TỐI ƯU HÓA SINH TỔNG HỢP LIPASE TỪ BACILLUS LICHENIFORMIS Ử DỤNG MA TRẬN PLACKETTBURMAN VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT – PHƯƠNG ÁN CẤU TRÚC CÓ TÂM

TỐI ƯU HÓA SINH TỔNG HỢP LIPASE TỪ BACILLUS LICHENIFORMIS SỬ DỤNG MA TRẬN PLACKETT-BURMAN VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT – PHƯƠNG ÁN CẤU TRÚC CÓ TÂM Tác giả HUỲNH THỊ THANH HIỀN Khóa lu

TỐI ƯU HÓA SINH TỔNG HỢP LIPASE TỪ BACILLUS LICHENIFORMIS

SỬ DỤNG MA TRẬN PLACKETT-BURMAN VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG

BỀ MẶT – PHƯƠNG ÁN CẤU TRÚC CÓ TÂM

Tác giả

HUỲNH THỊ THANH HIỀN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành

Bảo quản và chế biến nông sản và vi sinh thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn:

ThS Bùi Hồng Quân

Tháng 08 năm 2010

LỜI CẢM ƠN

Con kính tặng thành quả này cho Ba Mẹ và các thành viên của gia đình, những người đã nuôi dưỡng, dạy dỗ con nên người, luôn khuyên nhủ, động viên và chia xẻ cùng con những vui buồn trong cuộc sống

Mãi ghi nhớ công ơn của các Thầy Cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho con những kiến thức quý báu

Xin cho em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Bùi Hồng Quân đã tận tình giúp đỡ và nhiệt tình hướng dẫn cho em trong thời gian thực hiện đề tài

Cảm ơn tập thể Vi sinh 32 đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này và cho tôi những kỷ niệm khó phai của đời sinh viên

Một lần nữa xin cảm ơn tất cả

Huỳnh Thị Thanh Hiền

TÓM TẮT

Đề tài “Tối ưu hóa sinh tổng hợp lipase từ Bacillus licheniformis sử dụng ma

trận Plackett-Burman và phương pháp đáp ứng bề mặt – phương án cấu trúc có tâm”

đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm hóa sinh thuộc viện công nghệ sinh học và thực phẩm đại học Công Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh, từ ngày 8/03/2010 đến 30/06/2010 Đề tài gồm 2 phần chính:

Trong phần 1, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xây dựng đường cong sinh trưởng

của B licheniformis để xác định mức độ tăng trưởng của vi khuẩn từ đó tìm ra thời điểm bổ sung giống thích hợp (tuổi của giống) Kết quả thí nghiệm cho thấy vi khuẩn phát triển nhanh và đạt mật độ cao nhất sau 25 giờ nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ thường và chế độ lắc Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất có ý nghĩa lên mật độ vi sinh

vật

Trong phần 2, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy lên sản lượng lipase Thí nghiệm trải qua hai giai đoạn: thí nghiệm sàng lọc

và thí nghiệm chính

Thí nghiệm sàng lọc sử dụng ma trận Plackett-Burman để xác định các yếu tố

ảnh hưởng chính đến sản lượng lipase Kết quả thí nghiệm cho thấy CaCl2, tỷ lệ giống

và dịch chiết nấm men là ba yếu tố có ảnh hưởng chính đến sản lượng lipase với hệ số ảnh hưởng lần lượt là3,25; 3,09; 2,67

Thí nghiệm chính được thiết kế theo phương pháp đáp ứng bề mặt phương án cấu trúc có tâm Giá trị tối ưu của ba yếu tố để đạt được sản lượng lipase cao nhất đã được xác định như sau tỷ lệ CaCl2 (1,52%), tỷ lệ giống (4,39%) và dịch chiết nấm men (3,63%) cho sản lượng lipase cực đại theo mô hình là 20,5327 U/ml

(RSM)-MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Bacillus licheniformis 3

2.1.1 Đặc điểm của B licheniformis 3

2.1.2 Các nghiên cứu về B licheniformis 3

2.1.3 Tác hại 5

2.1.4 Ứng dụng 5

2.2 Tổng quan về enzym lipase 7

2.2.1 Cấu tạo 7

2.2.2 Cấu trúc 7

2.2.3 Các phản ứng xúc tác của lipase 8

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp lipase 9

2.2.4.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng 9

2.2.4.1.1.Ảnh hưởng của nguồn cacbon 9

2.2.4.1.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 10

2.2.4.1.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng 10

2.2.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi 10

2.2.4.2.1 pH môi trường 10

2.2.4.2.2 Độ thông khí 11

2.2.4.2.3 Mật độ tế bào 11

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của lipase 11

2.2.5.1 Nhiệt độ 11

2.2.5.2 pH 11

2.2.5.3 Hoạt độ nước 12

2.2.5.4 Ion kim loại 12

2.2.6 Nguồn thu nhận 13

2.2.6.1 Động vật 13

2.2.6.2 Thực vật 14

2.2.6.3 Vi sinh vật 14

2.2.7 Ứng dụng 15

2.2.7.1 Trong công nghệ thực phẩm 16

2.2.7.2 Trong mỹ phẩm 17

2.2.7.3 Trong công nghiệp thuộc da, công nghiệp giấy 17

2.2.7.4 Trong y học 18

2.2.7.5 Trong công nghiệp tẩy rửa, xử lí nước thải 18

2.2.7.6 Trong công nghiệp hóa dầu, trong nông nghiệp 19

2.2.7.7 Dầu sinh học 19

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm 20

3.2 Vật liệu và hóa chất sử dụng 20

3.2.1 Chủng vi sinh vật 20

3.2.2 Hóa chất 20

3.2.3 Thiết bị sử dụng 20

3.2.4 Môi trường nghiên cứu 21

3.3 Bố trí thí nghiệm 21

3.3.1 Thí nghiệm xác định mức độ tăng trưởng của vi khuẩn 21

3.3.2 Thí nghiệm xác định thành phần môi trường 21

3.3.2.1 Thí nghiệm sàng lọc 21

3.3.2.2 Thí nghiệm chính 22

3.4 Phương pháp nghiên cứu 25

3.4.1 Phương pháp vi sinh vật 25

3.4.2 Phương pháp hóa sinh 25

3.5 Phương pháp xử lí số liệu 26

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Thí nghiệm xây dựng đường cong sinh trưởng của B licheniformis 27

4.1.1 Thí nghiệm 27

4.1.2 Kết quả 27

4.2 Thí nghiệm sàng lọc 28

4.2.1 Thí nghiệm 28

4.2.2 Kết quả 28

4.3 Thí nghiệm chính 32

4.3.1 Thí nghiệm 32

4.3.2 Kết quả 33

4.3.2.1 Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ CaCl2 35

4.3.2.2 Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ giống 36

4.3.2.3 Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ dịch chiết nấm men 37

4.3.2.4 Kết quả ảnh hưởng qua lại của từng cặp yếu tố 38

4.3.2.4.1 Tìm các điểm cực trị trên bề mặt đáp ứng thu được khi các yếu tố trong phạm vi nghiên cứu 39

4.3.2.4.2 Tìm các điểm cực trị trên bề mặt đáp ứng thu được khi tỷ lệ giống thấp nhất 41

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Đề nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 59

RSM: Response Surface Methodology

SnDL: Snail digestive lipase

SS: Sum of squares

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Các tác nhân ức chế và xúc tác hoạt động của lipase vi khuẩn 12

Bảng 2.2: Ứng dụng của lipase trong các ngành công nghiệp 15

Bảng 3.1: Các biến trong ma trận Plackett-Burman 23

Bảng 3.2: Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman 23

Bảng 3.3: Nồng độ 3 yếu tố dùng trong RSM-CCD 24

Bảng 3.4: Môi trường cơ bản theo RSM-CCD để tối ưu hóa sản lượng lipase 24

Bảng 4.1: Sản lượng lipase thu được trong thí nghiệm sàng lọc yếu tố 29

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của các biến trong ma trận Plackett – Burman 30

Bảng 4.3: Sản lượng lipase thu được trong thí nghiệm CCD 32

Bảng 4.4: Bảng ANOVA của các yếu tố khảo sát 34  

Bảng 4.5: Các giải pháp để thu được sản lượng lipase cao nhất 39

Bảng 4.6: Các điểm cực trị thu được từ mô hình (bề mặt đáp ứng) 41

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: B licheniformis 3

Hình 2.2: cấu trúc lipase của B subtilis 8

Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng của B licheniformis trong môi trường NB 27

Hình 4.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ CaCl2 lên sản lượng lipase của B licheniformis 35

Hình 4.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống lên sản lượng lipase của B licheniformis 36

Hình 4.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch chiết nấm men lên sản lượng lipase của B licheniformis 37

Hình 4.5: Mặt đáp ứng sản lượng lipase theo CaCl2 và tỷ lệ giống 38

Hình 4.6: Mặt đáp ứng sản lượng lipase theo tỷ lệ giống và chiết nấm men 38

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Enzym là chất xúc tác sinh học được tạo thành trong tế bào sinh vật Nó đóng vai trò quan trọng và không thể thiếu được trong trao đổi chất Nhiều enzym đã được nghiên cứu và sử dụng trong các ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp hóa dầu, công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa (Choi và ctv, 2006)

Lipase chiếm khoảng 5% thị trường enzym, nó chỉ đứng sau protease và carbohydrase trên thị trường enzym thế giới (Vakhlu và Kour, 2006) Lipase ngày càng được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp: thực phẩm, hoá học, dược phẩm, mỹ phẩm, thuộc da và công nghiệp tẩy rửa Lipase có thể được tìm thấy trong thực vật, động vật và vi sinh vật Giống như carbohydrase và protease, lipase có nguồn gốc từ vi sinh vật có tầm quan trọng trong thương mại và nghiên cứu hơn so với lipase

từ thực vật và động vật vì nó có các ưu điểm sau:

 Một lượng lớn lipase tinh sạch có thể được sản xuất trong thời gian ngắn

 Lipase từ vi khuẩn nói chung ổn định hơn lipase từ động vật và thực vật

 Lipase hoạt động dưới những điều kiện nhiệt độ và áp suất ôn hòa do đó giúp tiết kiệm chi phí cho sự tiêu phí năng lượng trong các quá trình xử lý so với các phương pháp truyền thống

 Enzym sản xuất từ vi sinh vật có khả năng chịu nhiệt và những môi trường hóa chất bất lợi thì ổn định ở nhiệt độ cao

 Do tính đặc hiệu của enzym, những sản phẩm không mong muốn thường xuất hiện trong phản ứng được giảm hoặc giới hạn

 Lipase có thể hoạt động trong dung môi hữu cơ dùng trong công nghiệp

 Khi được cố định lipase có thể sử dụng được dưới những điều kiện công nghiệp đặc thù như nhiệt độ khoảng 70oC trong thời gian dài (Hasan và ctv, 2006; Vakhlu và Kour, 2006; Ardhaoui và ctv, 2004)

Sự sản xuất enzym chịu nhiều ảnh hưởng của thành phần môi trường, nhiệt độ,

pH, thời gian nuôi cấy, hoạt độ nước… Đã có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của

thành phần môi trường đến sự sinh tổng hợp lipase của B subtilis, Aspergillus niger

Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Quyền Đình Thi đã nghiên cứu phân lập

tương đối nhiều các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp lipase (Quyền Đình Thi và ctv, 2003), tối ưu sinh tổng hợp lipase từ chủng Geotrichum sp DTQ-26.3 (Nguyễn Sỹ Lê Thanh và ctv, 2006) và từ Ralstonia M1 (Quyen và ctv, 2007), đánh giá các tính chất

lý hóa của lipase từ chủng Geotrichum sp DTQ-26.3 (Nguyễn Sỹ Lê Thanh và Quyền Đình Thi, 2007), Ralstonia M1 (Quyen và ctv, 2007) cho tới nhân dòng lipase (Quyen

và ctv, 2004) và biểu hiện lipase tái tổ hợp từ chủng Ralstonia M1 với mức độ cao ở E coli (Quyền Đình Thi và ctv, 2004; Quyen và ctv, 2005) Nhóm nghiên cứu của Bùi Hồng Quân đã nghiên cứu về lipase của B licheniformis và Pichia anomala (Bùi

Hồng Quân và Nguyễn Đức Lượng, 2009) Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nhiều

nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp lipase bởi vi khuẩn B licheniformis

Được sự chấp thuận của Ban Chủ nhiệm khoa Công Nghệ Thực Phẩm, dưới sự hướng dẫn của Thạc sĩ Bùi Hồng Quân, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “TỐI ƯU

HÓA SINH TỔNG HỢP LIPASE TỪ Bacillus licheniformis SỬ DỤNG MA TRẬN

PLACKETT-BURMAN VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT”

1.2 Mục đích của đề tài

Đề tài nhằm thực hiện mục tiêu sau đây:

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn C, nguồn Nitơ, pH, nguồn khoáng và tỷ lệ

giống lên quá trình sinh tổng hợp lipase của B licheniformis

-Trên cơ sở đó tìm ra tỷ lệ thích hợp các thành phần của môi trường cho quá

trình sinh tổng lipase của B licheniformis

Mục đích của chúng tôi là tối ưu hóa thành phần môi trường và điều kiện nuôi

cấy để gia tăng khả năng sinh tổng hợp lipase từ B licheniformis nhằm gia tăng quy

mô sản xuất để thu nhận lipase

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Bacillus licheniformis

2.1.1 Đặc điểm của B licheniformis

B licheniformis là trực khuẩn Gram dương sinh bào tử thường thấy trong đất và lông chim B licheniformis sản xuất nhiều loại enzym ngoại bào có liên quan đến chu

trình của các chất dinh dưỡng trong tự nhiên như chu trình pentose phosphate, chu trình tricarboxylic acid (Veith và ctv, 2004; Schallmey và ctv, 2004) Nó được sử dụng rộng rãi với quy mô lớn trong sản xuất công nghiệp như sản xuất các enzym (proteases, α-amylase, penicillinase, pentosanase, cycloglucosyltransferase, β-

mannanase), kháng sinh B licheniformis có thể tiết ra 20 - 25 g/lprotein

Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của B licheniformis là 50°C, nhưng nó cũng có thể

tồn tại ở nhiệt độ cao hơn

Hình 2.1: B licheniformis

(http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_licheniformis)

2.1.2 Các nghiên cứu về B licheniformis

Khả năng chuyển hóa kỵ khí đường và các dẫn xuất của đường như sorbitol,

gluconate và glucuronate của B lichenifomis đã được nghiên cứu Glucose được lên

men qua con đường lên men hỗn hợp acid thành acetate, 2,3-butanediol, ethanol, formate, lactate, succinate và pyruvate Tuy nhiên, vi khuẩn này không có khả năng

lên men các dẫn xuất ba glucose Khi B lichenifomis được ủ kỵ khí với đường trong

sự hiện diện của nitrate, các sản phẩm chuyển hóa giảm, formate không xuất hiện và acetate được tạo thành như là chất chuyển hóa chính Sự phát triển và sự hình thành

acetate cũng xảy ra khi lên men kỵ khí B licheniformis với từng dẫn xuất 3 glucose

khi có nitrate (Shariati và ctv, 1995)

Các chủng B licheniformis phân lập từ ruột cá trôi Ấn Độ (Labeo rohita) cho

thấy khả năng sử dụng dimethoate như là nguồn cacbon duy nhất Loại vi khuẩn này

sử dụng nhanh chóng dimethoate (hơn 0,6 mg/ml) và chúng có khả năng tăng trưởng tốt trong môi trường có chứa 0,45 mg/ml dimethoate (Mandal và ctv, 2005)

Gần đây, việc giải trình tự gen của chủng B licheniformis DSM13 đã được

hoàn tất, điều này cho phép nghiên cứu sâu hơn quá trình trao đổi chất và các khả năng tiềm ẩn của nó (Veith và ctv, 2004)

Nhiễm sắc thể của B licheniformis có một khu vực rộng lớn tương tự như B subtilis và B halodurans Khoảng 80% trong chuỗi mã hóa của B licheniformis chứa các gen cùng nguồn với B subtilis vì vậy nó được coi là một phần của nhóm subtilis- licheniformis Mặc dù nhiễm sắc thể tương tự như B subtilis nhưng giữa chúng có sự

khác nhau ở số lượng và vị trí của tiền phage, yếu tố chuyển vị, ngoại enzym và các operon của con đường biến dưỡng chất thứ cấp

Hai nhóm gen liên quan đến sự thoái hóa và sử dụng cellulose đã được tìm thấy

trong B licheniformis nhưng không có ở B subtilis Hai nhóm gen này giúp cho B licheniformis có khả năng sử dụng cellulose như nguồn carbon và năng lượng Cellulose được biến đổi thành cellobiose và cuối cùng là thành glucose B licheniformis ATCC14580 còn có khả năng phát triển trên carboxymethyl cellulose như nguồn cacbon duy nhất Những gen của B licheniformis ATCC 14580 còn mã hóa

thêm những hoạt tính carbohydrase do đó vi khuẩn có khả năng phát triển trên nhiều polysaccharides như: xylanase, endo-arabinase và pectate lyase giúp giảm hemicelluloses; α-amylase và α-glucosidase giúp thủy phân tinh bột; chitinases cho sự phân giải chito-oligosaccharides từ nấm và côn trùng; levanase cho sự sử dụng β-D-

fructans (levans) B licheniformis ATCC 14580 chiếm ưu thế về khả năng sử dụng

nitrogen từ bên ngoài (proteins, peptides, amino acids, ammonia, nitrate và nitrite) B licheniformis cũng có khả năng sử dụng amino và imino nitrogen từ arginine,

asparagine và glutamine thông qua arginine deiminase, arginase, asparaginase và glutaminase (Rey và ctv, 2004)

Một số điều kiện tăng trưởng của B licheniformis có thể bị ức chế bởi

bacitracin Hiệu quả ức chế của bacitracin chủ yếu trong giai đoạn đầu của quá trình

tăng trưởng Mức bacitracin cần thiết để ngăn cản sự phát triển của B licheniformis cao hơn nhiều lần so với các sinh vật nhạy cảm như Staphylcoccus aureus Do đó B licheniformis được coi là vi sinh vật có độ nhạy cảm thấp Các quá trình ức chế này

đòi hỏi sự có mặt của cadmium hoặc ion kẽm (Snoke và Cornell, 1965)

Feijoo và ctv (1997) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và áp suất lên mức

độ tiêu diệt bào tử của B licheniformis trong kem sữa Tỷ lệ tiêu diệt bào tử đạt cao

nhất là 68% khi nhiệt độ đầu vào là 50°C và áp suất 200.000 kPa

2.1.3 Tác hại

B licheniformis thường gây ra tình trạng hư hỏng bánh mì Vi khuẩn này sẽ làm

cho bánh mì dính và nhớt Các bào tử của vi khuẩn không bị giết chết trong quá trình nướng bánh (Pepe và ctv, 2003)

Các vụ ngộ độc thực phẩm từ sữa tươi, thức ăn cho trẻ em liên quan đến B licheniformis đã được nghiên cứu Mặc dù, B licheniformis thường gây hại cho đường

tiêu hóa nhưng nó cũng có thể gây hại đến các bộ phận khác của cơ thể Nó có thể gây

ra viêm mắt, sẩy thai và làm giảm tính di động tinh trùng Các độc tố sản xuất bởi B licheniformis có thể gây hại cho màng tế bào và làm thể đỉnh của tinh trùng sưng lên

Tuy nhiên nó không gây hại trên ty thể (Kampfer và ctv, 1999)

2.1.4 Ứng dụng

Năm 1960, việc sản xuất protease bằng B licheniformis theo phương pháp nuôi

cấy chìm đã được thực hiện (Chen và Tsai, 2006) Protease kiềm sản xuất bởi B

licheniformis được sử dụng để bổ sung vào chất tẩy rửa, loại bỏ vết máu và làm mềm

da trong công nghiệp thuộc da Protease này có khả năng hoạt động ở nhiệt độ thấp do

đó ngăn ngừa tình trạng co rút và phai màu quần áo (Thu Quỳnh Mai, 2010; Nadeem

và ctv, 2008; Shehri, 2004)

Amylase từ B licheniformis được sử dụng trong thủy phân tinh bột, công

nghiệp dệt, hồ dán (Gray và ctv, 1986; Stephens và ctv, 1984) B licheniformis có khả năng sản xuất cyclodextrin glycosyltransferase (EC 2.4.1.19) tốt nhất khi tinh bột

khoai tây được sử dụng như nguồn cacbon (Bonilha và ctv, 2006) B licheniformis A2 được phân lập từ ruột của loài bọ trong cây cọ đỏ (Rhynchophorus ferrugineus) có khả

năng sản xuất chitinase hoạt động tối ưu ở 70oC và pH = 5 (Khiyami và Masmali

2008) Ngoài ra B licheniformis còn có khả năng tổng hợp các loại enzym khác như elastase (Chen và ctv, 2007), tannase (Mohapatra và ctv, 2009)

Bacitrain tổng hợp từ đồng phân L- của amino acid bởi B licheniformis đã

được tinh sạch Phản ứng enzym phụ thuộc vào ATP và Mg2+ (hoặc Mn2+) Khi đồng phân L- của glutamic acid, ornithine, phenylalanine hay asparagine được thay thế bởi các đồng phân D tương ứng, sự tổng hợp bacitracin vẫn xảy ra ngoại trừ trường hợp

của D-ornithine (Froyshov và Laland, 1974) Bacitracin được sản xuất bởi B

licheniformis là một hỗn hợp của ít nhất 5 polypeptide Kháng sinh này gồm có 3 hợp

chất riêng là kháng sinh A, B, C Kháng sinh A thì chiếm ưu thế hơn so với hai loại còn lại Nó hoạt động chống lại nhiều vi khuẩn gram dương như Staphylococcui, Streptococci, Corynebacter và Clostridia nhưng hầu như không chống lại vi khuẩn

gram âm (AL-Janabi, 2006)

Lin và ctv (2002) đã nghiên cứu các phản ứng sinh hóa của B licheniformis

R08 với Pd2+ bằng các kỹ thuật quang phổ học để tạo điều kiện phát triển phương pháp

xử lí nước ở các vùng bị ô nhiễm Ngoài ra nó còn có khả năng phục hồi của các ion kim loại quý

B licheniformis còn được sử dụng để sản xuất một polymer không nhớt không

hòa tan trong nước Polymer này dùng như một tác nhân để bịt kín các mao quản ở vùng đất cao giúp quản lý và lưu trữ phân bón Phân được lưu trữ sẽ giảm chi phí, tăng

hiệu quả sử dụng và an toàn môi trường đất Là một sinh vật sống trong đất nên B licheniformis có khả năng cạnh tranh với phần lớn các loài phổ biến trong đất như Arthrobacter và Bacillus (Ghaly và ctv, 2007)

Chủng B licheniformis SB3086 là thành phần hoạt chất của thuốc trừ nấm vi

sinh để sử dụng trên các bãi cỏ, các loài cây lá kim, thảm cỏ trang trí và vườn ươm (US Environmental Protection Agency Office of Pesticide Programs, 2001)

Govender (2005) đã nghiên cứu khả năng chống lại Colletotrichum gloeosporioides và Botryosphaeria parva, là các tác nhân gây hư hỏng xoài sau thu hoạch, của B licheniformis trong điều kiện ống nghiệm

Các nhà nghiên cứu đang cố gắng để biến lông chim thành một thức ăn chăn

nuôi bằng cách lên men protein không tiêu hóa trên lông chim với B licheniformis Khả năng B licheniformis gây ra những thay đổi về màu sắc ở lông chim cũng được

nghiên cứu (Thu Quỳnh Mai, 2010)

B licheniformis PTCC 1595 đã được nghiên cứu sản xuất chất nhũ hóa sinh

học Chất hoạt động bề mặt sinh học có một số lợi thế hơn so với chất hoạt động bề mặt hóa học như độc tính thấp hơn, thân thiện với môi trường hơn, tạo bọt cao hơn, tính chọn lọc cao và có thể hoạt động ở nhiệt độ khắc nghiệt (Noudeh và ctv, 2007)

Chất hoạt động bề mặt sinh học được sản xuất từ B licheniformis ở vịnh Ba Tư có khả

năng làm giảm sức căng bề mặt từ 72 xuống 35 mN/m (Rismani và ctv, 2006)

2.2 Tổng quan về enzym lipase

2.2.1 Cấu tạo

Lipase (EC 3.1.1.3) thuộc lớp enzym thủy phân có khả năng thủy phân triglycerit thành di, mono glycerit hoặc glycerol và acid béo nhờ khả năng hoạt động trên bề mặt dầu-nước Hơn nữa lipase còn thủy phân một số ester khác như thiol, polyol hay polyacid ester Ngoài ra lipase còn có thể được sử dụng để tổng hợp các acyglyceride (Treichel, 2010; Amara và ctv, 2009)

2.2.2 Cấu trúc

Van Pouderoyen và ctv (2001) đã xác định được cấu trúc bậc 3 của lipase từ B subtilis bằng tinh thể học tia X ở độ phân giải 1,5 Đây là cấu trúc đầu tiên được xác định của một thành viên tronghọ I.4 của lipases vi khuẩn.Các lipase của B subtilis có

dạng hình cầu với kích thước 35 Ao x 36Ao x 42Ao Đây là enzyme một cấu tử có cấu trúc cuộn α/β nhỏ với một tấm β có 6 sợi song song và 5 xoắn α hai trên một mặt của

tấm và ba ở mặt khác Các xoắn của lipase B subtilis tương tự như xoắn α/β của enzym thủy phân khácSo sánh cấu trúc bậc 2 của lipase B subtilis và của enzym thủy phân thông thường cho thấy rằng lipase B subtilis thiếu hai sợi β (β1 và β2) đầu tiên

so với các xoắn thông thường và xoắn αD được thay thế bởi một xoắn nhỏ 310 Hơn nữa, xoắn αE nhỏ khác thường với chỉ một lượt xoắn ốc và một số một xoắn α bắt đầu

hoặc kết thúc với 310 Bộ ba xúc tác Ser77, Asp133 và His156 và các phần còn hình thành nên lỗ trống ái oxy (nhóm amit chính của Ile12 vàthì ở vị trí tương tự như những lipase có cấu trúc bậc 3 đã được biết đến khác.Tuy nhiên, nó không có nắp và vị trí hoạt động Ser77 thì tiếp xúc với dung môi

Hình 2.2: Cấu trúc lipase của B subtilis (van Pouderoyen và ctv, 2001)

(Với bộ ba xúc tác Ser77, His156 và Asp133 được ký hiệu lần lượt là S, H và D Chữ cái N và C biểu thị cho đầu N và đầu C)

Có thể được chia thành 5 nhóm nhỏ sau:

Ester hóa (esterification) (1)

Ester hóa tương hỗ (interesterification) (2)

RCOOR1 + R2COOR3 RCOOR3 + R2COOR1

Rượu phân (alcoholysis) (3)

RCOOR1 + R2OH RCOOR2 + R1OH

Acid phân (acidolysis) (4)

RCOOR1 + R2COOH R2COOR1 + RCOOH

Amino phân (aminolysis) (5)

RCOOR1 + R2NH2  RCONHR2 + R1OH

3 nhóm (1), (2), (3) thường được gọi chung là tranesterification

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp lipase

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzym Những đặc điểm về tính chất, sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật có ý nghĩa quyết định hơn cả Không phải tất cả mọi vi sinh vật đều có khả năng sinh tổng hợp enzym như nhau, ngay cả trong những chủng cùng chi,

cùng loài cũng có thể rất khác nhau về sản lượng enzym Trong số 4 chủng B pumilus

(SG1, SG2, SG3 và SG4) thì B pumilus SG2 có khả năng sản xuất lipase vượt trội hơn

cả (Sangeetha và ctv, 2008) Ngoài việc tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp các hệ enzym có hoạt tính cao còn cần phải tiến hành nuôi cấy chúng trong các điều kiện tối ưu nhằm đảm bảo khả năng sinh tổng hợp và duy trì hoạt lực enzym của chúng

2.2.4.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng

Thành phần môi trường là nhân tố có tác động quan trọng đến sự phát triển cũng như quá trình tổng hợp enzym của vi sinh vật Vi sinh vật thường phát triển trên môi trường dinh dưỡng có chứa nguồn cacbon (dầu ăn), nguồn nitơ, nguồn photpho, khoáng đa lượng (K, Ca, Mg, Fe) và các yếu tố vi lượng Ngoài ra để vi sinh vật sinh tổng hợp enzym tốt cũng cần phải cung cấp các chất cảm ứng đặc trưng riêng cho từng enzym

2.2.4.1.1.Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Có nhiều nguồn cacbon để lên men sinh tổng hợp lipase: các loại dầu thực vật, tinh bột và các tween (Dutta và Ray, 2009; Mori và ctv, 2009; Dutra và ctv, 2008) Dầu olive là nguồn cacbon tốt cho Penicillium aurantiogriseum, Fusarium oxysporum

sinh tổng hợp lipase (Rifaat và ctv, 2010; Lima và ctv, 2003) Tween 20 ở nồng độ 0,8% kích thích sự tổng hợp lipase của Staphylococcus epidermidis CMST Pi 2 cao

hơn so với các tween khác (Esakkiraj và ctv, 2010) Tuy nhiên, Tween 80 lại có ảnh

hưởng tốt lên khả năng sinh tổng hợp lipase bởi B licheniformis, Serratia marcescens ECU1010, Staphylococcus sp Lp12 (Sangeetha và ctv, 2010; Zhao và ctv, 2009,

Pogaku và ctv, 2010)

2.2.4.1.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nitơ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự sinh tổng hợp của nhiều enzym vì nitơ là nguồn cung cấp vật liệu (nguyên tố nitơ) cho quá trình sinh tổng hợp protein Peptone,

dịch chiết malt và casein là nguồn nitơ thích hợp cho sự sản xuất lipase của Fusarium oxysporum (Rifaat và ctv, 2010) Bột rượu bắp sấy khô là nguồn nitơ rẻ tiền có thể thay thế dịch chiết thịt bò trong quá trình sinh tổng hợp lipase của Serratia marcescens ECU1010 (Zhao và ctv, 2009) Lin và ctv (1996) đã nhận thấy lipase kiềm của P alcaligenes F-111 được tổng hợp tốt nhất khi môi trường chứa bột đậu nành (1%),

peptone (1,5%) và dịch chiết nấm men (0,5%)

2.2.4.1.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng

Các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trường và sinh tổng hợp lipase của vi sinh vật Sự sản xuất lipase của Bacillus sp LBN 4 tốt nhất với sự có mặt của Na+ kế đến là K+ và Mg2+ trong môi trường lên men (Bora và Kalita,

2009) Lipase sản xuất bởi P alcaligenes F-111 bị ảnh hưởng khi môi trường được bổ

sung thêm Mg2 + (Lin và ctv, 1996)

2.2.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi

Điều kiên nuôi có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Điều kiện nuôi ở đây bao gồm các yếu tố pH, độ thông khí, mật độ tế bào

thường thích hợp cho sự phát triển cũng như quá trình sinh tổng hợp lipase của vi

khuẩn Sự sản xuất lipase của Amycolatopsis mediterranei DSM43304 tốt nhất ở pH

của môi trường ban đầu là 7,5 (Dheeman và ctv, 2010) Sản lượng lipase của

Staphylococcus sp Lp12 tăng từ 1 đến 3 đơn vị khi pH môi trường tăng dần từ 4 đến 8 (Pogaku và ctv, 2010) B pumilus SG2 sản xuất lipase tốt nhất ở điều kiện kiềm (pH = 9,0) pH trên hoặc dưới giá trị này sản lượng enzym giảm đáng kể (Sangeetha và ctv,

2008) Pseudomonas sp chủng S5 không tạo lipase trong môi trường axit (pH 3 và 5)

hoặc môi trường quá kiềm (pH 11) Lipase được sản xuất tối đa khi pH môi trường là

7 Ở pH = 9, sản lượng lipase giảm đến 80% (Baharum và ctv, 2003)

2.2.4.2.2 Độ thông khí

Rifaat và ctv (2010) đã nhận thấy sự thông khí có ảnh hưởng đến sản lượng lipase Các nghiên cứu cho thấy, tăng nồng độ ôxy làm tăng lượng lipase Sự sản xuất

lipase của Fusarium oxysporum tăng khi tốc độ trao đổi oxy tăng Tuy nhiên sự sản

xuất lipase bị ức chế hoàn toàn với chế độ lắc 200 vòng/phút ở mọi tỷ lệ giống.Tăng

hệ số trao đổi oxy từ 26 lên 38 h-1 làm cho sự sản xuất lipase của Staphylococcus warneri EX17 tăng xấp xỉ 4 lần và đạt sản lượng cao nhất là 800 U/L (Volpato và ctv,

2009)

2.2.4.2.3 Mật độ tế bào

Số lượng tế bào vi sinh vật cũng có ảnh hưởng lớn tới sinh tổng hợp lipase Sự

sản xuất lipase của Amycolatopsis mediterranei DSM 43304 tăng khi tỷ lệ giống tăng

và ở tỷ lệ giống 10% (v/v) lipase được tạo thành nhiêu nhất Tuy nhiên khi tỷ lệ giống tăng quá cao thì quá trình sinh tổng hợp enzym lại giảm (Dheeman và ctv, 2010)

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của lipase

2.2.5.1 Nhiệt độ

Nói chung, lipase có thể hoạt động trong khoảng nhiệt độ khá rộng Lipase của động vật và thực vật thường chịu nhiệt kém hơn so với lipase của vi sinh vật Lipase của tuyến tụy mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 40oC trong khi lipase từ Asp niger ổn định

ở 50oC (Öztürk, 2001)

Lipase từ các Bacilli ưa nhiệt hoạt động ở nhiệt độ cao hơn so với các sinh vật

ưa ấm Lipase từ Pseudomonas sp ưa ấm có hoạt tính dưới 50oC, nhưng cũng có thể

hoạt động ở vùng nhiệt độ cao hơn (Lin và ctv, 1996) Lipase từ hạt quả óc chó hoạt

động tối ưu ở 80oC (Yesiloglu và Demirkan, 2009)

Ngày nay để tăng khả năng chịu nhiệt của enzym người ta thường cố định enzym trong các chất nền khác nhau

2.2.5.2 pH

Tác động của pH lên hoạt tính của lipase phụ thuộc vào nguồn gốc của nó Mặc

dù lipase có khoảng pH hoạt động khá rộng từ 4,0 đến 10,0 nhưng pH tối ưu của phần lớn lipase trong khoảng từ 7,0 đến 9,0 (Öztürk, 2001)

Lipase của nấm Malassezia furfur có pH tối ưu ở vùng acid cũng như ở vùng

kiềm (Brunke và Hube, 2006) Lipase do Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis hoạt động mạnh ở vùng acid (Ingham và ctv, 1981; Dupis và ctv, 1993)

Lipase được sản xuất bởi Escherichia coli BL21(DE3), Alcaligenes, B cereus,

B subtilis có khả năng hoạt động tốt ở pH kiềm (Rabbani và ctv, 2009; Mori và ctv,

2009; Dutta và Ray, 2009, Ma và ctv, 2006)

2.2.5.3 Hoạt đ ộ nước

Dựa theo ảnh hưởng của hoạt độ nước lên hoạt tính của lipase có thể chia lipase

thành 3 loại

Loại thứ nhất là lipase hoạt động tối ưu ở hoạt độ nước thấp Newlase F

(Rhizopus niveus), lipase FAP-15 (Rhizopus oryzae) hoạt động tối ưu ở aw 0,19

Loại thứ hai là lipase hoạt động tốt ở hoạt độ nước trung bình Hầu hết các

lipase thuộc loại này và hoạt độ nước tối ưu trong loại này là khoảng 0,60

Loại thứ ba là lipase hoạt động tốt ở hoạt độ nước cao (aw > 0,75) Lipase của

mầm lúa mì thuộc loại này và hoạt động tối ưu ở aw 0,90 (Xia và ctv, 2009)

2.2.5.4 Ion kim loại

Tùy vào nguồn gốc của lipase mà hoạt tính của nó có thể bị ảnh hưởng bởi một

lượng nhỏ ion kim loại Các ion như Fe3+, Co2+ làm hoạt tính của lipase giảm đến 95%

(Ahmed và ctv, 2009) Ở nồng độ 1mM SeO2 và Li2SO4 làm hoạt tính của enzym

trong cám gạo giảm tương ứng 78 và 71% (Gangadhara và ctv, 2009)

Trái lại, Ca2+ (1 mM), Co2+ (0,1 mM) và Cu2+ (0,1 mM) lại có khả năng làm

tăng hoạt tính của lipase từ B cereus C7 (Dutta và Ray, 2009) Lipase của P

alcaligenes F-111 không chịu ảnh hưởng của các chất tẩy rửa khác nhau Các chất hoạt

động bề mặt như sodium tripolyphosphate, sodium dodecyl benzene sulfonatevà

sodium alkyl benzene sulfonate không ảnh hưởng lên hoạt tính của enzym Vì vậy

enzyme này rất thích hợp để áp dụng vào các chất tẩy rửa (Lin và ctv, 1996)

Bảng 2.1: Các tác nhân ức chế và xúc tác hoạt động của lipase vi khuẩn

Humicola

lanuginose Co

2+, Ni2+, Cu2+, Sn2+, Hg2+ K+, Ca2+

(Fadõloğlu và Söylemez, 1997)

2.2.6 Nguồn thu nhận

Lipase có thể được thu nhận từ động vật, thực vật và vi sinh vật (Treichel và ctv, 2010;Dutra và ctv, 2008) Nhưng nguồn lipase chủ yếu được tạo ra từ vi sinh vật đặc biệt là nấm mốc, vi khuẩn và nấm men (Esakkiraj và ctv, 2009; Volpato và ctv,

2009)

2.2.6.1 Động vật

Nồng độ lipase trong tuyến tụy nhiều hơn 100 lần so với trong gan, ruột tá, ruột non Dựa theo khối lượng, tuyến tụy chứa nhiều lipase hơn 35 – 40 lần so với toàn bộ máy tiêu hóa

Nguồn lipase cũng đã được tìm thấy ở nơi khác trong đường tiêu hóa của con người, ví dụ như bóng tá tràng, xoang môn vị, trong lưỡi, dạ dày và thực quản, bạch cầu, mô mỡ, huyết thanh, phổi và sữa (Tietz và Shuey, 1993)

Lipase còn được thu nhận từ ruột cá trắm cỏ (Labeo rohita), vây của cá lia thia (Cirrhinus reba) (Nayak và ctv, 2004; Islam và ctv, 2009) Amara và ctv (2009) đã

tinh sạch lipase từ hệ tiêu hóa của ốc sên (Eobania vermiculata) SnDL tinh sạch có

khối lượng khoảng 60 kDa Nó tác động lên các chuỗi triacylglycerol mạch ngắn tốt hơn các triacylglycerol mạch dài

2.2.6.2 Thực vật

Lipase thực vật đa số được tìm thấy trong ngũ cốc và các hạt lấy dầu Trong những năm gần đây đã có sự quan tâm nghiên cứu lipase từ thực vật vì chúng rẻ, dễ tinh sạch, rất linh hoạt và ổn định trong môi trường hữu cơ (Chen và Tsai, 1960)

Lipase từ các họ thực vật Asclepiadaceae, Euphorbiaceae, Caricaceae, hoặc Rosaceae đã có nhiều ứng dụng Nhiều nghiên cứu về một số đặc điểm sinh hóa và tinh sạch lipase từ hạt óc chó trong phòng thí nghiệm đã được thực hiện (Yesiloglu và Demirkan, 2009; Maeshima và Beevers, 1985; Moreau và ctv, 1980) Lipase từ hạt thầu dầu mất khoảng 20% hoạt tính ở 60oC trong 30 phút ở pH 7,0 (Ory và ctv, 1960) Lipase từ cám gạo xúc tác thủy phân các mối liên kết este chủ yếu trong chất béo trung tính như các triglyceride (Gangadhara và ctv, 2009)

Hai loại lipase đã được tìm thấy trong nội nhũ của hạt thầu dầu (Ricinus communis L.) Một loại có pH tối ưu là 5,0 (lipase acid) hoạt động mạnh trong suốt 2

ngày đầu của giai đoạn nẩy mầm Loại thứ hai tối ưu ở pH kiềm (lipase kiềm) hoạt

động tốt từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 5 (Muto và Beevers, 1974)

Lipase còn được tìm thấy trong Babaco (Carica pentagona Heilborn) - một cây

trong họ đu đủ có nguồn gốc ở vùng núi cận nhiệt đới của Ecuador Lipase này có tốc

độ rượu phân sau 24h nhanh hơn 1,3 lần và tốc độ ester hóa nhanh gấp gần 6 lần so với dạng papain thô (Mayer và ctv, 2003)

oxysporum sản xuất lipase tốt nhất trong điều kiện nuôi cấy chìm, hoạt tính enzym đạt

16,0 U/ml trong môi trường lỏng (Rifaat và ctv, 2010)

Vi sinh vật sinh tổng hợp lipase chủ yếu được phân lập từ đất và nơi chứa dầu thực vật Nhiều lipase có những tính chất đặc biệt được sinh tổng hợp bởi những vi sinh vật phân lập từ Alaska và Siberi (Choo và ctv 1998), suối nước nóng (Olusesan và ctv, 2009) và những nơi có nồng độ đường hoặc muối cao (Camacho và ctv, 2009; Elwan và ctv, 1985)

2.2.7 Ứng dụng

Lipase tác động đến nhiều vị trí khác nhau trên các cơ chất, do đó, nó được ứng dụng nhiều trong công nghiệp: thực phẩm, hoá học, dược phẩm, mỹ phẩm, thuộc da và công nghiệp tẩy rửa

Bảng 2.2: Ứng dụng của lipase trong các ngành công nghiệp

Bánh mì Cải thiện mùi vị và kéo dài thời

gian bảo quản

Bánh mì

Hóa chất Chọn lọc đồng phân Hóa chất và các dạng thuốc

Tẩy rửa Tổng hợp

Thủy phân

Hóa chất Loại bỏ vết bẩn bề mặt

Sữa Thủy phân mỡ sữa

Làm chín phomat Cải biến chất béo của bơ

Tác nhân tạo mùi Phomat

Nước chấm Cải thiện chất lượng Mayonnaise, nước sốt và

whippings và các loại nhũ như kem và trứng

Thực phẩm

dinh dưỡng

Transesterification Thực phẩm dinh dưỡng

Thịt và cá Tăng hương vị và loại bỏ chất

2.2.7.1 Trong công nghệ thực phẩm

Lipase có tác dụng cải thiện đặc tính của bột nhào làm tăng khả năng giãn nở, giảm tính dính của bột nhào nhờ đó bột có thể cắt bằng máy một cách dễ dàng Lipase còn làm tăng thể tích và làm cho bánh xốp hơn Lipase thủy phân một phần triglyceride để làm tăng hàm lượng monoglyceride cho phép làm chậm đi quá trình thoái hóa tinh bột (Horsmans và ctv, 2005; Rey và ctv, 2003)

Lipase có vai trò làm chín, tăng hương vị và chất lượng phomat Lipase từ R miehei và chủng Aspergilli được thương mại hóa và sử dụng trong một vài loại phomai

Ý (Aehle, 2004; Chang và ctv, 2003)

Các ester có khối lượng phân tử thấp được tổng hợp nhờ lipase dùng làm chất tạo mùi bổ sung vào các sản phẩm như bơ, rượu, mứt, kẹo (Chang và ctv, 2003) Ester saccharide–acid béo, monoglycerides và diglycerides là chất nền, chất nhũ hóa phân hủy sinh học quan trọng trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm được sản xuất bởi

lipase của R miehei, C antarctica B, Burkholderia cepacia (Fregolente và ctv, 2009;

Freitas và ctv, 2009; Valério và ctv, 2009; Ye và ctv, 2009; Fregolente và ctv, 2008)

Các loại dầu thực vật rẻ tiền, chất lượng thấp có thể được nâng cao chất lượng nhờ sử dụng lipase Lipase có tác dụng cải biến các triacyglycerol bằng cách thay thế các axít béo no bởi cácaxít béo không no, trong dung môi hiếm nước

Ví dụ: Lipozyme được dùng để sản xuất bơ cacao từ dầu cọ và các axít stearic

để sử dụng trong công nghiệp chế biến đồ hộp (Björkling và ctv, 1991)

Trong quá trình sản xuất bia và các thức uống có cồn khác, chất béo có trong hạt lúa mạch sẽ kết hợp với tinh bột gây cản trở quá trình lọc Ngoài ra, sau khi lọc hèm các lipit trong ngũ cốc còn gây mùi hôi, mất hương vị, không ổn định bọt Vì vậy, lipase từ vi sinh vật thường được bổ sung vào bia để khắc phục các bất lợi trên (Jerome và Marie, 1999)

2.2.7.2 Trong mỹ phẩm

Lipase xúc tác phản ứng ester hóa glycerol tạo thành monoacylglycerol và diacylglycerol là chất hoạt động bề mặt hiệu quả được ứng dụng trong mỹ phẩm (Katada và ctv, 1992)

Lipase từ C antarctica được dùng trong tổng hợp flavonoids (quercetin,

hesperidin, rutin và esculin) Nhiều thành phần của flavonoids này được ứng dụng trong dược phẩm, mỹ phẩm (Ardhaoui và ctv, 2004)

Việc bổ sung lipase vào axít béo chuỗi ngắn (C4 và C6) và axít béo chuỗi trung bình (C12 và C14) dẫn đến sự phát triển của hương thơm cho sản phẩm xà phòng (Vulfson, 1994)

2.2.7.3 Trong công nghiệp thuộc da, công nghiệp giấy

Lipase và protease kiềm có khả năng làm tăng hiệu quả tẩy nhờn, giảm hóa chất

sử dụng trong quá trình thuộc da do đó hạn chế bớt tác động xấu đến môi trường Việc ứng dụng lipase kiềm chịu nhiệt giúp giảm được lượng lớn nước sử dụng nhờ đó nó đem lại hiệu quả kinh tế cao (Afşar và Çetinkaya, 2008)

Ví dụ: người ta sử dụng lipase từ Rhizopus nodosus để xử lí tẩy nhờn lông cừu

Enzym sử dụng trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy ngày càng thu hút được sự nghiên cứu trong những năm gần đây Các enzym được sử dụng chủ yếu là cellulases, hemicellulases, resinases, lipase, v.v… (Kenealy và Jeffries, 2003). Lợi ích của việc sử dụng enzym giúp giảm năng lượng tiêu thụ, giảm chi phí sử dụng sợi (tức

là sử dụng nhiều chất xơ thứ cấp hơn), giảm chi phí tẩy trắng Tại nhà máy Yatusushiro (Groundwood bột giấy, 160 tấn / ngày) resinase A từ Novo Nordisk (lỏng)

thu được từ Aspergillus, lipase AYL (chất lỏng) được sản xuất từ C rugosa và lipase

OF (bột) sản xuất từ C cylindracea được sử dụng Khoảng 500 -1000 ml các enzym

dạng lỏng đã được bổ sung mỗi tấn bột giấy và các loại enzym dạng bột đã được bổ

sung ở mức 80 - 120 g / tấn (Augusto, 1994).

2.2.7.4 Trong y học

Novozyme 435 (lipase của C antarctica được cố định trên polyacrylic resin) có

khả năng ester hóa L-carnitine với acid linoleic liên hợp trong dung dịch [Bmim] PF6 (1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate) tạo thành linoleoyl-L-carnitine liên hợp Linoleoyl-L-carnitine liên hợp được biết đến như tác nhân hạ đường huyết,

giảm mỡ máu, hạ huyết áp và chống loãng xương (Tian và ctv; 2009)

Lipase từ P cepacia IAM1507 được dùng trong các liệu pháp để điều trị rối

loạn tiêu hóa do thiếu men tiêu hóa ở các bệnh nhân suy tuyến tụy mãn tính Lipase A

từ C antarctica được sử dụng để ngăn ngừa đột quỵ (Uhm và ctv, 2007; Braatz và ctv, 1997), lipase B từ C antarctica xúc tác quá trình tổng hợp capsiate từ capsaicin

(Ishihara và ctv, 2010)

Yamauchi và ctv (2005) đã nghiên cứu dùng lipase của Burkholderia cepacia

xúc tác phản ứng ester hóa chọn lọc dùng để tinh sạch archidonic acid (AA)

Lipase từ Thermosyntropha lipolytica xúc tác quá trình tổng hợp

diacylglycerols hỗ trợ việc giảm cân ở những bệnh nhân béo phì (Salameh và Wiegel, 2009; Maki và ctv, 2002)

2.2.7.5 Trong công nghiệp tẩy rửa, xử lý nước thải

Những ứng dụng của lipase mang lại giá trị thương mại chủ yếu trong lĩnh vực chất tẩy rửa Có đến 32% tổng số lipase dùng trong công nghiệp giặt tẩy Ước tính khoảng 1000 tấn enzym lipase dùng để sản xuất 13 tỉ tấn bột giặt mỗi năm Lipase được sử dụng trong nước rửa bát, dĩa, tác nhân làm sạch và chức năng tẩy trắng (Moeller và ctv, 1995) Cơ chế tác dụng làm sạch vết bẩn của enzym là phân giải chất bẩn thành các đoạn, các phần có khối lượng phân tử thấp hơn, dễ hòa tan hơn Lipase

có thể thủy phân các vết bẩn dầu/ mỡ ở nhiệt độ thấp hơn 40oC (Jars, 1992)

Lipase còn được sử dụng trong các bùn hoạt tính và các quy trình xử lý chất thải hiếu khí mà trong đó lớp lipit mỏng trong bề mặt bình hiếu khí được liên tục loại

bỏ để cho phép oxy xâm nhập vào (Vakhlu và Kour, 2006) Lipase từ Bacillus spp có

tên thương mại EX-M có khả năng giảm 99,36% dầu mỡ trong nước thải (Siripornadulsil và Labteephanao, 2008)

2.2.7.6 Trong công nghiệp hóa dầu, nông nghiệp

Lipase được sử dụng rộng rãi trong phản ứng ester hóa của nhiều loại axít carboxylic như axít béo với alcohols Khi lipase được sử dụng thì những phản ứng này

có thể xảy ra ở nhiệt độ phòng đến khoảng 70oC Do đó sử dụng lipase giúp giảm bớt chi phí năng lượng so với phương pháp sử dụng hóa chất Hơn nữa mức độ an toàn của phản ứng cũng cao hơn do lipase là chất xúc tác tự nhiên (Negishi và ctv, 2007)

Lipase được sử dụng trong nông nghiệp giúp bảo vệ cây trồng khỏi sự phá hại của côn trùng và hiệu quả có thể được duy trì lâu dài (McCutchen và ctv, 2007)

2.2.7.7 Dầu sinh học

Dầu sinh học có thể được tổng hợp từ các nguồn khác nhau như dầu thực vật,

mỡ động vật hoặc chất thải bột giấy bằng cách transesterification với một rượu như methanol hoặc ethanol (Karout, 2009) Dầu sinh học giảm thiểu ô nhiễm sulfur oxit

nên rất thân thiện với môi trường (Jaeger và Eggert, 2002) Với khả năng tái sinh dầu sinh học có thể thay thế dầu mỏ (Lee và ctv, 2009)

Lipase xúc tác phản ứng dưới điều kiện ôn hòa cho nên giúp giảm bớt chi phí trong tiêu thụ năng lượng và đầu tư thiết bị (Xu và ctv, 2009; Lee và ctv, 2009)

Xu hướng đang được áp dụng gần đây là cố định lipase của B subtilis, Burkholderia cepacia , C antarctica trong các chất nền khác nhau để có thể tái sử

dụng được nhiều lần (Dutra và ctv, 2008; Ying và Chen, 2007; Watanabe và ctv, 2005;

Bernardes và ctv, 2005) Trong các điều kiện tối ưu, kết quả đạt được khi cố định

lipase của Burkholderia cepacia trong к- carrageenan đầy hứa hẹn, gần 100% nguyên

liệu chuyển đổi sản được chuyển thành dầu sinh học (Kenthorai và ctv, 2009) Năng lượng dầu sinh học đã cho thấy nhiều triển vọng trong thập kỷ qua

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm đã được tiến hành tại phòng thí nghiệm hóa sinh thuộc viện công nghệ sinh học và thực phẩm đại học Công Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 8/03/2010 đến 30/06/2010

3.2 Nguyên liệu

3.2.1 Chủng vi sinh vật

B licheniformis GBDTY1 được cung cấp từ bộ sưu tập giống sản xuất chế

phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi thú y và nuôi trồng thủy hải sản của Công ty trách nhiệm hữu hạn Phát triển Công nghệ sinh học Toàn cầu

- Và một số thiết bị thông thường khác

3.2.4 Môi trường nghiên cứu

Môi trường hoạt hóa chủng B licheniformis (môi trường NB):

- Pepton 5 g

3.3.1 Thí nghiệm xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn

Vi khuẩn được nuôi trong 100ml môi trường NB dưới điều kiện lắc ở nhiệt độ phòng

Nồng độ sinh khối tế bào được đo ở bước sóng 620nm (Rismani và ctv, 2006) sau các khoảng thời gian 0h, 5h, 10h, 15h, 20h… để xác định mức độ tăng trưởng của

vi khuẩntừ đó tìm ra thời điểm bổ sung giống thích hợp (tuổi của giống)

3.3.2 Thí nghiệm xác định thành phần môi trường

Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các thành phần môi trường lên hoạt tính của lipase được tiến hành qua hai bước: thí nghiệm sàng lọc và thí nghiệm chính

tố được liệt kê trong bảng 3.1 Các biến số và khoảng biến thiên của các biến số được xác định dựa vào các kết quả nghiên cứu đã được công bố trên một số tạp chí khoa học được liệt kê bên dưới

 Bayoumi R.A., El-louboudey S.S., Sidkey N.M., và Abd-El-Rahman M.A.,

2007 Production, purification and characterization of thermoalkalophilic lipase

for application in bio-detergent industry Journal of Applied Sciences Research

3(12): 1752 - 1765

 Dutta S., và Ray L., 2009 Production and characterization of an alkaline thermostable crude lipase from an isolated strain of Bacillus cereus C7 Applied Biochemistry and Biotechnology 159: 142 - 154

 Rahman R.N.Z.R.A., Baharum S.N., Salleh A.B., và Basri M., 2006 S5 Lipase:

an organic solvent tolerant enzym The Journal of Microbiology 44(6): 583 -

590

 Sangeetha R., Geetha A., và Arulpandi I., 2010 Concomitant production of

protease and lipase by Bacillus licheniformis VSG1: production, purification and characterization Brazilian Journal of Microbiology 41(1)

3.3.2.2 Thí nghiệm chính

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm chính được thực hiện để xác định tỷ lệ thích hợp của các yếu tố có ảnh hưởng lớn lên sản lượng enzym lipase Thí nghiệm có 1 chỉ tiêu theo dõi: sản lượng lipase (U/ml dịch cấy)

Thí nghiệm chính được bố trí theo phương pháp bề mặt đáp ứng kiểu kết hợp có tâm (cơ sở lý thuyết của thí nghiệm được trình bày trong phụ lục 6) để khảo sát ảnh hưởng kết hợp của 3 yếu tố CaCl2, tỷ lệ giống, dịch chiết nấm men lên sản lượng enzym lipase Dựa vào kết quả thu được từ những thí nghiệm sàng lọc, phần mềm

Design Expert 7.0.0 sẽ bố trí những nghiệm thức của thí nghiệm chính

Ba yếu tố có ảnh hưởng chính được xác định giá trị tối ưu và được nghiên cứu ở 5 mức (-α, -1, 0, +1, +α) (Bảng 3.3) trong 20 thí nghiệm (Bảng 3.4)

Hàm đáp ứng được chọn là sản lượng lipase (Y, U/ml dịch nuôi cấy) Mô hình hóa được biểu diễn bằng phương trình bậc 2:

Y = bo + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b11x12 + b22x22 + b33x32 + b12x1x2 + b23x2x3 + b13x1x3

Trong đó b1, b2, b3 là các hệ số bậc 1; b11, b22, b33 là các hệ số bậc 2; b12, b23, b13

là các hệ số tương tác của từng cặp yếu tố; x1, x2, x3, x11, x22, x33, x12, x23, x13 là các biến độc lập Số liệu được phân tích bằng chương trình Design expert 7.0.0® của Stat-Ease Inc.USA Từ kết quả phân tích xác định mức tối ưu của các yếu tố cho sản lượng lipase đạt cực đại

Bảng 3.1: Các biến trong ma trận Plackett-Burman

Mức -α -1 0 +1 +α

x1 CaCl2 (%w/v) 0,16 - 1,84 0,16 0,5 1,0 1,5 1,84

x2 Tỷ lệ giống (% v/v) 3.30 - 11,7 3,30 5,0 7,5 10 11,7

x3 Chiết nấm men (%w/v) 0,32 - 3,68 0,32 1 2 3 3,68

Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm theo RSM-CCD để tối ưu hóa sản lượng lipase

19 0 0 0

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp vi sinh vật

Chủng B licheniformis được hoạt hoá trong môi trường hoạt hoá ở nhiệt độ

thường, điều kiện nuôi cấy lắc trong khoảng thời gian thích hợp Sau đó tiến hành nuôi cấy sinh tổng hợp lipase bằng phương pháp nuôi cấy chìm trong môi trường sinh tổng hợp ở nhiệt độ thường, điều kiện nuôi cấy lắc trong 72 giờ (Bayoumi và ctv, 2007)

3.4.2 Phương pháp hoá sinh

Phương pháp xác định hoạt độ lipase bằng chuẩn độ (Soares và ctv, 1999 trích bởi Souza và ctv, 2009)

 Nguyên lý

Dựa trên khả năng xúc tác thuỷ phân lipit của lipase, xác định lượng acid béo tạo ra trong 60 phút bằng lượng NaOH cần bổ sung làm đổi màu chất chỉ thị Hiệu số giữa lượng NaOH sau và trước khi bổ sung enzym đặc trưng cho hoạt tính xúc tác của lipase

 Cách xác định

o 10 ml nhũ tương + 2 ml dung dịch đệm sodium phosphate

o 1ml enzym

o Ủ 37oC trong 60 phút

o Thêm 25 ml dung dịch aceton:etanol

o 1 giọt phenolphthalein

o Chuẩn độ bằng KOH 25 mM

o Làm mẫu trắng tương tự nhưng không ủ ấm mà cho 10 ml dung dịch aceton:ethanol vào ngay

 Đơn vị hoạt độ lipase

Một đơn vị hoạt độ lipase (U) được xác định như là lượng enzym có khả năng chuyển hoá tạo 1 µmol axít béo trong thời gian 1 phút

Hoạt độ lipase trong 1ml dịch nổi được tính theo công thức:

Với t: thời gian đo độ tự thuỷ phân (phút)

v: Thể tích enzym (ml) a: Lượng KOH 25 mM tiêu tốn khi chưa có enzym (ml) b: Lượng KOH 25 mM tiêu tốn khi có enzym (ml) 0,025: hệ số chuyển đổi nồng độ

3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả của thí nghiệm xác định mức độ tăng trưởng của vi khuẩn được xử lý

ANOVA (Analysis of Variance) bằng phần mềm Minitab

Kết quả của các thí nghiệm sàng lọc và thí nghiệm chính được xử lý bằng phần mềm Design expert 7.0.0® của Stat-Ease Inc USA

Phần mềm Microsoft Excel 2007 cũng được sử dụng để tính toán

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thí nghiệm xây dựng đường cong sinh trưởng của B licheniformis