Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm tt

Liệu pháp sử dụng virus ly giải tế bào u để điều trị ung thư là một phương thức biến sự sao chép của virus thành vũ khí tiêu diệt các tế bào ung thư và hầu như không ảnh hưởng đến các t

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

HỌC VIỆN QUÂN Y

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Nguyễn Lĩnh Toàn

2 PGS.TS Hồ Anh Sơn

Phản biện 1: PGS TS Vũ Văn Khiên

Phản biện 2: PGS TS Nguyễn Văn Ba

Phản biện 3: PGS TS Nguyễn Thanh Thúy

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại Học viện Quân y

Vào hồi: giờ ngày tháng năm 2019

Có thể tìm hiểu luận án tại:

1 Thư viện Quốc Gia

2 Thư viện Học viện Quân y

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer-CRC) là quá trình bệnh lý phát sinh từ đại trực tràng, gây nên bởi sự tăng bất thường các tế bào có khả năng xâm lấn hay lan rộng vào các bộ phận khác của cơ thể Là quá trình bệnh lý phát triển qua nhiều giai đoạn, hậu quả từ sự tích lũy tăng dần của đột biến gen, đột biến ngoài gen và bất thường trong con đường tín hiệu nội bào Wnt Số bệnh nhân bị CRC và số ca tử vong do CRC vẫn tăng theo thời gian Liệu pháp sử

dụng virus ly giải tế bào u để điều trị ung thư là một phương thức

biến sự sao chép của virus thành vũ khí tiêu diệt các tế bào ung thư

và hầu như không ảnh hưởng đến các tế bào lành Các chủng virus vaccin sởi (MeV) và quai bị (MuV) đã được chứng minh là có hiệu quả điều trị ung thư người Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đánh giá hiệu quả kháng ung thư đại tràng người của phối hợp MeV và MuV

Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm” với các mục tiêu sau:

Mục tiêu:

1 Đánh giá khả năng gây độc tế bào và chết tế bào theo chương trình của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên dòng tế bào ung

thư đại tràng người HT-29 in vitro

2 Đánh giá hiệu quả kháng u của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29

Tính cấp thiết:

Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của phối hợp

virus vaccine sởi (MeV) và quai bị (MuV) cả in vitro cũng như trên

mô hình cấy ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch, làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo đánh giá tính an toàn, cơ chế tác dụng của phối hợp MeV và MuV kháng ung thư, tiến tới các thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau sử dụng phối hợp 2 virus vaccine này điều trị bệnh nhân ung thư

Đóng góp mới của luận án:

Hoàn thiện quy trình nuôi cấy tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 in vitro và ghép u trên đùi chuột nude

Đánh giá tác dụng kháng ung thư đại tràng người dòng tế bào

HT-29 của phối hợp MeV và MuV cả in vitro cũng như trên mô hình cấy

ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch Từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo tiến tới các thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư

Bố cục luận án:

Luận án có 140 trang, bao gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Chương 1: Tổng quan (36 trang), Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (28 trang), Chương 3: Kết quả (32 trang), Chương 4: Bàn luận (37 trang), Kết luận (2 trang), Kiến nghị (1 trang)

Luận án có 142 tài liệu tham khảo (tiếng Anh: 142)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Ung thư đại trực tràng

1.1 Tình hình ung thư đại trực tràng

Trên thế giới, nó là loại ung thư phổ biến thứ ba ở nam giới và

phổ biến thứ hai ở nữ giới, là nguyên nhân đứng thứ ba gây tử vong liên quan đến ung thư Trong năm 2017, ước tính có khoảng 95.520 trường hợp ung thư đại tràng và 39.910 trường hợp ung thư trực tràng mới được chẩn đoán tại Mỹ Tỉ lệ mắc CRC rất đa dạng về tuổi, chủng tộc, sắc tộc và kiểu mắc CRC đang có xu hướng trẻ hóa người

mắc (dưới 50 tuổi)

1.2 Nguyên nhân ung thư đại trực tràng

1.2.1 Đột biến gen di truyền

Bệnh đa polyp tuyến và hội chứng Gardner: là do các đột biến di

chuyền ở gen coli gây polyp tuyến (APC), một gen ức chế khối u

Hội chứng Lynch: là do những biến đổi ở các gen hỗ trợ sửa chữa

DNA, làm cho DNA bắt cặp sai, dẫn đến phát triển ung thư

Hội chứng Peutz-Jeghers: là do những biến đổi di truyền ở gen ức

chế khối u,

1.2.2 Các đột biến gen mắc phải

Đột biến gen xảy ra trong thời gian sống và không truyền qua các thế hệ, chúng chỉ có ở các tế bào sinh ra từ tế bào gốc bị đột biến CRC là do đột biến gen mắc phải gây ra nhiều hơn so với các đột biến gen di truyền

1.3 Cơ chế bệnh sinh của ung thư đại trực tràng

1.3.1 Gen, vi môi trường và di truyền ngoại gen (epigenetic)

Đột biến gen gây ra CRC: Bộ gen CRC có khoảng 13.000 gen đột

biến, nhưng chỉ có khoảng 69 đột biến gen điều khiển được đề xuất là

các đột biến có vai trò hình thành CRC Các đột biến gen APC kéo theo là đột biến xảy ra ở gen KRAS hoặc TP53, hoạt hóa con đường

tín hiệu Wnt làm khởi phát polyp tiến triển thành CRC Đột biến gen trong con đường tín hiệu yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta (TGFβ), gen thụ cảm thể TGFβ loại II, cả gen SMAD2, SMAD4, RUNX3 và TSP1 Ít gặp hơn là đột biến các gen MSH2, MSH6, MLH1 và PMS2 cũng có vai trò hình thành CRC

microRNA là phân tử điều hòa di truyền ngoại gen của CRC: có

một số microRNA tăng lên trong tế bào CRC so với tế bào đại trực tràng bình thường như: miRNA-31, miRNA-183, miRNA-17-5, miRNA-18a, miRNA-20a và miRNA-92, nhưng miRNA-143 và miRNA-145 lại thấp hơn đáng so với tế bào bình thường

Các microRNA ức chế khối u và microRNA gây ung thư:

miRNA-135a và miRNA-135b ảnh hưởng trực tiếp gen ức chế khối u APC và

kích hoạt tín hiệu con đường Wnt tạo ra CRC miRNA-122a là một

chất ức chế khối u làm tăng biểu hiện gen APC miRNA-21 tăng

trong tế bào ở giai đoạn sớm CRC, miRNA-21 là chất gây ung thư miRNA-143 và miRNA-145 cũng là chất ức chế khối u

1.3.2 Tăng methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng

Methyl hóa DNA là phản ứng cộng thêm một nhóm methyl vào

vị trí 5' của cytosine dưới xúc tác của enzyme DNA methyltransferase để tạo thành 5-methyl cytosine Tăng methyl hóa

làm bất hoạt gen, giảm quá trình tế bào chết theo chương trình, sửa

chữa DNA và kiểm soát chu trình tế bào

1.3.3 Giảm methyl hóa DNA trong tế bào CRC

Giảm methyl hóa DNA làm mất ổn định hệ gen, điển hình là trong

yếu tố nhân kích thước dài rải rác 1 (LINE-1) hình thành CRC

1.3.4 Thay đổi Histone trong tế bào CRC

Thể nhân là đơn vị cơ bản của nhiễm sắc thể, bao gồm một octamer tạo bởi bốn histone lõi (H3, H4, H2A, H2B) xung quanh có

147 cặp base của DNA phủ bên ngoài, lõi histone chủ yếu là hình cầu ngoại trừ “các đuôi” N- tận Có ít nhất 8 loại thay đổi histone: acetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa, ubiquityl hóa, sumoyl hóa, hóa ADP-ribose hóa, proline isomerise hóa và citrulline hóa Trong đó, acetyl hóa và methyl hóa là loại phổ biến nhất gây ra CRC

1.4 Liệu pháp MeV và MuV điều trị CRC

1.4.1 Sinh học MeV và MuV

MeV và MuV là các virus thuộc thành viên của họ Paramyxoviridae, có đường kính khoảng 100-300nm, với một lõi nucleocapsid xoắn chứa sợi RNA đơn (-) Hai protein màng: protein fusion (F) có vai trò hợp nhất màng của virus với màng tế bào đích

và huyết tán; protein hemagglutinin (H) hay hemagglutinin neuraminidase (HN) chịu trách nhiệm việc virus xâm nhập vào tế bào

1.4.2 MeV và MuV lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư đại trực tràng

1.4.2.1 Tế bào CRC có các thụ cảm thể đặc hiệu với MeV và MuV

MuV chủng Urabe sử dụng các sialoglycoprotein có chứa acid sialic trên bề mặt tế bào ung thư như là thụ cảm thể đặc hiệu MeV chủng Edmonston sử dụng các thụ cảm thể đặc hiệu CD46, Nectin-4

trên bề mặt tế bào CRC

1.4.2.2 MeV, MuV ly giải tế bào CRC nhờ các enzyme protease

Các protease có nhiều trong tế bào ung thư phân cắt glycoprotein của virus, tạo điều kiện để virus xâm nhập vào tế bào, đại diện là các matrix metalloproteinase

1.4.2.3 MeV, MuV tận dụng các khiếm khuyết gen ở tế bào CRC

Các khiếm khuyết di truyền trong tế bào ung thư làm cho các tế bào ung thư dễ bị nhiễm virus và tạo điều kiện cho virus nhân lên tốt

hơn mà hầu như không có ở tế bào bình thường

1.4.3 Cơ chế MeV, MuV ly giải tế bào ung thư đại trực tràng

1.4.3.1 MeV và MuV ly giải trực tiếp tế bào CRC qua hình thành hợp bào

MeV và MuV ly giải tế bào ung thư bằng cách hòa màng tế bào nhiễm virus và tế bào bình thường lân cận tạo thành hợp bào (tế bào khổng lồ có nhiều nhân) Một tế bào nhiễm virus có thể hợp nhất 50-

100 tế bào lân cận tạo thành hợp bào

1.4.3.2 MeV, MuV ly giải tế bào CRC qua trung gian miễn dịch đặc hiệu

MeV, MuV tạo ra 2 loại tín hiệu nguy hiểm là tín hiệu nguy hiểm nội sinh (DAMP), các tín hiệu nguy hiểm ngoại sinh (PAMP), chúng kích hoạt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu góp phần quan trọng ly giải tế bào u như: sản xuất IFN, các cytokine, hoạt hóa tế bào NK, đại thực

bào, tế bào DC, tế bào lympho T

Protein Hemagglutinin neuraminidase có vai trò như sialidase, loại bỏ axit sialic khỏi bề mặt tế bào ung thư, bộc lộ kháng nguyên ung thư, kích hoạt miễn dịch đặc hiệu tiêu diệt tế bào ung thư

1.5 Các nghiên cứu lâm sàng của MeV và MuV

Bảng 1.1 Các thử nghiệm lâm sàng của MeV và MuV

N.C lâm sàng, bệnh nhân (n)

Kết quả lâm sàng Năm

Virus sởi (MeV)

1/5 bệnh nhân thoái triển hoàn toàn

u tiêm, 3/5 bệnh nhân thoái triển một phần u tiêm, 2/3 bệnh nhân này

có thoái triển một phần các u ở xa

6 tháng)

Ung thư buồng trứng

Giai đoạn 1 (n = 21)

14/21 bệnh nhân có đáp ứng: thời gian sống trung bình là 1 năm; 1 bệnh nhân

có thời gian sống 3,2 năm

6 tháng)

Ung thư buồng trứng

Giai đoạn 1 (n=16)

Thời gian sống trung bình của bệnh nhân là 26,5 tháng 2015

NIS

Tiêm

nội u

Ung thư biểu

mô tế bào vảy đầu và cổ, vú

Giai đoạn 1 (n=12) Đang thực hiện 2013-

2018 MeV-

NIS

Tiêm

nội u

U thần kinh ngoại biên

Giai đoạn 1 (n=30) Đang thực hiện 2017-

2021 MeV-

2019 MeV-

CEA Tiêm

nội u

U biểu mô buồng trứng, màng bụng

Giai đoạn 1 (n=37) Đang thực hiện 2012-

2018 MeV-

NIS

Tiêm

nội u

U biểu mô buồng trứng

Giai đoạn 1 (n=54) Đang thực hiện 2014-

Giai đoạn 2 (n = 90)

79/90 bệnh nhân đáp ứng với điều trị và 37/79 bệnh nhân có thoái biến khối u đáng kể hay hoàn toàn

Giai đoạn 2 (n=200)

26/200 bệnh nhân có thoái biến khối u; đa số bệnh nhân có các triệu chứng khách quan nhẹ

Giai đoạn 2 (n = 22)

5/7 bệnh nhân đã mất hoàn toàn cổ trướng hoặc tràn dịch màng phổi; bệnh nhân có khối u lớn không đáp ứng Bệnh nhân tràn dịch màng bụng hoặc màng phổi có đáp ứng

1988

1 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Động vật và chất liệu nghiên cứu

Chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) chủng BALB/c Virus vaccine sởi chủng Edmonton và quai bị chủng Urabe Dòng tế bào Vero và ung thư đại tràng người HT-29

Môi trường nuôi cấy DMEM có thêm 10% FBS (Foetal Bovine Serum)

và 1% kháng sinh (penicillin và streptomycin), và các hóa chất khác…

Bộ kit MTT đánh giá tỉ lệ tế bào sống; kit FITC Annexin V Apoptosis Detection kit (BD) đáng giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis; các kháng thể gắn

chất phát huỳnh quang phát hiện các tế bào miễn dịch ở lách chuột

2.1.2 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu

Thước kẹp đo u, máy camera, máy đo quang (OD), kính hiển vi quang học, tủ ấm 37 0 C và 5% CO 2 , máy ly tâm, hệ thống flow cytometry, kính hiển vi điện tử truyền qua và các dụng cụ tiêu hao phòng thí nghiệm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy và tăng sinh các dòng tế bào

Tế bào HT-29 và Vero được lấy từ nguồnbảo quản âm sâu (-80 0 C), rã đông thật nhanh (<1 phút) Gieo tế bào vào đĩa nuôi cấy cùng với môi trường DMEM Khi tế bào phát triển, tách tế bào bằng trypsin-EDTA 1X

2.2.2 Phương pháp tăng sinh và chuẩn độ MeV và MuV

2.2.2.1 Tăng sinh MeV và MuV từ nguồn virus vaccine

Nhiễm MeV và MuV vào tế bào Vero Sau 9-10 ngày nhiễm virus thu dung dịch chứa MeV và MuV

Gieo tế bào Vero vào đĩa 96 giếng nồng độ 104/200µl/giếng Nhiễm MeV, MuV với nồng độ hòa loãng của stock virus từ 10 -2 -10 -9 Sau 5 ngày nhiễm MeV, MuV sử dụng xanh methylen làm chất hiện màu, tính TCID 50 Công thức tính TCID 50

I: Tính khoảng tỉ lệ (PD):

(%CPE ở nồng độ có %CPE trên 50%) – (50%)

(% CPE ở nồng độ có %CPE>50%) – (%CPE ở nồng độ có %CPE<50%)

II: Tính (-Log) nồng độ pha loãng có %CPE trên 50% (10-3 sẽ là 3) TCID 50 /ml = 10I+II/ml (CPE: là giếng có tế bào nhiễm virus)

2.2.3 Đánh giá MeV, MuV gây độc tế bào bằng thử nghiệm MTT

- Nhiễm MeV, MuV vào tế bào HT-29 trên đĩa 96 giếng với nồng độ hòa loãng 10 -2 -10 -8 Ở ngày nhiễm virus thứ 3, 4 và 5 cho dung dịch MTT vào các giếng, đo độ hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 570nm và tính kết quả

2.2.4 Chuẩn bị mẫu tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình và tế bào hoại tử bằng phương pháp dòng chảy

Tăng sinh tế bào HT-29 và gieo vào 5 đĩa nuôi cấy 6 giếng Nhiễm MeV,

MuV vào tế bào HT-29 trên các đĩa 6 giếng Thu tế bào ở các thời điểm

ngày thứ 3, 4, và 5 để đánh giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử

2.2.5 Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo chương trình và hoại tử bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy

Tế bào được xử lý và nhuộm theo hướng dẫn kèm theo bộ kit Fluorescein isothiocyanate, Annexin V Apoptosis Detection kit (BD) Đánh giá tỉ lệ tế bào

chết apoptosis và hoại tử trên hệ thống FACS CANTO II (BD)

2.2.6 Phương pháp nuôi chuột chuột nude

Chuột nude chủng BALB/c, được nuôi trong phòng sạch

2.2.7 Phương pháp tạo khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên dùi chuột thiếu hụt miễn dịch và tính kích thước khối u

Tạo khối u trên đùi chuột nude: Tăng sinh tế bào HT-29 Chuẩn bị chuột

thiếu hụt miễn dịch, 6-8 tuần tuổi Tiêm tế bào HT-29, nồng độ 10 6 tế bào/chuột vào dưới da đùi chuột

Đo kích thước khối u: Đo bằng thước kép chuẩn, đo 2 chiều

Công thức tính kích thước khối u: V=D x R 2 x 0,5 (mm 3 )

V: thể tích khối u D: chiều dài khối u R: chiều rộng khối u

2.2.8 Phương pháp điều trị chuột nude bằng MeV, MuV

Có 4 nhóm (10 con/nhóm): nhóm điều trị phối hợp MuV+MeV; nhóm điều trị MuV; nhóm điều trị MeV; nhóm chứng tiêm dung dịch PBS

Tiêm MeV, MuV nội u, liều 10 7 PFU/lần/con, 2 lần/tuần, 3 tuần điều trị

2.2.9 Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị

Theo dõi tình trạng sức khỏe chuột: cân nặng, vận động, đáp ứng kích thích, màu sắc da của chuột, phân chuột

So sánh kích thước u theo thời gian điều trị Thời gian sống trung bình, tỉ

2.2.11 Đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch ở lách chuột nude mang khối u tế bào HT-29 điều trị bằng MuV, MeV bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy

Phân lập tế bào từ lách chuột, nhuộm trypan blue kiểm tra tỉ lệ tế bào sống (tế bào sống >95%), xác định số lượng tế bào xét nghiệm (10 6 tế bào) Nhuộm tế bào lách bằng kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang: Kháng thể kháng CD11b- tế bào bạch cầu dòng tủy, kháng thể kháng CD49b-tế bào NK, kháng thể

kháng CD11c-tế bào DC, kháng thể kháng CD11c-tế bào DC trưởng thành

2.2.12 Phương pháp phân tích siêu cấu trúc tế bào

Soi, đọc kết quả trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400, JEOL, Nhật

Bản (Khoa Hình thái - Viện 69, Bộ tư lệnh Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh) 2.13 Phương pháp phân tích kết quả

Sử dụng phần mềm SPSS.20, GraphPad Prism, có ý nghĩa thống kê khi p<0,05

2 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Tăng sinh dòng tế bào tế bào HT-29, Vero, MeV và MuV

3

4

Hình 3.2 Tế bào Vero phát triển (A) ở vật kính 10X; (B) ở vật kính 20X; (C) ở vật kính 40X

Hình 3.3 Tế bào Vero nhiễm MeV, MuV (A), (B) ngày thứ 3, 4: các tế bào nhiễm virus co tròn, bong khỏi đáy; (C) nhiễm ngày thứ 5: tế bào nhiễm virus hòa màng tạo hợp bào; (D), (E) nhiễm ngày thứ 6, 7: hợp bào lan rộng; (F) nhiễm ngày thứ

9: hợp bào chết tạo ra xác tế bào (chú

thích bởi các mũi tên đen)

Hình 3.1 Tế bào HT-29 phát triển (A) ở vật kính 10X; (B) ở vật kính 20X;

(C) ở vật kính 40X

3.2 Chuẩn độ MeV, MuV theo phương pháp TCID 50

5

3.3 MeV và MuV ly giải trực tiếp dòng tế bào HT-29 in vitro

3.3.1 Tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV tạo hợp bào in vitro

Biểu đồ 3.2 Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 4

Biểu đồ 3.3 Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 5

3.4 Đánh giá tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết apoptosis

và hoại tử sau nhiễm MuV, MeV in vitro