PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ VÙNG MÃ HÓA PROTEIN NSP2 CỦA VI RÚT PRRS GENOTYPE BẮC MỸ XÁC ĐỊNH ĐƯỢC TẠI TP. HCM

Kết quả đạt được: Ly trích và giải trình tự vùng gen mã hóa protein Nsp2 trên các chủng virus phân lập tại Tp.HCM, các tỉnh phía Bắc Việt Nam Hà Nội, Bắc Giang và chủng virus vaccine BSL

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HIHI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ VÙNG MÃ HÓA PROTEIN NSP2 CỦA VI RÚT PRRS GENOTYPE BẮC MỸ XÁC ĐỊNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ VÙNG MÃ HÓA PROTEIN NSP2 CỦA VI RÚT PRRS GENOTYPE BẮC MỸ XÁC ĐỊNH

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên con xin gửi lời cám ơn đến ba mẹ đã luôn yêu thương và tạo mọi điều kiện cho con học tập Em cảm ơn anh hai đã luôn động viên em trong suốt bốn năm học qua

Em xin chân thành cảm ơn:

¾ Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã dạy những kiến thức hay và phong cách làm việc tốt cho em trong suốt 4 năm học

¾ Tập thể cán bộ và quý Thầy - Cô Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập

Em xin trân trọng biết ơn Thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải hết lòng hướng dẫn

và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn đến:

¾ KS Võ Khánh Hưng đã tận tình giúp đỡ và chỉ dẫn cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

¾ Các anh, chị cùng nhóm nghiên cứu, đã tận tình giúp đỡ và chỉ dẫn em trong lúc khó khăn

¾ Các bạn cùng nhóm nghiên cứu đã chia sẽ và động viên tôi trong quá trình làm việc chung

¾ Các bạn lớp DH06SH đã cùng nhau học tập suốt thời gian học

Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2010

Phan Thị Anh Văn

TÓM TẮT

Việc phân tích di truyền virus PRRS có ý nghĩa quan trọng trong dịch tễ học Từ cây di truyền ta có thể xác định được nguồn gốc phát sinh dịch bệnh, từ đó có những biện pháp hữu hiệu để phòng chống và ngăn ngừa sự lây lan bệnh ở Việt Nam

Chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu sau: khuếch đại vùng gen mã hóa nsp2 bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi được tham khảo của Youjun Feng và ctv (2007) và phân tích di truyền dựa vào vùng gen này Xây dựng qui trình xác định sự đồng nhiễm hai chủng Bắc Mỹ cổ điển và Trung Quốc độc lực cao

Kết quả đạt được: Ly trích và giải trình tự vùng gen mã hóa protein Nsp2 trên các chủng virus phân lập tại Tp.HCM, các tỉnh phía Bắc Việt Nam (Hà Nội, Bắc Giang) và chủng virus vaccine BSL-PS100, ingelVac Trên cây di truyền dựa tên trình tự mã hóa protein nsp2 (Xây dựng bằng phần mền DNAstar), nhóm vi rút PRRS tại Tp.HCM, ở phía Bắc và vi rút vaccine BSL-PS100 thuộc nhóm châu Mỹ, phân nhóm 2.2, cùng nhóm với chủng vi rút PRRS độc lực cao của Trung Quốc (93,9 - 95,7%) so với chủng

vi rút PRRS phân lập ở Quảng Nam (07QN) là 94,6 - 96,2% Độ tương đồng của PS100 so với các chủng ở Tp.HCM là 96,2 - 100%

BSL-SUMMARY

A phylogenetic tree of porcine reproduction and respiratory virus is very important to epidemiology From a phylogenetic tree, the origin of epidemic could be known so that the effective policies established to control and protect the widespread

of reproduction and respiratory virus in Ho Chi Minh City

We conduct research content following: amplified genes nsp2 by RT-PCR with primers designed by Youjun Feng et al., (2007) and genetic analysis based on this gene Determine the co-infected of two strains: North American and Chinese highly pathogenic

Results obtained from the study: Sequencing the nsp2 gene of the strains obtained

in Ho Chi Minh City, Hanoi, Bac Giang and BSL- PS100 as well as IngelVac vaccine strains Phylogenetic based on nsp2 gene (Built by software DNAstar) showed the PRRS virus in Ho Chi Minh City, Hanoi, Bac Giang and vaccinal virus belonged to American genotype, subgroup 2.2, and to the same group of highly pathogenic PRRS China strain (93.9 to 95.7%) The similarity of the strains was about 94.6 to 96.2% in comparring with PRRS virus strains isolated in Quang Nam (07QN) The similarity of vaccinal virus strains BSL- PS100 was about 96.2 to 100% in comparring with PRRS virus strains in Ho Chi Minh City

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1 1 Đặt vấn đề 1

1.2.2 Yêu cầu 2

1.2 Mục tiêu và yêu cầu 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1.Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRS) 3

2.1.2 Lịch sử bệnh 3

2.1.2 Vi rút gây bệnh hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo 4

2.1.3 Các chủng vi rút và sự phân bố 6

2.1.4 Cấu trúc bộ gen của vi rút PRRS 7

2.2 Protein không cấu trúc Nsp2 9

2.3 Sự khác biệt về trình tự giữa hai chủng PRRSV 12

2.4 PRRSV chủng độc lực cao tại Trung Quốc 13

2.5 Các phương pháp kiểm tra PRRS trong phòng thí nghiệm 15

2.6 Sơ lược một số tài liệu nghiên cứu liên quan 16

2.6.1 Trên thế giới 16

2.6.2 Trong nước 18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Thời gian và địa điểm 20

3.2 Nội dung nghiên cứu 20

3.3 Vật liệu và hóa chất 20

3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 20

3.3.2 Hóa chất 20

3.4 Phương pháp tiến hành 22

3.4.1 Thu nhận mẫu 22

3.4.2 Ly trích RNA 22

3.4.2.1 Ly trích RNA từ huyết thanh 22

3.4.2.2 Ly trích RNA từ mẫu phổi 23

3.4.2.3 Align mồi 24

3.5 Bố trí thí nghiệm và nội dung tiến hành thí nghiệm 26

3.5.1 Bố trí thí nghiệm 26

3.5.2 Nội dung tiến hành thí nghiệm 26

3.5.2.1 Thực hiện phản ứng nested RT_PCR 26

3.5.2.2 Phản ứng RT-PCR 30

3.5.2.3 Quy trình xác định sự đồng nhiễm 32

3.5.2.4 Phân tích trình tự 32

Chương 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 31

4.1 Kết nested RT-PCR khuếch đại khung đọc mở ORF7 35

4.2 Kết quả RT-PCR trên chủng vaccine và thực địa 36

4.3 Kết quả khảo sát phản ứng phát hiện đồng nhiễm 37

4.4 Phân tích di truyền các mẫu nghiên cứu 38

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

AP Accessary Protein

BHK-21 Baby Hamster Kidney-21

DIVA Differentiated Infected Vaccinated Animals

EAV Equine Arteritis Virus

EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein

ELISA Enzyme Linked-Immonosorbent Assay

FMD Foot and mouth disease

GEP Green Fluorescent Protein

ORFs Open Reading Frames

PCP Papain like Cystein Protease

PEARS Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome

PRRSV Porcine Reproductive and respiratory Syndrome Virus

QN Quảng Nam

RdRp RNA dependent RNA polymerase

RFS Ribosomal Frameshifting Site

sgmRNAs Subgenomic mRNAs

SHFV Simian Hemorrhagic Fever Virus

SIRD Swine Infertility and Respiratory Disease TRS Transcription Regulating Sequence UTR Untranslated region

Z Zinc-binding domain

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Sản phẩm dịch mã của các ORFs 8

Bảng 3.1 Thành phần của phản ứng RT-PCR với primer Outer 28

Bảng 3.2 Quy trình nhiệt của phản ứng RT-PCR cặp primer OF7 và OR7 28

Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng nested- PCR với cặp primer inner 29

Bảng 3.4 Chu kì nhiệt cho nested-PCR 29

Bảng 3.5 Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng gen mã hóa Nsp2 31

Bảng 3.6 Qui trình nhiệt phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng gen mã hóa nsp2 31

Bảng 3.7 Các chủng vi rút trong mẫu bệnh phẩm được giải trình tự 33

Bảng 3.8 Các chủng tham chiếu tại Việt Nam 33

Bảng 3.9 Các chủng virus tham khảo trên thế giới 34

Bảng 4.1 Kết quả xét nghiệm bằng phương pháp nested RT-PCR 35

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc hạt của vi rút PRRS và vị trí các protein cấu trúc 5

Hình 2.2 Cây phân bố giống, loài của một số chủng PRRSV 6

Hình 2.3 Cấu trúc gen của PRRS 8

Hình 2.4 Biểu đồ giả định của PRRSV nsp2 protein 10

Hình 2.5 Xây dựng các chủng VR-2332 nsp2 đột biến 12

Hình 3.1 Vị trí gắn của mồi trên vùng trình tự mã hóa protein Nsp2 25

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 26

Hình 3.3 Kết quả nested RT-PCR phân biệtchủng Bắc Mỹ và Châu Âu 30

Hình4.1 Kết quả nested RT_PCR khuếch đại khung đọc mở ORF7 35

Hình 4.2 Kết quả RT-PCR vùng trình tự mã hóa Nsp2 36

Hinh 4.3 Sản phẩm RT-PCR trên mẫu trộn giữa chủng TQ và vaccine ingelVac 37

Hình 4.4 Kết quả giải trình tự của virus PRRS trong vaccine BSL-PS100 38

Hình 4.5 Kết quả giải trình tự của virus PRRS trong vaccine BSL-PS100 40

Hình 4.6 Cây di truyền PRRSV vẽ bằng phần mềm DNAstar 41

Chương 1 MỞ ĐẦU

1 1 Đặt vấn đề

Đối với nước ta, ngành chăn nuôi chiếm một vai trò quan trọng trong nền kinh tế

cả nước nói chung và nền nông nghiệp nói riêng Do nhu cầu xã hội phát triển nên số lượng heo nuôi ngày càng tăng cao Với quá trình phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi heo thì giới chăn nuôi cũng phải đối mặt với không ít khó khăn, đặc biệt là những dịch bệnh ảnh hưởng trực tiếp đến thành tích sinh sản và tăng trưởng của heo như: bệnh FMD, bệnh đóng dấu son, bệnh giả dại…và một vấn đề đang làm đau đầu giới chăn nuôi, nó ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS: porcine reproductive and respiratory syndrome)

Từ khi xuất hiện, dịch bệnh PRRS gây ra nhiều thiệt hại nặng nề cho ngành công nghiệp lợn trên thế giới Đặc biệt, vào năm 2006, một trận dịch lớn xảy ra tại Trung Quốc, gây thiêt hại nặng cho ngành công nghiệp lợn của nước này Qua nghiên cứu, dịch bệnh này do chủng PRRS biến thể độc lực cao gây ra Các chủng vi rút biến thể này cũng được phát hiện ở Việt Nam sau đó Kết quả giải trình tự bộ gen của virút PRRS phân lập từ mẫu bệnh phẩm của Việt Nam được so sánh với trình tự bộ gen của

vi rút PRRS trên genbank cho thấy mức độ tương đồng là 77% so với chủng VR-2332

và 71% so với chủng MN184 (Đây là 2 chủng vi rút của Bắc Mỹ) nhưng đặc biệt có mức độ tương đồng từ 98,6 - 99,6% so với các chủng vi rút thể độc lực cao của Trung Quốc

Tian và cộng sự (2007) đã xây dựng nên những giả thiết ban đầu về sự tiến hóa của các chủng PRRSV độc lực cao ở Trung Quốc từ các chủng thuộc genotype Bắc

Mỹ với vùng tiến hóa tiềm năng nằm trên nsp2 của vùng ORF1 Vùng trình tự mã hóa nsp2 được xem như một yếu tố đặc trưng để nhân biết chủng vi rút độc lực cao cũng như xem xét sự biến chủng của vi rút PRRS Do đó việc phân tích trình tự mã hóa protein nsp2 ở Tp.HCM là công việc cần thiết việc xây dựng bản đồ dịch tễ phân tử tại

Tp HCM nói riêng và Việt Nam nói chung Đồng thời, ta cũng tiến hành phân tích trình tự nsp2 của vi rút vaccine BSL.PS 100 của hãng Besta, Singarbo sản xuất, là

vaccine đang được khuyến cáo sử dụng tại Việt Nam; vaccine ingelvac của hãng Boehringer Ingelheim

Việc phân tích di truyền giúp hiều rõ hơn về nguồn gốc căn bệnh, các yếu tố nguy

cơ dẫn đến sự phát sinh và lan truyền của dịch bệnh (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Qua

đó, quan sát sự biến đổi và phân loại các chủng virus PRRS và giúp đánh giá được hiệu quả sử dụng vaccine và công tác phòng chống bệnh Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân tích trình tự mã hóa protein nsp2 của vi rút PRRS genotype Bắc Mỹ xác định được tại TP HCM”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu

1.2.1 Mục tiêu

Xác định sự hiện diện, phân bố chủng, và sự biến đổi và tương quan di truyền của

vi rút PRRS tại TP.HCM so với các chủng PRRSV tại các chủng phía Bắc phân lập năm 2010 dựa trên phân tích trình tự nucleotide trên vùng mã hóa protein Nsp2

1.2.2 Yêu cầu

• Thu nhận mẫu bệnh phẩm

• Nắm vững các nguyên lý, quy tắc ly trích RNA, phản ứng RT-PCR, nested RT-PCR

• Nắm vững các phần mền phân tích trình tự, xây dựng cây sinh dòng Đưa ra ý kiến nhận xét về các số liệu trên

1.3 Nội dung nghiên cứu

• Khuếch đại vùng trình tự mã hóa nsp2 bằng phương pháp RT-PCR

• Xây dựng qui trình xác định đồng nhiễm hai chủng Bắc Mỹ cổ điển và Trung Quốc độc lực cao

• Phân tích trình tự mã hóa nsp2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) là một bệnh do vi rút gây ra, bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế và được phát hiện tại Mỹ vào năm 1987, sau đó lan truyền ra ở các nước: Canada, Anh, Pháp, Bỉ, Hà Lan, Nhật Bản gây nhiều thiệt hại cho các nền chăn nuôi lợn công nghiệp Các triệu chứng thường gặp của lợn mắc bệnh bao gồm rối loạn sinh sản, gây chết đối với lợn con và các biểu hiện rối loạn hô hấp đối với lợn ở mọi lứa tuổi PPRS được xếp vào nhóm B trong danh mục các bệnh của Tổ chức sức khỏe động vật thế giới Cho đến nay, lợn là động vật duy nhất mắc hội chứng này (Theo Nguyễn Bá Tiếp, GV đại học nông nghiệp Hà Nội) (Nguồn: http://tusach thuvienkhoahoc.com) Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính) Đến năm 2007, hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp chính thức xuất hiện tại 19 tỉnh trên cả nước khiến số lợn chết và tiêu huỷ hơn 20.000 con Năm 2008, dịch tai xanh thực sự là “cơn bão dữ” đối với Việt Nam vì mức độ lây lan nhanh và thiệt hại lớn Số lợn bị bệnh hơn 260.000 con, số lợn bị tiêu huỷ trên 255.000 con Tổng thiệt hại hơn 500 tỷ đồng (Theo Hoàng Văn Năm, Quyền Cục trưởng Cục thú y thuộc bộ NN&PTNN) (Nguồn: thanhnien.net 10/5/2010)

2.1.1 Lịch sử bệnh

Năm 1987, bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ với tên gọi “bệnh thần bí trên heo” (Mystery Swine Disease - MSD) Tháng 11 năm 1990, ổ dịch PRRS đầu tiên xảy

ra ở Đức và lan tràn nhanh chóng sang các quốc gia khác ở Châu Âu Mùa đông năm

1990 - 1991, lần lượt các quốc gia Châu Âu như Hà Lan, Bỉ, Pháp và Tây Ban Nha đã báo cáo về hội chứng này với nhiều tên gọi khác nhau: “Bệnh tai xanh” (Blue-eared Pig Disease), “Hội chứng hô hấp và sảy thai trên heo” (Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome -PEARS), hay “Hội chứng hô hấp và vô sinh” (Swine Infertility and Respiratory Disease - SIRD)

Năm 1991, lần đầu tiên Wenvoort và cộng sự đã phân lập được căn bệnh ở Viện thú y trung ương Lelytad – Hà Lan đã phân lập được căn bệnh và đặt tên cho loại vi rút này là “Lelystad”

Năm 1992, Collins và cộng sự ở Mỹ cũng báo cáo về việc phân lập được vi rút gây bệnh và sử dụng tên gọi VR-2332 để chỉ các chủng phân lập ở Bắc Mỹ Cũng trong năm 1992, hội nghị quốc tế và tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã nhất trí đặt tên cho bệnh này là “Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo” (Porcine reproductive and respiratory syndrome- PRRS)

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 con

có huyết thanh dương tính) Các nghiên cứu về bệnh trên những trại giống lớn tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% Ở các nước khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết thanh dương tính rất cao, như ở Anh là 6-75%, Mỹ là 36% (Phòng Dịch tễ - Cục Thú y)

Từ khi xuất hiện, bệnh này đã được gọi nhiều tên khác nhau như: bệnh bí ẩn trên heo, hội chứng hô hấp và vô sinh (SIRS), hội chứng sẩy thai dịch vùng và hô hấp trên heo (PEARS), bệnh heo tai xanh Tuy nhiên, đến năm 1992, tại hội nghị quốc tế về bệnh này ở St Paul, Minnessota, Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã nhất trí sử dụng tên chung của bệnh này là “hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp ở heo” (Porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS) ( Dal Young Kim., 2000)

2.1.2 Vi rút gây bệnh hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo do vi rút PRRS gây ra PRRSV

thuộc loài Nidovirales, họ Arteriviridae, gần giống với vi rút gây viêm khớp ở ngựa (EAV : equine arteritis virus; den Boon và ctv., 1991), Lactic Dehydrogenase virus

của chuột (LDH; Plagemann & Moennig, 1992) và vi rút gây sốt xuất huyết trên khỉ

(SHF; Godeny và ctv 1993) Vi rút PRRS được phân lập và định loại vào năm 1991

Vi rút PRRS có cấu trúc RNA sợi đơn có vỏ bọc, thuộc loại RNA vi rút, có kích thước vào khoảng 50 -70 nm, chứa nucleocapsid cùng kích thước có cấu trúc đối xứng 20 mặt, đường kính 35 nm (Meulenberg và ctv., 1993), chịu được nhiệt độ thấp (tồn tại 4 tháng dưới nhiệt độ -700C)

Hình 2.1 Cấu trúc hạt của vi rút Porcine Reproductive and Respiratory

Syndrome và vị trí các protein cấu trúc.(http://journals.cambridge

org/action/displayAbstract;jsessionid=2BE20E8ADE3E11074876AA184A4 E120C.tomcat1?fromPage=online&aid=7529228)

Vi rút có thể tồn tại trong tinh dịch của đực giống đến 93 ngày sau cảm nhiễm Môi trường không khí cũng phân tán vi rút một cách hiệu quả đặc biệt khi ẩm độ cao, nhiệt độ thấp và tốc độ gió mạnh Các trang thiết bị, dụng cụ chăn nuôi, các phương tiện vận chuyển… cũng là nguồn phân tán vi rút Ngoài ra, các loài côn trùng như

muỗi (Aedes vexans) và ruồi (Musca domestica); vịt trời cũng có thể là trung gian

truyền bệnh (http://www.huaf.edu.vn/diendan/viewtopic.php)

Một đặc trưng của Arteriviruses là cơ chế và vị trí của sao bản sơ cấp, chúng

sinh sản trong bào chất quanh nhân của các tế bào chủ Những virion mới được giải phóng bởi exocytosis từ bề mặt của tế bào Tế bào đích sơ cấp của vi rút là đại thực bào túi phôi của lợn Vi rút rất thích hợp với đại thực bào đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở vùng phổi Bình thường, đại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, vi rút xâm nhập vào cơ thể, riêng đối với vi rút PRRS, vi rút có thể nhân lên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%) Do vậy, khi đã xuất hiện trong đàn, chúng thường có xu hướng duy trì sự tồn tại và hoạt động âm thầm Đại thực bào bị giết sẽ làm giảm chức năng của hệ thống bảo vệ cơ thể và làm tăng nguy cơ bị nhiễm các bệnh kế phát Điều này có thể thấy rõ ở những đàn vỗ béo hoặc chuẩn bị giết thịt

có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi ( http://www.huaf.edu.vn/diendan/ viewtopic.php)

2.1.3 Các chủng vi rút và sự phân bố

PRRSV đã được xác lập với 2 kiểu gen chính là kiểu gen có nguồn gốc từ Châu

Âu hay là PRRS type 1 và kiểu gen có nguồn gốc từ Bắc Mỹ hay PRRS type 2 (Meulenberg JJ và ctv 1993; Nelson EA và ctv 1993) Việc so sánh chuỗi gen đã cho thấy sự khác biệt di truyền quan trọng giữa 2 nhóm này Giữa hai nhóm có sự tương đồng 67% về giá trị nucleotide Ở Bắc Mỹ chỉ tìm thấy kiểu gen NA, mặc dù cũng có một báo cáo đã cô lập được kiểu gen EU (Ropp và ctv 2004) Ở Châu Âu thì kiểu gen

EU trội hơn và cho đến nay vẫn chưa có chủng nào thuộc kiểu gen NA được xác lập ở phía Tây Châu Âu (Oleksiewicz và cs, 1998) Ở Châu Á và Nam Mỹ cả hai kiểu gen trên đã được xác lập Tuy nhiên bên trong mỗi kiểu gen lại có sự khác nhau giữa các chủng

Sự khác nhau giữa các chủng được thể hiện trong hình 2.2

Hình 2.2 Cây phân bố giống, loài của một số chủng Porcine Reproductive and

respiratory Syndrome Virus dòng Châu Âu và Châu Mỹ.(Nguồn: prrs.com/microbiology-prrsv-strains.asp )

http://www.porcilis-Hình 2.2 mô tả giống, loài của vi rút PRRS Trong đó có hai kiểu gen Bắc Mỹ và kiểu gen ở Châu Âu Sự khác nhau giữa các chủng phụ thuộc vào sự khác nhau trong chuỗi hợp chất hữu cơ của protein trong từng chủng vi rút Những nhánh chỉa ra là vùng phân bố của chủng đó đã được phân lập trong vùng hoặc từ những vùng xa hơn

Về mặt độc lực, người ta tìm thấy PRRS tồn tại dưới hai dạng:

• Dạng cổ điển: có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắt bệnh thì có tỉ lệ chết thấp, chỉ 1 - 5% trong đàn

• Dạng biến thể độc lực cao: gây nhiễm và chết nhiều lợn

2.1.4 Cấu trúc bộ gen của vi rút PRRS

Chuỗi hệ gen đầy đủ của vi rút PRRS được xác lập vào năm 1993, nó có kích thước khoảng 15,1 đến 15,5 kb và chứa ít nhất khoảng 9 khung đọc mở (ORFs) để mã hóa 20 protein đã định sẵn Hệ gen cũng chứa 2 vùng không dịch mã (UTR) ở hai đầu 5’ và 3’tại vị trí 59 và 39 (Meulenberg JJ, và ctv 1993) ORF 1a và 1b là định vị xuôi dòng của 59-UTR, nó chiếm giữ khoảng 75 % hệ gen ORF1a được dịch trực tiếp trong khi ORF1b được dịch bởi một khung dịch chuyển ribosome, độ lún xuống của chuổi protein ORF1ab lớn là do sự thủy phân protein thành các sản phẩm liên quan đến sự sao chép vi rút và bộ phận bản sao (Allende, và ctv 1999; Nelsen CJ và ctv 1999) ORF1a và ORF1b mã hóa các protein replicase, các protein tự phân tách ra làm

ít nhất 13 protein không cấu trúc liên quan đến việc nhân rộng và tái bản của vi rút (den Boon và ctv 1995; Snijder và ctv1994; van Dintenvà ctv 1996)

ORFs 2-7 là định vị ngược dòng của 39- UTR, ORF5 mã hóa protein N-

glycosylated, ORF6 mã hóa protein màng không glycosyl hóa M, ORF7 mã hóa

protein nuclecapsid N, ORF5 mã hóa glycoprotein màng chính GP5 (Meulenberg và

ctv 1995) Trong khi đó, GP2a, 2b, GP3 và GP4, dịch từ khung đọc mở 2a, 2b, 3 và 4,

tương ứng, được coi là protein cấu trúc có chức năng vẫn chưa rõ ràng, nhưng cần thiết cho nhiễm trùng (Wissink EH và ctv 2005) Dựa trên các nghiên cứu về EVA , GP2b, GP3, GP4 tạo thành một hợp chất tam phân liên kết các bề mặt của các virion

Các protein có nguồn gốc từ khung đọc mở ORF2-7 được dịch từ đầu 3’ của bộ subgenome mRNAs (sgmRNAs) Các sgmRNAs bao gồm một trình tự đầu bắt nguồn

từ đầu kết thúc 5’của bộ gen vi rút và hợp nhất thành một cơ thể theo cơ chế sao chép không liên tục (Snijder EJ và ctv 1998)

Bảng 2.1 Sản phẩm dịch mã của các ORF

ORF 1 RNA replicase ORF1a và ORF1b Proteins không cấu trúc

ORF2 Glycoprotein màng không quan trọng GP2a, GP2b

Protein cấu trúc

ORF2-7 Nucleocapsid protein N, nucleolar

localizationORF3 Glycoprotein màng GP3

ORF4 Glycoprotein màng GP4

ORF5 Glycoprotein màng chính GP5

ORF6 Protein liên kết màng - M

ORF7 Nucleocapsid protein - N

Hình 2.3 Cấu trúc gen của Porcine Reproductive and respiratory Syndrome A Tổ chức bộ gen của PRRSV, gen nhân rộng, bao gồm các khung đọc mở ORF1a và ORF1b,

mã hóa một polyprotein được tách ra tạo thành sản phẩm protein nhỏ gọi là các protein không cấu trúc (nsp1-n) theo sau ORF1 là các khung đọc mở ORF2-5 mã hóa glycoprotein GP2- GP5, ORF6 mã hóa protein màng M, ORF7 mã hóa protein nuclecapsid N trong ORF2 chèn thêm một ORF giả định là mã hóa một protein caaus trúc chưa rõ chúc nange B.bộ SubgenomeRNA tổng hợp trong suốt quá trình nhân rộng của PRRSV Đầu 5’ của RNA được thể hiện bởi hộp mầu đen ( nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10726635

2.2 Protein không cấu trúc nsp2

ORF1a và ORF1b mã hóa các protein replicase, các protein tự phân tách ra làm ít nhất 13 protein không cấu trúc liên quan đếm việc nhân rộng và tái bản của vi rút (Den Boon và ctv 1995; Snijder và ctv 1994; van Dintenvà ctv 1996) Trong số các protein không cấu trúc của PRRS, Nsp2 là sản phẩm lớn nhất của protein replicase, chứa một miền chymotrypsin protease như cystein (Snijder và ctv 1995) Protein Nsp2 của PRRS có cấu trúc tương tự như Nsp2 của EVA và có thể chia làm 3 vùng chính: vùng bảo tồn với đầu N- terminal cystein proteinase (PL2), vùng kỵ nước C-terminus™ (TM) ; vùng không tương đồng và vùng thay đổi không biết rõ chức năng là vùng nằm giữa hai vùng trên (Ziebuhr và ctv 2000) Chức năng của nsp2 của PRRS chưa được làm sáng tỏ, mặt dù nsp2 của EVA đã được xem là sự lắp ráp các màng đôi cùng với nsp3 (Snijder và ctv 2001) và được xem là đồng yếu tố cho các protein nsp4

Theo Pedersen và ctv (1999), nsp2 và nsp3 liên quan đến sự cảm ứng hình thành những túi màng kép (Double-membrane vesicle) Hơn nữa, theo Oleksiewicz và ctv (2001) nsp2 và nsp3 mang tính kháng nguyên cao Gene nsp2 cho thấy sự đa dạng di truyền cao nhất trong bộ gen virus, cũng như tính đa hình về kích thuớc đáng kể, gồm

sự xen vào 108 base và sự mất 3-333 base (Fang và ctv 2004) Điển hình, theo Tian và ctv (2007) những chủng PRRS Trung Quốc mang mầm bệnh cao, có sự mất không liên tục 90 base được báo cáo như là một chỉ thị phân tử (Marker) di truyền dịch tễ

Trong nghiên cứu về nsp2 của Dalyoungkim (2007), thì nsp2 sở hữu hai đặc điểm quan trọng làm cho nó có mục tiêu tiềm năng cho việc xây dựng marker vi rút: thứ nhất miễn dịch cao sở hữu 8 epitop của tế bào B; thứ hai nó có thể chèn được một gen bên ngoài vào và việc xóa bỏ trong nsp2

Nsp2 của PRRS sở hữu các protein chức năng, được đánh giá là có tính không đồng nhất cao và biến đổi Trình tự mã hóa Nsp2 cũng là vật liệu di truyền chính khác nhau giữa hai genotype Châu Âu và Bắc Mỹ, giống nhau khoảng 40% trình tự amino acid (Allende và ctv 1999; Nelsen và ctv 1999) Hơn nữa nsp2 là vùng chính cho sự khác nhau về chiều dài giữa hai type 1 và type 2 (Jun Han và ctv 2007) Nsp2 chia làm

3 vùng chính:

Hình 2.4 Biểu đồ giả định của Porcine Reproductive and respiratory Syndrome

Virus nsp2 protein Vùng nsp1 đến nsp5 của PRRSV và EVA trên lược đồ Vị trí giao nhau giữa hai vùng được đánh dấu hình tam giác và vị trí được chú thích Vùng hoạt động của các enzyme hộp màu đen, vùng không hoạt động PCP-1 trên EVA họp màu xóm Vùng TM(aa 876 to 898, 911 to 930, 963 to 979, and 989 to 1009) Hai vùng hypervariable(HV) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC2045381)

• Vùng PL2

Vùng PL2 của PRRS được dự đoán khoảng 100 aa, là vùng hoạt động trên chất nền giữa vùng giao nhau nsp2 - nsp3 và hai vị trí phân cắt đã được đề xuất 981GG và 1196G/G/G (Allende và ctv 1999; Ziebuhr và ctv 2000)

Vùng PL2 được dự đoán có tính bảo tồn cao (Han và ctv 2006; Bosch và ctv 2004; Ziebuhr và ctv 2000) Để kiểm tra tính quan trọng của miền PL2, Jun Han và cộng sự (2007) đã thiết kế và tạo dòng một đột biến xóa trên vùng PL2 của nsp2 (Y47- S180) Việc xóa đi vùng lõi PL2 trên nsp2 thì gây tử vong cho vi rút Được làm sáng

tỏ là không xác định được nội và ngoài bào các bản sao của vi rút bằng phương pháp RT-PCR hoặc kiểm tra miễn dịch sau 5-6 ngày nhiễm (Jun Han và ctv 2007) Đối với PRRS Nsp2 pL2, trình tự đầu cuối khoảng 45 aa và biến đổi cao, trừ 7 aa ở đầu N có tính bảo tồn cao và cần thiết cho sự nhận diện của PCP1 (Jun Han và ctv 2007)

Ngoài ra để xác định vai trò của vùng thượng lưu và hạ lưu của vùng PL2, Jun Han và cộng sự (2007) cũng đã thiết kế một trong hai đột biến xóa vùng trên A13-V35[V7 - nsp2Δ13 - 35] hoặc vùng sau S181- L323[V7 - nsp2 Δ181 - 323] được tạo dòng và gây nhiễm trên môi trường nuôi cấy tế bào MACR-144 Kết quả sự phiên mã RNA của V7 - nsp2Δ13 - 35 hữu hiệu còn nsp2 Δ181 - 323 chết Để loại trừ việc xóa

aa 181 - 323 có thể ảnh hưởng đến hoạt động của PL2, việc xóa có quan hệ chặt chẽ với vùng enzyme khác (S241- L323) [V7 - nsp2 Δ241 - 323] được thực hiện Kết quả

của việc xóa này vi rút chết Để phủ nhận rằng việc xóa trình tự có ảnh hưởng đến việc

xử lý nsp1, các RNA đột biến được dịch mã in vi tro

Kết quả cho thấy rằng, nsp1 dịch trực tiếp nsp1α và nsp1β Dữ liệu cho thấy miền PL2 và vùng hạ lưu (Downstream flanking sequence) cần thiết cho việc nhân rộng của

vi rút, khu vực thượng nguồn tiêu hao cần thiết cho sự tăng trưởng của vi rút (Jun Han

và ctv 2007)

• Vùng hypervariable (HV)

Khu vực ở giữa nsp2 khoảng 150- 850 aa, nằm giữa vùng PL2 và vùng TM, khác nhau rất cao giữa các giống và đặc biệt là giữa các kiểu gen PRRS (Allende và ctv., 1999; Nelsen và ctv 1999) Nhiều báo cáo về việc xóa, đột biến và chèn một đoạn mới vào khu vực này (Fang và ctv 2004; Gao, Z Q., X Guo, and H C Yang 2004 ; Ropp

và ctv 2004) Trong báo cáo của Jun Han và cộng sự (2007) đã chứng minh rằng vùng này không cần thiết cho việc nhân rộng

• Vùng TM và đuôi C

Vùng carboxyl của nsp2 thì bảo tồn cao trên các chủng PRRS và được dự đoán chứa khoảng 3 hoặc 4 vùng hydrophotic TM (aa 876-898, 911-930,963-979,989-1009) (Han và ctv 2007) Đặc điểm này giống với EVA, vùng TM tương tự trên đầu C (Snijder và ctv 1995; Ziebuhr và ctv 2000) Thay vì PL2 của EVA hơn 1 G/G dipeptide (Snijder và ctv 2001) Vì vậy đầu cacboxyl của nsp2 PRRS có hai vị trí giao cắt 981 G/G và 1196G/G/G (Allende và ctv 1999) Vì vậy vùng kỵ nước C chịu trách nhiệm cho các mô đích của protein không cấu trúc trên màng tế bào để hoàn thành việc nhân rộng của vi rút, giống như EVA (Van der Meer và ctv 1998) Việc xóa hoàn toàn vùng W876- Q1009[v7-nsp2 Δ876-1009] của vùng TM đã được thực hiện để xác định vùng kỵ nước cần thiết cho việc nhân rộng Các kết quả đã chỉ ra rằng việc xóa gây chết cho vi rút Ngoài ra, vị trí giao nhau 981G/G giữa 3 và 4 vùng xoắn ốc TM, 1 vùng trên TM ngắn (A880-A937)[v7-nsp2 Δ880-937] sau đó được xác định để duy trì

vị trí giao cắt Tuy nhiên việc xóa này cũng không hình thành được vi rút Tương tự như vậy, đột biến xóa S1070-A1162[v7-nsp2 Δ1070-1162] giữa vị trí giao cắt 981G/G

và 1196G/G/G cũng không cho phép cứu được vi rút Vì vậy vùng TM và đầu kỵ nước

C quan trọng cho chức năng của nsp2

Hình 2.5 Xây dựng các chủng VR-2332 nsp2 đột biến Đột biến đã được hoàn thành

để đạt được sản phẩm với xóa trong khung của nsp2 do độ trùng khớp PCR Các axit amin đã xóa được hiển thị là đường nét đứt và các vị trí liên quan được chỉ định theo tên của từng đột biến Với mục đích của biểu hiện gen bên ngoài, gen GFP được chèn vào vị trí nơi mà các aa vùng 324 - 434 của nsp2 đã bị xóa để tạo ra đột biến V7 - nsp2 – 324 -

434 - GFP Các miền enzyme giả định và vùng TM cũng như các vị trí giao nhau được hiển thị Tính khả thi cho mỗi đột biến xây dựng được hiển thị bên phải: +, khả thi; -, không khả thi ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2045381 )

2.3 Sự khác biệt về trình tự giữa hai chủng PRRSV Châu Âu và PRRSV Bắc Mỹ

Nelsen và ctv đã tìm thấy sự khác nhau quan trọng giữa dòng Châu Mỹ 2332) và dòng Châu Âu (Lelystad) trên trình tự đầu 5’ và một phần ORF1a Đánh dấu

(VR-sự khác biệt cũng đã được tìm thấy giữa các chủng vi rút Châu Âu và vi rút Châu Mỹ

cô lập nằm trên một số các gen cấu trúc (Kapur và ctv 1996; Murtaugh và ctv 1995) Gen ORF7 bảo tồn cao trên chủng Bắc Mỹ, 95 - 100% trình tự amino acid tương đồng nhưng khi so sánh giữa chủng Bắc Mỹ và chủng Lelystad chỉ có 57 - 59% trình tự amino acid tương đồng (Meng và ctv 1995; Murtaugh và ctv 1995) ORF6 là gen bảo tồn nhất trên chủng Bắc Mỹ với 100% trình tự amino acid tương đồng, và là gen bảo tồn nhất giữa dòng Châu Âu và Bắc Mỹ với sự tương đồng 71 - 80% (Andreyev và ctv

1997; Murtaugh và ctv 1995) Sự khác biệt về amino acid trên ORF5 từ 88 - 97% trên Bắc Mỹ và 51 - 59% khi so sánh với Lelystad (Andreyev và ctv 1997) Sự so sánh vi rút Lelystad với VR-2332, chủng Bắc Mỹ, nhận được 63, 58 và 68% sự tương đồng tại các gen tương ứng ORFs 2, 3 và 4 (Murtaugh và ctv 1995) Nó trùng với kết quả báo cáo so sánh vi rút Lelystad với vi rút US VR - 2385 (Morozov và ctv 1995) Các khác biệt lớn nhất được quan sát trong Nsp2 Protein Nsp2 của chủng US dài hơn 102 amino acid so với chủng LV, giống nhau 32% amino acid

2.4 PRRSV chủng độc lực cao tại Trung Quốc

Từ khi bệnh hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được phát hiện đầu tiên năm 1987 cho đến nay bệnh đã bùng phát khắp nơi trên thế giới Trong những năm gần đây, đã có những báo cáo về bệnh nặng của hội chứng PRRS (HP-PRRS) từ một

số các nước Châu Á, được xem như là một bệnh mới Theo báo cáo của OIE Trung Quốc (2009), ngày nay bệnh HP-PRRS được xem là phổ biến trên lợn

Năm 2006, bệnh HP- PRRS hay được biết đến với tên “bệnh lợn sốt cao”, được báo cáo đầu tiên tại Trung Quốc và từ đó lan truyền nhanh chóng Sau đó, được báo cáo tại Việt Nam, Lào, Campuchia, Philippin, Nga Dấu hiệu lâm sàng của HP-PRRS tương tự như bệnh sốt cao cổ điển ở lợn (CSF), nó lây lan rất nhanh và gây thiệt hai kinh tế đáng kể và có thể gây tử vong 100% lợn bệnh

Các nhà khoa học Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu và phân lập vi rút PRRS

từ năm 1996 Cho đến năm 2001, trình tự bộ gen của PRRS đầu tiên được phân tích trọn vẹn bởi Yang và cộng sự Sau đó có nhiều công trình nghiên cứu về sự phân dòng cũng như sự đa dạng về địa lý của các genotype PRRS trên khắp Trung Quốc, tiêu biểu có các nghiên cứu của An và ctv 2007; Tian và ctv 2007; Chen và ctv 2006; Gao

và ctv 2004 Kết quả của các nghiên cứu này đã cung cấp những thông tin quan trọng

về quan hệ di truyền của PRRSV Trung Quốc với các chủng vi rút khác trên thế giới

và thiết lập những giả thiết ban đầu cho sự tiến hóa của PRRSV tạo ra các chủng vi rút độc lực cao như hiện nay (dẫn liệu Đặng Thùy Dương, 2009)

Hai chủng PRRS Trung Quốc HB-1 và HB-2 đã được Gao và cộng sự (2004) bước đầu mô tả về đặc điểm bộ gen và so sánh với bộ gen của chủng PRRS Bắc Mỹ và chủng PRRS Châu Âu Kết quả hai có sự tương đồng cao (89,4 – 89,6%) giữa hai chủng HB-1 và HB-2 so với chủng VR - 2332 (chủng Bắc Mỹ), so với chủng Châu Âu

độ tương đồng chỉ 54,3 – 54,7% Điều này đã chứng tỏ được rằng hai chủng HB-1 và HB-2 nằm trong nhóm genotype Bắc Mỹ

Đến năm 2006, Chen và cộng sự nghiên cứu trên protein GP5 do ORF5 mã hóa của 13 chủng PRRS phân lập ở Trung Quốc chỉ có một chủng tương đồng với chủng PRRS Châu Âu, 12 chủng còn lại tương đồng với chủng Bắc Mỹ Điều này làm sáng

tỏ thêm cho kết quả của Gao và cộng sự (2004)

Trong nghiên cứu của Gao và cộng sự năm 2004, trong lúc so sánh hai chủng HB-1 và HB-2 với chủng Bắc Mỹ, ông đã phát hiện có một đột biến mất đoạn 12 aa ở Nsp2 thuộc dòng HB-2 và đã khẳng định đây là một chủng PRRS mới Năm 2007, Tian và cộng sự nghiên cứu cho biết nguyên nhân gây bệnh tại các ổ dịch của Trung Quốc năm 2006 vẫn là virus PRRS nhưng độc lực cao hơn nhiều Sau khi phân tích di truyền các chủng PRRS phân lập, cho thấy rằng các chủng vi rút này bị mất 30 amino acid trong nsp2

Kết quả tìm hiểu sự đột biến liên quan đến việc tạo nên dòng vi rút độc lực cao của các tác giả cho thấy chủng gây bệnh tương đồng cao với các chủng thuộc genotype Bắc Mỹ ở vùng ORF5, nhưng đặc biệt có sự xuất hiện hai đột biến trên nsp2 (vùng ORF1) Đột biến thứ nhất là đột biến mất leucine ở aa 482 và đột biến thứ hai là mất đoạn liên tục 29 aa từ 534 – aa 562 Những đột biến này chỉ xuất hiện trên những dòng gây tỷ lệ chết cao và chỉ xuất hiện sau đợt dịch 2006 Từ các kết quả này, Tian và cộng

sự (2007) đã xây dựng nên những giả thiết ban đầu về sự tiến hóa của các chủng PRRSV độc lực cao ở Trung Quốc từ các chủng thuộc genotype Bắc Mỹ với vùng tiến hóa tiềm năng nằm trên nsp2 của vùng ORF1 Các tác giả cũng gợi ý một số nguyên nhân tiến hóa là do các chủng virus thuộc genotype Bắc Mỹ lưu hành tại Trung Quốc chịu ảnh hưởng về mặt địa lý hay môi trường như nhiệt độ, ẩm độ cao vào mùa hè hay

sự nhiễm các vi khuẩn thứ phát cũng góp phần lên sự hình thành chủng virus độc lực Năm 2010, Chengmin Wang và cộng sự đã tiến hành phân tích đặc tính phân tử

và cây di truyền 7 virus PRRS biến thể cô lập tại Trung Quốc Kết quả phân tích 5 gen (GP2, GP3, GP4, GP5 và nsp2) của 7 PRRS cô lập từ Trung Quốc, được giải trình tự

và phân tích cây di truyền các base trên trình tự Nucleotide của ORF2-5 và nsp2 cho thấy rằng 7 cô lập này thuộc cùng phân nhóm di truyền và có quan hệ với kiểu gen PRRS Bắc Mỹ Chủng Trung Quốc tương đồng với Bắc Mỹ 80,8 - 92,9% Tất cả protein không cấu trúc nsp2 của 7 chủng này có sự biến thể (xóa 29 amino acid) so

với PRRS Bắc Mỹ phân lập khác Mặt khác, có nhiều amino acid đột biến trong protein GP5 và protein Nsp2 khi so sánh với các phân lập trước đây

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn heo nhập từ Mỹ (Phòng dịch tễ, Cục thú y Việt Nam) Tuy nhiên, dịch PRRS chỉ bắt đầu xuất hiện ở tỉnh Hải Dương từ tháng 3 năm 2007, sau đó lây lan ra các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ, Trung Bộ

và Nam Bộ, gây nhiều tổn thất cho ngành chăn nuôi lợn Từ cuối tháng 3 năm 2010, dịch lại xuất hiện từ Hải Dương và phát tán ra các tỉnh trong khu vực Tính đến ngày 19/5/2010 đã có 15 tỉnh công bố dịch lợn tai xanh gồm: Hải Dương, Thái Bình, Hưng Yên, Thái Nguyên, Hải Phòng, Bắc Ninh, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Nghệ An, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hòa Bình và Cao Bằng, làm cho hàng trăm nghìn lợn mắc bệnh, hàng chục nghìn con chết phải tiêu hủy (http://www.bacninh gov.vn/Story/NongNghiepKhuyenNong)

Kết quả giải trình tự bộ gen của virút PRRS phân lập từ mẫu bệnh phẩm của Việt Nam được so sánh với database nucleotide hoàn chỉnh của Ngân hàng Gen khẳng định sản phẩm PCR có mức độ tương đồng 77% so với chủng VR-2332 và 71% so với chủng MN184 (đây là 2 chủng vi rút của Bắc Mỹ) nhưng đặc biệt có mức độ tương đồng từ 98,6 - 99,6% so với các chủng virút thể độc lực cao của Trung Quốc như HUN4, JX0612, JXA1, HUB2, HUB1, HUN, HEB1 (Trung Tâm Chẩn đoán thú

y TW, 2008)

Trong nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Hải (2009), phân tích trình tự ORF5 thì thấy nhóm vi rút PRRS tại Đồng Nai và Tp.HCM thuộc nhóm Châu Mỹ, phân nhóm 2.2, cùng nhóm với chủng virus PRRS độc lực cao của Trung Quốc (99%)

Chính điều này, mà việc phân tích trình tự mã hóa nsp2 các chủng PRRS tại TP HCM là vấn đề cần thiết Chúng ta cần phải so sánh trình tự mã hóa Nsp2 ở Việt Nam

so với trình tự mã hóa protein nsp2 chủng Trung Quốc Từ đó có biện pháp phòng bệnh cũng như khắc phục bệnh cho hợp lý

2.5 Các phương pháp kiểm tra PRRS trong phòng thí nghiệm

Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên hoặc axit nucleic của vi rút: nuôi cấy tế bào; miễn dịch huỳnh quang; hóa mô miễn dịch; lai insitu; RT- PCR; nested RT-PCR Một số phương pháp cho phép phân biệt các dòng Châu Âu và Bắc Mỹ: RT-PCR; nested RT- PCR; Cắt phân đoạn đa hình(RFLP)

Ngoài ra một số phương pháp phát hiện kháng thể cũng được phát triển: ELISA,

đã được thương mại hóa thành bộ kít (Kít ELISA của IDEXX); phản ứng kháng thể huỳnh quang giàn tiếp (Indrect Fluoresent Assay- IFA); trung hòa virus (Serum Virus Neutralization – SNV); miễn dịch peroxydase một lớp (Immunoperoxydase monolayer Assay-IMPA) (Nguyễn Ngọc Hải , 2007)

2.6 Sơ lược một số tài liệu nghiên cứu liên quan

2.6.1 Trên thế giới

Năm 2009, Lei zhous và cộng sự đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của đột biến mất

30 aa trên nsp2 trên chủng PRRs động lực cao ở Trung Quốc Nghiên cứu tiến hành bằng cách tạo ra 4 nhân bản: một nhân bản độc lực cao PRRS JXwn06 (pWSK-JXwn), một nhân bản của chủng vi rút PRRS độc lực thấp HB-1/3.9 (pWSK-HB-1/3.9), một nhân bản dạng khảm trong đó khu vực có chứa nsp2 bị xóa 30 aa được thay thế bởi khu vực độc lực thấp của HB-1/3.9 tương ứng (pWSK-JXwn-HB1nsp2), và một nhân bản đột biến với việc xóa tương tự trong Nsp2 HB-1/3.9 như JXwn06 (pWSK-HB1-ND30) Họ nghiên cứu kỹ bệnh tích của 4 chủng vi rút trên heo để nghiên cứu vai trò của việc xóa 30 amino acid trên vùng mã hóa Nsp2 trong việc tạo độc lực của vi rút Tất cả các vi rút này có thể nhân rộng trên môi trường MARC-145 Kết quả RvJXwn-HB1-3.9 giữ lại độc tính cao cho heo con, giống như rvJXwn và JXwn06, mặt dù thời gian tồn tại của heo con bị nhiễm RvJXwn-HB1nsp2 kéo dài hơn RvHB1-ND30 độc tính thấp với heo con, như RvHB-1/3.9 và HB-1/3.9 vi rút cha mẹ Chính vì vậy mà kết luận rằng việc xóa 30 aa là không liên quan đến độc tính của PRRSV độc lực cao mới nổi ở Trung Quốc

Elisabeth Brown và công sự (2009) nghiên cứu khả năng tạo kháng thể của các Protein không cấu trúc (nsps) liên quan đến quá trình chẩn đoán bệnh và sự khác nhau giữa type I và type II Ngoài đáp ứng miễn dịch của cơ thể tạo ra do các protein cấu trúc đặc biệt protein N thì các protein không cấu trúc cũng tạo kháng thể rất cao: nsp1, nsp2, nsp7 và phương pháp ELISA thì được sử dụng trong nghiên cứu này

Jun Han và cộng sự (2007) nghiên cứu về cách nhận dạng các vùng không thiết yếu trên protein không cấu trúc nsp2 của PRRSV chủng Bắc Mỹ VR2332 Kết quả đã tìm thấy nhiều vùng không thiết yếu trên protein không cấu trúc nsp2: vùng từ aa 13 -

35 trước vùng Pl2, khu vực aa 324 - 813 nằm giữa vùng HV, vùng này có thể bỏ đi

100 aa đến 200 aa nhưng không thể bỏ hoàn toàn Nghiên cứu cũng thành công trong

việc chèn gen GEP bênh ngoài vào vùng không thiết yếu, vi rút tái tổ hợp bị suy yếu

và không có khả năng gây bệnh

Jian Chen và cộng sự (2006) đã tiến hành phân tích trình tự trên ORF5 trên 13 chủng PRRS phân lập tại Trung Quốc và so sánh với các chủng PRRS khác trên thế giới Kết quả có phân tích cây sinh dòng cho thấy tất cả các chủng phân lạp tại Trung Quốc đều thuộc kiểu gen của chủng Bắc Mỹ, chỉ có một chủng BJ3 là thuộc kiểu gen chủng Châu Âu Phân tích trình tự, tiết lộ chủng PRRS Trung Quốc và PRRS Bắc Mỹ

có sự tương đòng cao trên ORF5 và có thể chia thành hai lớp phụ Một lớp có quan hệ mật thiết với chủng Bắc Mỹ VR-2332 và một lớp có quan hệ với chủng vavccin MLV Resp Các chủng Trung Quốc phân lập có một số đột biến di truyền nhỏ và một số chủng có quan hệ trực tiếp với chủng vaccine

Năm 2007, Youjun và ctv xác định những chủng PRRSV phân lập từ vùng dịch ở Việt Nam và Trung Quốc năm 2007 Năm chủng PRRSV gồm một chủng từ Việt Nam (07QN) và bốn chủng phân lập từ Trung Quốc năm 2007 (07HEBTJ, 07BJ, 07HEN, 07NM) đã được giải trình tự toàn bộ bộ gen Phân tích quan hệ di truyền cho thấy chủng 07QN giống nhau 99% với PRRSV phân lập tại Trung Quốc về trình tự nucleotide Mối quan hệ di truyền dựa trên toàn bộ bộ gen của các chủng trên cho thấy rằng tất cả chủng vi rút phân lập này thuộc cùng nhóm trong nhóm 2 (dòng Châu Mỹ)

và tương đồng với các chủng phân lập tại Trung Quốc trước đó

An và ctv (2007) phân tích và so sánh những trình tự aa trên GP5 của 42 chủng virus PRRS phân lập tại Trung Quốc năm 1996 và 2006, đã phát hiện rằng tất cả các chủng phân lập tại Trung Quốc đều thuộc dòng châu Mỹ Giữa chúng có 2 phân nhóm

có sự thay đổi cao và phân biệt rõ trên cây di truyền của dòng Châu Mỹ Tất cả phân nhóm 2 của dòng châu Mỹ đều đa dạng cao trên vùng chức năng trung hòa sơ cấp và những chủng vi rút này giới hạn trong phía Nam Trung Quốc Những chủng thuộc phân nhóm 1 của dòng Châu Mỹ giống nhau cao với chủng vaccine RespPRRSV MLV và chủng gốc của vaccine MLV, VR-2332

Gall và ctv (1998) nghiên cứu sự biến đổi về mặt phân tử trên protein vỏ capsid (ORF7) của virus PRRS cho thấy hai dòng virus PRRS, châu Âu và châu Mỹ khá giống nhau Các chủng thuộc dòng châu Âu bảo tồn cao giữa các chủng Phân tích sự thay thế aa và nucleotide trên ORF7 của vi rút PRRS cho thấy có bốn vùng bảo tồn cao, không có đột biến cố định nào trên ORF7 được xác định

Raymond và ctv (2003) phân tích trình tự aa N protein của các chủng dòng châu

Mỹ và xác định hai trình tự tín hiệu định vị nhân (nuclear localization signal, NLS) nằm trên vị trí aa 10-13 (NLS-1) và 41-72 (NLS-2) Đồng thời tiến hành thay thế vị trí

aa quan trọng lysine với aa không mang điện tích trong NLS-2 dẫn đến khóa sự định vị nhân và hạch nhân Trình tự bên trong NLS-2, KKNKK, hình thành vùng định vị lõi bên trong của NLS-2

2.6.2 Trong nước

Trần Thị Bích Liên và Trần Thị Dân (2007), xác định tỷ lệ nhiễm virus PRRS tại một số cơ sở chăn nuôi heo miền Đông Nam Bộ Khảo sát được tiến hành trên 1082 mẫu huyết thanh thu thập từ 21 trại chăn nuôi công nghiệp và hộ chăn nuôi của hai tỉnh/thành (gọi là khu vực) thuộc miền Đông Nam bộ trong các năm 2003 – 2005 Xác định tỷ lệ nhiễm và chủng PRRS dựa vào sự phát hiện kháng thể kháng vi rút PRRS bằng kỹ thuật ELISA

Nguyễn Ngọc Hải và ctv (2007 ), chẩn đoán vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS) bằng kỹ thuật RT – PCR, thực hiện với cặp mồi Rovira

1 và Rovira 2 (Rovira, 2000), và cặp mồi P1, P2 (Donadeau M., 1999) nhằm phát hiện virut PRRS trong huyết thanh, tinh dịch, mô phổi, mô hạch

Nguyễn Ngọc Hải và Võ Khánh Hưng (2009), phân tích trình tự gen ORF5 và ORF 7 của vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) ở một số tỉnh miền nam Việt Nam Kết quả: dựa trên khung đọc mở ORF5 nhóm virus PRRS tại Đồng Nai và Tp.HCM thuộc nhóm châu Mỹ, phân nhóm 2.2, cùng nhóm với chủng vi rút PRRS độc lực cao của Trung Quốc (99%); dựa trên khung đọc mở ORF7 nhóm vi rút PRRS tại Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu và Tp.HCM thuộc phân nhóm 2.1 và 2.2 Hai chủng phân lập từ Bà Rịa – Vũng Tàu (1/BRVT/VN, 6/BRVT/VN) có sự tương đồng thấp so với các chủng thực địa Đồng Nai (82/DN/VN, 3428/DN/VN) (89,5 – 89,8 %), Tp.HCM (T2/HCM/VN, T5/HCM/VN) (90,1 %) và các chủng Bà Rịa – Vũng Tàu còn lại (4/BRVT/VN, VD/BRVT/VN) (89,5 – 90,3 %) và chủng vaccine BSL-PS100 (91,1%)

Nguyễn Ngọc Hải và Đặng Thùy Dương (2009), Chẩn đoán phân biệt virus chủng vaccine nhược độc và hoang dại gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS) Kết quả đạt được: kỹ thuật RT-PCR-RFLP có thể sử dụng phân biệt virus PRRS vaccine và virus PRRS hoang dại của genotype Bắc Mỹ với cả 4 loại