Sàng lọc các cây thuốc có tiềm năng điều trị bệnh gút thông qua ức chế xanthin oxidase in vitro

Với truyền thống lâu đời về y học cổ truyền, với những kinh nghiệm dân gian về sử dụng cây cỏ làm thuốc từ các dân tộc khác nhau trong nước, Việt Nam có một nguồn dược liệu phong phú và

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN NGỌC YẾN CHI

SÀNG LỌC CÁC CÂY THUỐC CÓ TIỀM NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH GÚT THÔNG QUA ỨC CHẾ XANTHIN

OXIDASE IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 T.S Nguyễn Thùy Dương

2 T.S Phương Thiện Thương Nơi thực hiện:

Bộ môn Dược lực

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khoá luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều của thầy cô, bạn bè và người thân

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thuỳ Dương

và TS Phương Thiện Thương, những người thầy đã luôn quan tâm, giúp đỡ,

hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình hoàn thành đề tài này

Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô và các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Dược lực đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng đào tạo, các bộ môn, phòng ban khác của trường đại học Dược Hà Nội

Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn luôn động viên, giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi hoàn thành khoá luận này

Hà Nội, tháng 5, năm 2013 Sinh viên

Trần Ngọc Yến Chi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Vài nét về bệnh gút & enzym xanthin oxidase 3

1.1.1 Khái niệm và cơ chế bệnh sinh bệnh gút 3

1.1.2 Mối liên quan giữa bệnh gút và enzym xanthin oxidase 4

1.1.3 Enzym xanthin oxidase 5

1.2 Một số thuốc và dược liệu có tác dụng ức chế XO 7

1.2.1 Các thuốc ức chế XO đang được lưu hành 7

1.2.2 Các nghiên cứu về phát triển dược liệu có tiềm năng ức chế XO 9

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 14

2.2 Phương tiện nghiên cứu 14

2.2.1 Hoá chất, thuốc thử 14

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 15

2.3 Nội dung nghiên cứu 15

2.4 Phương pháp nghiên cứu 16

2.4.1 Phương pháp thu thập mẫu và thông tin các cây thuốc đưa vào sàng lọc 16 2.4.2 Phương pháp chiết xuất dược liệu 16

2.4.3 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các mẫu thử lên hoạt độ XO 17

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 19

3.1 Kết quả 20

3.1.1 Kết quả thu thập dữ liệu về các dược liệu đưa vào sàng lọc 20

3.1.2 Kết quả sàng lọc tác dụng ức chế XO in vitro của các dƣợc liệu 44

3.1.3 Xác định IC50 của các dƣợc liệu tiềm năng ức chế XO 63

3.2 Bàn luận 63

3.2.1 Về thông tin của các cây thuốc đƣa vào nghiên cứu 63

3.2.2 Về kết quả sàng lọc tác dụng ức chế XO in vitro trên đĩa Costar 96 giếng .64

3.2.3 Về khả năng ức chế XO của cây thuốc tiềm năng 65

KẾT LUẬN 67

1 Kết luận 67

2 Đề xuất 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 1.1 Quá trình chuyển hoá purin trong cơ thể 4

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ lâu, các sản phẩm tự nhiên đã đóng vai trò quan trọng trong điều trị bệnh Trong hai thập kỉ qua đã có 30,2 % các loại thuốc mới được phê duyệt có nguồn gốc từ tự nhiên [72] Cùng với sự đổi mới trong các phương pháp điều trị bằng các sản phẩm tự nhiên, cây thuốc và các chế phẩm chiết xuất từ thực vật đã được quan tâm nhiều hơn bởi những ưu điểm so với hoá dược [114] Các thuốc theo y học hiện đại thường có tác dụng nhanh, hiệu quả tương đối tốt Tuy nhiên, khi dùng tân dược

để điều trị các bệnh mạn tính lại bộc lộ nhược điểm nhiều tác dụng không mong muốn và giá thành cao khi dùng lâu dài Gút là bệnh rối loạn chuyển hoá mạn tính Người bị bệnh gút phải đối mặt với việc sẽ phải sử dụng thuốc trong thời gian dài

và có thể gặp nhiều vấn đề mà các thuốc tân dược mang lại Do đó, nhiều nghiên cứu về thuốc có nguồn gốc từ dược liệu đã được đưa ra để khắc phục các nhược điểm nêu trên

Bệnh gút gắn liền với tăng acid uric máu và mục tiêu chính trong điều trị là làm giảm lượng acid uric trong máu Acid uric huyết thanh là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hoá purin qua trung gian là xanthin oxidase (XO), một loại enzym oxy hoá hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric Việc sử dụng các chất ức chế enzym XO để cản trở hình thành acid uric trong cơ thể là một mục tiêu mà các nghiên cứu đã và đang hướng tới Với truyền thống lâu đời về y học cổ truyền, với những kinh nghiệm dân gian về sử dụng cây cỏ làm thuốc từ các dân tộc khác nhau trong nước, Việt Nam có một nguồn dược liệu phong phú và còn chưa được khai thác nhiều Từ thực tế đó, để góp phần sàng lọc nhằm tìm kiếm các dược liệu có khả năng ức chế XO, bước đầu trong quá trình xác định dược liệu tiềm năng

điều trị gút, đề tài: “Sàng lọc các cây thuốc có tiềm năng điều trị bệnh gút thông

qua ức chế xanthin oxidase in vitro” được thực hiện với ba mục tiêu sau:

1 Thu thập được thông tin của một số cây thuốc Việt Nam có tiềm năng khai thác

2 Sàng lọc được các cây thuốc có tiềm năng điều trị gút thông qua con đường

ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng

3 Xác định IC50 của các cây thuốc có tiềm năng ức chế XO

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về bệnh gút & enzym xanthin oxidase

1.1.1 Khái niệm và cơ chế bệnh sinh bệnh gút

1.1.1.1 Khái niệm

Gút là bệnh rối loạn chuyển hoá các nhân purin, có đặc điểm chính là tăng acid uric máu Tình trạng viêm khớp trong bệnh gút là do sự lắng đọng các tinh thể monosolium urat trong dịch khớp hoặc mô [9]

và chuyển hypoxanthin thành inosinic acid

Hiện tượng giảm thải trừ acid uric ở thận với hầu hết các bệnh nhân gút 90%) đều không rõ nguyên nhân (tăng acid uric máu tự phát) Thông thường, nếu sản xuất acid uric cân bằng với thải trừ thì acid uric không bị tích lũy Tuy nhiên, ở bệnh nhân gút lượng thải trừ ít hơn nhiều so với lượng acid uric sinh ra dẫn đến tăng lượng tinh thể natri urat hòa tan trong máu [36]

(80-Khi nồng độ acid uric tăng cao sẽ gây lắng đọng các tinh thể urat tại mô tạo nên các hạt tophi Khi các hạt tophi tại sụn khớp bị vỡ sẽ khởi phát cơn gút cấp, sự lắng đọng vi tinh thể cạnh khớp, màng hoạt dịch, trong mô sụn và mô xương sẽ dẫn đến bệnh xương khớp mạn tính do gút Sự có mặt vi tinh thể urat tại mô mềm, bao gân tạo nên hạt tophi; viêm thận kẽ là do tinh thể urat lắng đọng tại tổ chức kẽ của thận; acid uric niệu tăng và sự toan hoá nước tiểu dẫn đến sỏi tiết niệu [9]

1.1.2 Mối liên quan giữa bệnh gút và enzym xanthin oxidase

Acid uric là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hoá các nucleoprotein

có chứa nhân purin trong cơ thể [1] Các purin được tạo ra chuyển hoá thành hypoxanthin và xanthin, dưới tác dụng của enzym XO, chúng được oxy hoá thành acid uric Quá trình chuyển hoá base purin trong cơ thể được miêu tả trong hình 1.1 [36]

Hình1.1 Chuyển hoá purin trong cơ thể

Guanylic acid

Nucleic acid

Bệnh gút có mối quan hệ chặt chẽ với nồng độ acid uric máu Khi nồng độ acid uric máu tăng cao sẽ làm tăng nguy cơ mắc bệnh Bên cạnh đó, enzym XO có vai trò chủ chốt trong quá trình điều hoà nồng độ acid uric máu Do vậy, ức chế enzym XO là một trong các cơ chế chính mà các thuốc điều trị gút đang hướng tới

1.1.3 Enzym xanthin oxidase

1.1.3.1 Vị trí, đặc điểm lý hoá và đặc điểm cấu trúc

- Vị trí phân bố

Enzym XO được tìm thấy ở nhiều loài động vật có vú, chim, côn trùng và vi khuẩn [11] Trong các mô động vật có vú, XO được phân bố rộng rãi ở gan, ruột, thận, phổi, tim, não, huyết tương, hồng cầu và các mô khác, trong đó ở gan và ruột hoạt động XO là lớn nhất [21] Ở người XO được tìm thấy trong hầu hết các tế bào của cơ thể, tuy nhiên nó có nhiều nhất trong các tế bào gan và các tế bào ruột [17]

- Đặc điểm lý hoá

XO có khối lượng phân tử là 275kDa Nó bị ức chế bởi các ion kim loại nặng, urê cũng như rất nhiều purin, pyrimidin và các hợp chất dị vòng khác như purin-6-aldehyd, 2-amino-4-hydroxypteridin-6-aldehyd… Enzym có pH tối ưu là 4,7 [11] EDTA, histidin được cho vào quá trình chiết xuất enzym để bảo vệ enzym trong suốt quá trình phản ứng [84]

- Đặc điểm cấu trúc:

XO là một protein có 2 tiểu đơn vị giống nhau Mỗi tiểu đơn vị gồm 4 trung tâm oxi hoá khử 1 Molybdopterin (85kDa), 1 FAD (40kDa) và 2 Fe2S2 (20kDa) Mo-co bao gồm 1 dẫn xuất pterin hữu cơ (molydopterin), có chứa 1 chuỗi dithiolen cùng 1 nguyên tử Mo [21], [95], [109]

Trình tự aminoacid rất tương đồng trong enzym của loài chuột và tương đồng khoảng 90% giữa loài chuột với con người [21]

1.1.3.2.Một số phương pháp xác định hoạt độ enzym

+ Phương pháp đo quang dựa trên lượng acid uric tạo thành từ quá trình oxy hóa xanthin dưới xúc tác của XO theo phản ứng :

Acid uric + O2 alantonin + H2O2 + CO2

H2O2 + ABTSred ABTSOX + 2 H2O

Từ lượng ABTSOX tạo thành đo quang ở bước sóng 410 nm xác định được hoạt độ XO

Đo huỳnh quang của isoxanthopterin được tạo thành: Hoạt động của XDH và

XO có thể được phân tích huỳnh quang bằng cách sử dụng quá trình oxy hoá pterin thành isoxanthopterin như biện pháp kích thích hoạt động enzym ở bước sóng 345nm và phát xạ tại 390nm Tỷ lệ oxy hoá pterin được xác định bởi sự vắng mặt

và hiện diện của chất nhận electron xanh methylen từ đó đánh giá hoạt động của XDH và XO tương ứng [21]

Xác định hoạt động enzym bằng cách định lượng H2O2 được tạo thành trong quá trình hydroxyl hoá xanthin bởi XO Flavin được khử phản ứng với O2 tạo thành

H2O2 [21]

Đo oxy tiêu thụ: Phản ứng xanthin/XO được nghiên cứu bằng cách đo thời gian liên tục của oxy sử dụng bằng 1 điện cực chọn lọc [21]

1.2 Một số thuốc và dược liệu có tác dụng ức chế XO

1.2.1 Các thuốc ức chế XO đang được lưu hành

Allopurinol và febuxostat là hai thuốc điển hình có tác dụng ức chế XO hiện đang được sử dụng trong điều trị

Thuốc ức chế XO, ngăn chặn sự tổng hợp urat từ hypoxanthin và xanthin do

đó làm giảm lượng acid uric trong máu

Khi không dùng allopurinol, purin thải trừ qua nước tiểu dưới dạng acid uric Khi dùng thuốc, purin trong nước tiểu sẽ tồn tại ở 3 dạng: acid uric, hypoxanthin và xanthin Mỗi chất có độ tan riêng nên kết quả là làm tăng lượng thải trừ purin qua nước tiểu, giảm nồng độ urat và acid uric ở huyết tương mà không làm đường niệu

bị tiếp xúc với một lượng acid uric quá lớn

Allopurinol làm giảm acid uric máu dưới độ tan giới hạn nên giúp hòa tan các hạt tophi và ngăn ngừa sự tiến triển của viêm khớp mạn do gút Ngoài ra, acid uric máu giảm cũng làm giảm sự hình thành sỏi, ngăn ngừa tiến triển bệnh về thận

Cơ chế:

Allopurinol làm hạ acid uric máu thông qua ức chế enzym XO Trong quá trình ức chế enzym, allopurinol được hydro hoá thành alloxanthin (oxypurinol), chúng phối hợp chặt chẽ với các trung tâm Mo đã bị khử tạo thành phức hợp không

hoạt động [82] Ở nồng độ thấp, allopurinol là cơ chất và là chất ức chế cạnh tranh,

ở nồng độ cao hơn, nó là chất ức chế không cạnh tranh [95]

Thuốc được dùng nhiều hơn các thuốc gây tăng thải acid uric máu do có thể dùng được trên hầu hết bệnh nhân, dùng một lần một ngày và tỷ lệ gặp tác dụng không mong muốn ít hơn [62]

Thuốc làm tăng bài xuất các tiền chất của acid uric qua nước tiểu nên ít gây sỏi thận và cơn đau quặn thận hơn [3]

Ngoài điều trị gút, allopurinol còn được sử dụng phối hợp điều trị các loại thiếu máu cục bộ, tổn thương mạch máu và suy tim mạn để cải thiện hoạt động bất thường của nội mô và làm giảm các dấu hiệu stress oxy hoá [65], [95]

1.3.1.2 Febuxostat

Febuxostat đã lần lươt được Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu - EMEA và Cục quản lý Thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ - FDA thông qua để điều trị dài hạn tăng acid uric mạn tính trên bệnh nhân gút [18], [23]

- Tác dụng và cơ chế tác dụng:

Febuxostat làm hạ acid uric máu bằng cách ức chế chọn lọc XO Febuxostat không có nhân purin Không giống như oxypurinol chỉ gắn chặt với dạng khử XO, febuxostat gắn với cả dạng khử và dạng oxy hoá của enzym Febuxostat gắn với kênh dài và hẹp dẫn đến molypden-pterin làm che khuất vị trí gắn của cơ chất, từ đó

ức chế hoạt động của enzym [47]

- Ưu điểm:

So với allopurinol, febuxostat ít gây dị ứng hơn, hiệu lực mạnh hơn khi lựa chọn cho bệnh nhân không uống được allopurinol hoặc các thuốc điều trị bệnh gút khác Thuốc hữu ích với 5-10% người đã có hiện tượng quá mẫn với allopurinol cũng như những người suy thận không thể dùng đủ liều allopurinol [107]

Febuxostat không có purin trong cấu trúc Tuy ức chế XO giống allopurinol nhưng febuxostat không ức chế các enzym khác trong con đường chuyển hoá purin

và pyrimidin [107], [47] Do đó, thuốc ít gây hiện tượng quá mẫn hơn allopurinol

Febuxostat chủ yếu chuyển hoá qua gan Vì vậy, thuốc có thể không cần phải điều chỉnh mức liều ở người suy thận như allopurinol [107]

Trong các nghiên cứu đã thực hiện, febuxostat an toàn hơn allopurinol Tuy nhiên, đây là thuốc mới, kinh nghiệm sử dụng chưa nhiều Vì vậy, các tương tác thuốc cũng như các tác dụng không mong muốn của thuốc cần phải tiếp tục được nghiên cứu [107]

1.2.2 Các nghiên cứu về phát triển dược liệu có tiềm năng ức chế XO

Allopurinol và febuxostat là 2 thuốc tân dược điển hình trong điều trị gút mạn Hiệu quả điều trị tốt là những ưu điểm nổi bật của hai thuốc trên Tuy nhiên, chúng có nhiều tác dụng không mong muốn đáng lo ngại Vì vậy, các dược liệu điều trị gút theo cơ chế ức chế XO vẫn đang được tiếp tục phát triển để khắc phục nhược điểm trên

1.2.2.1 Các hướng nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu sàng lọc in vitro là bước đầu để từ đó có thể nghiên cứu theo

định hướng tác dụng sinh học và đánh giá sâu hơn khẳng định tác dụng trên mô hình gây bệnh trên động vật thực nghiệm của các dược liệu có khả năng ức chế XO mạnh nhất

Trên thế giới, hướng nghiên cứu sàng lọc in vitro về dược liệu cũng như các

hoạt chất từ dược liệu để tìm kiếm nguồn thay thế với hiệu quả ức chế enzym XO tương tự hoặc vượt trội hơn đồng thời ít gây tác dụng phụ nghiêm trọng hơn

allopurinol được quan tâm phát triển Ngày càng có nhiều nghiên cứu được thực hiện ở khắp các nước trên thế giới như Australia, Việt Nam, Cộng hoà Séc, Paraguay, Panama, Philippin, Trung Quốc, Ấn Độ… và cho những kết quả khả quan [94], [114], [67], [121], [48], [20], [40], [90]

Liên quan đến tác dụng ức chế XO in vitro, 3 hướng tiếp cận chủ yếu của các

nghiên cứu được thực hiện bởi các nhóm nghiên cứu khác nhau trên thế giới về sàng lọc dược liệu và các chất/nhóm hợp chất phân lập từ dược liệu

- Tiếp cận sàng lọc dựa trên kinh nghiệm sử dụng dược liệu trong dân gian hoặc nền y học cổ truyền của một số nước

Hướng tiếp cận thứ nhất khá phổ biến và được thực hiện ở nhiều nước trên thế giới Hướng tiếp cận này tập trung sàng lọc các loài thuộc các họ khác nhau dựa trên kinh nghiệm dân gian hoặc nền y học cổ truyền ở các nước để từ đó tìm ra các cây thuốc có tiềm năng nhất Năm 1998, tác dụng ức chế XO đã được khảo sát trên

26 loài thuộc 18 họ theo truyền thống được sử dụng để điều trị bệnh gút và các triệu chứng liên quan của người dân bản địa của vùng đông bắc Bắc Mỹ Khoảng 88% các cây đã được tìm thấy có hoạt tính ức chế ở 100 g/ml, với 20% có sự ức chế lớn

hơn 50% Larix laricina có khả năng ức chế cao nhất là 86,33% [94]

Trong một nghiên cứu khác, 28 dịch chiết từ 17 loài thực vật bản địa ở

Australia được khảo sát, dịch chiết Stemodia grossa, Eremophila maculata có tác

dụng mạnh nhất với IC50 < 50 µg/ml [114]

Năm 2000, 122 cây thuốc dân gian ở Trung Quốc được lựa chọn dựa trên hiệu quả lâm sàng và tần số kê đơn để điều trị bệnh gút, tăng acid uric máu và các rối loạn liên quan khác để đánh giá tác dụng ức chế XO Kong và cộng sự đã phát hiện 69 dịch chiết methanol và 40 dịch chiết nước ức chế trên 50% hoạt độ XO ở nồng độ 100 µg/ml Khả năng ức chế lớn nhất là dịch chiết methanol của cành lá

Cinnamomum cassia (Lauraceae) (IC50 = 18 µg/ml), tiếp đến đó là hoa của cây

Chrysanthemum indicum (Asteraceae) (IC50 = 22 µg/ml) và lá Lycopus europaeus

(Lamiatae) (IC50 = 26 µg/ml Với các dịch chiết nước, thân rễ của Polygonum

cuspidatum (Polygonaceae) ức chế enzym XO mạnh nhất (IC50 = 38 µg/ml) Tuy

nhiên, trong nghiên cứu này, chúng vẫn yếu hơn nhiều so với allopurinol (IC50 = 1,06 µg/ml) [67]

Năm 2006, tác dụng ức chế XO được khảo sát trên 6 dược liệu với 18 dịch chiết nước, methanol và hỗn hợp nước-methanol thuộc các họ khác nhau của người dân bản địa ở Ấn Độ Trong 18 dịch chiết có 14 dịch chiết ức chế XO ở 100 µg/ml Trong đó có 10 dịch chiết ức chế lớn hơn 50% Sau đó, các dịch chiết methanol của

Coccinia grandis (IC50 = 29,79 µg/ml), Datura metel (IC50 = 76,75 µg/ml, Strychnos

nux-vomica (IC50 = 6,8 µg/ml) và Vitex negundo (IC50 = 78,5 µg/ml) được thử

nghiệm in vivo ở chuột [121]

Năm 2010, nghiên cứu in vitro khả năng ức chế XO của các cây được sử

dụng trong dân gian của Cộng hoà Séc và khu vực miền Trung, Đông Âu đã được tiến hành với 27 cây thuốc, gồm 84 dịch chiết ethanol và methylen clorid Trong đó

dịch chiết ethanol - methylen clorid của Populus nigra và Betula pendula ức chế

mạnh nhất với IC50 tương ứng là 8,3 và 25,9 µg/ml Tiếp đó là dịch chiết 80%

ethanol Caryophyllus aromaticus và Hypericum perforatum có IC50 dưới 50 µg/ml [48]

Năm 2011, Apaya và cộng sự đánh giá khả năng ức chế XO của dịch chiết từ

15 dược liệu được sử dụng với tác dụng chống viêm trong y học cổ truyền Philippin Kết quả cho thấy 5 dược liệu có tác dụng ức chế trên 50% ở nồng đồ 100 µg/ml, tuy nhiên tiềm lực yếu hơn nhiều so với allopurinol [20]

- Tiếp cận sàng lọc theo họ hoặc chi thực vật

Hướng nghiên cứu thứ 2 được một số tác giả lựa chọn để sàng lọc tác dụng

ức chế của các dược liệu thuộc một hoặc một số họ điển hình Hướng nghiên cứu này tập trung nghiên cứu sâu theo một họ, một số họ hoặc chi nhất định để xác định cây thuốc có tiềm năng nhất Trong dân gian, các họ này được sử dụng phổ biến với tác dụng giảm đau, chống viêm

Năm 1988, một nghiên cứu của Paraguay được tiến hành trên họ Sim

(Myrtaceae) trong đó Hexachlamys edulis là dược liệu ức chế XO mạnh nhất với

IC50 = 5,5 µg/ml [118] Tại Panama, 9 loài của họ Dây gối (Celastraceae) và họ Hoa

môi (Lamiaceace) đã được khảo sát và dịch chiết ethanol của Hyptis obtusiflora (Lamiaceae) và Hyptis lantanaefolia (Lamiaceae) có khả năng ức chế cao nhất,

khoảng 40% ở nồng độ 1 µg/ml [44] Các dược liệu của Brazil trong chi

Lychnophoras họ Cúc (Asteraceae) được sử dụng như thuốc giảm đau chống viêm

trong dân gian đã được nghiên cứu Trong số đó, Lychnophora trichocarpha,

Lychnophora ericoides, Lychnophoriopsis candelabrumvà Lychnophora staavioides

là 4 dược liệu có khả năng ức chế mạnh nhất [40]

- Tiếp cận sàng lọc theo nhóm hợp chất phân lập từ dược liệu

Hướng tiếp cận thứ 3 đi sâu vào hợp chất trong các nhóm hợp chất tự nhiên

đã được phân lập để từ đó tìm ra chất có tác dụng ức chế mạnh nhất Flavonoid, polyphenol, coumarin là những chất được đánh giá kĩ lưỡng [75], [31], [26] Điển hình nhất là các flavonoid với rất nhiều nghiên cứu Trong tổng số 2092 flavonoid

từ cơ sở dữ liệu, Lim và các cộng sự đã lựa chọn được 2 flavonoid là myricetin và luteolin có tác dụng ức chế XO tốt với IC50 tương ứng là 62,7 và 3,39 µg/ml [72] Bên cạnh đó, nghiên cứu về mối liên quan cấu trúc-tác dụng sinh học của các hợp chất flavonoid như apigenin, quercetin, myricetin, isovitexin, genistein và naringenin cũng đã được thực hiện Kết quả cho thấy, apigenin là chất ức chế mạnh nhất, tương tác thuận lợi nhất với trung tâm hoạt động enzym Tiếp theo đó là quercetin, myricetin, genistein và isovitexin Naringenin không cho thấy sự ức chế với IC50 > 50 M [75]

1.2.2.2 Các nghiên cứu của các tác giả Việt Nam

Với nguồn tài nguyên dược liệu phong phú và những kinh nghiệm lâu đời sử dụng cây cỏ làm thuốc, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã thực hiện các nghiên cứu sàng lọc, bước đầu cho kết quả khả quan Năm 2004, Nguyễn Thị Thanh Mai

và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu theo định hướng sàng lọc dược liệu có tiềm năng ức chế XO từ nguồn dược liệu ở Việt Nam với 288 dịch chiết từ 96 cây thuốc được sử dụng trong y học cổ truyền Kết quả cho thấy ở nồng độ 100 g/ml, 46 dịch chiết có sự ức chế lớn hơn 50% hoạt tính enzym Ở 50 g/ml, 21 dịch chiết ức chế hơn 50% Ở 25 g/ml, 8 dịch chiết cho thấy ức chế hơn 50%, trong khi tại nồng độ

10 µg/ml, 2 dịch chiết có sự ức chế lớn hơn 50% Các dịch chiết methanol của

Artemisia vulgaris (Ngải cứu), Caesalpinia sappan (Tô mộc), Blumea balsamifera

(Đại bi), Chrysanthemum sinense (Cúc hoa) và dịch chiết methanol-nước của

Tetracera scandens (Dây chiều) có khả năng ức chế XO mạnh với IC50 < 20 g/ml

Dịch chiết methanol từ hoa Chrysanthemum sinense có khả năng ức chế mạnh nhất

với giá trị IC50 = 5,1 g/ml [86] Từ cơ sở sàng lọc đó, các cây đã được nghiên cứu

sâu hơn Từ ruột gỗ của cây Caesalpinia sappanphân lập được 17 hợp chất tự nhiên

trong đó có 9 hợp chất có tác dụng ức chế XO với IC50 dao động từ 3,9 đến 93,2

M Hợp chất có tác dụng mạnh nhất là sappanchalcon với IC50 = 3,9 µM [87]

Nghiên cứu hoá thực vật từ cây Chrysanthemum sinense phân lập được một flavon

glycosid mới là acacetin 7-O-(3-O-acetyl-beta-D-glucopyranoside) và 27 hợp chất

đã biết khác bao gồm flavonoid, dẫn chất của acid caffeoyl quinic, monoterpenoid glycosid Các hợp chất này có hoạt tính ức chế XO mạnh hơn allopurinol (IC50

=2,5 M) với IC50 dao động từ 0,13-2,31 M [88] Trong số 8 hợp chất được phân

lập từ dịch chiết methanol của cây Blumea balsamifera có một dihydroflanovol mới

thể hiện khả năng ức chế mạnh nhất với IC50 = 0,23 0,01 M [89] Gần đây nhất,

từ dược liệu Tetracera scandens đã phân lập được một hợp chất nor-lupan triterpen

mới là 28-O- -D-glucopyranosyl ester của acid platonic với khả năng ức chế XO mạnh với IC50 = 1,9 µM [90]

Trong khuôn khổ đề tài này, hướng tiếp cận thứ nhất sẽ được ứng dụng để sàng lọc dược liệu có tiềm năng điều trị gút thông qua ức chế XO từ nguồn dược liệu thu thập từ dự án “Bảo tồn nguồn cây thuốc cổ truyền” của Viện Dược liệu Từ

đó, đề tài hi vọng tìm ra dược liệu có khả năng ức chế XO mạnh nhất và đưa vào nghiên cứu sâu hơn

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu

Dược liệu nghiên cứu gồm 202 cây thuốc được thu hái tại Việt Nam theo dự

án “Bảo tồn nguồn cây thuốc cổ truyền” của Viện Dược liệu [4]

2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Các mẫu dược liệu sau khi thu hái được rửa sạch, phơi hoặc sấy đế khô rồi

để trong túi polyethylen Bảo quản các mẫu trong điều kiện khô ráo, thoáng mát, tránh ánh sáng, mối mọt, mốc Không sử dụng hoá chất để bảo quản mẫu

Dược liệu được xay thô, được chiết xuất thành dạng cắn methanol toàn phần

Chuẩn bị mẫu thử cho thí nghiệm in vitro: cắn được hoà tan trong dimethyl

sulfoxid (DMSO), được pha loãng bằng đệm thành các nồng độ 100 g/ml, 50 g/ml, 10 g/ml thực hiện các phản ứng enzym

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Hoá chất, thuốc thử

Allopurinol (Sigma Aldrich)

Xanthin 99% (Sigma Aldrich)

Xanthin oxidase (9 đơn vị/mg protein, 8 mg protein/ml, Sigma Aldrich) Dimethyl sulfoxid (Merck)

Na2HPO4.2 H2O (Vel)

KH2PO4 (Vel)

HCl, NaOH (đạt tiêu chuẩn phân tích)

Các hóa chất và dung môi khác sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn dược dụng

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

Máy đo pH (EUTECH)

Máy ly tâm (HERMLE Z300)

Máy siêu âm (Power sonic 405)

Hệ thống máy ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể (Biotek, Hoa Kì) & máy

ủ lắc khay (Awareness, Hoa Kì)

Máy cất nước 2 lần (Halminton, Hoa Kì)

Thiết bị khuấy từ (Heidolph, Đức)

Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU)

96 đáy phẳng Costar 3596 (Corning, Hoa Kì)

Đầu côn, pipet, micropipet, microtube các loại

2.3 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài được thiết kế với các nội dung sau:

 Thực hiện mục tiêu 1: Thu thập được thông tin các cây thuốc đưa vào nghiên cứu

Xác định tên khoa học, bộ phận dùng

Tra cứu thông tin về tác dụng của dược liệu dựa trên các tài liệu tham khảo

 Thực hiện mục tiêu 2: Sàng lọc các dược liệu có khả năng ức chế XO

Chuẩn bị mẫu thử in vitro

Đánh giá khả năng ức chế của các mẫu thử ở 3 nồng độ 100 µg/ml, 50 µg/ml và 10 µg/ml

 Thực hiện mục tiêu 3: Xác định được IC50 của các cây thuốc có tiềm năng ức chế XO

Khảo sát khả năng ức chế của các mẫu thử tiềm năng ở các nồng độ khác nhau để xác định IC50

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu thập mẫu và thông tin các cây thuốc đưa vào sàng lọc

Thông tin về tên cây, bộ phận dùng, tên khoa học được xác định bởi nhóm thực hiện Dự án “Bảo tồn cây thuốc cổ truyền” Việc định danh tên khoa học của mẫu dược liệu do cử nhân Ngô Văn Trại, Viện Dược liệu và một số chuyên gia về thực vật xác định Mẫu tiêu bản hoặc mẫu cây được lưu giữ tại Viện Dược liệu Thông tin về tác dụng của các cây thuốc được thu thập từ các nguồn dữ liệu: sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của Đỗ Tất Lợi [10], sách Dược liệu học tập 2 của nhà xuất bản Y học [2] và các tạp chí khoa học từ nguồn cơ sở dữ liệu Pubmed, Science direct và Wiley

Một số dược liệu được sử dụng trong dân gian và y học cổ truyền chưa được nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như hoạt tính sinh học Trong công việc thực hiện Dự án Bảo tồn nguồn cây thuốc cổ truyền, nhóm thực hiện thu hái mẫu cây, làm tiêu bản, chụp ảnh, và đánh mã số dược liệu để xác định tên khoa học Các mẫu dược liệu thu hái có thể xác định ngay được tên khoa học, cũng có thể chưa xác định ngay được tên khoa học mà cần có thời gian để tra cứu, tham khảo tài liệu

và các chuyên gia về thực vật học Sau khi xác định được tên khoa học thì nhóm nghiên cứu sẽ xem xét có thể có biện pháp để bảo tồn hay phát triển cây thuốc Ở thời điểm hiện tại, đa số các cây thuốc có tên địa phương, tên khoa học, bộ phận dùng, tác dụng, nhưng cũng có những cây thuốc chưa có những thông tin này

2.4.2 Phương pháp chiết xuất dược liệu

Cân 100 g mẫu dược liệu đã sấy khô cho vào bình cầu 1 lít, thấm ẩm với MeOH rồi tiếp tục đổ MeOH ngập dược liệu khoảng 3 cm Chiết (2 lần) hồi lưu cách thuỷ trong 2 giờ, lọc qua giấy lọc lấy dịch chiết Cô dịch chiết được cắn MeOH toàn phần

Một số dược liệu có 2 mẫu thử là cắn methanol từ các bộ phận khác nhau của cùng một cây Nhóm nghiên cứu cũng thu hái một số mẫu dược liệu cùng một loài (cùng tên khoa học) nhưng được thu hái tại các địa phương khác nhau để khảo sát

sự khác nhau của các dược liệu theo vùng miền

2.4.3 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các mẫu thử lên hoạt độ XO

2.4.3.1 Nguyên tắc

XO xúc tác cho quá trình oxy hóa xanthin thành acid uric

Xanthin + O2 + H2O Uric acid + H2O2Hoạt độ XO tỷ lệ với lượng acid uric được định lượng bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 290nm

Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa 96 giếng

Bố trí trong một đĩa gồm có: mẫu chứng, mẫu đối chiếu (allopurinol) và mẫu thử

Bố trí hỗn hợp thử trong từng giếng được thể hiện ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm trong từng giếng

Tác dụng ức chế enzymXO đƣợc tính theo công thức [6], [104]

OD chứng = A CT -A C ; OD thử = A ST -A S Phần trăm ức chế XO = I% = [1 – OD thử / OD chứng] x 100

Trong đó: AC là độ hấp thụ của mẫu chứng

ACT là độ hấp thụ của mẫu trắng của chứng

AS là độ hấp thụ của mẫu thử

AST là độ hấp thụ của mẫu trắng của thử

2.4.3.4 Xác định IC 50 của các cây có tiềm năng ức chế XO

Tác dụng ức chế XO của các cây đƣợc lựa chọn đƣợc đánh giá theo trị số

IC50, là giá trị nồng độ (tính toán theo lý thuyết) tại đó mẫu thử ức chế 50% sự tạo thành acid uric trong hỗn hợp phản ứng so với mẫu chứng [5]

Với từng mẫu thử đƣợc lựa chọn, thiết lập dãy nồng độ khảo sát từ đó xác định IC50 và giới hạn khoảng tin cậy

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả

3.1.1 Kết quả thu thập dữ liệu về các dược liệu đưa vào sàng lọc

Thu hái được 202 mẫu cây tại Việt Nam theo dự án “Bảo tồn nguồn cây thuốc cổ truyền” của Viện Dược liệu

Thông tin về tên địa phương, tên khoa học, họ, bộ phận dùng và tác dụng dược lý được thể hiện trong bảng 3.1

Nhận xét:

202 mẫu cây thuộc 74 họ và 187 loài, trong đó:

- 27 mẫu cây chưa có thông tin về họ

- 81 mẫu cây chưa có thông tin về tác dụng

- 13 mẫu cây chưa có thông tin về bộ phận dùng

- 20 mẫu cây từ 10 loài thu hái ở các nơi khác nhau (phụ lục 3.1)

- 10 mẫu cây khác bộ phận dùng từ 5 loài (phụ lục 3.2)

- Một số mẫu chỉ có mã số, chưa có thông tin về tên cây, họ, bộ phận dùng và tác dụng

Bảng 3.1 Thông tin về các dƣợc liệu đƣợc sàng lọc

Các cây thuốc thu hái tại vườn quốc gia Bạch Mã, tỉnh Thừa Thiên Huế

STT Mã Tên phổ thông Tên khoa học Họ KH Bộ phận

dày [13]

11 CT29 Sắn thuyền Syzygium resinosum (Garnep.) Merr

kháng khuẩn [7]

16 CT35 Kinh giới rủ Elsholtzia penduliflora W.W Smith Lamiaceae trên mặt

17 CT01 Cấu trời, Can tri Phyllanthus chamaepeuce Ridl Euphorbiaceae toàn cây CCTT

[51]

STT Mã Tên phổ thông Tên khoa học Họ KH Bộ phận

25 CT15 Tầm phong Cardiospermum halicacabum L Sapindaceae toàn cây chống viêm,

oxh [52]

đất

sốt phát ban [10]

29 CT44 Câu đằng lá hình tim Uncaria cordata

đoạn thân

31 CT06 Liên đằng hoa nhỏ Illigera parviflora Dunn Hernandiaceae CCTT cây tắm Dao

đỏ [12]

STT Mã Tên phổ thông Tên khoa học Họ KH Bộ phận

[105]

35 CT08 Hà thủ ô trắng Streptocaulon juventas

độc tb ung thƣ [120]

hoa: lợi tiểu [10]

chống viêm [99]

STT Mã Tên phổ thông Tên khoa học Họ KH Bộ phận

thƣ [49]

45 CT48 An điền trứng Hedyotis ovata Thwaites ex Hook.f Rubiaceae cành, lá CCTT

viêm [30]

STT Mã Tên phổ thông Tên khoa học Họ KH Bộ phận

Các cây thuốc thu hái tại Sapa, tỉnh Lào Cai

50 CT49 Kim cang lá bắc to Smilax bracteata Presl Smilacaceae thân , rễ chống oxh

chống oxh [16]

[130]

STT Mã Tên phổ thông Tên khoa học Họ KH Bộ phận

Các cây thuốc thu hái tại Ba Vì, thành phố Hà Nội

STT Mã Tên phổ thông Tên khoa học Họ KH Bộ phận

mặt đất CCTT

69 CT57 Cà dại hoa trắng Solanum torvum Swartz Solanaceae thân, lá trị nứt nẻ[10]

70 CT61 Cơm cháy Sambucus javanica Reinw Ex Blume Caprifoliaceae cành mang

lá, hoa lợi tiểu [10]

lá

chống viêm [66]

mặt đất CCTT

74 CT65 Tử châu lông dị hình Callicarpa heterotricha Merr Verbenaceae cành, lá CCTT

75 CT62 Mại liễu Miliusa balansae Fin & Gagnep Annonaceae cành, lá độc tb ung

thƣ [55]

STT Mã Tên phổ thông Tên khoa học Họ KH Bộ phận

STT Mã Tên phổ thông Tên khoa học Họ KH Bộ phận

[117]

88 Số 4 Cơm cháy Sambucus javanica Reinw Caprifoliaceae cành, lá lợi tiểu [10]

93 CT87 Thần linh lá to Kibatalia macrophylla Woodson Apocynaceae thân, lá CCTT

94 Số 15 Dâm dương hoắc Epimedium macranthun Mooren et

chống viêm [133],[10]

STT Mã Tên phổ thông Tên khoa học Họ KH Bộ phận

96 Số 18 Ban tròn Hypericum patulum Ham Ex D.Don Hypericaceae cành mang

lá, hoa

độc tb ung thƣ [123]

[128]

STT Mã Tên phổ thông Tên khoa học Họ KH Bộ phận

rễ: kháng vi khuẩn lao [28]

thƣ [34]

108 CT66 Chòi mòi mờ Antidesma ambiguum Pax & Hoffm Euphorbiaceae cành non,

113 CT74 Chòi mòi Antidesma ghaesembilla Gaertn Euphorbiaceae cành non,

STT Mã Tên phổ thông Tên khoa học Họ KH Bộ phận

114 CT71 Xoan nhừ Choerospondias axillaris Burtt &

oxh [124]

116 BV52 Thiên niên kiện Homalomena occulta Lour schott Araceae thân rễ chống oxh