- Sỏi cystin

Trong các loại sỏi kể trên, sỏi calci oxalat là loại phổ biến nhất, chiếm khoảng 80% các ca sỏi tiết niệu [1], [26] Sỏi calci oxalat gồm hai dạng là calci oxalat monohydrat

(COM) và calci oxalat dihydrat (COD) COD còn gọi là weddellite có hình phong bì,

không kết tập thành các khối bền vững, ít gắn vào tế bào biểu mô ống thận, dễ đào thải theo nước tiểu [23] COM còn gọi là whewellite có dạng hình que dài 6 cạnh, hình bầu dục, hình tạ đôi, có khả năng kết tập cao, dễ gắn với tế bào biểu mô ống thận nên dễ gây sỏi thận hơn dạng COD [23]

(a) (b) (c)

Hình 1.1 Hình dạng tinh thể COD (a) và COM (b, c) dưới kính hiển vi quang học

1.1.3.2 Phân loại theo vị trí của sỏi trong đường tiết niệu

Dựa vào vị trí của sỏi trong đường tiết niệu, sỏi tiết niệu được chia thành: sỏi thận, sỏi niệu quản, sỏi bàng quang, sỏi niệu đạo [4]

1.1.4 Nguyên nhân và cơ chế hình thành sỏi tiết niệu

1.1.4.1 Nguyên nhân và yếu tố thuận lợi gây bệnh sỏi tiết niệu

- Yếu tố di truyền, đặc biệt là sỏi cystin và sỏi acid uric

 Yếu tố thuận lợi Các yếu tố thuận lợi cho sự phát sinh bệnh sỏi tiết niệu bao gồm [26] :

- Những người có bệnh dị dạng đường tiết niệu

- Chỉ có một thận chức năng

- Bị sỏi thận sớm (dưới 25 tuổi) thường có nguy cơ tái phát cao

- Uống ít nước

- Nằm bất động lâu ngày

- Bệnh mắc kèm : rối loạn chuyển hóa, loãng xương, gút, cường giáp trạng

- Do dùng quá liều các thuốc : calci, vitaminC, vitamin D, acetazolamid, triamteren, indinavir, sulphonamid

1.1.4.2 Cơ chế hình thành sỏi tiết niệu

Quá trình hình thành sỏi tiết niệu tương đối phức tạp, bao gồm nhiều sự kiện hóa lí diễn ra liên tiếp hoặc đồng thời Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện nhưng

cơ chế hình thành sỏi tiết niệu vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ Nhìn chung, quá trình này trải qua 5 giai đoạn chính, bao gồm: sự quá bão hòa nước tiểu, tạo nhân tinh thể, sự lớn lên của tinh thể, kết tập các tinh thể và sự gắn các tinh thể vào mô thận [6], [16], [25]

 Sự quá bão hòa nước tiểu

Nước tiểu trở thành quá bão hòa khi nồng độ các ion hòa tan của một chất trong nước tiểu vượt quá giới hạn hòa tan của chất đó Sự quá bão hòa nước tiểu là nhân tố thúc đẩy quá trình tạo nhân và lớn lên của tinh thể Do đó, đây là điều kiện tiên quyết cho sự hình thành sỏi tiết niệu [16] Tuy nhiên, nước tiểu ở người bình thường cũng có thể trở thành quá bão hòa với một số chất như calci oxalat, calci phosphat, hydroxyapatit…nhưng không xuất hiện tinh thể trong nước tiểu Nguyên nhân do trong nước tiểu bình thường có những chất ức chế quá trình tạo sỏi, bao gồm những chất có khối lượng phân tử nhỏ như citrat, pyrophosphat, magnesi và những chất có khối lượng phân tử lớn như acid ribonucleic, glycosaminoglycan [22], [25] Mặc dù vậy, mức độ quá bão hòa nước tiểu ở người bệnh sỏi tiết niệu thường cao hơn ở người bình thường Nguyên nhân của sự quá bão hòa nước tiểu một cách bất thường có thể do một rối loạn chuyển hóa làm tăng đào thải một hoặc một số chất qua nước tiểu, do thay đổi pH nước tiểu hoặc do giảm thể tích nước tiểu [6]

Sự tạo nhân tinh thể là quá trình các ion tự do trong nước tiểu ở trạng thái quá bão hòa kết hợp lại với nhau thành các tiểu phân rất nhỏ Có hai loại nhân là nhân đơn thành phần và nhân đa thành phần Trong nước tiểu, loại nhân đa thành phần chiếm đa

số bởi vì nhân tinh thể có thể hình thành ở trên những cấu trúc là những mảnh vụn tế bào, tinh thể niệu, trụ niệu Do đó, đa số sỏi tiết niệu là sự pha trộn của hai hay nhiều thành phần [13], [16], [55]

 Sự lớn lên của các tinh thể

Sự lớn lên của tinh thể là sự chuyển các ion từ dung dịch vào tinh thể Đây là một quá trình diễn ra khá chậm, do đó khó có khả năng tạo ra các tinh thể lớn Khi đó, sự lớn lên của tinh thể được giải thích bằng quá trình kết tập các tinh thể nhỏ, hoặc quá trình tạo các nhân thứ cấp trên bề mặt tinh thể ban đầu [13], [25]

 Sự kết tập các tinh thể Đây là quá trình liên kết các tinh thể nhỏ với nhau bằng lực hóa học hoặc tĩnh điện

để tạo thành các tinh thể lớn Sự kết tập các tinh thể đóng vai trò rất quan trọng trong

cơ chế hình thành sỏi tiết niệu Một tinh thể đơn độc không bao giờ đạt được kích thước đủ lớn để được giữ lại ở thận bằng quá trình lớn lên đơn thuần [16], [55]

 Sự gắn các tinh thể sỏi vào mô thận Quá trình các tinh thể sỏi bị giữ lại trong thận được giải thích theo các giả thuyết khác nhau Thuyết thứ nhất cho rằng các tinh thể sỏi được hình thành tại các ống thận, tại đó chúng kết tập, lớn lên đến kích thước đủ để làm tắc ống thận và bị giữ lại Theo thuyết thứ hai, các tinh thể sỏi cũng được hình thành ở ống thận nhưng cho rằng tinh thể được gắn chặt vào một vị trí nào đó tại bề mặt tế bào biểu mô ống thận hoặc tại cấu trúc nằm trên bề mặt của nhú thận [9] Các nghiên cứu gần đây xác nhận vai trò quan trọng của sự tổn thương tế bào biểu mô thận đối với cơ chế hình thành sỏi thận, các tổn

thương này đã được phát hiện khi gây sỏi tiết niệu bằng mô hình gây tăng bài tiết oxalat niệu [49]

1.1.5 Diễn tiến của bệnh sỏi tiết niệu

Sau khi đã hình thành, nếu kích thước nhỏ, sỏi có thể được đào thải một cách tự nhiên qua đường tiết niệu Tuy nhiên, nếu sỏi bị vướng lại trong đường tiết niệu sẽ gây ảnh hưởng đến đường tiết niệu và trải qua các giai đoạn sau [1], [4]:

- Giai đoạn chống đối: Đường tiết niệu phía trên viên sỏi sẽ tăng co bóp để tống sỏi

ra ngoài Niệu quản và bể thận phía trên viên sỏi chưa bị giãn nở Có sự tăng áp lực đột ngột ở đài bể thận gây cơn đau quặn thận

- Giai đoạn giãn nở: Thông thường sau khoảng 3 tháng, nếu sỏi không di chuyển được, niệu quản, bể thận và đài thận phía trên viên sỏi sẽ bị giãn nở, nhu động của niệu quản bị giảm

- Viên sỏi nằm lâu sẽ không di chuyển được vì bị bám dính vào niêm mạc, niệu quản

bị xơ dày, có thể bị hẹp lại Chức năng thận sẽ bị giảm dần, thận ứ nước, ứ mủ nếu

có nhiễm trùng Sỏi còn tồn tại trong đường tiết niệu là một yếu tố thuận lợi cho việc nhiễm trùng tái diễn, lâu ngày sẽ gây viêm thận mạn tính và suy thận mạn Sỏi niệu quản hai bên có thể gây vô niệu do tắc nghẽn

1.1.6 Điều trị và dự phòng sỏi tiết niệu

1.1.6.1 Điều trị nội khoa

 Điều trị triệu chứng

- Thuốc giảm đau: Thuốc giảm đau chống viêm không steroid (NSAIDs) là thuốc giảm đau được ưu tiên sử dụng để giảm triệu chứng Trường hợp không đáp ứng với NSAIDs thì có thể thay bằng giảm đau opioid [17], [26]

- Giãn cơ trơn: Buscopan, Drotaverin, được sử dụng để giãn cơ, giảm triệu chứng trên cơn đau do sỏi

- Kháng sinh : được sử dụng trong trường hợp bệnh sỏi tiết niệu kèm theo nhiễm khuẩn [26]

 Thuốc đào thải sỏi qua đường tiết niệu

- Thuốc chẹn kênh calci (nifedipin) và thuốc chẹn α adrenergic giúp sỏi dễ đào thải qua đường tiết niệu, có tác dụng tốt đối với sỏi có kích thước nhỏ hơn 5 mm [17]

- Thuốc gây kiềm hóa nước tiểu (bicarbonat, foncitril) có tác dụng hòa tan sỏi acid uric [26]

1.1.6.2 Điều trị ngoại khoa

Điều trị ngoại khoa được chỉ định đối với các trường hợp sỏi có kích thước lớn hơn 7 mm, sỏi gây tắc nghẽn kèm theo nhiễm khuẩn hoặc không kiểm soát được cơn đau do sỏi Một số phương pháp điều trị ngoại khoa đang được áp dụng như: mổ lấy sỏi, tán sỏi ngoài cơ thể, lấy sỏi qua da, bóp sỏi bàng quang [18], [26]

1.1.6.3 Dự phòng tái phát

 Chế độ ăn, uống

Ở những bệnh nhân không có nguy cơ cao, kiểm soát chế độ ăn và lượng nước uống hàng ngày có thể là đủ để dự phòng tái phát sỏi tiết niệu [26]

- Uống nhiều nước để đảm bảo thể tích nước tiểu 24 giờ tối thiểu là 2L

- Chế độ ăn nhiều rau và chất xơ, hạn chế protein động vật (0,8 - 1g/kg), muối ( không quá 3g/ngày), các thức ăn giàu oxalat như bột mì, cacao, chè xanh …

- Đối với bệnh nhân sỏi urat, cần hạn chế thức ăn giàu acid uric (gan, thận, một số loại cá… )

 Chế độ dùng thuốc

Trong trường hợp đã điều chỉnh chế độ ăn và lượng nước uống thích hợp nhưng chưa đủ để kiểm soát sự tái phát sỏi tiết niệu, hoặc những bệnh nhân có nguy cơ tái phát cao, cần kết hợp sử dụng thêm các thuốc như: lợi tiểu thiazid, kali citrat,

orthophosphat … [17], [26]

1.2 Các phương pháp và mô hình nghiên cứu thuốc điều trị sỏi tiết niệu

Các phương pháp nghiên cứu in vitro và các mô hình in vivo được sử dụng trong

nghiên cứu cơ chế và quá trình hình thành sỏi tiết niệu, các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh bệnh sỏi tiết niệu (chế độ ăn, giới tính, bệnh mắc kèm…) và đánh giá tác dụng dự phòng và điều trị sỏi tiết niệu của các thuốc

1.2.1 Các phương pháp in vitro trong nghiên cứu thuốc điều trị sỏi tiết niệu

1.2.2.1 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế của thuốc lên quá trình hình thành sỏi

calci oxalat

 Nguyên tắc

Tạo sỏi calci oxalat trong môi trường nước tiểu nhân tạo (nước tiểu nhân tạo được chuẩn bị theo công thức của Kanavagh và cộng sự ) Khả năng ức chế hình thành sỏi của thuốc được đánh giá dựa trên số lượng và thành phần sỏi calci oxalat [30]

 Thiết kế thí nghiệm

Chuẩn bị song song mẫu trắng sỏi và mẫu thử Mẫu trắng sỏi là dung dịch nước tiểu nhân tạo, được cho thêm dung dịch natri oxalat ở nồng độ thích hợp Mẫu thử được chuẩn bị trong cùng điều kiện nhưng cho thêm dung dịch thuốc cần nghiên cứu Các mẫu nghiên cứu được ủ ở nhiệt độ 37oC, có khuấy trộn Đo mật độ quang OD

ở bước sóng 620 nm tại những thời điểm thích hợp

- Tỉ lệ ức chế của thuốc lên quá trình hình thành sỏi calci oxalat được tính dựa vào mật độ quang OD theo công thức:

% ức chế = (ODmẫu thử - ODmẫu trắng sỏi)/ODmẫu trắng sỏi

- Đánh giá ảnh hưởng của thuốc đến thành phần sỏi calci oxalat dựa vào tương quan

tỉ lệ COD/COM khi quan sát mẫu dưới kính hiển vi

 Áp dụng phương pháp Phương pháp này đã được áp dụng để nghiên cứu tác dụng ức chế hình thành sỏi

tiết niệu của số dược liệu như Hernaria hirsuta[20], Origanum vulgare[18]

1.2.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế của thuốc lên từng giai đoạn của quá trình hình thành sỏi calci oxalat

 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế của thuốc lên giai đoạn tạo nhân tinh thể

- Nguyên tắc Khả năng ức chế tạo nhân tinh thể tỉ lệ với thời gian ti , là thời gian cần để các tinh thể hình thành với số lượng đủ để có thể phát hiện sự tăng OD của dung dịch bằng máy quang phổ, và tốc độ tăng OD theo thời gian [31]

- Thiết kế thí nghiệm Chuẩn bị song song mẫu trắng sỏi và mẫu thử Mẫu trắng sỏi là dung dịch nước tiểu nhân tạo có nồng độ calci xác định và được thêm một lượng thích hợp dung dịch oxalat Mẫu thử được chuẩn bị trong cùng điều kiện nhưng cho thêm dung dịch thuốc cần nghiên cứu Đo mật độ quang OD tại bước sóng 620 nm, bắt đầu từ thời điểm phối hợp dung dịch oxalat với dung dịch nước tiểu nhân tạo

Xây dựng đồ thị của OD theo thời gian Từ đồ thị, xác định ti, là điểm tại đó OD bắt đầu tăng, và ts, là độ dốc của đoạn tuyến tính trên đồ thị Khả năng ức chế sự tạo nhân của thuốc được tính toán dựa vào ti, ts của mẫu trắng sỏi và mẫu thử

- Áp dụng phương pháp

Phương pháp này này đã được áp dụng để nghiên cứu khả năng ức chế tạo nhân

tinh thể của dịch chiết dược liệu Hernaria hirsuta [21], protein Tamm-Horsfall [31]

 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế của thuốc lên giai đoạn lớn lên của tinh thể

ở bước sóng 214 nm Tiến hành song song mẫu có chất thử và mẫu không có chất thử

để xác định tốc độ tiêu thụ oxalat trung bình của từng mẫu

- Áp dụng phương pháp

Phương pháp này đã được áp dụng để nghiên cứu tác dụng ức chế sự lớn lên của

tinh thể calci oxalat của protein Tamm-Horsfall [31], dược liệu Terminalia arjuna [6]

 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế của thuốc lên giai đoạn kết tập các tinh thể calci oxalat

- Nguyên tắc Trong dung dịch bão hòa calci oxalat, các tinh thể calci oxalat ở trạng thái cân bằng, tức là không có sự lên lên hoặc hòa tan tinh thể Khi đó, số lượng và kích thước tinh thể chỉ phụ thuộc vào quá trình kết tập các tinh thể Mức độ kết tập tỉ lệ với tốc độ lắng của các tinh thể [6], [31]

- Thiết kế thí nghiệm Thêm từ dung dịch oxalat vào dung dịch nước tiểu nhân tạo chứa một lượng ion calci thích hợp trong điều kiện khuấy trộn liên tục Xác định sự thay đổi mật độ quang của dung dịch theo lượng oxalat thêm vào dung dịch Tại thời điểm mật độ quang đạt giá trị cực đại, ngừng khuấy trộn dung dịch và xác định sự thay đổi mật độ quang theo thời gian

Tiến hành song song mẫu có chất thử và mẫu không có chất thử Khả năng ức chế quá trình kết tập của chất thử được đánh giá bằng cách so sánh độ dốc của đường biểu diễn sự giảm OD theo thời gian của mẫu thử so với mẫu chứng

- Áp dụng phương pháp Phương pháp này được áp dụng để nghiên cứu khả năng ức chế sự kết tập các tinh

thể calci oxalat của dịch chiết dược liệu Hernaria hirsuta [21], Origanum vulgare[18]

1.2.2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng hòa tan sỏi tiết niệu in vitro của thuốc

 Thiết kế thí nghiệm Sỏi tiết niệu lấy từ bệnh nhân được đặt trong môi trường nước tiểu nhân tạo có mặt chất thử hoặc không có mặt chất thử Sau một khoảng thời gian thích hợp, lấy sỏi ra và đem xác định khối lượng Chất đang nghiên cứu được cho là có tác dụng khi nó làm giảm khối lượng của viên sỏi ban đầu trong khi mẫu chứng không làm giảm khối lượng sỏi hoặc giảm ít hơn đáng kể so với mẫu chứng

1.2.2.1 Mô hình gây sỏi tiết niệu thông qua gây tăng bài tiết oxalat niệu bằng hóa chất tạo sỏi

 Nguyên tắc

Gây tăng bài tiết oxalat niệu bằng cách cho chuột uống hoặc tiêm oxalat hoặc các chất tiền chuyển hóa của oxalat như natri oxalat [47], amoni oxalat [36], ethylen glycol [8], [10], [15], [19], glycolat, glyoxylat, hydroxy-L-prolin [34], [46], [48] Các tiền chất của oxalat khi vào cơ thể bị chuyển hóa tại gan tạo thành oxalat Oxalat bài tiết ra nước tiểu gây quá bão hòa oxalat và tạo ra các tinh thể calci oxalat niệu Trong các chất kể trên, ethylen glycol là chất được sử dụng phổ biến nhất trong các mô hình gây sỏi tiết niệu trên động vật [7], [11], [33], [48]

Các chất gây tăng bài tiết oxalat niệu được sử dụng đơn độc hoặc kết hợp với một chất khác để tăng hiệu quả của quá trình kết tập sỏi vào trong thận Các chất này có thể

là:

- Amoni clorid: làm tăng khả năng kết tập sỏi calci oxalat vào mô thận [8], [33]

- Vitamin D và calci gluconat: làm tăng nồng độ calci trong nước tiểu, do đó thúc đẩy quá trình hình thành và lớn lên của các tinh thể calci oxalat [11], [24]

- Gentamicin: Có thể do kháng sinh này gây tổn thương biểu mô ống thận, do đó làm tăng khả năng gắn các tinh thể sỏi vào thận Ngoài ra, gentamicin cũng làm tăng bài tiết calci niệu [13], [24]

 Thiết kế thí nghiệm Chuột thực nghiệm được chia thành lô chứng và lô bệnh (gây sỏi) Lô chứng uống nước bình thường trong khi nước uống của lô bệnh được trộn thêm hóa chất gây sỏi ở nồng độ thích hợp Thời gian gây sỏi kéo dài từ 1 - 4 tuần tùy thuộc loại, nồng độ và cách đưa hóa chất gây sỏi vào cơ thể động vật thí nghiệm Trong thời gian thí nghiệm, định kì lấy mẫu nước tiểu chuột để xác định pH nước tiểu Phần cặn nước tiểu sau khi

li tâm được soi dưới kích hiển vi quang học để xác định số lượng và loại tinh thể calci oxalat Phần dịch thu được dùng để xác định các chỉ số hóa sinh nước tiểu Kết thúc thí nghiệm, thu tất cả thận để làm tiêu bản mô bệnh học nhằm đánh giá mức độ kết tập sỏi calci oxalat tại thận

 Áp dụng mô hình trong nghiên cứu thuốc phòng và điều trị sỏi tiết niệu

Mô hình trên đã được sử dụng một cách phổ biến trong nghiên cứu tác dụng phòng

và điều trị sỏi tiết niệu của các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu [19], [36], [41]

Trong mô hình nghiên cứu tác dụng phòng bệnh của thuốc, chuột được chia thành

lô chứng trắng, lô chứng bệnh và lô điều trị Cả lô chứng bệnh và lô điều trị đều được gây sỏi bằng cách cho chuột uống hóa chất gây sỏi, lô điều trị được uống thêm thuốc cần nghiên cứu So sánh lô điều trị và lô chứng bệnh để đánh giá hiệu quả của thuốc trong dự phòng sỏi tiết niệu Mô hình này đã được áp dụng để nghiên cứu tác dụng dự

phòng sỏi tiết niệu của dịch chiết các dược liệu Cynodon dactylon [19], Musa AAB [45], Hernaria hirsuta [20], Trigonella foenumgraecum [8]…

Trong mô hình nghiên cứu tác dụng hòa tan sỏi tiết niệu của thuốc, lô điều trị được

sử dụng hóa chất gây sỏi để gây sỏi tiết niệu trước, sau đó mới cho sử dụng thuốc cần

nghiên cứu trong thời gian thích hợp Mô hình này đã được áp dụng để nghiên cứu tác

dụng hòa tan sỏi tiết niệu của dịch chiết các dược liệu Cynodon dactylon [19],

 Thiết kế thí nghiệm

Chuột được chia thành lô chứng trắng, lô chứng bệnh và lô điều trị Lô chứng bệnh

và lô điều trị được cho ăn thức ăn hoàn toàn không có vitamin B6, lô chứng trắng được cho ăn với thức ăn tương tự nhưng bổ sung thêm 6mg/kg vitamin B6 vào thức ăn Lô điều trị được sử dụng thêm thuốc cần nghiên cứu Thí nghiệm gây sỏi được tiến hành trong vòng 12 tuần Tiến hành lấy mẫu nước tiểu và mẫu thận ở cuối thí nghiệm để xét nghiệm các chỉ số hóa sinh nước tiểu, đánh giá sự kết tập sỏi calci oxalat trong thận

mức độ bài tiết calci niệu cao qua nhiều thế hệ, David A.Bushinsky và cộng sự đã tạo được thế hệ chuột có mức độ bài tiết calci cao gấp 8 - 10 lần so với bình thường Nhóm chuột này được sử dụng để nghiên cứu sự hình thành sỏi tiết niệu có căn nguyên tăng bài tiết calci niệu [45]

 Thiết kế thí nghiệm

Để gây sỏi calci oxalat, nhóm chuột tăng bài tiết calci niệu được cho ăn thức ăn chứa thêm hydroxy L - prolin trong vòng 18 tuần Mẫu nước tiểu được thu gom 2 tuần một lần để làm các xét nghiệm hóa sinh Kết thúc thí nghiệm, thu thận để làm xét nghiệm mô bệnh học nhằm đánh giá sự kết tập sỏi calci oxalat tại thận

 Áp dụng của mô hình

Mô hình gây sỏi tiết niệu trên chuột tăng bài tiết calci do di truyền rất thích hợp để nghiên cứu bệnh lý tăng calci niệu, một rối loạn phổ biến ở những người mắc bệnh sỏi tiết niệu [17] Mô hình này đã được áp dụng để nghiên cứu tác dụng của một số thuốc điều trị bệnh sỏi tiết niệu như cinacalcet [14], thiosulfat [35]

1.2.2.4 Mô hình gây sỏi tiết niệu bằng cách cấy trực tiếp sỏi vào bàng quang của động vật thí nghiệm

 Nguyên tắc Tạo hạt sỏi calci oxalat rồi đưa vào bàng quang của chuột thông qua phẫu thuật để gây sỏi bàng quang [41]

 Tiến hành thí nghiệm

Tạo hạt sỏi calci oxalat in vitro bằng phản ứng kết tủa giữa dung dịch natri oxalat

và calci clorid ở nồng độ thích hợp Những tinh thể nhỏ được tách khỏi dung dịch và tạo quá trình kết tập bằng cách duy trì trạng thái ổn định ở 37oC trong vòng 2 tuần Hạt

sỏi calci oxalat được tạo ra có đường kính khoảng 4 mm Cấy hạt sỏi calci oxalat vào bàng quang của chuột thông qua phẫu thuật mở bàng quang

Tất cả chuột sau phẫu thuật cấy sỏi được chia thành lô chứng bệnh và lô được điều trị bằng thuốc đang nghiên cứu Sau thời gian thí nghiệm, lấy mẫu máu và mẫu nước tiểu để xét nghiệm các chỉ số hóa sinh, đồng thời sỏi được lấy ra từ bàng quang để phân tích kích thước, hình thái, thành phần cấu tạo So sánh lô điều trị với lô chứng bệnh để đánh giá tác dụng hòa tan sỏi tiết nệu của thuốc

 Áp dụng mô hình trong nghiên cứu thuốc điều trị sỏi tiết niệu

Mô hình gây sỏi tiết niệu bằng cách cấy sỏi trực tiệp vào bàng quang của chuột cống trắng được áp dụng để nghiên cứu tác dụng hòa tan sỏi tiết niệu của dịch chiết dược

liệu Phyllanthus niruri [41]

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Hóa chất

- Ethylen glycol ( C2H6O2), 1,111 - 1,115 g/ml, Xilong chemical

- Amoni clorid ( NH4Cl ), 99,5 - 100,5 %, Xilong chemical

- Natri citrat ( C6H5Na3O7 ), 99,9 - 100,1 %, Merck

- Các hóa chất khác: formol, HCl, NaOH, bộ kit định lượng Ca, Mg, P Hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

- Cân phân tích AY220 (Shimadzu)

- Cân kĩ thuật TE 412 (Satorius)

- Tủ sấy dụng cụ UM (Memmert)

- Máy đo PH Euteck instrument pH 510

- Máy sinh hóa TC 84 plus (Teco diagnostics)

- Máy li tâm PLC - 012E

- Kính hiển vi truyền hình (Laica)

- Thiết bị nghiền đồng thể mô (IKA)

- Dụng cụ hứng nước tiểu và các dụng cụ thí nghiệm sử dụng trong lấy mẫu và xét nghiệm

2.1.3 Động vật thí nghiệm

Chuột cống trắng thuộc cả hai giống, cân nặng 150 ± 20g do Học viện quân y cung cấp Chuột được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm Bộ môn Dược lực, duy trì nhịp sinh học 12 giờ sáng - tối, chế độ ăn, uống nước tự do với thức ăn tiêu chuẩn dành cho chuột được cung cấp từ Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương Trước khi tiến hành nghiên cứu, tất cả chuột được nuôi thích nghi trong điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 7 ngày

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Thực hiện nghiên cứu thăm dò nhằm lựa chọn nồng độ của ethylen glycol, amoni clorid và thời gian gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng

- Triên khai mô hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol và amoni clorid với nồng

độ và thời gian đã chọn

2.3 Phương pháp gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng

Tiến hành gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng bằng mô hình ethylen glycol được mô tả bởi Jie Fan 1999 [33] với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm và mục đích nghiên cứu

Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng ethylen glycol - một chất tiền chuyển hóa của oxalat - để gây tăng bài tiết oxalat niệu, từ đó hình thành sỏi calci oxalat tại thận Trong mô hình này, ethylen glycol có thể được dùng kết hợp với amoni clorid để làm tăng khả năng kết tập sỏi calci oxalat vào mô thận

2.3.1 Khảo sát nồng độ ethylen glycol, amoni clorid để gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng

2.3.1.1 Thiết kế thí nghiệm

Chuột cống trắng được chia thành 5 lô sao cho có sự đồng đều giữa các lô về tỉ lệ đực - cái và khối lượng cơ thể

- Lô 1: sử dụng làm lô chứng, chế độ ăn và nước uống bình thường

- Lô 2: nước uống hàng ngày được bổ sung ethylen glycol đến nồng độ 1%

- Lô 3: nước uống hàng ngày được bổ sung ehylen glycol và amoni clorid đến nồng

độ tương ứng là 1% và 0,5%

- Lô 4: nước uống hàng ngày được bổ sung ehylen glycol và amoni clorid đến nồng

độ 1% đối với cả hai chất

- Lô 5: nước uống hàng ngày được bổ sung ehylen glycol và amoni clorid đến nồng

độ tương ứng là 1% và 2%

Thời gian gây sỏi dự kiến 28 ngày

Quy trình thực nghiệm được mô tả ở hình 2.1

- Thu nước tiểu xác định tinh thể niệu

- Lấy thận làm mô bệnh học

Giai đoạn thích nghi

Uống hóa chất gây sỏi hàng ngày

Thu nước tiểu xác định tinh thể niệu Chia lô ngẫu nhiên

-1 0 1 2 3 4

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thực nghiệm thăm dò liều của hóa chất và thời gian

gây sỏi

2.3.1.2 Các thông số đánh giá

 Khối lượng cơ thể chuột Tất cả chuột được cân vào ngày trước khi tiến hành thí nghiệm và hàng tuần trong suốt quá trình thí nghiệm để theo dõi ảnh hưởng của hóa chất gây sỏi lên khối lượng cơ thể (KLCT) của chuột Mức độ tăng KLCT được tính theo công thức:

Độ tăng KLCT (%) = (m2 - m1) x 100/m1 Trong đó, m1 là KLCT trước khi tiến hành thí nghiệm, m2 là KLCT tại thời điểm xác định trong quá trình thí nghiệm

Thể trạng của chuột cũng được theo dõi chặt chẽ

 Số lượng và thành phần tinh thể calci oxalat trong nước tiểu

Tuần

Mẫu nước tiểu được gom vào ngày trước khi tiến hành thí nghiệm và các ngày thứ

7, 14, 21, 28 trong quá trình thí nghiệm Chuột được nhốt riêng vào các lồng hứng nước tiểu để gom mẫu nước tiểu trong vòng 5 giờ Trong thời gian gom mẫu, cho chuột uống nước (loại nước uống đã được quy định cho từng lô) bằng kim đầu tù với lượng 1ml/giờ, không cung cấp thức ăn trong quá trình lấy mẫu để tránh nhiễm tạp vào mẫu Mẫu nước tiểu thu được được đem li tâm, hút bỏ phần dịch bên trên với lượng chính xác là 95% tổng thể tích đem li tâm Phần cặn còn lại được đưa vào buồng đếm Neubauer và quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại x 400 Quan sát trên

3 vi trường để xác định số lượng tinh thể calci oxalat trong mẫu nước tiểu, bao gồm COD và COM

Số lượng tinh thể COD, COM được đánh giá theo thang điểm như sau:

- Không có tinh thể nào: 0

- Từ 1 - 3 tinh thể/vi trường : 1

- Từ 4 - 6 tinh thể/vi trường : 2

- Trên 6 tinh thể/vi trường : 3

Số lượng tinh thể calci oxalat niệu bằng tổng số lượng của COD và COM

 Khối lượng thận và tiêu bản mô bệnh học thận

Kết thúc thí nghiệm, giết chuột bằng ether mê và giải phẫu lấy cả hai thận Cân khối lượng từng thận, sau đó thận phải được bảo quản trong dung dịch formol 10% để làm xét nghiệm mô bệnh học

Quá trình làm tiêu bản mô thận được thực hiện tại Bộ môn Gải phẫu bệnh - Trường đại học Y Hà Nội Quy trình làm tiêu bản mô thận được mô tả tóm tắt như sau:

cố định thận bằng parafin, cắt lát 5 µm, sau đó nhuộn màu bằng hematoxylin và eosin Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại x 100 và x 400 để đánh

giá số lượng các tinh thể kết tập Mức độ kết tập sỏi calci oxalat tại thận được đánh giá theo thang điểm như sau:

- Không thấy tinh thể kết tập : 0

- Có một số tinh thể nhỏ nằm rải rác: 1

- Tinh thể kết tập thành nhiều đám nhỏ: 2

- Tinh thể kết tập thành nhiều đám lớn : 3 Nồng độ của hóa chất gây sỏi được lựa chọn là nồng độ tại đó, tỉ lệ chuột bị sỏi thận cao và ít ảnh hưởng đến thể trạng chuột Thời gian gây sỏi căn cứ vào thể trạng của chuột và sự thay đổi bài tiết tinh thể calci oxalat trong nước tiểu

2.3.2 Triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng bằng ethylen glycol, amoni clorid với nồng độ và thời gian đã chọn

2.3.2.1 Thiết kế thí nghiệm

Chuột cống trắng được chia thành 3 lô:

- Lô chứng trắng: uống nước bình thường, giờ uống thuốc hàng ngày được cho uống

nước cất với lượng 1ml/100g chuột

- Lô chứng bệnh: uống nước bổ sung ethylen glycol và amoni clorid với liều đã chọn,

giờ uống thuốc hàng ngày được cho uống nước cất với lượng 1ml/100g chuột

- Lô citrat: cho uống nước bổ sung ethylen glycol và amoni clorid với liều đã chọn,

hàng ngày được uống natri citrat 25% với lượng 1ml/100g cân nặng

Thời gian của thí nghiệm gây sỏi là 28 ngày

Quá trình thực nghiệm được mô tả ở hình 2.2

Uống hóa chất gây Giai đoạn

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu

2.3.2.1 Các thông số đánh giá

 Khối lượng cơ thể chuột

Tiến hành như mô tả ở mục 2.3.1

 Thể tích, pH và các chỉ số hóa sinh nước tiểu

Thu mẫu nước tiểu như mô tả ở mục 2.3.1 Mẫu nước tiểu thu được đem đo thể

tích, pH Sau đó đem li tâm lấy phần dịch để xét nghiệm các chỉ số hóa sinh bao gồm

Ca, Mg, P Các xét nghiệm này được thực hiện tại khoa Sinh hóa, Bệnh viện Bạch Mai

 Số lượng và thành phần tinh thể calci oxalat trong nước tiểu

Tiến hành như mô tả ở mục 2.3.1

 Khối lượng thận và tiêu bản mô bệnh học thận

Tiến hành như mô tả ở mục 2.3.1

 Các chỉ số hóa sinh của dịch nghiền đồng thể thận

- 1 0 1 2 3 4

tuần

Thận trái thu được ở cuối thí nghiệm được nghiền đồng thể và phân tán trong dung dịch HCl 1M ( 10 ml HCL 1M / 1g thận), để qua đêm Sau khi li tâm, phần dịch được trung hòa bằng NaOH 1M và tiến hành định lượng nồng độ Ca, P Các xét nghiệm này được thực hiện tại khoa Sinh hóa, Bệnh viện Bạch Mai

2.4 Xử lí số liệu

Số liệu được lưu trữ bằng phần mềm Excel 2007

Kết quả được biểu diễn dưới dạng mean ± SE (giá trị trung bình ± sai số chuẩn) Với số liệu có phân phối chuẩn, sử dụng kiểm định ANOVA với phân tích hậu kiểm Dunnette để so sánh sự khác biệt về giá trị trung bình giữa các lô hoặc sử dụng t - test

để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình giữa hai lô Với số liệu không có phân phối chuẩn, sử dụng kiểm định phi tham số (kiểm định Mann-Whitney) Các số liệu thống

kê được xử lí bằng phần mềm SPSS 16.0 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

3.1 Kết quả thực nghiệm khảo sát nồng độ của hóa chất và thời gian gây sỏi

3.1.1 Thể trạng của chuột thí nghệm khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng độ khác nhau

Sau 4 - 5 ngày, ở nhóm sử dụng ethylen glycol (EG) 1% kết hợp với amoni clorid (AC) 1% hoặc 2%, chuột bắt đầu gầy yếu, giảm hoạt động, giảm ăn và uống nước Sau

đó, nhiều chuột bắt đầu có biểu hiện xuất huyết ở các chi và niêm mạc mắt, mũi Với nồng độ AC ≥ 1%, tất cả chuột đều bị chết rải rác trong khoảng thời gian từ 1 tuần đến

2 tuần sau khi tiến hành thí nghiệm Do đó, các thông số nghiên cứu thu được ở nhóm này không đầy đủ hoặc không đồng nhất về mặt thời gian Đặc biệt, nhóm sử dụng EG 1% kết hợp với AC 2% gần như không thể thu được mẫu nước tiểu 5 giờ

Với nhóm chuột sử dụng EG đơn độc hoặc kết hợp với AC 0,5%, không nhận thấy

sự khác biệt về thể trạng so với nhóm chứng Chuột thuộc nhóm này vẫn ăn, uống, vận động bình thường cũng như không ghi nhận các biểu hiện bất thường khác

3.1.2 Khối lượng cơ thể chuột thí nghiệm khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng

độ khác nhau

Để theo dõi ảnh hưởng của hóa chất gây sỏi đến thể trạng của chuột, KLCT chuột được xác định hàng tuần kết hợp với theo dõi thường xuyên việc ăn, uống và các biểu hiện bất thường của chuột Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, các cá thể thuộc nhóm EG 1% + AC 1% và nhóm EG 1% + AC 2% bắt đầu chết từ khoảng 1 đến 2 tuần sau khi sử dụng hóa chất gây sỏi Do đó, số liệu của hai nhóm này được xác định và so sánh vào ngày thứ 10 của thí nghiệm, kết quả được thể hiện ở bảng 3.1 Nhóm EG 1%

và EG 1% + AC 0,5%, khối lượng cơ thể chuột được xác định hàng tuần, kết quả thể