Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây gạo

Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây Gạo”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết mình

Ừ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác

định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây Gạo”, ngoài sự làm việc

nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu

người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS Nguyễn Thái An

– Bộ môn Dược liệu, NCS Hồ Thị Thanh Huyền, DS Phạm Lê Minh đã cho tôi

những đóng góp quý giá về đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất - trường Đại học Dược Hà Nội, các cán bộ Trung tâm Kiểm nghiệm dược phẩm và mỹ phẩm Hà Nội đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2013

Kiều Thị Bích Huệ

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ………

CHƯƠNG I TỔNG QUAN……….………

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY GẠO………

1.1.1 Đặc điểm thực vật……….…………

1.1.2 Tính vị và công năng của cây Gạo………

1.1.3 Bộ phận sử dụng………

1.1.4 Thành phần hóa học………

1.2 TỔNG QUAN VỀ LÁ CÂY GẠO………

1.2.1 Daucosterol………

1.2.2 Stigmasterol………

1.2.3 Mangiferin……… …

1.2.4 Lupeol………

1.2.5 Taraxeryl acetat………

1.2.6 Taraxerol……….……

1.2.7 7α-hydroxysitosterol……… …

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)………

1.3.1 Nguyên tắc của HPLC………

1.3.2 Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký………

1

2

2

2

2

3

3

4

4

5

6

7

8

9

10

10

10

11

1.4 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS)……… …

1.4.1 Nguyên tắc………

1.4.2 Máy khối phổ……….…

1.4.3 Ứng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các chất…….…

1.4.4 Một số kỹ thuật LC-MS………

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….…

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ………

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu………

2.1.2 Dụng cụ thiết bị………

2.1.3 Hóa chất, thuốc thử………

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU………

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… ……

2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử………

2.3.2 Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (chuẩn)……… ……

2.3.3 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký……… …

2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích………

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu………

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ……… ………

3.1 HÀM ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN………

3.1.1 Hàm ẩm của dược liệu………

3.1.2 Hiệu suất chiết………

3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ……… 3.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CỨU…

14

14

14

16

17

18

18

18

18

18

19

19

19

20

21

21

23

24

24

24

24

24

27

3.4 ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT TRÊN SẮC KÝ ĐỒ………

3.5 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG LÁ CÂY GẠO BẰNG HPLC………

3.5.1 Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký……… …

3.5.2 Độ lặp lại………

3.5.3 Khoảng nồng độ tuyến tính………

3.5.4 Độ đúng……… …

3.5.5 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ……… …

3.6 ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG LÁ CÂY GẠO……

3.7 BÀN LUẬN……… …

3.7.1 Về phương pháp xử lý mẫu………

3.7.2 Về khảo sát điều kiện sắc ký……….…

3.7.3 Về kết quả định lượng các chất trong lá cây Gạo………

3.7.4 Về thẩm định phương pháp định lượng………

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT………

KẾT LUẬN………

ĐỀ XUẤT……… TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

30

32

32

34

34

39

42

43

43

43

43

44

44

46

46

46

ESI: ion hóa bằng phun điện từ (Electronspray ionization)

GC-MS: Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas chromatography–mass spectrometry)

HO-1: Heme oxygenase – 1

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HUVEC: Tế bào thuộc màng trong ống dây rốn (Human umbilical vein

endothelial cell)

LC-MS: Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography – Mass

Spectrometry)

LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Qualification)

MeCN: Acetonitril

MeOH: Methanol

MS: Khối phổ (Mass Spectrometry)

NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

PDA: Detector PDA (Photodiode Array)

RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

S/N: Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)

SD: Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

SKĐ: Sắc ký đồ

STT: Số thứ tự

t R : Thời gian lưu

UV-VIS: Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet visible)

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ khối của máy khối phổ……… 15

Hình 1.2 Sơ đồ bộ tứ cực chập ba……… 16

Hình 3.1 SKĐ của hỗn hợp 7 chất nghiên cứu……… 26

Hình 3.2 SKĐ của dịch chiết toàn phần lá cây Gạo……… 26

Hình 3.3 SKĐ của hợp chất mangiferin phân lập được từ lá Gạo ……… 27

Hình 3.4 SKĐ của hợp chất daucosterol phân lập được từ lá Gạo……… 28

Hình 3.5 SKĐ của hợp chất 7α-hydroxysitosterol phân lập được từ lá Gạo… 28 Hình 3.6 SKĐ của hợp chất lupeol phân lập được từ lá Gạo……… 28

Hình 3.7 SKĐ của hợp chất taraxeryl acetat phân lập được từ lá Gạo…… … 29

Hình 3.8 SKĐ của hợp chất stigmasterol phân lập được từ lá Gạo………… 29

Hình 3.9 SKĐ của hợp chất taraxerol phân lập được từ lá Gạo……… 29

Hình 3.10 Phổ khối lượng ứng với pic của mangiferin trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu………

30 Hình 3.11 Phổ khối lượng ứng với pic của daucosterol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……… ……

30 Hình 3.12 Phổ khối lượng ứng với pic của 7α-hydroxysitosterol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……… ……

31 Hình 3.13 Phổ khối lượng ứng với pic của lupeol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……… ……

31 Hình 3.14 Phổ khối lượng ứng với pic của taraxeryl acetat trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu………

31

SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……… … 32 Hình 3.16 Phổ khối lượng ứng với pic của taraxerol trên

SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……… …

32Hình 3.17 SKĐ của mẫu trắng (dung môi pha mẫu)……….… 33

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Độ ẩm bột dược liệu……….… 24

Bảng 3.2 Một số thông số thể hiện sự phù hợp của hệ HPLC đã lựa chọn…… 33

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ lặp lại với các chất nghiên cứu…….………… 34

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của mangiferin…….… 34

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của daucosterol……… 35

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của 7α-hydroxysitosterol………

36 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của lupeol……… 36

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của taraxeryl acetat… 37 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của stigmasterol…… 38

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của taraxerol……… 38

Bảng 3.11 Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 7 hợp chất……… 39

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ đúng với mangiferin……… 39

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ đúng với daucosterol……… 40

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ đúng với 7α-hydroxysitosterol……… 40

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát độ đúng với lupeol……… 40

Bảng 3.16 Kết quả khảo sát độ đúng với taraxeryl acetat……… 41

Bảng 3.17 Kết quả khảo sát độ đúng với stigmasterol……… 41

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát độ đúng với taraxerol……… 41

Bảng 3.19 Kết quả khảo sát LOD và LOQ (µg/ml) ……… 42

Bảng 3.20 Kết quả xác định hàm lượng từng chất trong mẫu dược liệu nghiên cứu………

42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Gạo còn được gọi là Bông gạo, Mộc miên, Gòn…vốn là loài cây đã rất quen thuộc đối với mỗi người dân Việt Nam, đặc biệt là người dân miền Bắc Theo kinh nghiệm dân gian, nhiều bộ phận của cây như vỏ thân, hoa và nhựa được sử dụng để trị các bệnh như viêm loét dạ dày, viêm loét ngoài da, thấp khớp, bó gãy xương, kiết lỵ [6], [15], [20] Các nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu hóa thực vật cũng như thử tác dụng sinh học của lá Gạo và cho những kết quả rất đáng ngạc nhiên về tiềm năng chữa các bệnh “thời đại” như bảo vệ gan, hạ huyết

áp, hạ đường huyết [40], [44]…

Từ lá cây Gạo ở Việt Nam, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã nghiên cứu

về phương pháp chiết xuất và đã phân lập 07 hợp chất là 7-hydroxysitosterol, daucosterol, mangiferin, lupeol, stigmasterol, taraxerol và taraxeryl acetat

Ngày nay, trên thế giới xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo dược ngày càng tăng Ở Việt Nam, với lợi thế

về địa hình và khí hậu đã tạo ra nguồn tài nguyên cây cỏ vô cùng phong phú cũng như nguồn dược liệu dồi dào cùng với tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc từ lâu đời Tuy nhiên, nhiều loài cây được sử dụng rộng rãi theo kinh nghiệm dân gian mà chưa có hoặc có rất ít nghiên cứu có giá trị khoa học Cần có các nghiên cứu xác định hàm lượng các hợp chất đã tìm thấy trong dược liệu để đánh giá đúng tiềm năng của nguồn dược liệu và góp phần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu trong quá trình

hiện đại hóa các thuốc có nguồn gốc dược liệu Do đó, đề tài “Nghiên cứu xây

dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây Gạo” đã được thực hiện nhằm các mục đích sau:

1 Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất đã

được phân lập từ lá cây Gạo bằng phương pháp HPLC

2 Ứng dụng phương pháp xây dựng được để sơ bộ xác định hàm lượng 7 hydroxysitosterol, daucosterol, mangiferin, lupeol, stigmasterol,

-taraxerol và taraxeryl acetat có trong một mẫu lá cây Gạo thu hái được

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Bombax malabaricum DC., họ Gạo (Bombacaceae)

Tên đồng nghĩa: Bombax ceiba L., Gossampinus malabarica (DC.) Merr., Salmalia malabarica (DC.) Schott et Endl, Bombax heptaphylla Cavl

Tên khác: Gòn rừng, Mộc miên thụ, Mạy mìn, Mạy nghịu (Tày)

Cây gỗ to, cao tới 15m hay hơn Thân có gai hình chùy và có bạnh vè ở gốc Cành mọc ngang với những gai hình nón; cành non dày, không gai Lá mọc so le, kép chân vịt, gồm 5-7 lá chét, hình mác hoặc hình trứng, gốc thuôn, đầu nhọn, dài 9-15 cm, rộng 4-5 cm, hai mặt nhẵn, mép nguyên, cuống chung dài hơn phiến lá, dài từ 20-25cm

Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm, màu đỏ, nở trước khi cây ra lá từ tháng 1 tới tháng 3, cuống hoa ngắn, nhỏ, khỏe Hoa to, đều, lưỡng tính Đài dầy, hình chuông, có 5 răng tù và ngắn màu nâu xám, bao bọc lấy nụ hoa, khi hoa nở thì rách ra thành 3-5 mảng không đều Tràng 5 cánh nạc, rời nhau, mặt ngoài phủ lông nhung Nhị rất nhiều hợp thành 5 bó hoặc 6 bó (không thành ống), ngắn hơn cánh hoa, bó nằm trong 2 cuống cánh khác nhau Bầu thượng 5 ô, một vòi mang 5 đầu nhụy, bầu hình nón, có lông màu trắng nhạt Mùa hoa tháng 2 – 3, mùa quả tháng 5 – 7 [6], [7], [11], [15], [20]

1.1.2 Tính vị và công năng của cây Gạo

- Hoa Gạo có vị ngọt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, tiêu viêm, thu liễm [5]

- Vỏ thân cây Gạo có vị đắng, tính mát, có tác dụng lợi tiểu, tiêu sưng, gây nôn [18], khu phong, trừ thấp, tiêu thũng [5] Theo tài liệu Ấn Độ, nước sắc vỏ thân

có tác dụng làm dịu viêm, cầm máu [5]

- Rễ có vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích, bổ, cũng có tác dụng gây nôn và giảm đau [19], ngoài ra còn có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, thu liễm, chỉ huyết, tán kết, chỉ thống Ở Indonesia, nước ép rễ có tác dụng hạ sốt [5]

- Lá Gạo được dùng rất tốt cho đái dắt, phát ban, chữa thiếu máu, chữa lỵ [21], được sử dụng để điều trị thấp khớp, viêm da, nhiễm trùng da, phát ban, sưng hạch, kiết lỵ, tiểu tiện khó khăn, chữa rắn cắn và có tác dụng nhuận tràng Ngoài ra còn được dùng trong các trường hợp thiếu máu, rong kinh, huyết trắng, vô sinh [22],

[32] Theo y học cổ truyền phía Nam Pakistan, lá B.malabaricum DC được sử dụng

như là một thuốc trị giun sán [29]

- Hạt bông Gạo làm tăng tiết sữa ở phụ nữ sau khi sinh [19]

- Nhựa gôm chích từ thân cây Gạo được dùng chữa lậu, kiết lỵ, cầm máu, rong kinh, kích dục [5]

1.1.3 Bộ phận sử dụng

Toàn cây được sử dụng cho các mục đích khác nhau:

- Vỏ thân thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa xuân [19] nhưng cũng có tài liệu cho rằng tốt nhất vào mùa hè [6] Vỏ thân mang về cạo bỏ vỏ thô bên ngoài, rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô sắc uống hoặc dùng tươi giã nát để đắp ngoài [15]

- Lá non làm dịu và lợi sữa

- Rễ, hoa, nhựa cũng dùng làm thuốc chữa bệnh

Trong khóa luận dược sỹ của Trần Thị Điểm Anh, đã kiểm tra định tính các chất trong vỏ thân và kết quả cho thấy thành phần có courmarin, flavonoid, alkaloid, saponin [3] Mặt khác, một số nhà khoa học trên thế giới đã phân lập được các chất Lupeol, Shamimicin từ vỏ thân cây Gạo [25], [45]

Theo Võ Văn Chi, hạt Gạo chứa chất béo, tinh dầu [6]

Trong tài liệu “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, nhựa gôm cây Gạo

có chứa acid catechutanic [15]

Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập và xác định được cấu trúc các thành phần hóa học của cây Gạo là: Lupeol, Friedenin, Epicatechin, Sphingerin, Daucosterol, Stigmasterol, Mangiferin, Taraxeryl acetat, Taraxerol, 7α-hydroxysitosterol, Ergosterol peroxide, Aurantiamid acetat, Octadeca-9,12-dienoic 1.2 TỔNG QUAN VỀ LÁ CÂY GẠO

Năm 1999, Faizi S và Ali M đã phân lập được shamimin – một flavonol

C-glycoside mới có dạng bột màu vàng nhạt từ dịch chiết ethanol của lá B.malabarium

DC có cấu trúc glucopyranosylosy-4H-1-benzopyran-4-ori) [28]

2-(2,4,5-trihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-6-C-Năm 2011 và 2012, từ dịch chiết methanol của lá khô B.malabaricum DC.,

NCS Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được 7 chất là Daucosterol, Stigmasterol, Mangiferin, Lupeol, Taraxeryl acetat, Taraxerol, 7α-hydroxysitosterol

1.2.1 Daucosterol

1.2.1.1 Nguồn gốc

Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được Daucosterol

từ vỏ thân và lá cây gạo [12]

Theo [40], từ 492,2g dược liệu khô cây Arctotis arctotoides có thể phân lập

được 120mg Daucosterol

Theo [53], Daucosterol còn có trong rễ, thân, lá cây Plumbago zeylanica L

với hàm lượng trong lá lớn nhất (từ 49,6mg – 96,7mg/100g dược liệu tùy theo thời điểm thu hoạch)

Theo [26], từ 3kg hạt khô của cây Arctium lappa L phân lập được 30mg

Daucosterol

Ngoài ra, Daucosterol còn được phân lập từ cây mộc ký ngũ hùng

Dendrophtoe pentandra sống ký sinh trên cây mít Artocapus integrifolia và cây na

Annona squamosa [8], thân cây Thàn mát thuỳ dày (Millettia pachyloba – họ Leguminocae) [14]

1.2.1.3 Tác dụng và công dụng

- Theo [34], nghiên cứu in vitro trên chuột của Lee JH và cộng sự tại đại học Dongduk Women đã đưa ra kết quả Daucosterol giúp bảo vệ tế bào chuột bởi nấm men Candida Daucosterol có tác dụng điều hoà miễn dịch cơ thể, thông qua việc làm tăng hoạt tính của tế bào CD4 và Th1 tại chuột, qua đó làm giảm sinh

trưởng của tế bào nấm men Candida albicans

Theo [49], nghiên cứu đã phân lập được 65mg Stigmasterol từ 10g lá cây

Rubus suavissimus, họ Rosoideae

1.2.2.2 Tính chất

- Công thức phân tử: C29H48O (M = 412,69 g/mol)

- Tên khoa học: (24S)-24-ethylcholesta-5,22-dien-3β-ol

- Tính chất vật lý: Chất bột kết tinh màu trắng, t°nc = 170°C, tan trong các dung môi hữu cơ thông thường, rất dễ tan trong benzen, ethyl ether, ethanol, không tan trong nước, λmax = 257 nm, [α]D22 = −51°C (C = 2, cloroform) [24]

1.2.2.3 Tác dụng và công dụng

- Theo Richard E và cộng sự [43], Phytosterols có tác dụng làm giảm Lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-C), là một trong những chỉ số biểu thị mức độ cholesterol máu Một kết quả tương tự cũng được tìm thấy qua nghiên cứu [42] của Padmanabhan P Nair và cộng sự, Stigmasterol có tác dụng giảm sự hấp thu

Cholesterol vào máu, do đó làm giảm nguy cơ béo phì và nguy cơ ung thu ruột

- Stigmasterol còn được dùng làm nguyên liệu để tổng hợp progesterol [46] Progesterol là một hormon quan trọng trong cơ thể Progesterol có thể dùng một mình để tránh thai và điều trị nhiều loại bệnh, bao gồm xuất huyết tử cung bất thường, vô kinh, lạc nội mạc tử cung, ung thư vú, thận, ăn mất ngon và sụt cân do

AIDS Do đó, việc tổng hợp ra progesterol mang tính thực tiễn rất cao

1.2.3 Mangiferin

1.2.3.1 Nguồn gốc

Mangiferin có ở lá, vỏ thân và vỏ rễ cây xoài Mangiferin indica với hàm

lượng khác nhau tùy từng vùng và tùy từng giống xoài, khoảng 3% ở vỏ thân và khoảng 1,6% ở lá [15]

Năm 2011, Nguyễn Thị Thúy đã phân lập được Mangiferin từ lá cây gạo [18]

- Tính chất vật lý: Bột kết tinh mịn, màu vàng ánh lục, không mùi hay mùi

nhẹ [4]; hơi tan trong hỗn hợp aceton – nước (1 : 1), tan trong cồn metylic, cồn etylic, thực tế không tan trong nước lạnh, cloroform [9]; t°nc = 258 - 261°C; phổ tử ngoại của dung dịch chế phẩm 0,001% trong methanol, trong khoảng 220 – 400 nm phải có hấp thụ cực đại ở các bước sóng 241±2 nm, 258±2nm, 316±2 nm, 366±2

- Ngoài ra, những nghiên cứu mới đây còn cho thấy mangiferin có tác dụng

hạ đường huyết do làm tăng độ nhạy cảm của mô tế bào đích với insulin và ức chế thoái giáng tế bào glycogen ở gan [47]

1.2.4 Lupeol

1.2.4.1 Nguồn gốc

- Lupeol được tìm thấy trong các loại rau như bắp cải trắng, hạt tiêu, cà

chua; trong trái cây như ô liu, quả sung, xoài và trong cây thuốc như Bombax ceiba, Tamarindus indica, Sebastiania adenophora… với hàm lượng rất khác nhau: quả ô

liu chứa 3µg/g quả, lá lô hội chứa 2803µg/g lá khô… [39]

- Năm 2012, Phùng Thị Hồng đã phân lập được lupeol từ vỏ thân cây Gạo

với hàm lượng khoảng 20mg trong 700g vỏ thân khô [13]

1.2.4.2 Tính chất

- Công thức phân tử: C30H50O (M = 426,72 g/mol)

- Tên khoa học: 3β-hydroxylup-20(29)en

- Tính chất vật lý: Lupeol là tinh thể hình kim, màu trắng đục; tan tốt trong

dầu, đặc biệt là chuỗi monoglycerid, diglycerid và propylen glycol monocaprylat, tan 6,7 – 10mg/ml ethanol ở 22°C, λmax = 350 nm [37]

1.2.4.3 Tác dụng và công dụng

- Lupeol đã được nghiên cứu để chứng minh các tác dụng dược lý khác nhau trong cả điều kiện in vitro và in vivo Chúng bao gồm các tác dụng có lợi đối với tình trạng viêm, ung thư, viêm khớp, tiểu đường, bệnh tim mạch, độc tính trên thận và nhiễm độc gan… [36], [39]

- Năm 2003, Young-Jea You và cộng sự tiến hành sàng lọc một số dược liệu thu hái tại Việt Nam có tác dụng antiangiogenic cho thấy dịch chiết methanol của vỏ thân cây Gạo (cụ thể là lupeol) có tác dụng antiangiogenic trên dòng tế bào thuộc màng trong ống dây rốn (HUVEC) [38], [50]

- Tên khoa học: D-Friedoolean-14-en-3β-yl acetate

- Tính chất vật lý: t°nc = 303-305°C; [α]D = +10,5° (C = 1,8, cloroform) [54]

- Ngoài xuất hiện trong lá cây Gạo, Taraxerol còn được tìm thấy trong vỏ

cây Cupania dentata (họ Sapindaceae) với 52,2 mg khi tiến hành chiết và phân lập 982g dược liệu khô [30]

1.2.6.2 Tính chất

- Công thức phân tử: C30H50O (M = 426,72 g/mol)

- Tên khoa học: D-Friedoolean-14-en-3-ol

- Tính chất vật lý: tinh thể màu trắng, tan trong benzene, chloroform, ether;

ít tan trong rượu; t°nc = 279 - 280°C; [α]D = +2,9 (C = 0,490, cloroform) [30]

1.2.7.3 Tác dụng và công dụng

- Theo [27], các thành phần trong hạt giống cây đậu đũa Vigna sinensis nói

chung và 7α-hydroxysitosterol nói riêng đều được đánh giá là hiệu quả trên Heme

oxygenase – 1 (HO-1) – một enzym được xem như là có tác dụng ngăn cản sự ly giải heme thành carbon monoxid và sắt tự do, giúp tăng sự tác động của HO-1 trên

pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố trên Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi lại nhờ máy ghi

và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic của chất phân tích Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc đồ

Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc

ký khác nhau: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học Trong đó sắc ký lỏng phân bố được

sử dụng rộng rãi nhất hiện nay [1], [16]

1.3.2 Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký [1]

1.3.2.1 Thời gian lưu (t R )

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất phân tích đến detector Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc các yếu tố:

- Bản chất của pha tĩnh

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động

Thường chọn k’= 1-5

1.3.2.3 Số đĩa lý thuyết

Mỗi cột sắc ký có thể phân thành nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là đĩa lý thuyết Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa pha tĩnh và pha động Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc

ký

N: số đĩa lý thuyết H: chiều cao pic

tR: thời gian lưu W: chiều rộng của pic

1.3.2.4 Độ phân giải của cột

Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách định lượng hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc ký:

W1/2A: chiều rộng pic A ở phân nửa chiều cao của pic

W1/2B: chiều rộng pic B ở phân nửa chiều cao của pic

1.3.3.2 Định lượng

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng

độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó

Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký là:

- Phương pháp chuẩn ngoại

- Phương pháp chuẩn nội

- Phương pháp thêm chuẩn

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong khuôn khổ của khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại

Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc chuẩn hóa nhiều điểm:

 Chuẩn hóa một điểm

Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:

Cx =

Cx: Nồng độ mẫu thử

CS: Nồng độ mẫu chuẩn

Sx: Diện tích của pic chất phân tích trong mẫu thử

SS: Diện tích của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn

 Chuẩn hóa nhiều điểm

Cách tiến hành: Chuẩn bị 1 dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần

rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm nồng độ chuẩn Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định Có thể tính theo 2 cách:

- Áp dữ liệu diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ của nó

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích pic (hoặc chiều cao) với nồng độ của chất cần xác định

S = a + b.C S: Diện tích pic

a: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung b: Độ dốc của đường chuẩn

LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao

và phân tích khối phổ Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống có những ứng dụng rộng lớn trong phân tích

1.4.1 Nguyên tắc

Khối phổ (Mass Spectrometry – MS) là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng

và điện tích ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phần tử hoặc nguyên tử mẫu

Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử hoặc bằng Dalton (Da)

Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ

bộ phân tích khối trước khi đến detector Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được

thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau, tập hợp thành một khối phổ

đồ hoặc phổ khối, cung cấp thông tin để định tính, xác định cấu trúc và định lượng các chất

1.4.2 Máy khối phổ

1.4.2.1 Bộ nạp mẫu (Inlet)

Đưa mẫu vào máy Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn phải chuyên mẫu sang dạng hơi bằng cách thích hợp Có thể nạp mẫu trực tiếp hoặc nối với đầu ra của một thiết bị phân tích khác như sắc ký khí, sắc ký lỏng siêu giới hạn (SFC), điện di mao quản (CE)

Hình 1.1 Sơ đồ khối của máy khối phổ

1.4.2.2 Bộ nguồn ion (Ion source)

Ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi, khử dung môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối, cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển với bộ phận nằm trong chân không sâu Và rút ra ngoài các phân tử trung hòa, ion khác dấu có thể ảnh hưởng tới phép đo

Các kỹ thuật ion hóa đã được phát triển và sử dụng là: Va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng nguồn ion phun sương khử solvat, ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển, ion hóa bởi nguồn ion bằng giải hấp

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng kỹ thật ion hóa bằng phun điện từ - Electronspray ionization (ESI)

1.4.2.3 Bộ phân tích khối (Mass Analyzer)

Tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector Có thể phân bộ phận tích khối thành 4 loại:

- Bộ phân tích từ (Magnetic Analyser)

- Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole)

- Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser – TOF)

- Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron (Ion cyclotron resonance analyser – ICR)

Đề tài này chúng tôi sử dụng máy khổi phổ có bộ phân tích khối là bộ phân

tích tứ cực chập ba

Bộ tứ cực chập ba (Triple Quadrupole Analyser): Bộ phân tích khối gồm ba

bộ tứ cực nối tiếp nhau Bộ Q1 và Q3 làm nhiệm vụ phân tích khối, bộ Q2 làm nhiệm vụ va chạm ion để phân tách thành các mảnh khối nhỏ hơn, đó là ion con

Hình 1.2 Sơ đồ bộ tứ cực chập ba

Bộ phân tích tứ cực chập ba còn gọi là Tandem Mass Analyser Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này là khối phổ 2 lần (MS/MS) Kỹ thuật này thường được dùng để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần chưa được tinh chế sạch

1.4.2.4 Detector

Detector có nhiệm vụ chuyển các ion đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện

tử của máy khối phổ Hiện có 2 dạng truyền thống:

- Nhân eclectron (electron myltiplier)

- Nhân quang (photomultiplier)

1.4.2.5 Bộ xử lý dữ liệu (Data System)

Tín hiệu điện từ detector được khuyếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu

số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ khối, so sánh với thư viện phổ, định lượng…

1.4.3 Ứng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các chất

- Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử

M+, (M + 1)+, (M + 2)+ Đây là đặc trưng quan trọng của hợp chất hóa học Bên cạnh đó, xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối lượng của vài mảnh ion có thể xác định được công thức nguyên của chất phân tích

- Trong phân tích dược, thường sử dụng kết nối GC-MS hoặc LC-MS Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ nghiên cứu với chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu

1.4.4 Một số kỹ thuật LC-MS

- Kỹ thuật phân tích toàn thang (FULL SCAN)

Cho đầy đủ thông tin về các chất phân tích trong mẫu ion, tuy nhiên phương pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn

- Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, Selected Ion Monitoring)

Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời gian, kỹ thuật SIM nhạy hơn FULL SCAN từ 10 tới 100 lần tùy theo thiết bị

- Kỹ thuật MS/MS

Trong kỹ thật MS/MS một ion chọn lọc ở chế độ MS lần 1 được phân tích bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy, tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế

độ phân tích MS lần 2 Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng

độ nhạy do làm giảm nhiễu đường nền rất đáng kể

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật MS/MS để định tính 7 hợp chất có trong lá cây Gạo

CHƯƠNG II

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là lá của cây Gạo (được làm khô tự nhiên) thu hái tại Hương Sơn (Mỹ Đức, Hà Nội) và đã được TS Trần Huy Thái (Viện Sinh thái và Tài

nguyên sinh học) giám định tên khoa học là: Bombax malabaricum DC., họ Gạo

(Bombacaceae)

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị

- Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS 8030 có kết nối thêm

detector SPD-20A (có khả năng phân tích UV-VIS trong vùng 190-700nm) của Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ phẩm Hà Nội

- Cột sắc ký Zorbax C18 (250mm x 4,6 mm; 5μm) kết hợp bảo vệ cột

Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15×30mm ID)

- Cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác 0,01mg

- Máy đo hàm ẩm Precisa XM 60, max 124g, d=0,001g

- Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 µm

- Bộ sinh hàn hồi lưu và bình cầu

- Máy li tâm Hettich của Đức

- Nồi đun cách thủy

- Pipet tự động 1000µl, 100 µl và 10 µl

- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong, ống ly tâm,

phễu lọc, màng lọc …

2.1.3 Hóa chất và thuốc thử

- Hóa chất tinh khiết phân tích: acid formic

- Dung môi loại dùng cho HPLC: methanol, acetonitril

- Các hợp chất đã phân lập được từ lá cây Gạo là mangiferin, lupeol,

taraxerol, taraxeryl acetat, stigmasterol, 7-hydroxysitosterol và daucosterol đã được tinh chế và nhận dạng cấu trúc bằng các phương pháp phổ MS và NMR

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Đánh giá tổng tạp có trong các mẫu hợp chất phân lập và tinh chế được

bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích

- Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn các hợp

chất trong hỗn hợp 7 hợp chất nghiên cứu với nhau và với các hợp chất khác trong cao lỏng lá cây Gạo

- Định tính các pic trên SKĐ dựa vào thời gian lưu và kết hợp với MS kết

nối

- Thẩm định các điều kiện định lượng một số hợp chất trên với chất đối

chiếu là các chất phân lập được đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích

- Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lượng 7 hợp chất trên có trong mẫu lá cây

Gạo đã thu hái được

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử

Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp xử lý mẫu khác nhau, chúng tôi xử lý mẫu theo phương pháp ngâm lạnh

 Xác định độ ẩm của bột dược liệu:

Lá sau khi sấy khô, nghiền thành bột khô Lấy khoảng 2g bột mẫu nghiên cứu để xác định độ ẩm của dược liệu Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 110oC, rắc bột dược liệu lên đĩa cân và trải đều lên mặt đĩa, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình, đọc kết quả Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình

 Chiết xuất:

Cân khoảng 500g dược liệu lá cây (đã xác định độ ẩm trước) được làm nhỏ, ngâm lạnh 3 lần với methanol trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ Thu dịch chiết, lọc, gộp dịch lọc cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu và cân cắn toàn phần thu

được Cắn được bảo quản ở 4°C

 Tính hiệu suất chiết:

Hàm lượng % của cắn toàn phần so với khối lượng bột dược liệu được tính theo công thức sau:

X: Hàm lượng (%) M: Khối lượng dược liệu đem chiết (g) x: Độ ẩm dược liệu (%)

a: Khối lượng cắn toàn phần thu được (g)

 Pha dung dịch thử:

Lấy chính xác khoảng 0,5g cắn toàn phần, hòa tan hoàn toàn trong methanol định mức thành 25ml dung dịch, lọc qua bông thủy tinh, rồi qua màng lọc 0,45µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống HPLC

2.3.2 Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (chuẩn)

2.3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu phân lập được

- Chất nghiên cứu được cân chính xác và hòa tan thành các dung dịch trong

methanol và tiêm vào hệ thống sắc ký

- Độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu được đánh giá qua tổng tạp có

trong chúng sau khi phân lập và tinh chế để xác định cấu trúc Tổng tạp của các hợp chất được đánh giá theo phương pháp chuẩn hóa diện tích

2.3.2.2 Pha các dung dịch đối chiếu gốc

Vì các chất khảo sát đều tan tốt trong methanol nên tôi quyết định chọn methanol làm dung môi để pha dung dịch chuẩn

Cân chính xác một lượng từng chất nghiên cứu đã phân lập và tinh chế được, cho vào bình định mức 25ml, thêm vừa đủ methanol, lắc đều cho tan hoàn toàn Dung dịch này dùng để kiểm tra tổng tạp và được pha loãng thích hợp để xây dựng dãy dung dịch chuẩn

2.3.3 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký

Sử dụng cột hiện có là Cột Zorbax C18 (250mm × 4,6 mm; 5 µm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30mm ID)

A: acid formic 0,1% trong acetonitrile

B: acid formic 0,1% trong methanol

- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

2.3.4.1 Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký

Đánh giá độ phù hợp của hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bao gồm các yếu tố như: máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích, mẫu thử …