KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ NHIỄM VI SINH VẬT CỦA SẢN PHẨM CỒI ĐIỆP ĐÔNG LẠNH TẠI CÔNG TY BINH CHANH FOOD

KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ NHIỄM VI SINH VẬT CỦA SẢN PHẨM CỒI ĐIỆP ĐÔNG LẠNH TẠI CÔNG TY BINH CHANH FOOD Tác giả HUỲNH ÁI LINH Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kĩ sư ngàn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ NHIỄM VI SINH VẬT

CỦA SẢN PHẨM CỒI ĐIỆP ĐÔNG LẠNH

TẠI CÔNG TY BINH CHANH FOOD

Họ và tên sinh viên: HUỲNH ÁI LINH Ngành: BQCBNSTP & VI SINH THỰC PHẨM Niên khóa: 2006 – 2010

KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ NHIỄM VI SINH VẬT CỦA SẢN PHẨM CỒI ĐIỆP ĐÔNG LẠNH TẠI CÔNG TY BINH CHANH FOOD

Tác giả

HUỲNH ÁI LINH

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kĩ sư ngành Bảo quản chế biến nông sản thực phẩm và vi sinh thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn:

Th.s NGUYỄN ANH TRINH

Tôi cũng cảm ơn các thành viên lớp VT32 đã luôn bên cạnh, động viên,giúp đỡ tôi trong suốt thời gian vừa qua

Cuối cùng, một lần nữa, xin chân thành gởi lời cám ơn đến tất cả mọi người

TÓM TẮT

Đề tài “ Kiểm tra và đánh giá sự nhiễm vi sinh sinh vật trên sản phẩm cồi điệp đông lạnh” được thực hiện tại phòng Vi sinh Công ty TNHH Một thành viên Thực phẩm Bình Chánh (BCF- Seaspimex), thời gian từ 08/03/2010 đến 08/05/2010

Chúng tôi đã tiến hành phân tích các chỉ tiêu TVKHK (NMKL86/1999), tổng

số Coliforms (NMKL44/1995), Escherichia coli (TCVN 5287: 1994), Staphylococcus

aureus, Salmonella (NMKL71/1999) và Vibrio (FDA, 1998) trên các nhóm thực

phẩm: sò điệp nguyên liệu, cồi điệp bán thành phẩm (giai đoạn phân cỡ), cồi điệp thành phẩm (sau trụng) Kết quả thu được như sau:

- Đối với sò điệp nguyên liệu: Trong 22 mẫu khảo sát có 17 mẫu đạt theo qui định của Bộ Thủy Sản 28TCN 201: 2004 dành cho sản phẫm thủy sản đông lạnh-Cồi điệp, chiếm 77,27% và 5 mẫu không đạt chiếm 22,73% Trong đó có 1 mẫu vượt

quá chỉ tiêu qui định về cả TVKHK và Coliforms và được xác định S aureus dương

tính; 2 mẫu vượt quá chỉ tiêu qui định về TVKHK lẫn Coliforms; 2 mẫu còn lại do vượt quá chỉ tiêu qui định về Coliforms

- Đối với cồi điệp bán thành phẩm: Trong 22 mẫu khảo sát , theo qui định thì có 19 mẫu đạt chiếm 86,36%, 3 mẫu không đạt chiếm 13,64% Trong đó có 2 mẫu vượt quá chỉ tiêu qui định cả về TVKHK lẫn Coliforms; mẫu còn lại do vượt quá chỉ

tiêu qui định về Coliforms và xác định S aureus dương tính

- Đối với cồi điệp thành phẩm: Trong 22 mẫu khảo sát, dựa trên qui định 28TCN 201: 2004, thì có 21 mẫu đạt chiếm 95,45%, 1 mẫu không đạt chiếm 4,55% do

vượt chỉ tiêu qui định về Coliforms và xác định S aureus dương tính

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh sách các hình, sơ đồ, biểu đồ vii

Danh sách các bảng viii

Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích, yêu cầu 1

Chương 2: TỔNG QUAN 2.1.Tổng quan về công ty 3

2.1.1 Lịch sử hình thành và phát triển 3

2.1.2 Vị trí, diện tích 3

2.1.3 Sản phẩm 3

2.1.4 Tình hình sản xuất, thị trường xuất khẩu 4

2.2 Sản phẩm cồi điệp 4

2.2.1 Giới thiệu 4

2.2.2 Điệp nguyên liệu 4

2.3 Kiểm soát các chỉ tiêu trên sản phẩm cồi điệp 6

2.3.1 Chỉ tiêu cảm quan 7

2.3.2 Chỉ tiêu hóa học 7

2.3.3 Chỉ tiêu vi sinh 8

2.3.3.1 Tổng vi khuẩn hiếu khí 9

2.3.3.2 Tổng số Coliforms 10

2.3.3.3 Escherichia coli 11

2.3.3.4 Staphylococcus aureus 12

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 16

3.2 Vật liệu và trang thiết bị sử dụng 16

3.2.1 Mẫu 16

3.2.2 Môi trường và hóa chất 16

3.2.3 Dụng cụ 17

3.2.4 Thiết bị 17

3.3 Phương pháp thực hiện 18

3.3.1 Chuẩn bị mẫu 18

3.3.2 Phương pháp định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí 18

3.3.3 Phương pháp định lượng Coliforms 20

3.3.4 Phương pháp định tính E coli 22

3.3.5 Phương pháp định tính S aureus 25

3.3.6 Phương pháp xác định Salmonella trong thực phẩm 26

3.3.7 Phương pháp xác định Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus 29

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát qui trình sản xuất 32

4.2 Mức độ nhiễm vi sinh vật trong sò điệp nguyên liệu 36

4.3 Mức độ nhiễm vi sinh vật trong cồi điệp ở giai đoạn phân cỡ 39

4.4 Mức độ nhiễm vi sinh vật trong cồi điệp thành phẩm sau trụng 43

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 47

5.2 Đề nghị 47

Tài liệu tham khảo 48

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

ADH hay ADC (arginine decarboxylase)

ADN (Acid deoxyribonucleic)

APC (Aerobic Plate Count)

BAM (Bacteriological Analytical Manual)

BCF (Binh Chanh Food)

CFU (Colony forming units)

GMP (Good Manufacture Programe)

HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point)

KCS (Kiểm tra Chất lượng Sản phẩm)

LDC (lysine decarboxylase)

NMKL (Nordik Metodikkommitte For Livmedel – Nordic Committee On Food Analysis)

ONPG (o – nitrophenyl – D – galactopyranoside)

SPC (Standard Plate Count)

SPW (Saline Peptone Water)

TPC (Total Plate Count)

TVC (Total Viable Count)

TVKHK (Tổng Vi Khuẩn Hiếu Khí)

DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 2.1: Hình thái cấu tạo thân mềm thuộc lớp Bivalvia 5

Hình 2.2: Các loài sò điệp dùng làm nguyên liệu 6

Hình 2.3: E coli dưới kính hiển vi điện tử 12

Hình 2.4: S aureus dưới kính hiển vi điện tử 13

Hình 2.5 : V choleraee dưới kính hiển vi điện tử 15

Hình 3.1: Máy chưng cất nước 18

Sơ đồ 3.2: Qui trình định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí 20

Hình 3.3: Phản ứng Coliforms với BGBL 21

Sơ đồ 3.4: Qui trình định lượng tổng số Coliforms 22

Hình 3.5: Thử nghiệm sinh hóa (a) MR và (b) VP 24

Hình 3.6: Thử nghiệm sinh hóa Simon Citrate 24

Sơ đồ 3.7: Qui trình định tính E coli 24

Hình 3.8 : Thử nghiệm phản ứng coagulase của S aureus 26

Sơ đồ 3.9: Qui trình định tính S aureus 26

Hình 3.10 : Phản ứng urease 28

Sơ đồ 3.11: Qui trình xác định Salmonella trong thực phẩm 28

Sơ đồ 3.12: Qui trình xác định Vibrio trong thực phẩm 31

Sơ đồ 4.1: Qui trình sản xuất 33

Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ mẫu đạt và không đạt của sò điệp nguyên liệu 38

Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ mẫu đạt và không đạt của cồi điệp bán thành phẩm (phân cỡ) 41

Biểu đồ 4.4: Tỉ lệ vượt qui định TPC và Coliforms giữa cồi điệp phân cỡ còn cơ và không cơ 41

Biểu đồ 4.5: Tỉ lệ mẫu đạt và không đạt của cồi điệp thành phẩm (sau trụng) 44

Biểu đồ 4.6: Tỉ lệ nhiễm vi sinh vật trong các nhóm cồi điệp 44

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG Trang

Bảng 2.1: Giới hạn vi sinh cho phép của cá và thủy sản tươi sống 6

Bảng 2.2: Các chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm cồi điệp đông lạnh sau rã đông theo 28TCN 201: 2004 7

Bảng 2.3: Các chỉ tiêu hóa học của sản phẩm cồi điệp đông lạnh theo 28TCN 201: 2004 7

Bảng 2.4: Các chỉ tiêu vi sinh của sản phẩm cồi điệp đông lạnh theo 28TCN 201: 2004 8

Bảng 2.5: Chỉ tiêu vi sinh của sản phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ đông lạnh 9

Bảng 2.6: Tính chất sinh hóa của các loài thuộc nhóm Coliforms 10

Bảng 3.1: Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định E coli 23

Bảng 3.2: Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định Salmonella 27

Bảng 3.3: Thử nghiệm sơ bộ V cholerae và V parahaemolyticus 29

Bảng 3.4: Thử nghiệm khẳng định V cholerae và V parahaemolyticus 30

Bảng 4.1: Kết quả phân tích của sò điệp nguyên liệu 37

Bảng 4.2: Kết quả phân tích cồi điệp bán thành phẩm (phân cỡ) 39

Bảng 4.3: Kết quả phân tích cồi điệp thành phẩm sau trụng 42

Bảng 4.4: Kết quả phân tích sự nhiễm vi sinh vật trong các nhóm cồi điệp 45

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nước ta có đường bờ biển dài, nguồn nguyên liệu thủy hải sản vô cùng dồi dào,

phong phú cả về chủng loại lẫn số lượng Trong số đó, cồi điệp là một mặt hàng thuộc

loại đặc sản, có giá trị kinh tế đối với cả thị trường trong lẫn ngoài nước, cũng phù hợp

với tiêu chí sản xuất các mặt hàng đặc sản của công ty Seaspimex

Hiện nay, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đang gióng lên hồi chuông báo

động với hàng loạt sai phạm bị cơ quan truyền thông phát hiện Hơn nữa, thủy sản

thuộc nhóm thực phẩm có nguy cơ cao Vì vậy, để đảm bảo an toàn vệ sinh chất lượng

cho người tiêu dùng, đặc biệt đối với các thị trường khó tính như Mĩ, châu Âu, cần có

sự kiểm soát chất lượng một cách nghiêm ngặt Trong đó, tình trạng nhiễm vi sinh vật

vào các mặt hàng thủy sản, nhất là thủy sản xuất khẩu chiếm một sự quan tâm không

nhỏ đối với nhà sản xuất, nhà quản lí cũng như người tiêu dùng

Vậy việc kiểm soát chất lượng sản phẩm thủy sản nói chung và sản phẩm cồi

điệp đông lạnh nói riêng hiện nay như thế nào, đặc biệt trong thời buổi vấn đề vệ sinh

an toàn thực phẩm đang rất được quan tâm?

Trong đợt thực tập này, dưới sự quan tâm giúp đỡ của Công ty TNHH Một

thành viên BCF, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Kiểm tra và đánh giá sự nhiễm

vi sinh vật trên sản phẩm cồi điệp đông lạnh” Kết quả của đề tài này sẽ góp phần đánh

giá mức độ nhiễm vi sinh vật trên sản phẩm cồi điệp đông lạnh

1.2 Nội dung, mục đích

Khảo sát qui trình sản xuất cồi điệp, nhằm hiểu rõ các công đoạn trong qui trình

sản xuất của công ty, từ đó đánh giá nguy cơ nhiễm vi sinh vật ở mỗi công đoạn trong

qui trình sản xuất của công ty

Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh: TVKHK, Coliforms, E coli, S aureus,

Salmonella, Vibrio trên các mẫu sò điệp nguyên liệu, cồi điệp bán thành phẩm (phân

cỡ), cồi điệp thành phẩm (sau trụng), với mục đích khảo sát tỉ lệ nhiễm vi sinh vật trên từng nhóm sản phẩm cồi điệp trong qui trình sản xuất, góp phần vào việc kiểm soát chất lượng sản phẩm cồi điệp đông lạnh của công ty

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về công ty

2.1.1 Lịch sử hình thành và phát triển

Công ty thực phẩm Bình Chánh BCF – Binh Chanh Food là đơn vị thành viên trực thuộc công ty Seaspimex được thành lập ngày 01/09/2008 trên cơ sở di chuyển toàn bộ các đơn vị sản xuất và chia tách một số đơn vị nghiệp vụ của Công ty cổ phần Thủy đặc sản Seaspimex để thành lập doanh nghiệp mới tại Bình Chánh theo Nghị quyết Đại hội cổ đông thường niên năm 2008, phù hợp với chủ trương của Ủy ban Nhân dân thành phố về việc di dời các cơ sở sản xuất ra ngoài thành phố

Hiện nay, công ty BCF gồm có các phân xưởng sản xuất:

- Phân xưởng sản xuất hàng đông

- Phân xưởng sản xuất hàng khô

- Phân xưởng sản xuất đồ hộp

Địa chỉ: B23/63 ấp 2, đường Hoàng Phan Thái, xã Bình Chánh, huyện Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh

- Sản phẩm đông lạnh: cồi điệp, tôm càng, bạch tuộc, mực, đùi ếch, cua…

- Sản phẩm khô: khô mực, khô cá…

- Sản phẩm đồ hộp: cá ngừ sốt dầu, cá nục sốt cà, xúc xích heo – bò…

2.1.4 Tình hình sản xuất, thị trường tiêu thụ

Nhà máy được thiết kế với công suất sản xuất ban đầu là 15000 tấn/năm Ngoài việc sản xuất các mặt hàng thủy sản, súc sản , hàng khô cung cấp cho thị trường nội địa

và xuất khẩu, công ty còn kinh doanh cho thuê kho lạnh, phân xưởng sản xuất; sản xuất

Theo 28TCN 201: 2004, cồi điệp là phần cơ thịt đã được tách ra khỏi vỏ, màng

áo và nội tạng; có thể còn dính trứng hoặc không trứng (theo dân gian là còn gan hay không gan) Tiêu chuẩn này áp dụng cho cồi điệp đông lạnh đã qua xử lí nhiệt (chần/ trụng) hay chưa qua xử lí nhiệt phải qua nấu chín trước khi sử dụng

 Sản phẩm cồi điệp đông lạnh gồm hai loại:

- Loại có trứng: là loại cồi điệp khi lấy cồi , trứng được giữ lại và phải dính chặt vào cồi

- Loại không trứng: là loại cồi điệp đã loại bỏ trứng khi lấy cồi

 Sản phẩm cồi điệp đông lạnh gồm hai dạng:

- Cấp đông rời (IQF)

- Cấp đông khối (block)

2.2.2 Điệp nguyên liệu:

Theo Wikipedia, sò điệp (scallop) là 1 loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ được phân loại khoa học bởi Rafinesque vào năm 1815 như sau:

Hình 2.1: Hình thái cấu tạo thân mềm thuộc lớp Bivalvia

(Nguồn: Huỳnh Thu Hòa, 2005)

Điệp nguyên liệu dùng để chế biến cồi điệp gồm hai loài:

 Điệp quạt/ Điệp răng lược (Chlamys nobilis)

 Điệp tròn/Điệp bơi viền trắng(Amusium pleuronectes)

(a) (b)

Hình 2.2: Các loài sò điệp dùng làm nguyên liệu:

(a) Chlamys nobilis (b) Amusium pleuronectes

(Nguồn: www.shellscarvalho.com và www.reef.crc.org.au)

Theo tiêu chuẩn vi sinh cho phép trong thực phẩm của Bộ Y Tế tháng 4/1998, ,

cá và thủy sản tươi sống (phải xử lí nhiệt trước khi sử dụng) phải đáp ứng các giới hạn sau:

Bảng 2.1: Giới hạn vi sinh cho phép của cá và thủy sản tươi sống

Chỉ tiêu Giới hạn cho phép (cfu/g)

2.3 Kiểm soát các chỉ tiêu trên sản phẩm cồi điệp:

Theo tiêu chuẩn của Bộ Thủy Sản 28TCN 201: 2004 về sản phẩm đông lạnh – cồi điệp, để đảm bảo chất lượng cồi điệp thành phẩm cần kiểm soát các chỉ tiêu sau đây:

2.3.2 Chỉ tiêu hóa học:

Bảng 2.3: Các chỉ tiêu hóa học của sản phẩm cồi điệp đông lạnh

theo 28TCN 201: 2004

1 Hàm lượng protein thô (tính bằng phần

trăm theo khối lượng), không nhỏ hơn

15%

2 Hàm lượng nước (tính bằng phần trăm

3 Tỷ số giữa hàm lượng nước và hàm

lượng protein thô (H/P), không lớn hơn 5

4 Hàm lượng photphat (tính bằng mg P2O5

Chất lượng của một lô được xem là đạt khi tất cả các mẫu có số khuẩn lạc

không lớn hơn 3m; chấp nhận được khi tất cả các mẫu có số khuẩn lạc trong khoảng 3

m và 10 m (M) và khi c/n không lớn hơn 2/5

Chất lượng của một lô được xem là không đạt khi trong tất cả các mẫu, số

khuẩn lạc đều lớn hơn M và khi c/n lớn hơn 2/ 5

Ngoài ra, Bộ Thủy Sản cũng qui định trong 28TCN 105: 1997 về chỉ tiêu vi

sinh áp dụng cho sản phẩm thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ đông lạnh

Bảng 2.5: Chỉ tiêu vi sinh của sản phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ đông lạnh

1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản

4 E coli, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm Không cho phép

5 Salmonella, tính bằng số khuẩn lạc trong 25g sản phẩm Không cho phép

6 Vibrio cholerae, tính bằng số khuẩn lạc trong 25g sản phẩm Không cho phép

2.3.3.1 Tổng vi khuẩn hiếu khí

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong

điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử

Chỉ số này có một số tên gọi khác nhau: số vi sinh vật hiếu khí APC, tổng số

đếm trên đĩa TPC, tổng số vi sinh vật sống TVC, số đếm đĩa chuẩn SPC

Chỉ số này được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong một

đơn vị khối lượng thực phẩm (cfu/g thực phẩm)

Chỉ tiêu tổng vi khuẩn hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về

vi sinh vật , nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong

quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu

chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm

2.3.3.2 Tổng số Coliforms

Coliforms là những trực khuẩn đường ruột Gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy ý, có khả năng sinh acid và sinh hơi do lên men lactose ở 37oC trong vòng 24h

Bảng 2.6: Tính chất sinh hóa của các loài thuộc nhóm Coliforms

Với + (-): đa số là + và – (+): đa số là -

Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác

1920 Sự hiện diện một lượng lớn Coliforms và E coli trong thực phẩm là điều không

mong muốn, tuy nhiên không loại bỏ chúng hoàn toàn khỏi nhiều thực phẩm đông lạnh hoặc tươi sống Vấn đề là ở chỗ số lượng chúng đến mức nào có thể coi là không an toàn cho thực phẩm.

Thử nghiệm Coliforms được dùng rộng rãi trong việc kiểm soát vệ sinh môi trường sống của nhuyễn thể hai mảnh vỏ nhưng không phải luôn là một chỉ thị tốt về chất lượng vệ sinh Coliforms hoàn toàn không có khả năng chỉ thị về sự hiện diện của virus đường ruột Ví dụ như ở sò, không có sự tương quan nào giữa Coliforms phân và

Vibrio cholerae hay giữa E coli và Vibrio parahaemolyticus

Tuy vậy, đối với một số thực phẩm, chỉ tiêu Coliforms cũng có những giá trị nhất định như một chỉ thị vệ sinh, và cũng có phần có ích khi phục vụ cho chương trình quản lí chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm HACCP

2.3.3.3 Escherichia coli

Theo DANIDA (2004), Escherichia coli là dạng Coliforms phân có nguồn gốc

từ phân, là trực khuẩn Gram âm kị khí tùy ý, không sinh bào tử, phổ biến trong tự nhiên đặc biệt là trong đường tiêu hóa của người và động vật, phát triển được ở nhiệt

độ 44oC, sử dụng glucose và lactose, sinh indole, sinh acid

Phần lớn E coli phân lập từ môi trường là loại không gây bệnh Các nhóm E

coli gây bệnh gồm EPEC, EIEC, ETEC có thể được phát hiện bằng các phương pháp

thông thường như khi phân lập Coliforms phân ở 44 – 45oC Tuy nhiên, cần chú ý có

những dạng E coli mới được phát hiện gần đây như E coli O157: H7 cần vài phương

pháp khác để phân lập

E coli có khả năng chỉ thị sự nhiễm phân trong nước là do thời hạn sống sót

của chúng Chúng thường chết đi sau cùng một khoảng thời gian như các vi sinh vật gây bệnh khác có ở ruột Đối với các thực phẩm đã qua các biện pháp xử lí như ướp

lạnh, cấp đông, chiếu xạ, E coli bị tiêu diệt trong khi một số vi sinh vật gây bệnh khác

vẫn chống chịu được và sống sót

Hình 2.3: E coli dưới kính hiển vi điện tử

(Nguồn: www.rosemerena.orghome2)

2.3.3.4 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram dương, hiếu khí hay kị khí tùy ý,

đường kính khoảng 0,7µm, không sinh bào tử, không di động, thường tụ thành chùm (nên còn được gọi là tụ cầu khuẩn), lên men mannitol sinh sắc tố vàng, chịu mặn (7,5%) và có khả năng đông huyết tương (phản ứng coagulase) Tất cả các dòng S

aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa

đến 15% NaCl

S.aureus phân bố khắp nơi nhưng chủ yếu được phân lập từ da, màng nhầy của

người và động vật máu nóng (Trần Linh Thước, 2008) và xoang mũi, tóc ở người (Bộ

Thủy sản và DANIDA, 2004).Khi phát triển trong thực phẩm, hầu hết các dòng S

aureus đều có thể tổng hợp enterotoxin (độc tố ruột) trong môi trường có nhiệt độ trên

15oC, nhiều nhất khi tăng trưởng ở 35 – 37oC Các loại enterotoxin của Staphylococcus

(A, B, C1, C2, C3, D và E) có thể gây nôn mửa, đau thắt bụng, tiêu chảy, kiệt sức đến mức nghiêm trọng sau 4 – 6h sau khi ăn, sự phục hồi xảy ra sau 24 – 72h, nạn nhân không tử vong nhưng rất đau đớn Các enterotoxin này thuộc loại chịu nhiệt: một khi

đã hình thành bên trong thực phẩm, việc đun sôi không phá hủy được chúng Biện

pháp cần thiết để ngăn S aureus không phát triển trong thực phẩm là trữ lạnh các sản

phẩm chín hay giữ nóng các thực phẩm ăn nóng

Cần lưu ý có những loài Staphylococcus có phản ứng coagulase âm tính (không

làm đông huyết tương) nhưng vẫn có khả năng sinh enterotoxin thậm chí enterotoxin chịu nhiệt

S aureus có thể nhiễm vào trong thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người

thao tác trong quá trình chế biến Vì vậy sự hiện diện của S aureus nhằm chỉ thị điều

kiện vệ sinh và hiệu quả của việc kiểm soát nhiệt độ trong quá trình chế biến

Hình 2.4: S aureus dưới kính hiển vi điện tử

(Nguồn: http://www.foogle.biz/mrsa)

2.3.3.5 Salmonella

Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy ý, kích thước 0,6 - 2µm, có khả

năng di động (trừ Salmonella galinarum – pullorum), không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol nhưng không lên men lactose (trừ S Arizona) và sucrose, không

sinh indole, không phân giải urea, hầu hết các chủng đều sinh H2S

Có khoảng 3 dạng bệnh do Salmonella gây ra: sốt thương hàn do S typhi, nhiễm trùng máu do S cholera-suis, rối loạn tiêu hóa do S typhimurium và S

enteritidis Các triệu chứng bệnh do Salmonella như nôn, mửa, đau đầu, ớn lạnh, tiêu

chảy, sốt xuất hiện sau 12 – 24h sau khi ăn phải thực phẩm chứa 1 – 10 triệu

Salmonella trong 1g Bệnh kéo dài 2 – 3 ngày , phần lớn hồi phục nhưng cũng có

trường hợp tử vong đặc biệt là người già, trẻ sơ sinh và người có hệ miễn dịch suy giảm

Do kém chịu nhiệt, Salmonella dễ dàng bị tiêu diệt khi thực phẩm được đun nấu phù hợp Theo phương pháp truyền thống, việc phát hiện Salmonella gồm các bước

huyết thanh, tính chung thời gian mất khoảng 7 ngày Hiện nay có thể rút ngắn thời

gian kiểm nghiệm Salmonella bằng phương pháp ELISA và thử nghiệm ADN Tuy

vậy, đối với những mẫu có khả năng dương tính cần tiến hành các thao tác truyền

thống nhằm khẳng định sự hiện diện của Salmonella

2.3.3.6 Vibrio

 V cholerae

Năm 1883, Robert Kock là người đầu tiên phát hiện Vibrio cholerae trong phân

bệnh nhân ở vụ đại dịch tả lần thứ năm ở thành phố Alexandrie (Ai Cập) Năm 1905,

Gotschlich cũng đã phân lập được Vibrio cholerae Eltor (gây dịch tiêu chảy giống tả)

Vibrio là vi khuẩn Gram âm hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình

dấu phẩy nên còn được gọi là phẩy khuẩn, di động bằng mông long roi, không sinh bào tử, kị khí tùy ý, lên men glucose nhưng không sinh hơi và H2S, có phản ứng catalase và oxidase (+), phát triển được ở nhiệt độ 420C, lên men saccharose, khử lysine, phát triển được ở môi trường không có muối nhưng không phát triển được ở môi trường có nồng độ muối lớn hơn hoặc bằng 6 %, nhạy với hợp chất ức chế phẩy

khuẩn O/129 Vibriostat V cholerae gồm các nhóm:

V cholerae nhóm O – 1 gồm các vi khuẩn sinh độc tố gây bệnh tả và ngưng kết

với kháng huyết thanh O1

V cholerae nhóm O – 1 không điển hình gồm các vi khuẩn có thể ngưng kết

với kháng huyết thanh O1 nhưng không sinh độc tố ruột, không gây bệnh

V cholerae không thuộc nhóm O – 1 (gọi là V cholerae non – O1)gồm các vi

khuẩn có tính chất sinh hóa giống V cholerae nhóm O – 1 nhưng không ngưng kết với

kháng huyết thanh O1, chúng có thể gây bệnh lẻ tẻ nhưng không thành dịch Một số chủng có thể sinh độc tố ruột nhưng biểu hiện bệnh không nghiêm trọng như bệnh tả

Một ngoại lệ duy nhất và đáng kể của V cholerae non – O1 từng gây đại dịch chính là chủng O139 nổi tiếng, có khả năng gây bệnh do cũng có gen sinh độc tố tả như V

cholerae O – 1 Do đó, từ 31/5/1999, cơ quan kiểm dịch Nhật Bản đã yêu cầu sửa đổi

nội dung xác nhận về V cholerae trong chứng chỉ vệ sinh các lô hàng thủy sản nhập

V cholerae sinh enterotoxin và endotoxin (nội độc tố) trong đường tiêu hóa,

kích thích nghiêm trọng màng nhày sinh dịch nhày, làm suy yếu bơm Na của tế bào động vật gây tiêu chảy nặng, mất nước, choáng thậm chí tử vong tỉ lệ lên đến 20 – 50%

Hình 2.5 : V cholerae dưới kính hiển vi điện tử.

(Nguồn : www.nhasinhhoctre.com)

 V parahaemolyticus

V.parahaemolyticus được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè năm 1951

tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn hàu, hến, cá sống

V parahaemolyticus là trực khuẩn Gram âm hình cong, di động bằng một lông

roi, không sinh bào tử, ưa mặn, phát triển tốt ở môi trường chứa 3 – 4% muối, thậm chí phát triển được ở 8% muối, biên độ nhiệt phát triển 15 – 40oC, vùng pH từ 5 – 9,6

V parahaemolyticus nhạy cảm với các kháng sinh streptomycine, tetracycline,

chloramphenicol và novobiocine nhưng lại có khả năng chống chịu đối với polymycine và colistine

V parahaemolyticus thường gặp ở thủy sản loại nhuyễn thể và giáp xác trong

nước biển lẫn nước ngọt Phần lớn dịch bệnh nổ ra vào mùa hè Các triệu chứng bệnh như đau bụng, tiêu chảy, mửa, hơi ớn lạnh, đau đầu… xuất hiện khoảng 12h sau khi ăn một lượng lớn vi sinh vật (105/g)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh thuộc Công ty thực phẩm Bình Chánh BCF - Seaspimex, huyện Bình Chánh Tp.Hồ Chí Minh

Thời gian thực hiện từ 08/03/2010 đến 08/08/2010

3.2 Vật liệu và trang thiết bị sử dụng

3.2.2 Môi trường và hóa chất:

Phòng vi sinh công ty BCF sử dụng môi trường dạng đông khô, pha chế theo hướng dẫn trên vỏ hộp khi cần sử dụng, môi trường và hóa chất thuộc các nhãn hiệu Merck (Đức), Biorad (Pháp) và Himedia (Ấn Độ)

- Plate Count Agar (PCA)

- Violet Red Bile Lactose Agar (VRBL).4u

- Canh Brilliant Green Lactose Bile Salt (BGBL)

- Eosin Methylene Blue Lactose Agar (EMB)

- Tryptone Soya Agar (TSA)

- Baird Parker Agar (BP)

- Brain Heart Infusion (BHI)

- Tellurite emulsion (lòng đỏ trứng gà)

- Buffer Pepton Water (BPW)

- Alkaline Pepton Water (APW)

- Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS)

- Canh Methyl Red Voges Proskauer (MR – VP)

- Simmons Citrate Agar

- Kliger’s Iron Agar (KIA)

- Triple Sugar Iron Agar (TSI)

- Thuốc thử Methyl Red

- Bình tam giác dung tích 200ml, 250ml, 300ml, 500ml

- Cốc thủy tinh dung tích 500ml, 1000ml

- Pipette thủy tinh 1ml, 2ml, 5ml, 10ml

- Máy dập mẫu (stomacher)

- Máy đồng nhất mẫu (autovortex)

Lấy một lượng mẫu theo yêu cầu (10g hoặc 25g), tạo huyền phù ban đầu theo tỉ

lệ 1: 9 trong dịch pha loãng phù hợp, sau đó đem đồng hóa

3.3.2 Phương pháp định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí

Phương pháp này tham chiếu tham chiếu theo NMKL 86, ấn bản lần 3 năm

1999

 Nguyên tắc: Tổng vi khuẩn hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều

 Nuôi ủ: Lật ngược đĩa, ủ trong 72±6h ở 30±1oC

Đĩa có số khuẩn lạc đếm trên 250: đếm số khuẩn lạc trên vài vùng đại diện cho

số khuẩn lạc của đĩa (1/4, 1/6… diện tích đĩa) rồi qui ra cho diện tích toàn đĩa Đánh dấu kết quả bằng dấu (*) để biết rằng đó là kết quả ước định tính từ đĩa nằm ngoài ngưỡng 25 – 250

Đối với dạng mọc lan: nếu chỉ có 1 chuỗi khuẩn lạc không tách rời khỏi nhau như được tạo nên bởi sự phân tách của một cụm vi sinh vật thì đếm như 1 khuẩn lạc đơn; nếu là dạng mọc lan trong lớp nước mỏng giữa thạch và đáy đĩa hay trong lớp nước mỏng ở rìa hoặc trên mặt thạch thường sinh ra những khuẩn lạc tách rời và được đếm như những khuẩn lạc riêng biệt

 Báo cáo kết quả:

Kết quả tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g sản phẩm được tính bằng cách nhân

số khuẩn lạc đã đếm với nồng độ pha loãng tương ứng Đơn vị tính là cfu/g mẫu

Sơ đồ 3.2: Qui trình định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí

3.3.3 Phương pháp định lượng Coliforms

Phương pháp này tham chiếu theo NMKL 44, ấn bản lần 4 năm 1995 được áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm để xác định Coliforms tổng số

 Nguyên tắc: Số lượng Coliforms được xác định bằng cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường rắn chọn lọc VRBL và một chất chỉ thị pH Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau khi ủ trong 24h ở 37oC, khẳng định lại bằng môi trường canh BGBL, Coliforms sẽ sinh hơi trong môi trường này khi ủ ở 37oC trong 24h

 Qui trình:

 Chuẩn bị mẫu: Cân 10g mẫu cho vào bao PE vô trùng, thêm 90ml SPW, sau đó đồng hóa mẫu bằng máy dập mẫu

 Đổ đĩa: Dùng pipette vô trùng chuyển 1ml dịch mẫu sau đồng nhất vào giữa đĩa

Đồng hóa10g mẫu trong 90ml SPW Pha loãng mẫu ở nồng độ thích hợp: 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 Cho 1 ml dịch mẫu ở hai nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ một đĩa

Đổ 15 – 20ml môi trường PCA mỗi đĩa Lắc đều, đợi thạch đông

Báo cáo kết quả: tổng vi khuẩn hiếu khí (cfu/g) Lật ngược đĩa, ủ ở 30±1oC trong 72±6h Đếm khuẩn lạc ở các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 - 250