NGHIÊN CỨU THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI

Kết quả thu được gồm có EBM-2 + 15% FBS/KS + GF là môi trường giúp cho sự bám dính tăng sinh tế bào ứng viên tốt nhất trong các môi trường khảo sát; chúng tôi cũng đã chọn lọc thành công

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ

TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI

Tháng 7/2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ

TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS PHẠM VĂN PHÚC LÂM THIÊN NGỌC

Tháng 7/2010

LỜI CẢM ƠN

Sau hơn 4 tháng thực hiện đề tài tốt nghiệp tại Phòng Thí nghiệm Nghiên cứu

và Ứng dụng Tế bào gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, tôi đã học tập được nhiều điều Đó không chỉ là những kiến thức bổ ích về tế bào gốc, không chỉ là tác phong nghiên cứu khoa học chuyên nghiệp

mà hơn hết là tình cảm gắn bó giữa các bạn sinh viên với lãnh đạo phòng cùng các anh chị cán bộ trẻ Trong suốt thời gian làm đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ từ mọi phía, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Thầy trưởng bộ môn và các thầy cô thuộc Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học,

trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh,đã tạo tận tình dạy bảo tôi trong 4 năm đại học và tạo điều kiện để tôi được thực hiện đề tài tốt nghiệp theo hướng yêu thích

Thầy Phan Kim Ngọc, người đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài và luôn hỏi han, động viên khiến tôi thêm vững niềm tin vào bản thân Từ tận đáy lòng, tôi biết

ơn thầy và cầu mong thầy luôn mạnh khỏe để tiếp tục cống hiến cho nền khoa học nước nhà

Thầy Phạm Văn Phúc, người hướng dẫn khoa học và luôn sẵn sàng giúp đỡ định hướng cho đề tài của tôi Thầy là người luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài và cũng là một người anh thân thiết, luôn động viên tinh thần cho tôi, giúp tôi vượt qua những trở ngại để hoàn thành tốt đề tài

Thầy Nguyễn Thanh Tâm, người trực tiếp chỉ dẫn tôi từ những ngày đầu tiến hành đề tài và luôn đồng hành cùng tôi trong suốt quãng thời gian sau đó Tôi học được nhiều điều từ thầy sau 4 tháng làm khóa luận, trong đó, điều quan trọng nhất là đối với mọi việc mình làm, chỉ cần có sự say mê và nỗ lực thì thành công đang chờ đợi

ta phía trước

Các anh chị Vũ Bích Ngọc, Huỳnh Mỹ Linh, Vương Gia Tuệ, Phạm Quốc Việt

đã luôn bên cạnh tôi, hỗ trợ tôi về kiến thức chuyên môn và là nguồn động lực khiến tôi cố gắng hơn Các anh chị trẻ, nhiệt tình và luôn sẵn sàng giúp đỡ sinh viên Mong

Các bạn Đinh Văn Long, Phan Lữ Chính Nhân, các bạn nhóm ung thư vú, tế bào mầm và tất cả sinh viên trong phòng thí nghiệm, các bạn đã giúp đỡ tôi rất nhiều

và cho tôi hiểu thêm rằng cuộc sống thật tuyệt khi bên cạnh lúc nào cũng có những người bạn sẵn sàng giúp đỡ mình

Xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến ba mẹ tôi – người đã cho tôi cơ hội được có mặt trên cuộc đời này Con mong ba mẹ luôn khỏe Cảm ơn người chị tuyệt vời và đứa

em bé bỏng của tôi Chúc mọi người những điều tốt đẹp nhất

in vitro Chúng có vai trò quan trọng trong sự sửa chữa các mạch máu bị tổn thương và

hình thành mạch máu mới Việc nghiên cứu sử dụng tế bào tiền thân nội mô trong điều trị các bệnh về tim mạch sẽ mở ra những chiến lược chữa trị mới đầy hứa hẹn Tế bào tiền thân nội mô có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó máu cuống rốn người là nguồn cung cấp tế bào dồi dào Mục đích nghiên cứu này là nhằm thiết lập phương pháp hiệu quả để thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người

Đề tài gồm 2 nội dung chính là thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người và nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô Tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn được thu nhận bằng phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng với Ficoll và nuôi cấy chọn lọc trong 4 môi trường khảo sát: M199 + 15% FBS/KS; M199 + 15% FBS/KS + GF; EBM-2 + 15% FBS/KS; EBM-2 + 15% FBS/KS + GF Phương pháp chuyển dịch nổi sau 3, 6, 9 ngày được sử dụng để đánh giá hiệu quả bám dính, tăng sinh của tế bào ở các thời điểm chuyển dịch Số lượng tế bào bám dính vào đĩa nuôi được đếm ở 30 thị trường ngẫu nhiên và tính trung bình cộng các mẫu Các số liệu trung bình này được dùng để so sánh giữa các môi trường nhằm chọn ra môi trường tối ưu cho việc phân lập tế bào

Sau khi đã xác định được môi trường nuôi cấy tối ưu (EBM-2 + 15% FBS/KS + GF), việc nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô được tiến hành trong môi trường này bằng phương pháp chuyển dịch nổi sau 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9 ngày Khi tế bào hấp thụ hết chất dinh dưỡng và giải phóng các chất thải của quá trình trao đổi chất vào môi trường, tiến hành thay môi trường mới cho đĩa nuôi Sau khi tế bào bám trải và tạo thành lớp tế bào đơn, tiến hành cấy chuyền để tăng số lượng tế bào và cung cấp chất

dinh dưỡng, không gian cho sự phát triển tế bào Tế bào tiền thân nội mô được xác định dựa vào khả năng bám dính, tăng sinh, hình thái và marker bề mặt (CD133+, CD34+)

Kết quả thu được gồm có EBM-2 + 15% FBS/KS + GF là môi trường giúp cho

sự bám dính tăng sinh tế bào ứng viên tốt nhất trong các môi trường khảo sát; chúng tôi cũng đã chọn lọc thành công tế bào tiền thân nội mô có khả năng tăng sinh cao trong môi trường tối ưu và biểu hiện dương tính với các marker chọn lọc

Chúng tôi kết luận đã thiết lập thành công quy trình thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người trong môi trường tối ưu EBM-2 + 15% FBS/KS + GF bằng phương pháp chuyển dịch sau 1 ngày

Endothelial progenitor cell is a unipotential stem cell which has a capacity for differentiation to mature endothelial cell and transdifferentiation to smooth muscle cell

in vitro It plays an essential role in repairing injured vascular and promoting

neovascularization Investigation of using endothelial progenitor cells will create a novel and promising strategy for treatment cardiovascular diseases Endothelial progenitor cells can be isolated from various sources, among which human umbilical cord blood is a tremendous source The aim of this research is to establish a method to efficiently isolate and culture human umbilical cord blood -derived endothelial progenitor cells

At first, mononuclear cells were isolated from human umbilical cord blood by gradient centrifugation made by Ficoll Then these cells were cultured on selective media to isolate endothelial progenitor cells There were 4 different media 1 M199 + 15% FBS/antibiotic-antimycotic; 2 M199 + 15% FBS/antibiotic-antimycotic + GF; 3 EBM-2 + 15% FBS/antibiotic-antimycotic; 4 EBM-2 + 15% FBS/antibiotic-antimycotic + GF Every 3 day the supernatant was changed, and the number of attached cells was counted at 30 random fields to estimate the capacity of cell proliferation Then, the averages of total samples were used to compare among media

to examine which one is best for cell adhesion and proliferation The result indicated the most successfully selective culture of endothelial progenitor cells was the last medium (EBM-2 + 15% FBS/KS + GF)

We used the identified medium for the next step We changed supernatant every

0, 24, 48, 72, 96, 144, 216 hrs When the culture dish reached to 75-80% cell confluence, cells were harvested using Trypsin/EDTA 0,25% and then cultured in a defined volume of medium Endothelial progenitor cells were identified based on their

ability to attach to culture dish, to proliferate, and on their morphology and surface markers

In summary, human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells were isolated successfully in optimal medium EBM-2 + 15% FBS/KS + GF by changing supernatant after 24h These cells displayed high potential to proliferate and express specific markers

MỤC LỤC

Bìa chính

Bìa phụ

Lời cảm ơn

Tóm tắt i

Summary iii

Mục lục v

Danh mục các bảng vii

Danh sách các biểu đồ viii

Danh mục các chữ viết tắt ix

Danh sách các hình xi

Danh sách các sơ đồ xii

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.2.3 Ý nghĩa của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tế bào gốc 4

2.2.1 Định nghĩa 4

2.2.2 Phân loại 4

2.2.3 Ứng dụng 5

2.2 Sinh học cuống rốn 7

2.2.1 Cấu tạo và sự phát triển cuống rốn 7

2.2.2 Ưu thế sử dụng nguồn tế bào gốc từ máu cuống rốn 8

2.3 Tế bào tiền thân nội mô 9

2.3.1 Định nghĩa 9

2.3.2 Lịch sử nghiên cứu tế bào tiền thân nội mô 10

2.3.3 Đặc điểm 13

2.3.4 Nguồn thu nhận 16

2.3.5 Nuôi cấy EPC 20

2.3.6 Ứng dụng 22

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

3.1.1 Thời gian 25

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 25

3.2 Vật liệu 25

3.2.1 Mẫu vật 25

3.2.2 Dụng cụ 26

3.2.3 Thiết bị 27

3.2.4 Hóa chất 28

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Nội dung 1: Thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người 30

3.3.1 Nội dung 2: Nuôi cấy chọn lọc EPC 32

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

4.1 Hiệu quả bám dính, tăng sinh tế bào tiền thân nội mô trong môi trường khảo sát 39

4.2 So sánh tương quan số lượng tế bào tối ưu trong 4 môi trường 48

4.3 Khảo sát phương pháp nuôi cấy tối ưu EPC ứng viên trong EGM-2 49

4.4 Khẳng định tế bào tiền thân nội mô ứng viên là tế bào tiền thân nội mô 52

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

5.1 Kết luận 54

5.2 Đề nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Phụ lục

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Phân biệt tế bào gốc và tế bào tiền thân 10

Bảng 3.1 Một số dụng cụ được sử dụng trong đề tài 26

Bảng 3.2 Một số thiết bị được sử dụng trong đề tài 27

Bảng 3.3 Tỉ trọng các loại tế bào trong máu 32

Bảng 4.1 Trung bình số tế bào bám dính và tăng sinh trong 4 môi trường 39

Bảng 4.2 So sánh tương quan số lượng tế bào giữa 4 môi trường nuôi cấy 48

Bảng 4.3 Sự tăng sinh EPCs ứng viên qua các ngày nuôi cấy 49

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1 Số lượng tế bào EPCs ứng viên bám dính và tăng sinh trong 4 môi trường tại các thời điểm khảo sát 40 Biểu đồ 4.2 So sánh tương quan số lượng tế bào bám dính và tăng sinh trong 4 môi trường nuôi cấy 48 Biểu đồ 4.3 Sự tăng sinh của EPCs ứng viên qua các ngày nuôi cấy 51

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CEC Circulating endothelial cell Tế bào nội mô tuần hoàn

EC Endothelial cell Tế bào nội mô

nội mô

EPC Endothelial progenitor cell Tế bào tiền thân nội mô

ES Embryonic stem cell Tế bào gốc phôi

FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai bò

FGF Fibroblast growth factor Nhân tố tăng trưởng nguyên bào

sợi

GF Growth factor Nhân tố tăng trưởng

GFP Green fluorescent protein

HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan B

HCV Hepatitis C virus Virus viêm gan C

HIV Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch

L-EPC Large - endothelial progenitor cell Tế bào tiền thân nội mô lớn

MNC Mononuclear cell Tế bào đơn nhân

MOMCs Monocyte – derived multipotential

cells

Tế bào đa năng thu nhận từ bạch cầu đơn nhân to

MSC Mesenchymal stem cell Tế bào gốc trung mô

growth factor

Nhân tố tăng trưởng biểu mô người tái tổ hợp

SCI Spinal cord injury Chấn thương tủy sống

S-EPC Small - endothelial progenitor cell Tế bào tiền thân nội mô nhỏ

mạch

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu tạo nhau thai và hệ mạch máu trong cuống rốn 7

Hình 2.2 Phân biệt tế bào gốc vả tế bào tiền thân 10

Hình 2.3 Hình thái tế bào tiền thân nội mô 13

Hình 2.4 Nguồn gốc và định hướng phát triển của EPC 15

Hình 3.1 Túi máu TERUFLEXTM 25

Hình 3.2 Một số dụng cụ sử dụng trong đề tài 26

Hình 3.3 Một số thiết bị được sử dụng trong đề tài 27

Hình 3.4 Minh họa phương pháp chuyển dịch nổi tế bào 34

Hình 3.5 Minh họa nguyên tắc kỹ thuật flow cytometry 37

Hình 4.1 Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS sau 3 ngày trong các giếng 40

Hình 4.2 Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS trong 3 thời điểm khảo sát ở giếng 1, 2, 3 42

Hình 4.3 Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS + GF trong 3 thời điểm khảo sát ở giếng 1, 2, 3 44

Hình 4.4 Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS trong 3 thời điểm khảo sát ở giếng 1, 2, 3 45

Hình 4.5 Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS + GF trong 3 thời điểm khảo sát ở giếng 1, 2, 3 47

Hình 4.6 Sự tăng sinh của EPCs ứng viên theo thời gian nuôi cấy 50

Hình 4.7 Sự tăng sinh của EPCs ứng viên trước và sau khi cấy chuyền 51

Hình 4.8 Kết quả phân tích flow cytometry tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau khi thu nhận với 2 marker CD133 và CD34 53

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát thí nghiệm 30

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Năm 2004, khoảng 17,1 triệu người chết vì bệnh tim mạch chiếm 29% số tử vong của cả thế giới, trong đó bệnh nghẽn mạch vành làm chết 7,2 triệu người và 5,7 triệu người chết do đột quỵ (WHO, 2010) Theo WHO, dự đoán đến năm 2030, khoảng 23,6 triệu người sẽ chết vì các bệnh liên quan đến tim mạch, chủ yếu là do bệnh tim và đột quỵ Đây là căn bệnh gây tỷ lệ tử vong hàng đầu trên thế giới Bệnh do

sự rối loạn chức năng tim và mạch máu làm máu không được cung cấp đủ đến tim, não

và các cơ quan khác, gây nguy cơ thiếu máu cục bộ tại các cơ quan này, dễ dẫn đến tử vong Mặc dù y học đã có nhiều tiến bộ trong điều trị nội khoa cũng như ngoại khoa nhất là những kỹ thuật nong động mạch hoặc giải phẫu bắt cầu mạch vành Tuy nhiên cho đến nay, những kỹ thuật này vẫn tốn kém một chi phí lớn, bệnh nhân vẫn phải

dùng thuốc suốt đời và cuối cùng nguy cơ tái hẹp vẫn là điều phải lo ngại

Sự ra đời của tế bào gốc đã mở ra niềm hy vọng to lớn về khả năng ứng dụng trong liệu pháp chữa trị bệnh cho con người Với tiềm năng tự làm mới, tăng sinh

mạnh và có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào có chức năng in vitro khác nhau, tế bào

gốc là nguồn nguyên liệu để sử dụng trong việc chữa trị các căn bệnh hiểm nghèo Trong đó, tế bào tiền thân nội mô mặc dù được phát hiện gần đây (Asahara và ctv, 1997) nhưng cũng cho thấy có tiềm năng trong chữa trị các bệnh về mạch máu, đặc biệt là bệnh lý thiếu máu cục bộ Sự huy động EPC khi có các tổn thương mạch máu sẽ góp phần nhanh chóng sửa chữa và tạo mạch máu mới EPC có khả năng di chuyển trong hệ tuần hoàn, tăng sinh và biệt hóa thành tế bào nội mô trưởng thành Chúng là nguồn tế bào mới được sử dụng trong liệu pháp chữa trị các bệnh lý tim mạch cũng như trong nghiên cứu hiện nay

giá trị mới đối với khoa học (Hua-xin Duan và ctv, 2006; Zhang L và ctv, 2006) Nguồn tế bào trong máu cuống rốn dồi dào, có khả năng tăng sinh mạnh và có thể biệt hóa thành nhiều dạng tế bào khác nhau Các dòng tế bào có trong máu cuống rốn là các tế bào gốc và tế bào tiền thân, bao gồm tế bào gốc trung mô, tế bào gốc tạo máu, tế bào tiền thân nội mô và tế bào gốc thu nhận từ bạch cầu đơn nhân Tế bào tiền thân nội

mô là quần thể tế bào ưu việt nhất trong máu cuống rốn về tiềm năng sửa chữa và tạo mạch Chúng được ứng dụng trong việc cấy ghép lâm sàng trên các bệnh nhân bị bệnh

lý tim mạch, mang lại hiệu quả cao, chữa trị dứt khoát bệnh Tuy nhiên sự khan hiếm của quần thể tế bào gốc và đặc biệt là các tế bào tiền thân nội mô trong máu cuống rốn

đã hạn chế đáng kể những khả năng ứng dụng của nó Do đó, việc thu nhận và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc thu nhận từ máu cuống rốn ứng dụng trong chữa trị bệnh là một chiến lược mới đầy hứa hẹn

Ở Việt Nam, nghiên cứu về tế bào gốc vẫn còn khá mới mẻ, đặc biệt chưa có báo cáo khoa học nào về tế bào tiền thân nội mô Trên thế giới hiện có nhiều cách thu nhận và nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô khác nhau bởi vì sự không đồng nhất trong khái niệm về tế bào tiền thân nội mô Vì vậy, trong phạm vi đề tài này, chúng tôi tìm hiểu phương pháp thu nhận và nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô hiệu quả nhất nhằm thu nhận tế bào tiền thân nội mô với số lượng nhiều và sức sống tốt để ứng dụng cho những nghiên cứu trên mô hình động vật bệnh lí tim mạch hay những nghiên cứu lâm sàng trên người

Đây cũng là hướng nghiên cứu phù hợp với sự phát triển khoa học công nghệ, đặc biệt là lĩnh vực nghiên cứu tế bào gốc cả trong nước và trên thế giới

1.2 YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục tiêu

Xây dựng được quy trình thu nhận và nuôi cấy tăng sinh tế bào tiền thân nội mô

từ máu cuống rốn người đạt hiệu quả cao

1.2.2 Yêu cầu

- Thu nhận được quần thể tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người

- Nuôi cấy tăng sinh các tế bào tiền thân nội mô ứng viên

1.2.3 Ý nghĩa của đề tài

Đề tài có ý nghĩa lớn trong việc khai thác nguồn tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn, góp phần làm giàu nguồn tế bào gốc nội mô

Đây là bước đi quan trọng tiếp cận liệu pháp tế bào gốc trong điều trị các bệnh

về tim mạch

1.3 NỘI DUNG THỰC HIỆN

a Khảo sát sự bám dính và tăng sinh của tế bào tiền thân nội mô ứng viên trong

4 loại môi trường:

- M199 bổ sung 15% FBS/KS

- M199 bổ sung 15% FBS/KS + GF (Growth Factors)

- EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS

- EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS + GF

Các nhân tố tăng trưởng (growth factors - GF) gồm:

¾ Nhân tố tăng trưởng biểu mô người (Human epidermal growth factor – hEGF)

¾ Chất bổ sung tăng trưởng tế bào nội mô (Endothelial cell growth supplement – ECGS)

¾ Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi người (Human fibroblast growth factor – FGF)

b Khảo sát thời gian chuyển dịch nổi để thu nhận quần thể tế bào tiền thân nội

mô biểu hiện dương tính cao với các marker chọn lọc

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TẾ BÀO GỐC

2.1.1 Định nghĩa

Tế bào gốc (SCs_Stem Cells) là những tế bào không (hoặc chưa) chuyên hóa trong mô sống, chúng có khả năng trở thành các tế bào chuyên hóa với các chức phận

sinh lí Trong điều kiện in vivo hoặc in vitro, mỗi tế bào gốc có thể tự làm mới với các

tính năng riêng biệt mới Chẳng hạn, các tế bào gốc tủy xương hoàn toàn chưa được chuyên hóa, chúng có thể biệt hóa thành các tế bào máu chuyên hóa (tế bào bạch cầu,

tế bào hồng cầu …) và những kiểu tế bào mới này có các chức năng chuyên biệt như khả năng sản xuất kháng thể, vận chuyển các chất khí … mà trước đó tế bào gốc không có Do đó, một kiểu tế bào xuất thân từ một tế bào khác thì tế bào khác đó cũng

có thể được gọi là “tế bào gốc” (Phan Kim Ngọc và ctv, 2009)

Từ tế bào gốc sẽ phát sinh ra nhiều loại tế bào khác nhau tạo nên cơ thể sinh vật Chúng có thể phát triển thành tế bào trưởng thành mang đặc điểm hình dạng và chức năng chuyên biệt, như tế bào cơ tim, da, thần kinh Chúng có khả năng phân chia hoặc tự sao chép trong thời gian dài Sự sao chép này có thể tiếp tục suốt cuộc đời sinh vật Khả năng phân chia và hình thành tế bào khác của chúng gọi là sự biệt hóa, hoặc “tính mềm dẻo”

Tế bào gốc có 2 đặc tính quan trọng phân biệt với các loại tế bào khác:

Đó là những tế bào không chuyên hóa có khả năng tự làm mới trong một thời gian dài nhờ quá trình phân chia tế bào

Tế bào gốc làm phát sinh những tế bào chuyên biệt với chức phận sinh lý, quá trình này gọi là sự biệt hóa Ví dụ như từ các tế bào gốc xương biệt hóa thành các tế bào máu chuyên hóa như tế bào bạch cầu, tế bào hồng cầu với các chức năng chuyên biệt như sản xuất kháng thể, vận chuyển chất khí mà tế bào gốc không có

2.1.2 Phân loại

Tế bào gốc có thể được phân loại dựa vào tính mềm dẻo hoặc tính đa năng của chúng trong quá trình phát triển, gồm: tế bào gốc toàn năng, tế bào gốc vạn năng, tế

bào gốc đa năng, tế bào gốc đơn năng Nhiều tác giả có cách phân loại khác nhau, hiện tại tế bào gốc được đề nghị chia thành 5 nhóm chính:

Tế bào gốc phôi: thu nhận từ phôi giai đoạn tiền làm tổ

Tế bào gốc nhũ nhi: thu nhận từ nhau thai, mô cuống rốn, máu cuống rốn …

Tế bào gốc trưởng thành: thu nhận từ cơ thể trưởng thành

Tế bào gốc vạn năng cảm ứng: có tiềm năng như là các tế bào gốc phôi

Tế bào gốc ung thư: được coi là nguồn gốc của khối u và chỉ có trong khối u

2.1.3 Ứng dụng

2.1.3.1 Cấy ghép tế bào gốc

Mặc dù các tế bào gốc thần kinh nội sinh vẫn có trong não động vật hữu nhũ nhưng hoạt động tự sửa chữa những vùng bị tổn thương thì không hiệu quả Việc nuôi cấy tế bào gốc thần kinh và cấy ghép vào vùng tổn thương có thể khắc phục những hạn chế này Do đó, chúng là niềm hy vọng trong việc chữa trị các rối loạn như bệnh

Alzheimer, Parkinson, Huntington, chấn thương tủy sống và đột quỵ

Chấn thương tủy sống (SCI_Spinal Cord Injury) là một vấn đề y khoa nan giải

vì hiện tại chưa có biện pháp để sửa chữa hệ thần kinh trung ương và phục hồi chức năng Tế bào gốc phôi (ES_Embryonic Stem Cells) có những đặc tính rất quan trọng cho sự sửa chữa cột sống Sử dụng tế bào ES cho cấy ghép thần kinh vẫn còn khá mới

mẻ và chỉ có vài công trình thành công chứng minh rằng tế bào ES có khả năng sát

nhập vào vùng bị thương của cột sống và biệt hóa theo hướng phù hợp

Tế bào cơ tim có thể được cấy ghép vào tim người trưởng thành bình thường hoặc bị tổn thương một cách ổn định Các nghiên cứu gần đây chứng minh rằng những

tế bào cho được cấy ghép có thể hình thành hợp bào có chức năng như tế bào cơ tim vật chủ (Rubart và ctv, 2003) Tế bào gốc phôi có thể biệt hóa thành các tế bào cơ tim

có chức năng in vitro; những tế bào cơ tim thu nhận từ tế bào ES sẽ hình thành các

mảnh ghép ổn định trong tim khi được cấy ghép Vì thế, tế bào ES có thể là nguồn thích hợp với liệu pháp cấy ghép tế bào nhằm phục hồi lượng cơ tim mất đi khi bị

bệnh tim

Bỏng và loét da là nguyên nhân chính gây ra tỷ lệ tử vong cao ở cả nước phát triển và đang phát triển Tế bào biểu mô đã được sử dụng trong liệu pháp qua nhiều thập kỷ dưới dạng mảnh ghép da tự thân Trong 20 năm gần đây, những kỹ thuật nuôi

cấy tế bào tiến bộ đã cho phép sự phát triển các phương pháp nhận dạng và phân lập tế bào gốc da còn sống, chúng có tiềm năng trong việc chữa trị bỏng và loét da.Tế bào gốc biểu mô nằm trong lớp nền và được xác định nhờ khả năng tự duy trì và tự làm mới Ngoài việc tạo ra nhiều tế bào gốc hơn, tế bào gốc cũng tạo ra các tế bào thay đổi

tạm thời có thể phân chia 3 - 5 lần trước khi tạo ra tế bào sừng biệt hóa in vivo Hiện

tại, người ta dùng ghép tự thân (autografts) hoặc ghép cùng loài (allografts) để chữa trị

bỏng da

2.1.3.2 Công nghệ mô

Theo truyền thống, việc tiếp cận phục hồi chức năng mô liên quan đến sự cho

cơ quan Tuy vậy, vẫn thiếu các mô người cho cấy ghép như tủy xương, tim, thận, gan, tụy Hiện nay, hơn 74.000 bệnh nhân ở Mỹ đang chờ được cấy ghép cơ quan, chỉ có

khoảng 21.000 người nhận được cơ quan cấy ghép mỗi năm

Liệu pháp dựa trên công nghệ mô sẽ là sự lựa chọn để giảm việc thiếu người cho cơ quan Tế bào gốc phân lập từ người trưởng thành và phôi đang phát triển hiện đang là nguồn tế bào cho công nghệ mô Tuy vậy, chúng đều có những khó khăn liên quan đến các ứng dụng lâm sàng Tế bào gốc trưởng thành có thể được phân lập trực tiếp từ bệnh nhân, chúng lại rất khó để phân lập và tăng trưởng khi nuôi cấy Tế bào

ES dễ dàng phát triển trong điều kiện nuôi cấy và biệt hóa thành nhiều dạng tế bào,

chúng lại dễ bị loại thải và những tế bào ES không biệt hóa có thể hình thành khối u

Có 3 hướng tiếp cận trong công nghệ mô: (a) Sử dụng các tế bào được phân lập; (b) Sử dụng vật liệu không có nguồn gốc tế bào (acellular) có khả năng cảm ứng sự tái tạo mô; (c) Sử dụng sự kết hợp tế bào và vật liệu (scaffold)

2.1.3.3 Chữa trị bệnh

Với tiềm năng biệt hóa thành các loại tế bào chức năng trong cơ thể, liệu pháp

tế bào gốc là một lựa chọn hứa hẹn cho việc chữa trị bệnh Từ khi ra đời đến nay, tế bào gốc đã được ứng dụng rất rộng rãi, nhiều bệnh đã được phục hồi Các bệnh nan y khác cũng đang được nghiên cứu nhằm ứng dụng tế bào gốc vào điều trị Điển hình là bệnh tiểu đường Mặc dù insulin được khám phá hơn 75 năm về trước, những biến chứng bệnh này vẫn còn tạo nên những hệ quả tai hại Mối tương quan giữa lượng glucose máu cao và những biến chứng của bệnh võng mạc, bệnh thận, bệnh thần kinh

đã trở nên rất rõ ràng Con đường để ngăn chặn những biến chứng này là liệu pháp

thay thế những tế bào beta nhờ cấy ghép Tế bào gốc phôi có khả năng tạo ra bất cứ dạng tế bào chuyên biệt nào trong cơ thể nên chúng phải có khả năng tạo ra tế bào với kiểu hình tế bào beta Phải có sự kết hợp của môi trường với nhân tố tăng trưởng hoặc biệt hóa mới có thể thực hiện được điều đó Hiện tại, không có phương pháp nào đơn giản để đạt được mục tiêu này Tuy nhiên, các nghiên cứu tiếp theo về tế bào ES hy vọng sẽ hiểu rõ hơn cơ chế điều khiển sự phát triển của tuyến tụy nội tiết và mục đích cuối cùng là giúp các nhà nghiên cứu đi đúng hướng

2.1.3.4 Liệu pháp gen tế bào gốc

Liệu pháp gen có thể được phát huy bằng cách sử dụng tế bào gốc như là một công cụ vận chuyển sản phẩm gen liệu pháp vào vật chủ thay vì sử dụng vector virus hoặc tế bào Hai khiếm khuyết lớn của liệu pháp gen là các rủi ro do hệ thống mang gen có thể gây ra và sự đáp ứng loại thải miễn dịch Trong khi đó, tế bào gốc được phân lập từ chính cơ thể bệnh nhân, được sửa chữa những lỗi di truyền, nuôi cấy tăng

sinh ex vivo rồi cấy ghép trở lại bệnh nhân sẽ tạo ra những tế bào bình thường in vivo

Sự biến đổi di truyền tế bào gốc được chỉ định để sửa chữa hoặc bù đắp cho các khiếm khuyết di truyền

2.2 SINH HỌC CUỐNG RỐN

2.2.1 Cấu tạo và sự phát triển cuống rốn

Hình 2.1 Cấu tạo nhau thai và hệ mạch máu trong cuống rốn

(www.umm.edu/pregnancy/000247.htm)

Cuống rốn người được hình thành vào ngày 26 quá trình mang thai, là sợi dây

liên kết giữa phôi và nhau thai, cung cấp chất dinh dưỡng, oxy… đến thai nhi

Cấu tạo cuống rốn đơn giản, gồm 2 động mạch và 1 tĩnh mạch, là nguồn dự trữ chính của máu cuống rốn Chúng được bao quanh bởi mô nhầy và mô liên kết gelatin được gọi là chất nhầy Wharton Năm 1656, Thomas Wharton là người đầu tiên mô tả

cụ thể về chúng Chất nhầy Wharton được bao bọc trong lớp biểu mô màng ối, có những đặc tính vật lý giống với đệm polyurethane nhằm bảo vệ đường mạch máu quan trọng kết nối nhau thai và phôi Cấu trúc tuy đơn giản nhưng lớp mô liên kết này có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng nhằm ngăn chặn sự xoắn vặn mạch trong suốt quá trình vận động của phôi đang phát triển Vì vậy, hầu hết tế bào của lớp nhầy Wharton

là nguyên bào sợi cơ (Takechi và ctv, 1993), Takechi cũng phỏng đoán rằng chúng có thể biệt hóa từ những cơ chất trung mô nguyên thủy để đáp ứng với môi trường rung động trong cuống rốn Vì vậy, “tế bào nền” đã được tách ra từ chất nhầy Wharton - nền cuống rốn, sử dụng nhiều kỹ thuật bao gồm làm nhỏ hoặc tiêu hóa bằng enzyme

mô chất nhầy Wharton (Friedman và ctv, 2007; Lund và ctv, 2007; Wang và ctv, 2004) và nuôi cấy ở môi trường ngoài (Mitchell và ctv, 2003)

Cuống rốn phát triển từ cuống phôi, hệ mạch của rốn phát triển từ tế bào trung

mô trong cuống phôi và ở thành cuống noãn hoàng Vào ngày thứ 35 – 40, ống noãn hoàng và niệu nang thoái hóa Niệu nang được cho là định hướng sự tạo các mạch máu trong dây rốn

Gần đây, tế bào gốc đã được phân lập một cách riêng biệt từ tĩnh mạch cuống rốn và chất nhầy Wharton (McElreavey và ctv, 1991; Naughton và ctv, 1997; Purchio

và ctv, 1999; Romanov và ctv, 2003)

2.2.2 Ưu thế sử dụng nguồn tế bào gốc từ máu cuống rốn

Máu cuống rốn là lượng máu còn lại trong cuống rốn và nhau thai sau khi sinh Trong quá khứ, nó được xem như là rác thải y tế và thường bị vứt bỏ Tuy nhiên, gần đây, máu cuống rốn đã được chấp nhận rộng rãi như là một nguồn dồi dào nhiều loại tế bào gốc với các thuận lợi trong việc thu nhận cũng như không vi phạm đạo đức, không gây nguy hiểm đối với người cho mẫu Từ khi ca cấy ghép máu cuống rốn đầu tiên được thực hiện vào năm 1988 cho đứa trẻ bị thiếu máu Fanconi, nó đã trở thành nguồn

an toàn và được chấp nhận cho cấy ghép tế bào gốc tạo máu vì ít có khả năng nhiễm virus và giảm thiểu trường hợp bệnh vật chủ chống lại mảnh ghép (GVHD_Graft Versus Host Disease) trong khi cấy ghép tủy xương đòi hỏi sự tương thích mô nghiêm

ngặt giữa người cho và người nhận Ngoài tế bào gốc tạo máu, trong máu cuống rốn còn chứa nhiều tế bào gốc khác có tiềm năng biệt hóa thành nhiều dạng tế bào khác nhau và có thể được sử dụng để sửa chữa những tế bào và mô bị tổn thương trong cơ thể người

Giáo sư Hal Broxmeyer, trường đại học Indiana, lần đầu tiên sử dụng cấy ghép máu cuống rốn như một cách chữa trị bệnh, dựa trên việc sử dụng nguồn nguyên liệu

mà trước kia được xem như là chất thải

Từ năm 1989, hơn 5000 người với nhiều rối loạn di truyền và ác tính đã nhận được sự cấy ghép từ máu cuống rốn của tế bào gốc tạo máu và tế bào tiền thân Từ những nghiên cứu lâm sàng ban đầu, ngân hàng máu cuống rốn được phát triển rộng khắp, cho phép mở rộng việc cấy ghép từ người cho có quan hệ họ hàng cho người không có quan hệ họ hàng, thời gian chờ đợi cho cấy ghép cũng đã được giảm xuống đáng kể so với trước đây nhờ các mẫu được bảo quản sẵn trong ngân hàng cuống rốn

2.3 TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ

2.3.1 Định nghĩa

Thông thường, tế bào gốc tạo ra một loại tế bào trung gian trước khi đạt được trạng thái biệt hóa hoàn toàn, những tế bào gốc đó được gọi là tế bào tiền thân (progenitor cell) Tế bào tiền thân được xem là tế bào gốc do nó có khả năng biệt hóa cho ra nhiều loại tế bào có liên quan với nhau Ví dụ: tế bào tiền thân dòng tủy có thể biệt hóa tạo thành nhiều loại tế bào máu như tế bào hồng cầu hay tế bào bạch cầu trung

mô thiếu máu cục bộ nhờ cải thiện sự lưu thông máu (Patricia Pranke và Raquel Canabarro, 2009) Điều này cho thấy tính khả thi trong việc sử dụng tế bào máu cuống rốn người cho liệu pháp tái tạo mạch Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng tế bào

đơn nhân máu cuống rốn người được cấy ghép có thể tồn tại trong cơ tim vật chủ mà không có sự đào thải miễn dịch, cải thiện đáng kể sự tái tạo tâm thất trái sau nhồi máu

cơ tim và tăng cường sự tạo mạch ở vùng nhồi máu

Tế bào tiền thân nội mô có thể được sử dụng cho các liệu pháp tạo mạch hoặc là marker sinh học để đánh giá nguy cơ bệnh tim mạch Hiện nay, chưa có định nghĩa đồng nhất cho EPC Mặc dù dấu hiệu xác định của tế bào gốc và tế bào tiền thân là khả năng tăng sinh và tạo ra những tế bào chức năng, EPC chủ yếu được định nghĩa dựa vào sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt CD34, KDR (VEGFR-2) và CD133

Bảng 2.1 Phân biệt tế bào gốc và tế bào tiền thân

Loại tế bào

năng

trước khi biệt hóa

Không đạt được quần thể tối

đa

Hình 2.2 Phân biệt tế bào gốc và tế bào tiền thân

(www.brown.edu/Courses/BI0032/adl /asc.htm)

2.3.2 Lịch sử nghiên cứu tế bào tiền thân nội mô

Trước năm 1997, các tế bào tiền thân nội mô được biết chỉ tồn tại trong phôi, được gọi là nguyên bào mạch (angioblast hay EPC phôi), chúng có thể được thu nhận

từ tế bào trung mô ngoại phôi bì EPC sẽ biệt hóa thành các mạch máu nguyên thủy Trong khoảng thời gian này, không có một dữ kiện nào chứng tỏ sự tồn tại của nguyên bào mạch ở cơ thể trưởng thành

Đến năm1997, Asahara mới phát hiện và thu nhận được các EPC ứng viên từ máu ngoại vi ở người Sự mô tả về EPC của Asahara đã dẫn đến những thay đổi nhanh chóng trong sự hiểu biết của chúng ta về sự tạo mạch máu, trong vòng 5 năm đã có các nghiên cứu lâm sàng đầu tiên ở người sử dụng EPC thu nhận từ tủy xương để tăng cường sự tạo mạch mới ở mạch vành và chức năng tim sau thiếu máu cơ tim Tuy nhiên, để cải thiện sự thành công của liệu pháp này, những hiểu biết rõ ràng hơn về sinh học EPC là cần thiết Jeremy D Pearson chỉ ra rằng, thật ra hầu hết EPC không phải là tế bào tiền thân nội mô mà đúng hơn là các bạch cầu tạo mạch và ông khám phá sự liên quan của chúng cho những liệu pháp trong tương lai

Từ năm 2002, đặc điểm kiểu hình của EPC đã được nghiên cứu ngày càng cụ thể, những tế bào này đã được so sánh với những điều đã biết về sự biệt hóa phôi của

tế bào nội mô từ những cơ chất xác định Sự định vị và tồn tại của EPC trong mô hình sửa chữa mạch hoặc tạo mạch mới đã được kiểm tra cụ thể Từ những nghiên cứu này,

rõ ràng là chỉ có một phần nhỏ EPC là tiền thân nội mô, nhầm lẫn này là do sự khác nhau trong định nghĩa về EPC Tuy nhiên, theo Ingram, Yoder và ctv, cũng gọi EPC

là dòng bạch cầu ưu thế

Những kết quả đã được báo cáo từ những thử nghiệm lâm sàng trong đó những

tế bào đơn nhân thu nhận từ tủy xương có hoặc không chọn lọc với CD34 được dùng

để kiểm tra liệu chúng có thể cải thiện chức năng tim sau thiếu máu cơ tim hoặc đột quỵ Sekiguchi và ctv, 2009, trong khi đa số thử nghiệm cho thấy có một vài lợi ích khi sử dụng các tế bào đó, những thử nghiệm khác lại không Những bằng chứng không đồng nhất với nhau đưa đến câu hỏi quan trọng, bao gồm việc chính xác là bằng cách nào EPC có thể tăng cường sửa chữa mạch và tạo mạch mới, liệu có những nguồn thay thế nào của tế bào tiền thân nội mô “thật” ở người trưởng thành có thể được sử dụng cho các thử nghiệm lâm sàng hiệu quả hơn không? Với các nghiên cứu hiện tại,

đặc biệt về sinh học tế bào tiền thân và tế bào gốc, sẽ dẫn đến những hiểu biết rõ hơn

về sự biệt hóa tế bào nội mô có thể được sử dụng thành công cho liệu pháp tạo mạch trong tương lai

Theo truyền thống, định nghĩa của EPC tuần hoàn dựa trên việc biểu hiện các marker bề mặt như CD34, CD133, KDR (VEGFR-2), dựa trên quan sát ban đầu của Peichev và ctv, 2000, những tế bào này khi nuôi cấy sẽ mất CD133 - một marker của

cơ chất tế bào tạo máu không trưởng thành và xuất hiện những marker nội mô sau đó Tuy nhiên, những nghiên cứu sau đó cho thấy rằng những tập đoàn nội mô tăng trưởng sớm được thu nhận từ tế bào đơn nhân tuần hoàn dương tính CD34 biểu hiện marker CD45 của mọi loại bạch cầu, marker CD14 bạch cầu và không tăng sinh Trái lại, một

tỷ lệ nhỏ tế bào nuôi cấy hình thành những tập đoàn tăng trưởng trễ, chúng thiếu marker tạo máu và tăng sinh Người ta tin rằng đó là những tế bào tiền thân nội mô thật sự, nhưng chỉ chiếm nhỏ hơn 1% EPC tuần hoàn, thậm chí còn nhỏ hơn ở tế bào tủy xương dương tính CD34 được sử dụng trong các thử nghiệm lâm sàng Do đó, ngày càng có nhiều người đồng ý rằng EPC tồn tại rất ít, nếu có chỉ vài tế bào tiền thân nội mô thật và được mô tả chính xác hơn như là các đại thực bào tạo mạch

Ba bài báo gần đây củng cố thêm quan điểm này Raemer và ctv, 2009 chứng tỏ rằng EPC bám dính trong quần thể tế bào đơn nhân từ máu có thể có kháng nguyên và đồng kích thích tế bào T hiệu quả như bạch cầu và hiệu quả hơn nhiều tế bào nội mô trưởng thành Piaggio và ctv, 2009 củng cố rằng ECFC tăng trưởng muộn là không phải từ dòng tủy, ông chứng minh rằng ở các bệnh nhân bị tăng sinh nguyên tủy bào mãn tính, những tập đoàn tăng trưởng sớm biểu hiện các đột biến có ở bạch cầu tuần hoàn, trong khi ECFC tăng sinh trễ thì không

Sau đó, Prokipi và ctv, 2009 đã phân tích protein để chứng minh rằng sự có mặt của marker tế bào nội mô ở các tập đoàn EPC tăng trưởng sớm là do kết quả của sự lẫn tiểu cầu hơn là sự tổng hợp nội sinh Tiểu cầu được bắt giữ bên trong lớp màng đệm khi tinh sạch tế bào đơn nhân Khi nuôi cấy, tất cả tiểu cầu hoặc vi phân tử thu nhận từ tiểu cầu nhanh chóng bị tiêu thụ bởi bạch cầu, nhờ vậy mà vận chuyển rất nhiều tiểu cầu, bao gồm những tiểu cầu mà bình thường được sử dụng như là marker tế bào nội

mô Các tác giả cũng kết luận rằng, một phần quan trọng trong hoạt tính tạo mạch của những tập đoàn bạch cầu này là phụ thuộc vào các protein thu nhận từ tiểu cầu

Mặc dù EPC không còn được cho là tiền thân nội mô xác thật nữa, rõ ràng là chúng tăng cường sự tạo mạch và sửa chữa mạch trong nhiều mô hình thí nghiệm Rehman và ctv, 2003 là một trong số những người đầu tiên chứng tỏ rằng EPC tiết ra những nhân tố tạo mạch bao gồm VEGF Zhang và ctv, 2009 tìm thấy rằng cả EPC sớm và muộn ECFC đều tiết ra cytokine tiền nhiễm, chúng bị ức chế khi xử lý với

statin Những nghiên cứu in vivo như Anghelina và ctv, 2006 nhấn mạnh vai trò quan

trọng của tế bào bạch cầu trong việc định vị và dẫn đến sự tạo mạch, nhờ tiết ra nhân

tố tạo mạch và enzyme để làm phá vỡ chất nền Một bài báo gần đây của Krenning và ctv, 2009 tóm tắt bằng chứng rằng EPC có thể hoạt động giống như vậy Họ kết luận rằng sự hình thành mạch máu mới ở người trưởng thành như ban đầu là chủ yếu dựa vào phân chia và tự sao chép tế bào nội mô từ những mạch máu có sẵn, nhưng bị kích thích và tạo điều kiện bằng sự kéo đến của EPC bạch cầu thu nhận từ máu Tuy nhiên,

họ cũng ghi nhận rằng, một phần của những tế bào nội mô mới có thể là từ tủy xương, giả thiết là từ những tế bào tuần hoàn dương tính với CD34 và âm tính với CD14

nhân với hình thái viên sỏi, biểu hiện CD31, CD34, VEGFR-2, VE-cadherin, không biểu hiện marker dòng tủy Tuy nhiên, Yoder và ctv gần đây đã chứng minh rằng dòng

tế bào CD45+, CD14+ cùng biểu hiện marker tế bào nội mô thì không phải là tế bào nội

mô mà là tế bào tiền thân dòng tủy thu nhận từ tế bào tạo máu Ingram và ctv phân chia tế bào nội mô thành vài quần thể phụ dựa vào sự tạo tập đoàn và tiềm năng tăng sinh Họ nhận dạng một quần thể tế bào tạo tập đoàn nội mô tiềm năng tăng sinh cao

mà từ đó sẽ hình thành tập đoàn thứ cấp và tam cấp ở máu cuống rốn người Việc phân lập hiệu quả EPC tiềm năng tăng sinh cao là vô cùng quan trọng cho việc tạo ra các

liệu pháp đáng tin và an toàn

Khi tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn được nuôi cấy trong điều kiện nội mô khoảng 6 tuần, những tế bào bám dính sẽ tăng số lượng, thay đổi hình thái từ dạng tròn ban đầu thành hình thoi để tạo thành quần thể đồng nhất, khá giống với HUVEC và phù hợp với đặc tính của EC trưởng thành Tuy nhiên, những quan sát tỉ mỉ hơn quá trình biệt hóa cho thấy rằng có những giai đoạn khác nhau, khi tế bào bám dính bộc lộ hình thái khá khác biệt so với ban đầu hoặc của EC Sau 3-5 ngày nuôi cấy, tế bào bám dính sẽ có hình thái khá giống với EPC được mô tả bởi Asahara và ctv Những nghiên cứu trước đây chứng minh rằng một vài tế bào đơn nhân của tủy xương và máu cuống rốn biệt hóa thành EC trưởng thành qua giai đoạn EPC Hơn nữa, các nghiên cứu trong vài năm qua cho thấy rằng EPC tồn tại trong tủy xương người trưởng thành, máu tuần hoàn và máu cuống rốn Những báo cáo này ủng hộ rằng những tế bào bám dính được quan sát ở đây chính là EPC thu nhận từ máu cuống rốn

2.3.3.2 Marker bề mặt

Tế bào tiền thân nội mô ban đầu được nhận dạng như là quần thể tế bào gốc trong máu ngoại vi người và được xác định qua sự biểu hiện marker CD34, VEGFR-2, CD133 Sau đó, EPC được phân lập từ những nguồn khác như là tủy xương, gan thai

và máu cuống rốn Sự định nghĩa EPC vẫn còn gây nhiều tranh cãi, do đó phương pháp để phân lập EPC vẫn còn rất khác nhau giữa các nhà nghiên cứu

Hình 2.4 Nguồn gốc và định hướng phát triển của EPC

(Guido Krenning và ctv, 2009)

EPC được phân lập từ máu ngoại vi, tủy xương, máu cuống rốn, được xác định

là những quần thể không đồng nhất Tuy nhiên, sự thay đổi đặc thù trong đặc tính của EPC đã được làm rõ Tế bào đơn nhân thu nhận từ máu cuống rốn thay đổi hình thái để biệt hóa thành tế bào nội mô trưởng thành sau 6 tuần nuôi cấy Vào những ngày đầu nuôi cấy, cùng với sự biệt hóa, 2 quần thể tế bào riêng biệt của EPC đã được phát hiện, nhờ xác định những chấm 2 chiều với flow cytometry, được gọi là S-EPC và L-EPC S-EPC biểu hiện CD34 nhưng không biểu hiện CD14, L-EPC ngược lại Khi những tế bào CD34+/CD14− và những tế bào CD34−/CD14+ được phân lập từ tế bào đơn nhân máu cuống rốn và được nuôi cấy riêng biệt, S-EPC và L-EPC được thu nhận từ CD34+/CD14− và CD34−/CD14+ Hơn nữa, ở ngày 7, khi tách 2 quần thể EPC nhờ

chọn lọc tế bào và tái nuôi cấy, không thấy có sự giao nhau trong việc biểu hiện CD34

và CD14 Trong khi sự biểu hiện VE-cadherin và VEGFR-2 ở L-EPC lớn hơn nhiều so với S-EPC, thì đối với CD31, S-EPC lại biểu hiện cao hơn L-EPC có tiềm năng tăng sinh cao hơn khi bị kích thích bởi VEGF Mặc dù 2 loại EPC biểu hiện kiểu hình khác nhau, bao gồm thụ thể cho nhân tố tăng trưởng, tiềm năng tăng sinh cũng khác nhau,

cả 2 loại đều cuối cùng biệt hóa thành EC trưởng thành sau hơn 3 tuần nuôi cấy

Vì EPC và HSC đều được cho là có nguồn gốc từ những tế bào cơ chất trung phôi bì chung (như nguyên bào tạo mạch), nói chung chúng biểu hiện một vài kháng nguyên bề mặt tế bào như CD34, AC133, Tie-2 Trong những báo cáo trước đây, tế bào CD34+ tạo ra những tế bào hình thoi, giống với S-EPC Do đó, AC133 có thể là marker đáng tin cậy hơn để xác định và theo dõi EPC giống nguyên bào mạch người

Có nghiên cứu cho rằng sự phân lập ở phạm vi phòng thí nghiệm máu cuống rốn AC133+ có khả năng biệt hóa thành EC trưởng thành Tỉ lệ biểu hiện marker nội mô như CD31, VE-cadherin, VEGFR-2 thay đổi giữa 2 loại EPC Dữ liệu cho thấy S-EPC biểu hiện CD31 cao hơn L-EPC Ngược lại cho VE-cadherin và VEGFR-2 EPC từ CD34+ biểu hiện CD31 khá cao và VE-cadherin khá thấp Tuy nhiên, những marker nội mô này đều được biểu hiện ở hơn 75% tế bào bám dính vào giai đoạn EC

2.3.4 Nguồn thu nhận

HSC được thấy xuất hiện thông qua sự nảy nở từ vùng bụng của động mạch chủ sống lưng của phôi trong vùng động mạch chủ-tuyến sinh dục- trung thận, được cho rằng có nguồn gốc nội mô (Smith và Glomski, 1982, Tavian, 1996, Mukouyama,

1998 và Tamura, 2002) Những tiến bộ gần đây về di truyền học trên chuột, sử dụng

hệ thống theo dõi (trace) dòng nội mô cho thấy những HSC thật sự được tạo ra từ các

tế bào nội mô động mạch chủ (Zovein và ctv, 2008) Những dữ liệu cho thấy rằng nội

mô tạo máu động mạch là các tiền thân xác thực của máu người trưởng thành hơn là HSC và EC từ nguyên bào mạch tạo máu (Li và ctv, 2005) Sau khi xuất hiện ở phôi, HSC di cư đến gần thai nơi mà nhiều dòng tạo máu xuất hiện Do đó, gan thai trở thành nơi chứa HSC và có thể tạo nên tất cả các dòng tạo máu cần thiết cho toàn bộ quá trình phát triển sau đó Sau khi sinh, HSC di chuyển đến tủy xương Vì vậy, mối

quan hệ giữa EC và tế bào máu là rất mật thiết hơn những đánh giá trước đây

Các nghiên cứu trước đó đề nghị rằng EPC có thể được phân lập từ các nguồn trưởng thành như máu ngoại vi và tủy xương (Asahara, 1997, Peichev 2000 và Shi, 1998) Ít nhất 3 dạng tế bào tiềm năng, thu nhận từ tủy xương, được cho rằng là đại diện cho đặc tính tiền thân của EPC trưởng thành: HSC/nguyên bào mạch máu, tế bào dòng tủy và tế bào gốc trung mô từ tủy xương

Nguyên bào mạch tạo máu/tế bào gốc tạo máu: các nghiên cứu báo cáo rằng EPC có thể được phân lập từ tủy xương hoặc máu Nghiên cứu đầu tiên xác định EPC ở người trưởng thành cho thấy rằng các tế bào dương tính với CD34 được phân lập từ các tế bào máu đơn nhân tuần hoàn biểu hiện những thay đổi phân tử và kiểu hình kết hợp với EC trưởng thành dưới những điều kiện thích hợp (Asahara và ctv, 1997) EPC tuần hoàn được cho rằng bao gồm trong quần thể tế bào biểu hiện CD133

và VEGFR-2 trong nhóm nhỏ tế bào CD34+ (Gill và ctv, 2001) nhưng một vài marker khác cũng được sử dụng để xác định EPC, chúng thay đổi phụ thuộc vào các nghiên cứu Tiêu chuẩn chính xác nhất để xác định EPC ở chuột là Sca-1+/Kit-

1+/Lin−/VEGFR-1+, trong khi ở người CD34+/c-kit low/Lin−/CD133+

/VEGFR-1+/VEGFR-2+ được dùng như là marker EPC giả định (Larrivee và Karsan, 2007) Hầu hết các marker này cũng được sử dụng để xác định quần thể tế bào tạo máu Điều này làm cản trở việc nhận dạng những tế bào thật sự là EPC CD133 thường được sử dụng

để phân biệt EPC từ CEC và các tế bào bạch cầu đơn nhân dòng tủy, khi những marker gắn với tế bào gốc này không được biểu hiện bởi CEC và bị mất khỏi bề mặt của tế bào đơn nhân dòng tủy (Rehman và ctv, 2003) Tuy nhiên, sử dụng sự biểu hiện CD133 ở chuột như là marker tế bào gốc chuyên biệt là không rõ ràng, một số nghiên cứu dựa trên CD117 như là marker thay thế CD133 ở chuột (Bertolini và ctv, 2006)

EPC tuần hoàn ở người được xác định nhờ CD34+/VEGFR2+ mất biểu hiện CD133 khi biệt hóa thành EC trưởng thành HSC cũng mất biểu hiện CD133 khi chúng tham gia vào giai đoạn biệt hóa tế bào tiền thân (Peichev và ctv, 2000) Khi có

sự có mặt của VEGF, sự nuôi cấy các tiền thân tạo máu CD133+ nguyên thủy sẽ tạo ra các tập đoàn có thể biểu hiện marker EC như VEGFR-2 và VE-cadherin, cùng đồng thời mất biểu hiện CD133 (Peichev và ctv, 2000) Khả năng biệt hóa thành EC trưởng thành của những tế bào CD133+ được tin rằng là bằng chứng cho sự tồn tại của nguyên bào tạo mạch ở người trưởng thành (Gehling và ctv, 2000) Các thí nghiệm sử dụng

những tế bào đơn Kit+/Sca1+/Lin− cấy ghép ở chuột tạo nên sự tái tạo hoàn chỉnh tế bào tạo máu, cũng như sự kết hợp của EPC thu nhận từ tủy xương vào tủy xương người nhận, đó cũng là bằng chứng về nguyên bào tạo máu ở người trưởng thành (Grant, 2002 và Larrivee, 2005) Các thử nghiệm để xác định EPC phụ thuộc vào đặc tính động học tăng trưởng của những tế bào này (Lin và ctv, 2000) Những tế bào đã phân lập được kiểm tra tiềm năng tạo tập đoàn khi có mặt của nhân tố tăng trưởng VEGF, FGF và IGF, khi được nuôi trên lớp fibronectin hay collagen EPC tạo nên các tập đoàn nội mô tăng trưởng trễ sau 20 ngày có tiềm năng tăng sinh cao sẽ được so sánh với CEC với tiềm năng tăng sinh giới hạn (Lin và ctv, 2000)

Khó khăn cơ bản trong việc nhận dạng EPC là do thiếu marker chuyên biệt, vì nhiều marker EPC đang sử dụng cũng được biểu hiện tế bào tạo máu và tế bào nội mô trưởng thành Vì vậy, các biện pháp dựa trên kháng nguyên để xác định EPC phải rất cẩn thận Ví dụ như CD146 ban đầu được cho là marker nội mô chuyên biệt và được dùng để phân lập EPC, tuy nhiên những nghiên cứu cũng cho thấy rằng nó cũng được biểu hiện bởi lympho bào và vài tế bào trung mô như tế bào mạch cơ trơn (Duda, 2006

và Elshal, 2005) Flow cytometry với nhiều tham số đã được dùng để phân lập EPC từ máu (Bertolini, 2006, Larrivee và Karsan, 2007 và Rafii and Lyden, 2003) Rõ ràng,

sử dụng kháng nguyên CD45 để loại trừ các tế bào tạo máu, do đó những marker nội

mô như CD31, CD146, VEGFR-2, CD34 có thể được dùng để phân lập EPC từ đám CD45- (CD45- pool) EPC có thể được phân biệt với CEC nhờ sự biểu hiện CD133 Do

sự chồng lấp về marker giữa EPC, CEC, HSC, việc kết hợp chọn lọc âm tính và dương tính nên được dùng để phân lập EPC nhờ chọn lọc bằng dòng chảy

Các nguồn EPC khác thu nhận từ tủy xương

Tế bào dòng tủy: có nhiều bằng chứng cho thấy rằng tế bào thu nhận từ dòng tủy có thể góp phần gián tiếp vào sự tạo mạch khối u (Murdoch và ctv, 2008) Tuy nhiên, cũng có người cho rằng những tế bào này bắt chước kiểu hình EC và sáp nhập vào nội mô khối u trong một vài trường hợp (Fernandez Pujol, 2000, Harraz, 2001, Kuwana, 2003, Zhao, 2003, Bailey, 2006 và Li, 2009) Tế bào tiền thân đa năng thu nhận từ bạch cầu đơn nhân to (MOMCs) từ tế bào tuần hoàn CD14+/CD45+/CD34+/Col I+ (Kuwana và ctv, 2003) Những tế bào này biểu hiện vài đặc điểm của tế bào trung mô nhưng cũng biểu hiện marker EC đáp ứng với các nhân

tố tạo mạch và hình thành những ống nhỏ trong Matrigel (Kuwana và ctv, 2006) MOMCs được cấy ghép cùng với tế bào khối u trong các thí nghiệm ghép ngoại lai cho thấy hơn 40% kết hợp vào mạch khối u (Kuwana và ctv, 2006) Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng MOMCs có thể được thu nhận từ quần thể CD14+/CD34low tuần hoàn biểu hiện những đặc tính của tế bào đa năng (Romagnani và ctv, 2005) Quần thể

tế bào tiền thân sợi cũng được lựa chọn đến khối u và tập trung vào mạch máu ex vivo

và in vivo (Conejo-Garcia và ctv, 2004) Cuối cùng, quần thể tuần hoàn của tế bào tạo

máu CD45+/VE-cadherin+ cho thấy ung thư buồng trứng dạng xâm nhiễm (infiltrate ovarian carcinomas) (Conejo-Garcia và ctv, 2005) Quần thể này, được xem như là bạch cầu mạch cũng biểu hiện vài marker EC khác như CD31, CD146, CD34 và marker chuyên biệt nội mô khối u TEM1, TEM7 (Conejo-Garcia và ctv, 2005) Những

bạch cầu mạch có biểu hiện đặc điểm hình thái và chức năng tương tự với EC in vivo

(Conejo-Garcia và ctv, 2005)

Tế bào gốc trung mô (MSC_Mesenchymal Stem Cells): MSC được cho là có tiềm năng biệt hóa thành nhiều dòng mô xương, mô sụn, mô mỡ, mô cơ, mô sợi, biểu

mô và dòng thần kinh (Liu, 2009 và Prockop, 1997) Cũng có bằng chứng rằng MSC

có thể biệt hóa thành EC in vivo trong các mô hình khác nhau bao gồm cả thiếu máu

chi (Davani và ctv, 2003) MSC cũng định hướng đến những vị trí vết thương và khối

u ở các mô hình thí nghiệm khác nhau, dẫn đến khái niệm rằng MSC có thể được sử dụng để chuyển đổi gen độc hóa liệu pháp vào khối u (Hall và ctv, 2007) Mặc dù các bằng chứng cho thấy sự bổ sung MSC vào khối u, vai trò của những tế bào này trong

sự tạo mạch khối u vẫn còn ít được biết Trong mô hình u nguyên bào đệm U-87, MSC được tiêm cùng với tế bào khối u cho thấy sự tăng trong khả năng tạo mạch và tăng trưởng mạch (Annabi và ctv, 2004) Người ta dự đoán rằng 5% MSC cùng được nhuộm với marker CD31, vì vậy các tác giả kết luận rằng việc tăng cường sự tạo mạch hầu hết là do tác động nội sinh của MSC (Annabi và ctv, 2004) Trong nghiên cứu khác, MSC đã đánh dấu GFP được tiêm vào mạch của chuột khiếm khuyết miễn dịch cho thấy sự hình thành cấu trúc mạch và đồng định vị với các marker nội mô ở các khối u nhỏ (Hung và ctv, 2005) Trái lại, sự biệt hóa MSC thành EC không được quan sát ở trong khối u ở mô hình ghép ngoại lai ung thư ở tụy (Beckermann và ctv, 2008)

Do đó, sự đóng góp của MSC như là nguồn nội mô khối u không rõ và cần nghiên cứu nhiều hơn

Nguồn không phải tủy xương: những nguồn EPC đề cập ở trên đều có nguồn gốc từ tủy xương Liệu những nguồn EPC giả định không thu nhận từ tủy xương có tham gia vào sự tạo mạch nội mô khối u không vẫn còn ít được tìm hiểu, mặc dù nghiên cứu gần đây từ chuột khiếm khuyết MMP9 ủng hộ quan điểm này (Ahn

và Brown, 2008) Trong nghiên cứu này, khối u được cấy ghép vào chuột thiếu MMP9

đã được chiếu xạ cục bộ để ngăn sự tạo mạch Những khối u được tiêm vào không tăng trưởng ở những vùng bị chiếu xạ ở những con chuột này, trái ngược với dạng chuột hoang dại bị chiếu xạ Kiểu hình này có thể được phục hồi nhờ cấy ghép từ chuột biểu hiện Tie2-LacZ, tác động phục hồi không chỉ liên quan tới EPC thu nhận từ tủy xương mà liên quan tới các tế bào bạch cầu dòng tủy dương tính CD11b biểu hiện MMP9 Những tế bào bạch cầu dòng tủy CD11b vì vậy rất quan trọng cho sự tạo mạch cách gián tiếp, nhờ kích thích sự phát triển của EPC không thu nhận từ tủy xương với nguồn gốc không rõ ràng Các tế bào thu nhận từ nguồn không phải tủy xương sau khi sinh đã được báo cáo trước đây là sáp nhập vào mạch máu mới (Aicher, 2007, Ingram,

2005 vàZengin, 2006) Nguồn gốc của những tế bào này không rõ nhưng người ta cho rằng chúng bắt nguồn từ những cơ quan như ruột non, gan (Aicher và ctv, 2007) Những quan sát gần đây thấy rằng EC kết hợp khối u chứng minh sự bất thường của tế bào như sự lệch bội lẻ và bất thường trung thể đề nghị rằng khối u đích của tế bào có đặc điểm tế bào nội mô (Bertolini và ctv, 2006) Những bất thường di truyền tương tự nhau có ở CEC khi các tế bào khối u từ người bệnh mà màng bào tương của tế bào u tủy mất 13q14 (Rigolin và ctv, 2006) Tương tự, những sai lệch di truyền giống nhau ở các bệnh nhân với tế bào u tủy B-cell non-hodgkin được tìm thấy ở tế bào vi mạch ung thư (Streubel và ctv, 2004) Tuy nhiên, những nghiên cứu trên người không được thực hiện đủ cương quyết để loại bỏ khả năng của các tín hiệu bắt nguồn từ 2 tế bào cạnh nhau Thú vị là, nghiên cứu gần đây báo cáo rằng quần thể CD105+ từ những tế bào ung thư thận chứng minh đặc tính tế bào gốc như là chúng có thể biệt hóa thành EC và tập trung vào các cấu trúc mạch máu ở khối u (Bussolati và ctv, 2008)

2.3.5 Nuôi cấy EPC

2.3.5.1 Môi trường nuôi cấy

Có vài môi trường có thể dùng để nuôi cấy EPC, tuy nhiên, hiện nay môi trường nuôi cấy tốt nhất là EGM-2 (Endothelial Growth Medium 2) Đây là môi trường đã được thương mại hóa rộng rãi, là môi trường ít huyết thanh, được dùng nuôi

cấy in vitro tế bào nội mô từ mạch máu Môi trường này tối ưu cho tế bào người sơ

cấp, nhưng cũng được sử dụng cho cả tế bào nội mô của bò, heo, thỏ, voi và chuột

Thành phần: môi trường cơ bản và bổ sung tạo nên môi trường tăng trưởng hoàn chỉnh EGM-2 chứa các nhân tố tăng trưởng và chất bổ sung cần thiết cho sự tăng trưởng tối ưu của tế bào nội mô người EGM-2 thiếu ECGS (Endothelial cell growth supplement) nhưng có chứa nhân tố tăng trưởng giống insulin –IGF và nhân tố tăng trưởng nội mô mạch EGM-2 không chứa kháng sinh hoặc kháng nấm và sử dụng hiệu quả trong điều kiện tủ ấm 5%CO2 Môi trường cơ bản gồm các muối vô cơ, amino acid, vitamin, các nguyên tố vi lượng …

Trong đó có các thành phần bổ sung như huyết thanh thai bê, nhân tố tăng trưởng biểu mô, nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi, nhân tố tăng trưởng giống insulin, nhân tố tăng trưởng nội mô mạch, ascorbic acid (Vitamin C, chống tác nhân oxy hóa), heparin (chất chống đông), hydrocortisol (hormon)

Huyết thanh bào thai bò: việc bổ sung huyết thanh vào môi trường nuôi cấy có nhiều tác dụng hữu ích Đó là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng cũng như các nhân tố tăng trưởng cho tế bào; khi tiến hành cấy chuyền tế bào, huyết thanh giúp phục hồi tổn thương tế bào nhờ các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin; huyết thanh còn làm tăng độ bám dính của tế bào, cải thiện tính tan của chất dinh dưỡng, chống oxy hóa… Tuy vậy, việc sử dụng huyết thanh cũng còn nhiều hạn chế như thành phần phức tạp, khó ổn định nên không thể sử dụng riêng lẻ; giá thành rất cao và lại dễ bị nhiễm virus, mycoplasma, có các thành phần ức chế sự phân bào Vì vậy, các nhà khoa học đang hướng đến việc sử dụng môi trường nuôi cấy không có huyết thanh hoặc dùng với tỷ lệ thấp

Nhân tố tăng trưởng biểu mô người tái tổ hợp (rhEGF_Epidermal Growth Factor) là một protein 6,2kDa tạo sự phân bào đối với nhiều dạng tế bào hữu nhũ EGF kích thích sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào biểu mô từ da, giác mạc, phổi và mô khí

quản và ruột non EGF cũng thúc đẩy sự tăng trưởng và di cư của tế bào sừng và tăng cường sự tăng sinh của nguyên bào sợi và tế bào phôi EGF có vai trò quan trọng trong hàn gắn vết thương và tạo cơ quan Chúng cũng tác động lên sự tổ chức bộ khung tế bào, sự di cư tế bào, sự tổng hợp và hủy bỏ các phân tử nền ngoại bào EGF thúc đẩy

sự tiêu hủy xương nhờ tăng cường quá trình loại bỏ calcium từ mô xương EGF thường được sử dụng như là chất bổ sung ở mức 1 – 20µg/ml trong môi trường không

có huyết thanh hoặc huyết thanh ở nồng độ thấp, dùng cho nuôi cấy tế bào hữu nhũ

Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF_Fibroblast Growth Factor) là nhân tố tăng trưởng liên kết heparin, kích thích sự tăng sinh của nhiều loại tế bào bao gồm trung mô, tế bào ngoại bì thần kinh và tế bào nội mô FGF cũng tác động đến hoạt động tạo mạch in vivo rhFGF có thể được dùng để nuôi cấy tế bào hES trong điều kiện nuôi cấy không có thành phần tế bào động vật, không lớp feeder

Chất bổ sung tăng trưởng nội mô (Endothelial cell growth supplement – ECGS): có nguồn gốc từ dịch chiết não bò, là môi trường được thiết kế cho sự tăng trưởng của các tế bào nội mô mạch người in vitro, chứa các nhân tố tăng trưởng, hormon, protein cần cho nuôi cấy tế bào nội mô Các chất bổ sung phải được sử dụng kết hợp với môi trường tế bào nội mô

2.3.5.2 Điều kiện nuôi cấy

Hai loại khí cần quan tâm trong nuôi cấy tế bào động vật là CO2, O2 Tỷ lệ thích hợp cho sự sống tế bào giữa 2 loại khí này được cung cấp bởi tủ ấm có sự phối trộn các khí này

Mỗi môi trường được thiết lập công thức với các thành phần được thiết kế hoạt động với nồng độ CO2 chuyên biệt (từ 0-10% CO2 trong hỗn hợp không khí) để cung cấp hệ đệm bicarbonat Đối với EPC, môi trường EGM-2, tế bào được nuôi ở 5% CO2

Hầu hết dòng tế bào thu nhận từ người và động vật được nuôi cấy ở 370C Nhiệt

độ cao hơn sẽ làm tế bào dễ chết so với nhiệt độ thấp hơn Đối với EPC, tối ưu nhất là môi trường EGM-2 và nuôi ở 370C, 5% CO2

2.3.6 Ứng dụng

Xơ vữa động mạch, quá trình viêm chọn lọc tác động đến động mạch, rất phổ biến ở người Những biến chứng tắc mạch máu của xơ vữa động mạch, bao gồm đột quỵ và nhồi máu cơ tim là những nguyên nhân chính dẫn đến tỉ lệ mắc bệnh và tỷ lệ

chết trong thế giới công nghiệp Xơ vữa động mạch phát triển đáp ứng với những tổn thương nội mô cục bộ Sự giảm chức năng nội mô và mất tế bào là những đặc điểm của xơ vữa động mạch Sự phục hồi dòng nội mô bình thường rất quan trọng cho tiến trình làm chậm hoặc ngăn chặn xơ vữa động mạch Có nhiều dữ liệu cho thấy rằng EPC có vai trò quan trọng trong việc tái sinh nội mô ở những mạch máu bị thương tổn

EPC thu nhận từ máu cuống rốn người cho thấy đặc tính tăng trưởng khác biệt,

sử dụng cho công nghệ mô cấy ghép mạch Những tế bào này cho thấy kiểu hình nội

mô ổn định và có những đặc điểm chức năng liên quan Dựa trên những kết quả này, EPC có vẻ như là một nguồn tế bào tự hủy đầy hứa hẹn cho công nghệ mô tim mạch, đặc biệt là sửa chữa những khiếm khuyết bẩm sinh

Ở nhiều mô hình động vật, sự cấy ghép tế bào tiền thân thu nhận từ tủy xương

có thể điều trị hiệu quả các cơ quan, tăng cường sự phục hồi mạch và sự tái tạo mô

Tăng số lượng tế bào tiền thân tuần hoàn sẽ làm tăng khả năng hồi phục và tính nguyên vẹn của dòng nội mô, ngăn cản sự hình thành màng trong mạch, tăng cường lưu thông máu đến vị trí thiếu máu cục bộ EPC thu nhận từ những nguồn khác nhau (tủy xương hoặc không tủy xương), đặc tính sửa chữa sẽ khác so với giai đoạn trưởng thành của tế bào

Giới hạn thực sự trong phẫu thuật tim trẻ em là thiếu nguyên liệu để sửa chữa

những khuyết tật bẩm sinh Công nghệ mô hướng đến những cấu tạo in vitro của mảnh

ghép sống tự hủy với khả năng tăng trưởng, sửa chữa và tái sinh Mảnh ghép từ EPC thu nhận từ máu cuống rốn người được cho là nguồn tế bào cấy ghép an toàn

Tế bào gốc từ máu cuống rốn được cho là chứa nhiều tế bào tiền thân có thể tăng sinh Các nhà khoa học chứng minh rằng tế bào CD133+ thu nhận từ máu cuống rốn người có thể di cư, tạo tập đoàn và tồn tại trong cơ tim của chuột đột quỵ Một số

tế bào ở vùng bị thương tổn có khả năng hình thành mô tim mới Chúng cũng ngăn chặn sự tạo sẹo và suy giảm chức năng của tâm thất trái Mặc dù lĩnh vực này còn khá mới mẻ nhưng nhiều kết quả cho thấy rằng tế bào máu cuống rốn có tiềm năng to lớn trong sửa chữa mô tim bị thương tổn

Ngày 01/03/2006, viện tim Cooper ở Camden, New Jersey, phối hợp với viện nghiên cứu y khoa Coriell xác định vai trò của tế bào gốc trong việc sửa chữa tim bị thương tổn Tiến sĩ Joseph Parrillo tin rằng những nghiên cứu này là bước đi đầu tiên

hứa hẹn sẽ điều trị bệnh tim mà không cần cấy ghép hoặc giải phẫu phức tạp Tiến sĩ Steven Hollenberg xem máu cuống rốn là “holy grail- viên sỏi thiêng liêng” của nghiên cứu tế bào gốc tim học Việc chữa trị với tế bào máu cuống rốn có thể tạo ra cơ tim mới và tạo ra tế bào giúp sự hoạt động của tim hiệu quả hơn

Liệu pháp chữa trị nhồi máu cơ tim hiện nay, gồm thuốc, can thiệp mạch vành qua da và qua phẫu thuật, có thể cải thiện sự tràn dịch cơ tim và thiếu máu cục bộ, nhưng tác động hồi phục chức năng tim suy yếu còn khá hạn chế Cấy ghép tế bào gốc

là một phương pháp mới để bảo vệ chức năng tim sau nhồi máu cơ tim mặc dù tính hiệu quả và cơ chế dựa trên tế bào vẫn còn nhiều tranh cãi

Aldehyde dehydrogenase (ALDH) là enzym chịu trách nhiệm cho việc oxy hóa aldehyde nội bào Tế bào tiền thân tạo máu, bao gồm tế bào gốc và tế bào gốc nang ruột, biểu hiện cao mức độ ALDH Trong những nghiên cứu gần đây, tế bào gốc tạo máu với mức độ biểu hiện cao ALDH được phân lập từ máu cuống rốn dựa trên mật

độ aldefluor Những tế bào gốc tạo máu quan tâm có mức biểu hiện cao ALDH cho thấy chức năng tiền thân tạo máu và khả năng tái tạo quần thể tế bào tốt hơn khi so sánh với tế bào gốc tạo máu với mức ALDH thấp Trong nghiên cứu hiện nay, một số nhà khoa học phân lập 2 quần thể EPC từ máu cuống rốn dựa vào hoạt động ALDH của chúng và kiểm tra marker bề mặt cùng chức năng của chúng Họ phát hiện rằng EPC với mức ALDH cao và thấp khác nhau rõ rệt về khả năng tăng sinh và đáp ứng

với sự cảm ứng giảm oxy huyết in vitro và invivo EPC với hoạt động ALDH thấp có

tiềm năng tăng sinh và huy động cao khi so sánh với EPC có hoạt động ALDH cao, trái ngược với tế bào gốc tạo máu Hơn nữa, EPC với hoạt động thấp ALDH phản ứng tốt hơn với sự giảm oxy huyết khi cảm ứng với điều hòa tăng của mức protein HIF, đó

là protein gây ra sự cảm ứng của gen mục tiêu, như VEGF, CXCR4, GLUT-1, Mrna, trong khi việc đáp ứng sự giảm oxy huyết thì không quan trọng đối với EPC có hoạt động ALDH cao Quả thật, việc đưa EPC có hoạt động ALDH thấp sẽ sửa chữa đáng

kể mô thiếu máu ở mô hình chuột Vì vậy, quy trình phân lập EPC sử dụng aldefluor

mở ra một kỹ thuật để tinh sạch EPC với khả năng tái tạo mô