XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN PH VÀ NHIỆT ĐỘ THÍCH HỢP ĐỐI VỚI CHẾ PHẨM CỦA ENZYME PECTINASE, INVERTASE, PROTEASE TRÊN CƠ CHẤT DỊCH CƠM NHẦY CỦA HẠT CA CAO.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN PH VÀ NHIỆT ĐỘ THÍCH HỢP ĐỐI VỚI CHẾ PHẨM CỦA ENZYME PECTINASE, INVERTASE,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN PH VÀ NHIỆT ĐỘ THÍCH HỢP ĐỐI VỚI CHẾ PHẨM CỦA ENZYME PECTINASE, INVERTASE, PROTEASE TRÊN CƠ CHẤT DỊCH CƠM

NHẦY CỦA HẠT CA CAO

Họ và tên sinh viên: TRẦN THỊ MAI Ngành: BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NÔNG SẢN THỰC PHẨM Niên khóa: 2006 – 2010

XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN PH VÀ NHIỆT ĐỘ THÍCH HỢP ĐỐI VỚI CHẾ PHẨM CỦA ENZYME PECTINASE, INVERTASE, PROTEAZA TRÊN CƠ CHẤT DỊCH CƠM NHẦY

CỦA HẠT CA CAO

Tác giả

TRẦN THỊ MAI

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành

Bảo quản và chế biến nông sản thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn:

Ths Phan Thanh Bình Ths Vương Thị Việt Hoa

Tháng 08 năm 2010

LỜI CẢM ƠN

Xin cho em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Phan Thanh Bình và Cô Vương Thị Việt Hoa vì sự giúp đỡ và sự hướng dẫn nhiệt tình, sâu sắc cùng sự quan tâm lo lắng cho em trong thời gian thực hiện đề tài

Em ghi nhớ công ơn của các Thầy Cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu về công nghệ thực phẩm và những vốn kinh nghiệm vô giá trong cuộc sống Đồng thời, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên và phòng Hóa Sinh Và Công Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện cho em thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn các cô, chú, anh, chị trong phòng Hóa Sinh và Công Nghệ Sinh Học đã chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài

Trần Thị Mai

TÓM TẮT

Đề tài “Xác định điều kiện pH và nhiệt độ thích hợp đối với enzyme pectinase, invertase, protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao” đã được tiến hành tại Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên, thời gian từ tháng 3 đến tháng 7 năm

2010

Các thí nghiệm trong đề tài là thí nghiệm một yếu tố bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 2 lần và được tiến hành ở các mức nhiệt độ 35 0C, 40 0C, 45 0C, 50 0C và các mức pH: 3,5; 4,5; 5,5; 6,5

Đề tài được chia làm hai phần:

 Phần 1: Xác định pH và nhiệt độ thích hợp đối với enzyme pectinase, protease,

invertase trên cơ chất dịch cơm nhầy hạt ca cao Trong phần này gồm có 3 nội dung:

- Nội dung 1: Khảo sát khả năng hoạt động của enzyme từ đó rút ra khoảng pH

và nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động của chế phẩm enzyme pectinex ultra SP-L (chứa chủ yếu là enzyme pectinase) trên cơ chất dịch cơm nhầy ca cao, sử dụng phương pháp đo độ nhớt

- Nội dung 2: Khảo sát khả năng hoạt động của enzyme flavourzyme (chứa chủ yếu là enzyme protease) từ đó rút ra khoảng pH và nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động của enzyme trên cơ chất dịch cơm nhầy ca cao, sử dụng phương pháp quang phổ

- Nội dung 3: Khảo sát khả năng hoạt động từ đó rút ra khoảng pH và nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động của chế phẩm enzyme invertase trên cơ chất dịch cơm nhầy ca cao, sử dụng phương pháp quang phổ

 Phần 2: Xác định thời điểm thích hợp để bổ sung các chế phẩm enzyme

pectinase, invertase, protease vào trong quá trình lên men ca cao Ta dựa vào kết quả ở phần 1 và sự biến đổi của nhiệt độ, pH của khối hạt ca cao trong điều kiện thực tiễn lên men tại Viện

Kết quả thu được như sau:

- Chế phẩm enzyme pectinase nên bổ sung vào ngày thứ 2 của quá trình lên men

- Chế phẩm enzyme flavourzyme nên được bổ sung vào ngày thứ 5 của quá trình lên men

- Chế phẩm enzyme invertase nên bổ sung vào khối ủ ca cao ngày thứ 3 của quá trình lên men

MỤC LỤC

TRANG

Trang tựa i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục v

Danh sách chữ viết tắt vii

Danh sách các hình viii

Danh sách các bảng ix

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích đề tài 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về ca cao 3

2.1.1 Sơ lược về cây ca cao 3

2.1.2 Thành phần hóa học của quả và hạt ca cao 4

2.1.3 Sơ chế hạt ca cao 6

2.2 Tổng quan về enzyme 10

2.2.1 Giới thiệu chung về enzyme 10

2.2.1.1 Khái niệm: 10

2.2.1.2 Bản chất của enzyme: 10

2.2.1.3 Cơ chế tác động của enzyme 11

2.2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme 12 

2.2.2 Enzyme chủ yếu trong quá trình lên men ca cao 14

2.2.3 Giới thiệu về Enzyme Protease 15

2.2.4 Giới thiệu về enzyme pectinase 15

2.2.5 Giới thiệu về enzyme invertase 17

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm 19

3.2 Đối tượng nghiên cứu 19

3.3 Vật liệu và phương tiện thí nghiệm 19

3.3.1 Chế phẩm enzyme sử dụng 19

3.3.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng 20

3.4 Bố trí thí nghiệm 21

3.4.1 Phần 1: Xác định pH và nhiệt độ thích hợp đối với enzyme pectinase, protease, invertase trên cơ chất dịch cơm nhầy hạt ca cao 21

3.4.2 Phần 2: Xác định thời điểm thích hợp để bổ sung các enzyme pectinase, protease, invertase trong quá trình lên men ca cao 25

3.5 Phương pháp xác định các chỉ tiêu 25

3.6 Phương pháp thực hiện thí nghiệm 25

3.7 Phương pháp xử lý số liệu 28

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Phần 1 29

4.1.1 Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase

trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao 29

4.1.2 Nội dung 2: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme flavourzyme trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao 39

4.1.3 Nội dung 3: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme

flavourzyme trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao 50

4.2 Phần 2 60

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63

5.1 Kết luận 63

5.2 Đề nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 67

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1: Một số sản phẩm có hương vị chocolate 1

Hình 2.1 : Một số giống ca cao 3

Hình 2.2: Thịt quả ca cao 4

Hình 2.3: Quy trình sơ chế ca cao 6

Hình 2.4: Trữ trái ca cao trong lồng làm bằng tre 6 

Hình 2.5: Trữ trái ca cao trên nền nhà 6

Hình 2.6: Ủ thúng 7 

Hình 2.7: Ủ thùng 7 

Hình 2.8: Sự chuyển biến đường của cơm nhầy trong quá trình lên men 9

Hình 2.9: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới tốc độ phản ứng 12 

Hình 2.10: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới tốc độ phản ứng 13

Hình 2.11: Phản ứng được xúc tác bởi enzyme pectinesterase 16

Hình 2.12: Hoạt động thủy phân của enzyme polygalacturonase 16

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các thành phần của hạt ca cao tươi, tính theo % trọng lượng tươi 4

Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm 1 21

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm 2 21

Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm 3 22

Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm 4 23

Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm 5 24

Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm 6 24

Từ ca cao, người ta có thể chế biến ra rất nhiều loại sản phẩm như: bánh, kẹo nhân chocolate, nước uống hương vị chocolate…Không những thế, cacao khô và một

số thành phần chocolate chứa rất nhiều nhóm chất chống oxy hóa có vai trò quan trọng trong việc duy trì hệ thống tim mạch hoạt động tốt, ngăn ngừa bệnh tim…(Phạm Hồng Đức Phước, 2009)

Hình 1.1: Một số sản phẩm có hương vị chocolate

Tuy nhiên, để tạo ra được những sản phẩm từ ca cao chất lượng cao thì cần quan tâm đến nhiều vấn đề, trong đó cần chú trọng đến quá trình lên men ca cao Quá trình lên men có vai trò rất quan trọng nhằm tạo ra các hợp chất hóa học tạo nên hương

vị đặc trưng cho sản phẩm chocolate Trong quá trình lên men có sự tham gia hoạt động của các enzyme làm tăng hiệu quả các phản ứng tạo được nhiều tiền chất đặc trưng cho chocolate, từ đó làm tăng chất lượng sản phẩm Các enzyme quan trọng trong quá trình lên men của ca cao như pectinase, protease, invertase,… Tuy nhiên, để xác định thời điểm thích hợp bổ sung enzyme để quá trình lên men được tối ưu chúng

tôi thực hiện đề tài “Xác định điều kiện pH và nhiệt độ thích hợp đối với các chế phẩm của enzyme pectinase, invertase, protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao”

1.2 Mục đích đề tài

Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới khả năng hoạt động của các chế phẩm enzyme pectinase, invertase, protease Từ đó xác định thời điểm thích hợp bổ sung các enzyme trên vào khối ủ ca cao trong quá trình lên men để hiệu quả lên men đạt cao nhất (hiệu quả lên men ở đây dựa vào tốc độ giảm nhớt của dịch cơm nhầy, hàm lượng tiền chất hương vị ca cao sinh ra (đường khử và amino acid))

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về ca cao

2.1.1 Sơ lược về cây ca cao

Cây ca cao có tên khoa học là Theobroma cacao L., thuộc họ Sterculiaceae, là loài duy nhất trong số 22 loài của chi Theobroma được trồng sản xuất Ca cao có

nguồn gốc từ lưu vực sông Amazon nằm ở Nam, Trung Mỹ và cũng đã được trồng rộng rãi ở đây từ hơn 500 năm trước Sinh thái tự nhiên của cây ca cao là ở tầng thấp trong những cánh rừng mưa nhiệt đới: nơi có cường độ ánh sáng thấp, ẩm độ không khí cao, biên độ nhiệt giữa ngày và đêm cũng như giữa các tháng trong năm đều hẹp (Phạm Hồng Đức Phước, 2009)

Hiện nay, ca cao được chia làm 3 nhóm chính, bao gồm: Criollo, Forastero và

Trinitario

Hình 2.1: Một số giống ca cao 2.1.2 Thành phần hóa học của quả và hạt ca cao

Nước, chất béo (bơ ca cao), carbohydrates, nitrogen, acid hữu cơ, muối khoáng,…Các thành phần này sẽ có hàm lượng khác nhau ở chất nhầy, vỏ hạt và thịt hạt

- Chất nhầy (thịt quả) có hàm lượng nước và đường cao nhất, ngoài ra còn có acid citric làm cho pH của thịt quả luôn ở 3,5

- Vỏ hạt có hàm lượng carbohydrates cao

- Thịt hạt chứa hàm lượng bơ ca cao rất cao, vỏ hạt chứa một ít và chất nhầy không có

Hình 2.2: Thịt quả ca cao Bảng 2.1 Các thành phần của hạt ca cao tươi, tính theo % trọng lượng tươi Thành phần Chất nhầy Vỏ hạt Phôi nhũ

_ _ 2,7 0,7 10,0

9,4 3,8

13,8 46,0 _ _ _

35,0 31,3

3,2 4,5 4,9 _ 1,1

Protein

Theobromine

Enzyme

Polyphenols

Acid hữu cơ

Citric & acetic, oxalic

Muối khoáng

Tổng số

0,6 _ _ _

0,7 0,8

100,0

18,0 _ _ 0,8

_ 8,2

100,0

8,4 2,4 0,8 5,2

0,6 2,6

100,0

(Nguồn: F Hardy Trích từ Phạm Chí Thông, 1999) Theo Dr Emile Cros, 1999 thì trong lớp cơm nhầy chứa khoảng 82% – 87% là nước, 10% – 15 % đường, acid citric 1% – 3 %, protein 0,6%, pH ban đầu của lớp cơm nhầy vào khoảng 3,6 Các thành phần này là cơ chất thích hợp cho hoạt động của các enzyme protease, invertase và pectinase

Với các thành phần trên thì việc ứng dụng các enzyme (pectinase, protease, invertase) phù hợp với cơ chất có trong thành phần của lớp thịt quả (lớp cơm nhầy), đây là hướng đi chính của đề tài

2.1.3 Sơ chế hạt ca cao

 Thu hoạch quả ca cao

Trong thu hoạch cần phải hái trái chín, vì nếu chưa chín hạt trong trái khó bóc ra, khó ủ, tỉ lệ hạt tím

và xám cao, năng xuất cacao thô giảm nhiều Nhưng trái chín lâu trên cây thì dễ bị sâu bệnh, côn trùng phá hoại

và bản thân trái ca cao bị chín rục, thối rữa và hạt trong trái sẽ nảy mầm (Phạm Trí Thông, 1999)

Quả sau khi thu hoạch được trữ khoảng 1 tuần như vậy sẽ đem lại hiệu quả lên men cao hơn (Sưu tầm và biên dịch Cao Xuân Lộc, 2007)

Hình 2.3: Quy trình sơ chế ca cao

Hình 2.4: Trữ trái ca cao trong lồng tre Hình 2.5: Trữ trái ca cao trên nền nhà

 Lên men

Theo Phạm Trí Thông, 1999 có 4 phương pháp ủ hạt cacao: ủ thành đống, ủ thùng, ủ thúng (cần xé), ủ trên khay

Hình 2.6: Ủ thúng Hình 2.7: Ủ thùng

 Mục đích của quá trình lên men

Ca cao sau khi thu hoạch cần thiết phải lên men Trong quá trình lên men các tiền chất để tạo hương chocolate được hình thành Do đó ca cao chất lượng chỉ đạt được sau khi lên men đúng kỹ thuật Lên men cũng làm giảm vị đắng, chát và hình thành màu nâu đặc trưng của chocolate

 Yêu cầu của quá trình lên men

Nhiệt độ trong quá trình lên men cần phải đạt từ 45 – 50 0C để tiêu diệt sức sống của hạt (tránh hạt nảy mầm), nhiệt độ này sẽ thuận lợi cho các phản ứng sinh hóa trong tế bào xảy ra nhanh hơn

Thời gian lên men từ 5 – 7 ngày đối với giống Forastero, Trinitario và tùy điều

kiện thời tiết của từng vùng Nếu thời gian lên men quá ngắn thì các quá trình sinh hóa chưa xảy ra hoàn thiện, còn nếu lên men quá dài thì sự phân hủy đối với một số chất hữu cơ trong hạt xảy ra mãnh liệt và tạo ra các sản phẩm gây mùi khó chịu như: phân hủy protein thành NH3, oxy hóa các acid béo không no thành các aldehyt có mùi át mùi đặc trưng của ca cao, các phản ứng tạo ester với các mùi không mong muốn…(Bernard W.Minific, C C., F.R.I.C, 1980)

Mức độ thông khí: Thông thường quá trình lên men yếm khí xảy ra đối với hạt

ca cao bình thường (không được lưu quả) là 32 – 48 giờ, đối với hạt đã làm giảm hàm lượng nước (lưu quả 9 ngày) thì sau 24 – 32 giờ và tiếp theo sau đó là quá trình lên men hiếu khí tạo acid acetic Như vậy, thời gian đảo cần thiết đối với hạt bình thường (không được lưu quả) là 2 ngày 1 lần, đối với hạt từ quả được lưu 9 ngày là một ngày sau 48 giờ (Smilja, L., 2007)

Loại thùng ủ: Thùng ủ phải đảm bảo không có mùi vị lạ (mùi cao su, mùi xốp,…), không bị acid ăn mòn, chất liệu thùng ủ không bị tác động bởi acid và cồn Thùng ủ còn phải có tác dụng dễ thoát dịch nhớt, giữ được nhiệt độ

Khối lượng và độ cao khối hạt: Khối lượng hạt để đạt được kết quả lên men tốt

là từ 50 kg hạt tươi trở lên, độ cao khối hạt trong ủ lên men ở khối lượng vừa và nhỏ là không quá 40 cm Với khối lượng và độ cao này thì các quá trình sinh hóa trong hạt sẽ xảy ra một cách triệt để và theo xu hướng tốt (Sterling S Thompson, K B M., Alex S.lopez, 2001)

 Cơ chế của quá trình lên men

Lớp cơm nhầy chứa một trữ lượng đường cao (khoảng 15 % - 20 %) và do sự

có mặt của acid citric tạo nên độ pH của lớp cơm nhầy ban đầu là 3,5 là môi trường

Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, các nấm men như: Candida,

Debaryomyces, Hansenula, Saccharomyces…đã phát triển và chuyển hóa đường trong

chất cơm nhầy thành rượu ethylic và CO2 theo phản ứng:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

(Phạm Trí Thông, 1999)

Sự chuyển hóa này xảy ra trong điều kiện kị khí, điều kiện này cho phép sự

phát triển của các vi khuẩn acid lactic _ Lactobacillus, chủ yếu là L.plantarum,

L.collinoides và L.fermentum, cùng với sự sản sinh ra acid lactic Các vi khuẩn này

cũng tham gia vào quá trình phân hủy các chất đường

Khi chất nhầy bị tan vỡ và dịch ca cao chảy ra làm môi trường ủ thông thoáng,

độ acid giảm, pH đạt khoảng 5 vào cuối giai đoạn lên men do sự mất đi của acid citric Lúc này phản ứng oxy hóa cồn thành acid acetic diễn ra mạnh do sự xâm nhập của

không khí vào khối ủ tạo điều kiện cho vi khuẩn Acetobacter spp và Gluconobacter

khi chất nhầy bị hủy hoại Các vi khuẩn này hoạt động mạnh làm nhiệt độ khối ủ tăng lên Nhệt độ tăng đều trong 48 giờ đầu và đạt 42 – 48 0C, sau khi được đảo trộn nhiệt

độ tăng đến 50 0C, sau đó giảm xuống Sau 6 ngày ủ nhiệt độ đạt cỡ 48 0C

Khi ủ một khối lượng lớn, nhiệt độ trong lòng khối ủ tăng chậm hơn và tỉ số hạt còn sống ở giữa khối ủ còn cao, trong lúc đó ở lớp trên thì coi như không còn nữa Vì vậy trong quá trình ủ cần phải đảo trộn để làm cho khối ủ được thông khí giúp cho các hạt lên men đều đặn Ngoài ra còn giúp cho nấm mốc không nảy nở trên bề mặt và hạt không bị quá khô

(Wood G.A.R, a R A L., 2001)

Hình 2.8: Sự chuyển biến đường của cơm nhầy trong quá trình lên men

 Phơi, sấy ca cao

Sau khi ủ ẩm độ của hạt ca cao khoảng 55 % (ẩm độ theo cơ sở ướt) và ẩm độ này phải giảm xuống đến giá trị 6 – 7 % mới đảm bảo an toàn được, nhưng nếu hạ thấp

ẩm độ xuống dưới 5 % hạt ca cao sẽ rất giòn và dễ gãy (Phạm Trí Thông, 1999)

Mục đích của việc phơi sấy: Ngoài việc hạ thấp ẩm độ nhằm ngăn ngừa nấm mốc phát triển còn để hoàn tất các biến đổi hóa học xảy ra tiếp tục bên trong hạt sau thời kỳ lên men để tạo hương vị đặc biệt cho ca cao (http://www.dost-bentre.gov.vn/chuyen-muc/ung-dung-khoa-hoc-cong-nghe/289-qui-trinh-len-men-ht-ca-cao.html)

Trong giai đoạn phơi (sấy) thì các phản ứng sinh hóa tiếp tục xảy ra (dưới tác động của các enzyme được sinh ra trong quá trình lên men), trong đó đặc biệt là các phản ứng phân hủy protein thành các amino acid, phân hủy tinh bột thành đường, các phản ứng oxy hóa polyphenol tạo màu nâu và các tiền hương vị chocolate trong nhân hạt ca cao (Phan Thanh Bình, 2009)

 Bảo quản

Hạt ca cao đã ủ và phơi có thể bảo quản khá tốt ở các vùng ôn đới nhưng lại dễ

hư hỏng ở các vùng nhiệt đới Cho nên cần chú ý đến các điều kiện trong bảo quản để phẩm chất của hạt không bị tổn hại và giảm sút (Phạm Trí Thông, 1999)

tế bào của mọi sinh vật, không những chỉ xúc tác cho các phản ứng trong cơ thể sống

mà còn xúc tác cho cả các phản ứng ngoài tế bào (Nguyễn Phước Nhuận và ctv, 2003)

Ngày nay, enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: chăn nuôi, thú

y, công nghiệp chế biến thực phẩm…

2.2.1.2 Bản chất của enzyme

Bản chất của enzyme là protein cấu trúc bậc I, II, III và đôi khi bậc IV

Về mặt cấu tạo, enzyme được chia làm 2 nhóm:

- Enzyme một cấu tử: Là enzyme trong thành phần cấu tạo của nó chỉ có protein Một số enzyme được cấu tạo bằng một chuỗi polypeptid duy nhất, đa số enzyme được cấu tạo bằng nhiều chuỗi polypeptid giống nhau hoặc khác nhau

- Enzyme nhị cấu tử: Một vài enzyme cần phải liên kết với một thành phần phi protein để thực hiện chức năng xúc tác của mình, thành phần phi protein này được gọi

là cofactor Trong trường hợp này, thành phần protein được gọi là apoenzyme và kết hợp hai thành phần trên được gọi là holoenzyme Trong đó, các cofactor tham gia trực tiếp vào quá trình xúc tác và ảnh hưởng đến đặc điểm của phản ứng xúc tác (oxy hóa, vận chuyển…), còn apoenzyme chịu trách nhiệm về tính đặc hiệu của enzyme đối với

cơ chất

2.2.1.3 Cơ chế tác động của enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ các đặc điểm của chất xúc tác nói chung

Các phản ứng hóa học chỉ có thể xảy ra khi phân tử các chất tham gia phản ứng

va chạm với nhau ở vị trí xảy ra phản ứng và phải ở trạng thái hoạt động Muốn hoạt hoá các phân tử thì cần cung cấp năng lượng cho chúng Năng lượng đó gọi là năng lượng hoạt hóa Chất xúc tác nói chung và chất xúc tác enzyme đều có khả năng làm giảm năng lượng hoạt hóa mà phản ứng yêu cầu bằng cách tiến hành qua các phản ứng tạo phức trung gian mà tổng số năng lượng hoạt hóa của chúng nhỏ hơn trường hợp không có chất xúc tác (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998)

Sự tạo thành phức ES và biến đổi phức này thành sản phẩm P trải qua 3 giai đoạn sau:

E + S  ES  P +E

- Trong giai đoạn thứ nhất: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzyme cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp

- Trong giai đoạn thứ hai: Xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn đến sự kéo căng và phá

vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng này Kết quả là làm cho cơ chất được hoạt hóa dễ dàng tham gia phản ứng hơn

- Trong giai đoạn thứ ba: Sản phẩm được tạo thành, còn enzyme được giải phóng dưới dạng tự do

2.2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme

- Nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng bậc nhất phụ

thuộc vào nồng độ enzyme

Đường biểu diễn có dạng sau: Khi thừa cơ chất thì khi nồng độ enzyme tăng, vận tốc tăng Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất thì nồng độ enzyme tăng vận tốc không thay đổi

(Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998)

Hình 2.9: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới tốc độ phản ứng

V: Vận tốc phản ứng E: Nồng độ enzyme

- Nồng độ cơ chất: Trong các phản ứng enzyme xúc tác trước hết tạo thành phức

trung gian giữa enzyme và cơ chất sau đó lại tiếp tục kết hợp với phân tử cơ chất khác

Giả sử phản ứng chỉ có một cơ chất S và tạo thành sản phẩm P, phản ứng xảy ra như sau:

E + S ES P + E

ES là chất trung gian “enzyme – cơ chất” Tốc độ phản ứng tỉ lệ với nồng độ phức chất trung gian này Nồng độ ES càng cao, tốc độ phản ứng càng lớn, khi toàn bộ lượng enzyme trong phản ứng đều tham gia vào phức chất ES, tốc độ sẽ đạt cực đại

Hình 2.10: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới tốc độ phản ứng

- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Vì bản chất của enzyme là protein do đó khi tăng

nhiệt độ tới một giới hạn nào đó thì vận tốc phản ứng enzyme sẽ bị giảm do sự biến tính của protein Trong khoảng nhiệt độ mà enzyme chưa bị biến tính thì khi tăng nhiệt

độ lên 10 0C thì vận tốc phản ứng tăng lên từ 1,4 đến 2 lần Khi bắt đầu có biến tính protein thì xảy ra hai hiện tượng: một mặt vận tốc phản ứng vẫn tăng theo sự tăng nhiệt độ, mặt khác vận tốc biến tính protein xảy ra nhanh hơn Kết quả là vận tốc phản ứng giảm dần tới đình chỉ hoàn toàn

Nhiệt độ ứng với vận tốc cực đại gọi là nhiệt độ tối thích Nhiệt độ mà tại đó enzyme bị bất hoạt hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn Nhiệt độ quá thấp cũng làm giảm mạnh hoạt độ enzyme

- Ảnh hưởng của pH môi trường: pH có ảnh hưởng lớn tới vận tốc phản ứng

enzyme, mỗi enzyme chỉ hoạt động thích hợp nhất ở một pH nhất định gọi là pH hoạt động tối thích của enzyme

pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm định chức ở trung tâm hoạt động enzyme làm thay đổi khả năng phản ứng của các nhóm này trong phản ứng xúc tác và có thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme

pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa của cơ chất, tại pH tối thích phân tử cơ chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp với enzyme

2.2.2 Enzyme chủ yếu trong quá trình lên men ca cao

Chất lượng hạt ca cao được hình thành nên bởi các chất hóa học (tiền chất) để tạo thành hương vị đặc trưng cho chocolate Các chất hóa học này sinh ra trong quá trình lên men, phơi (sấy) và hoàn thiện dần trong quá trình bảo quản hạt Tác động của enzyme vào các phản ứng sinh hóa trong quá trình lên men và phơi sấy sẽ làm tăng tốc

độ phản ứng, làm tăng hiệu quả của các phản ứng và từ đó tạo ra nhiều tiền chất chocolate và làm tăng chất lượng sản phẩm

Tác động của các enzyme trong quá trình lên men ca cao (theo Phan Thanh Bình, 2009):

- Giai đoạn 1: Các enzyme pectinase sẽ tác động vào các phân tử pectin làm gãy các liên kết và tạo thành các phân tử nhỏ hơn làm cho lớp dịch nhầy rữa ra và thoát bớt Trong giai đoạn này enzyme cellulase cũng có tác dụng để phân cắt các sợi cellulose nhằm làm cho lớp nhầy nhanh phân hủy

- Giai đoạn 2: Các enzyme phân hủy như: invertase, β – glocodase để tạo nên nguyên liệu cho phản ứng tạo rượu Enzyme invertase trong phần cơm nhầy hoạt động mạnh phân hủy các đường không khử thành đường khử, cơ chất cho phản ứng tạo màu Maillar (phản ứng giữa acid amin và đường khử)

- Giai đoạn 3: Khi có không khí các enzyme protease, amylase, glycosidase, polyphenol oxydase, lactatdehydrogenase và aldehydehydrogenase sẽ hoạt động thủy phân các chất tương ứng tạo nên các tiền chất cũng như các chất tạo hương của sản phẩm Enzyme polyphenol oxydase, peroxidase đã xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử để tạo nên các tiền hương vị chocolate và tiền chất tạo màu Enzyme carboxypeptide phân hủy peptid thành các oligopeptid và các amino acid tự do

- Giai đoạn 4 (quá trình lên men và trong quá trình phơi): Các acid hình thành sẽ dịch chuyển từ lớp nhớt vào trong nhân và tác động đến các tế bào chứa polyphenol để giải phóng các polyphenol và dưới tác dụng của enzyme polyphenol oxydase sẽ oxy hóa để tạo thành các chất màu có trong hạt ca cao

2.2.3 Giới thiệu về enzyme protease

Protease là các enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân của liên kết peptide (CO – NH) giữa các L_acidamin và chúng cũng thường tác dụng lên các liên kết este đơn giản, ngoài ra còn có khả năng thủy phân các liên kết ester, liên kết amide và tham gia phản ứng chuyển vị gốc amino acid (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2006)

Có nhiều cách phân loại protease khác nhau theo sự phân bố của chúng, pH hoạt động, tính đặc hiệu cơ chất, nguồn thu nhận enzyme (Đinh Ngọc Loan, 2008)

2.2.4 Giới thiệu về enzyme pectinase

Enzyme pectinase là tên gọi chung của một nhóm enzyme có khả năng phân giải pectin (là một polysaccharid)

Cấu tạo pectin chủ yếu là mạch chính gồm các gốc acid galacturonic liên kết nhau bằng liên kết 1-4 glucosid còn gọi là polygalacturonic hay acid peptic

Theo Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1997, các pectinase được chia thành hai nhóm chủ yếu:

 Enzyme pectinesterase (PE) (EC 3.1.1.11)

Là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết este trong phân tử pectin hoặc acid pectinic khi toàn bộ các nhóm metoxyl đều bị tách ra khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành là metanol và các acid polygalacturonic Sự thủy phân chỉ xảy ra ở liên kết este

kề liền với nhóm carboxyl tự do

Enzyme pectinesterase chỉ phân cắt các nhóm methoxyl đứng cạnh nhóm COOH tự do Bắt đầu từ nhóm COOH tự do, kết quả là tạo thành acid pectic và methanol

(Ashraf F., 1993)

Hình 2.11: Phản ứng được xúc tác bởi enzyme pectinesterase

pH tối ưu là 5,5 – 6; nhiệt độ tối ưu là 55 – 60 0C Đối với enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc, nhiệt độ tối ưu là 30 0C – 40 0C

 Enzyme polygalacturonase (PG)

Enzyme polygalacturonase phân cắt liên kết glucozit 1,4 trong mạch pectin,tạo

ra acid galacturonic

(Ashraf, F., 1993)

Hình 2.12: Hoạt động thủy phân của enzyme polygalacturonase

Nhiệt độ tối thích của PG là 40 0C – 50 0C, pH tối thích là 4 – 4,5

- Có nhiều polygalacturonase có tính đặc hiệu rất khác nhau: polymethyl galacturonase tác dụng chủ yếu lên các este metylic của các acid polygalacturonic Các enzyme này được chia thành hai nhóm nhỏ tùy theo vị trí liên kết glucozit bị cắt đứt dưới sự xúc tác của enzyme ở đầu hay giữa mạch

+ Endoglucozidase – polymetylgalacturonase I: Xúc tác sự thủy phân các liên kết glucozit nội mạch ở các phân tử acid polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao

+ Exo – glucozidase – polymetylgalacturonase III: Xúc tác sự thủy phân các liên kết glucozit ở đầu mạch để tách từng gốc acid galacturonic ra khỏi phân tử pectin, bắt đầu từ đường không khử

- Polygalacturonase là các enzyme có tác dụng chủ yếu lên các acid pectic (các acid polygalacturonic không bị este hóa) và acid pectinic (các acid polygalacturonic bị este hóa ở mức độ thấp) Các enzyme này cũng được chia làm hai nhóm nhờ vào vị trí liên kết glucozit bị cắt đứt:

+ Endo – glucozidase – polygalacturonase II: Xúc tác sự thủy phân các liên kết glucozit ở giữa mạch của các phân tử acid pectic hoặc acid pectinic, các enzyme này tác dụng ở vị trí liên kết đầu nhóm carboxyl tự do

+ Exo – glucozidase – polygalacturonase IV: Xúc tác sự thủy phân các liên kết glucozit ở đầu mạch của phân tử acid pectic hoặc acid pectinic

Các enzyme thủy phân pectin có tính bền nhiệt và pH hoạt động tối thích khác nhau Các exo – polygalacturonase của Asp.awamori 16 hoạt động mạnh ở pH 3,5; các endo polymetylgalacturonase hoạt động mạnh ở pH 4,2; còn pectinesterase chỉ hoạt động mạnh ở pH 5 Nhiệt độ hoạt động tối thích của các enzyme này trong khoảng

45 – 52 0C

Trong công nghiệp, pectinase được ứng dụng để phân giải pectin nhằm nâng cao hiệu suất ép, lọc nước quả, chiết dược liệu, làm trong rượu vang và nước quả

2.2.5 Giới thiệu về enzyme invertase

Enzyme invertase tên khoa học là -fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26), là enzyme thuộc nhóm enzyme saccharase, là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân saccharose thành glucose và fructose (tỉ lệ mol 1:1), còn được gọi là đường nghịch đảo Đường nghịch đảo được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong công nghệ sản xuất bánh kẹo và nước giải khát do đặc tính hút ẩm cao, tác dụng ổn định, tránh hiện tượng khô cứng (Đinh Ngọc Loan, 2008)

Invertase có trong động vật, thực vật, vi sinh vật và đặc biệt là nấm men có khả

năng tổng hợp invertase cao Saccharomyces hiện là vi sinh vật được quan tâm nhiều nhất trong lĩnh vực lên men tạo invertase, invertase của Saccharomyces gồm hai loại

như sau: invertase nội bào và invertase ngoại bào (Nam Sun Wang, 2003)

Theo R.Bergamasco, F.J.Bassetti, F.F.de Moraes and G.M.Zanin, 2000, phản ứng thủy phân saccharose do invertase xúc tác như sau:

Invertase Saccharose (đường không khử) α-Glucose + β-Fructose (đường khử)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm đã được tiến hành tại phòng thí nghiệm sinh hóa và công nghệ sinh học Viện KHKT Nông lâm nghiệp Tây Nguyên, Đaklak

Thời gian tiến hành thí nghiệm: Từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2010

3.2 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu là dịch cơm nhầy của hạt ca cao giống Forastero hái từ vườn kinh

doanh của Viện KHKT Nông lâm nghiệp Tây Nguyên, Đaklak

Độ chín của quả ban đầu dùng cho các thí nghiệm là quả có màu sắc vàng trên toàn bộ đường rãnh quả hoặc trên cả bề mặt quả từ 1/2 trở xuống

3.3 Vật liệu và phương tiện thí nghiệm

khuẩn chủ yếu là Aspergillus aculeatus, Trichoderma reesei và Aspergillus niger

Trong lên men ca cao, enzyme pectinase phân cắt các pectin trong lớp cơm nhầy làm giảm độ nhớt Pectinex ultra SP-L là chế phẩm enzyme dạng lỏng, có màu nâu, mùi nhẹ của sản phẩm lên men, dễ tan trong nước, pH hoạt động từ 3 – 6, pH tối ưu là

4,7 – 5,2 Bảo quản ở 0 – 10 0C (32 0F – 50 0F), nhiệt độ hoạt động là 10 0C (50 0F) –

57 0C (135 0 F), nhiệt độ tối thích là 40 – 45 0C (Lê Mỹ Hồng, 2005)

 Chế phẩm enzyme flavourzyme TM 500L của hãng Novozyme do Viện KHKT Nông lâm nghiệp Tây Nguyên, Đaklak cung cấp

Chế phẩm enzyme protease flavourzyme được chiết xuất từ Aspergillus oryzae

Trong lên men ca cao, enzyme flavourzyme cắt các liên kết peptid của chuỗi protein tạo ra các amino acid (tiền chất hương vị chocolate) Nhiệt độ thích hợp cho enzyme flavourzyme hoạt động: 40 – 55 0C, nhiệt độ tối thích: 50 – 55 0C (Đề tài khoa học Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản số 03/2007 ĐH Nha Trang) pH thích hợp: 5 –

7, pH tối ưu: 6 (Rasa và ctv, 2005) Chế phẩm enzyme flavourzyme có dạng bột, màu nâu

 Chế phẩm enzyme invertase của hãng Novozyme do Viện KHKT Nông lâm nghiệp Tây Nguyên, Đaklak cung cấp

Trong lên men ca cao, enzyme invertase có tác dụng chuyển hóa đường không khử thành đường khử (tiền chất hương vị chocolate) Chế phẩm enzyme invertase có dạng bột, màu vàng nhạt, nên bảo quản ở 5 – 10 0C, trong môi trường lạnh và khô thì hoạt tính của enzyme có thể giữ được trong 1 năm pH hoạt động của chế phẩm enzyme này là 3 – 5, pH tối thích là 4,5, nhiệt độ tối thích là 60 0C

 Máy đo độ nhớt Viscotester VF03, máy đo quang phổ Thermospecial

 Máy đo pH Hanna điện cực thủy tinh, máy xay sinh tố, nồi cách thủy

 Tủ định ôn, tủ sấy, cân điện tử, sàng 1,4 mm và 800 µm

 Nhiệt kế điện tử hệ số Hanna, micro pipet

 Thí nghiệm 1: Xác định điều kiện pH

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, 4 mức pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5), 2 lần lặp lại

Yếu tố cố định Thể tích dịch

cơm nhầy (ml)

Lượng enzyme

sử dụng (µl)

Nhiệt độ thí nghiệm (0C)

 Thí nghiệm 2: Xác định điều kiện nhiệt độ

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, 4 mức nhiệt độ (35 0C,

40 0C, 45 0C, 50 0C), 2 lần lặp lại

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm 2

Yếu tố cố định Thể tích dịch

cơm nhầy (ml)

Lượng enzyme

sử dụng (µl)

pH thí nghiệm

- Ở mỗi công thức của thí nghiệm 1 và 2 có một mẫu đối chứng (NTĐC) và một

mẫu có bổ sung enzyme (NTTN) Mỗi nghiệm thức cần 650 ml dịch cơm nhầy của hạt

ca cao Nồng độ enzyme sử dụng là 30 ppm so với thể tích dịch mẫu thí nghiệm, do đó

đối với mỗi nghiệm thức thí nghiệm cần 19,5 µl enzyme

- Chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm 1 và 2: Biến thiên độ nhớt (mPa.s) của dịch

cơm nhầy theo thời gian

3.4.1.2 Nội dung 2: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ thích hợp đối với

enzyme protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao

 Thí nghiệm 3: Xác định điều kiện pH

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, 4 mức pH (3,5; 4,5; 5,5;

Yếu tố cố định Khối lượng dịch Lượng enzyme Nhiệt độ thí

0

 Thí nghiệm 4: Xác định điều kiện nhiệt độ

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, 4 mức nhiệt độ (35 0C,

Yếu tố cố định Khối lượng dịch

cơm nhầy (g)

Lượng enzyme

sử dụng (µg)

pH thí nghiệm

CT4 NTTN4 50 0C

NTĐC4

Ở mỗi công thức của thí nghiệm 3 và 4 có một mẫu đối chứng (NTĐC) và một mẫu có bổ sung enzyme (NTTN) Mỗi nghiệm thức cần 20 g dịch cơm nhầy của hạt ca cao Nồng độ enzyme sử dụng là 5 ppm so với khối lượng mẫu thí nghiệm, do đó đối với mỗi nghiệm thức cần 0,1 µg enzyme

Chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm 3 và 4: Sự biến đổi hàm lượng amino acid thông qua giá trị OD đo được bằng máy đo quang phổ

3.4.1.3 Nội dung 3: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ thích hợp đối với enzyme invertase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao

 Thí nghiệm 5: Xác định điều kiện pH

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, 4 mức pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5), 2 lần lặp lại

Yếu tố cố định Khối lượng dịch

cơm nhầy (g)

Lượng enzyme

sử dụng (µg)

Nhiệt độ thí nghiệm (0C)

 Thí nghiệm 2: Xác định điều kiện nhiệt độ

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, 4 mức nhiệt độ (35 0C,

Yếu tố cố định Khối lượng dịch

cơm nhầy (g)

Lượng enzyme

sử dụng (µg)

pH thí nghiệm

3.5 Phương pháp xác định các chỉ tiêu

- Độ nhớt của dịch cơm nhầy: Sử dụng máy đo độ nhớt (Viscotester VF03) để đo

độ nhớt của dịch cơm nhầy

- Hàm lượng amino acid: Sử dụng phương pháp quang phổ với thuốc thử hiện màu ninhydrin (chi tiết được trình bày ở phụ lục 1)

- Hàm lượng đường khử: Sử dụng phương pháp quang phổ với thuốc thử hiện màu 3,5 – dinitrosalicylic acid (chi tiết được trình bày ở phụ lục 2)

3.6 Phương pháp thực hiện thí nghiệm

 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm

 Thí nghiệm 1 và 2

Quả ca cao sau khi thu hoạch từ vườn thực nghiệm của Viện KHKT Nông lâm

lấy phần cơm nhầy bên ngoài hạt, sau đó cho nước vào và xay hỗn hợp bằng máy xay sinh tố (tỉ lệ nước/cơm nhầy: 1 lít nước/200g cơm nhầy) Hỗn hợp sau khi xay đầu tiên được lọc sàng có đường kính lỗ 1,4 mm và sau đó lọc qua sàng 800 µm Sau đó tiến hành đảo trộn hỗn hợp dịch nhớt và lấy dịch nhớt cho mỗi mẫu thí nghiệm Điều chỉnh dịch nhớt về pH và nhiệt độ khảo sát (cách điều chỉnh pH và nhiệt độ xem phụ lục 4)

Sau khi điều chỉnh dịch nhớt về pH và nhiệt độ thí nghiệm lại tiếp tục đảo trộn hỗn hợp dịch nhớt lần nữa và chia hỗn hợp này ra làm 2 (ứng với NTĐC và NTTN) cho vào 2 cốc thủy tinh 1 lít Trước khi tiến hành thí nghiệm phải kiểm tra độ nhớt ban đầu

ở mỗi nghiệm thức sao cho độ nhớt ban đầu của các nghiệm thức và các công thức bằng nhau

Trong quá trình thí nghiệm phải thường xuyên kiểm tra nhiệt độ của dịch mẫu

để có biện pháp điều chỉnh nhiệt độ khi nhiệt độ cao quá hoặc thấp dưới nhiệt độ khảo sát

 Thí nghiệm 3 và 4

Quả ca cao sau khi thu hoạch từ vườn thực nghiệm của Viện KHKT Nông lâm nghiệp Tây Nguyên về sẽ tiến hành đập quả lấy hạt Phần hạt này cho thêm nước và ngâm trong vòng 2 tiếng (tỉ lệ nước/hạt: 3 lít nước/10 kg hạt) Sau đó tiến hành lọc lấy phần dịch nước bằng sàng 400 µm và tiếp tục lọc qua giấy lọc để thu được dung dịch trong

Trước khi lấy mẫu phải đảo trộn hỗn hợp dịch nhớt Ở mỗi công thức thí nghiệm lấy ra 20 g dịch nhớt, sau khi điều chỉnh dịch nhớt về pH và nhiệt độ thí nghiệm ta lại tiếp tục đảo trộn hỗn hợp dịch lọc lần nữa Vì ninhydrin rất nhạy với amino acid nên phải pha loãng thêm dịch lọc này Sau những thí nghiệm sơ bộ thì dịch nhớt nên được pha loãng làm 2 lần tức là ở mỗi công thức thí nghiệm cần bổ sung thêm 20 g nước cất Tuy nhiên, vì phải bổ sung thêm một lượng acid citric hay NaOH khi điều chỉnh pH nên lượng acid citric 0,1 N hay NaOH 0,1 N thêm vào + 1 lượng nước cất = 20 g Chia hỗn hợp vừa pha loãng làm 1 cho vào 2 cốc thủy tinh (mỗi cốc

20 g) ứng với mỗi nghiệm thức

 Thí nghiệm 5 và 6

Thí nghiệm cũng được chuẩn bị như ở thí nghiệm 3 và 4 Nhưng ở mỗi công thức thí nghiệm lấy ra 100 g dịch lọc, sau khi điều chỉnh dịch nhớt về pH và nhiệt độ thí nghiệm lại tiếp tục đảo trộn hỗn hợp dịch lọc lần nữa Sau đó chia hỗn hợp cho vào

2 cốc thủy tinh (mỗi cốc 50 g) ứng với mỗi nghiệm thức Vì khi điều chỉnh pH của dịch lọc thì ở các công thức khác nhau (ứng với các pH khác nhau) sẽ có độ loãng khác nhau, do đó phải lấy một thể tích V chung = lượng acid citric 0,1 N hay NaOH 0,1 N thêm vào + 1 lượng nước cất thêm vào, trong thí nghiệm này V = 10 ml Như vậy sẽ đảm bảo sau khi điều chỉnh pH thì thể tích dịch mẫu ở các công thức bằng nhau

 Thí nghiệm 3 và 4

Sau khi chuẩn bị mẫu xong, lấy 0,5 ml dung dịch lọc, cho thêm 1,5 ml dung dịch đệm citrat Ở mỗi nghiệm thức, lấy 0,5 ml dịch cho vào mỗi ống nghiệm, cho thêm 1,5 ml dung dịch đệm citrat 0,1 M; pH = 5 và 2 ml dung dịch ninhydrin Lắc đều ống nghiệm và đặt vào nồi cách thủy đun sôi 30 phút Cứ sau 5 phút ta lại lấy dịch lọc một lần sau 50 phút kết thúc thí nghiệm

Sau 30 phút đun sôi trong nồi cách thủy thì lấy ống nghiệm ra cho thêm etanol

50 % vào và định mức đến 10 ml Khi ống nghiệm đã nguội thì tiến hành đo giá trị hấp thu OD ở bước sóng λ = 540 nm Chỉnh máy về 0 với ống kiểm tra có đủ hóa chất trên nhưng thay dung dịch có amino acid bằng nước cất với cùng thể tích

Trong quá trình thí nghiệm phải thường xuyên kiểm tra nhiệt độ của dịch mẫu

để có biện pháp điều chỉnh nhiệt độ khi nhiệt độ cao quá hoặc thấp dưới nhệt độ khảo

 Thí nghiệm 5 và 6

Sau khi chuẩn bị mẫu, lấy 3 ml dung dịch mẫu ở mỗi nghiệm thức vào mỗi ống nghiệm, thêm vào 1 ml thuốc thử DNS Chuẩn bị ống thử không bằng cách thêm 1 ml thuốc thử DNS vào 3 ml nước cất Dùng bông gòn hoặc miếng nilon sạch bịt kín đầu ống nghiệm, đặt vào nồi nước đang sôi trong 5 phút

Sau 5 phút thì tiến hành hút dịch mẫu 1 lần, sau 50 phút kết thúc thí nghiệm Các ống nghiệm được làm lạnh về nhiệt độ phòng, sau đó đo độ hấp thu OD ở bước sóng 540 nm Dùng ống thử 0 để chuẩn độ truyền suốt về 0 Chú ý là tất cả các ống nghiệm phải được làm nguội về nhiệt độ phòng trước khi đo vì độ hấp thu rất nhạy với nhiệt độ

3.7 Phương pháp xử lý số liệu

Các đồ thị được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, kết quả được xử lý bằng phần mềm xử lý thống kê Minitab 2002

Tốc độ giảm độ nhớt phụ thuộc vào các phản ứng sinh hóa ở lớp cơm nhầy như: phản ứng oxy hóa, phản ứng thủy phân và đặc biệt là phản ứng phân hủy pectin Sau khi quá trình lên men kết thúc, hàm lượng lớp cơm nhầy càng thấp thì chứng tỏ khối hạt lên men tốt

Trong nội dung 1 sử dụng chế phẩm enzyme pectinex ultra SP-L Cũng như các enzyme khác, mức độ hoạt động của enzyme này phụ thuộc vào nhiệt độ và pH Ở các nhiệt độ và pH khác nhau thì hoạt động của enzyme sẽ làm mức độ giảm của độ nhớt dịch cơm nhầy của hạt ca cao khác nhau Ở nhiệt độ và pH nào mà mức độ giảm của

độ nhớt cao nhất thì đó là điều kiện tối thích của enzyme

4.1.1.1 Thí nghiệm 1: Xác định điều kiện pH:

 Ở pH = 3,5

Đồ thị 4.1: Sự biến đổi của độ nhớt ở pH = 3,5

Qua đồ thị 4.1 sự biến động của độ nhớt dịch cơm nhầy ca cao giảm dần theo thời gian Mức độ giảm của NTTN1 nhanh hơn so với NTĐC1 và giảm thấp nhất ở mức 124,5 mPa.s sau 60 phút nhưng NTĐC1 chỉ giảm tới 142,5 mPa.s Sự khác nhau này có

ý nghĩa thống kê với p ≤ 0,05 (xem thêm phụ lục 11.1)

Nguyên nhân sự khác biệt giữa NTTN1 và NTĐC1 có thể do ở pH này thích hợp cho hoạt động của enzyme pectinase, do đó khi bổ sung enzyme vào NTTN1 thì enzyme

sẽ phân hủy pectin của dịch cơm nhầy làm cho độ nhớt giảm

NTTN1

NTĐC1