XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHỤC HỒI GIỐNG LAN Mokara DÒNG ĐỎ LÁ QUẶT (Mokara cv DO LA QUAT ) ĐÃ NHIỄM VIRUS Cymbidium mosaic (CyMV) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHỤC HỒI GIỐNG LAN Mokara DÒNG ĐỎ LÁ QUẶT Mokara cv DO LA QUAT ĐÃ NHIỄM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHỤC HỒI GIỐNG LAN Mokara DÒNG ĐỎ LÁ QUẶT (Mokara cv DO LA QUAT ) ĐÃ NHIỄM VIRUS Cymbidium mosaic (CyMV) BẰNG

KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: ĐỖ PHONG LƯU Niên khóa: 2006 – 2010

Tháng 7/ 2010

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHỤC HỒI GIỐNG LAN Mokara DÒNG ĐỎ LÁ QUẶT (Mokara cv DO LA QUAT ) ĐÃ NHIỄM VIRUS Cymbidium mosaic (CyMV) BẰNG

KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG

ThS Nguyễn Xuân Dũng Đỗ Phong Lưu

KS Nguyễn Phúc Trường

Tháng 7/ 2010

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:

¾ Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều

kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

¾ Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các thầy cô đã trực tiếp

giảng dạy trong suốt bốn năm qua

¾ Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM, đặc biệt là phòng Công nghệ Sinh

học Thực vật đã tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận này

¾ ThS Nguyễn Xuân Dũng và CN Nguyễn Phúc Trường đã tận tình hướng dẫn

và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

¾ Anh Lâm Vỹ Nguyên cùng các chị thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học

Tp.HCM đã giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình em thực hiện đề tài tốt

nghiệp tại đây

¾ Bạn Nguyễn Thị Hoa Thùy cùng toàn thể lớp DH06SH thân yêu đã hỗ trợ,

giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài

¾ Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều

kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

Tháng 07 năm 2010

Đỗ Phong Lưu

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM trên cây lan

Mokara dòng Đỏ lá quặt in vitro Ngọn khảm vàng cây lan Mokara dòng Đỏ lá quặt in vitro sạch virus được tạo ra từ chồi ngọn của cây nhiễm virus bằng phương pháp xử lý

nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Đỉnh sinh trưởng có kích thước từ 0,5 - 1

mm, sau khi tách được nuôi cấy trên môi trường Knudson C trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc Việc tái sinh chồi được thực hiện trên môi trường MS với nồng độ BA và NAA tương ứng với tỉ lệ 2,5 : 0,5 (µg/l) Kiểm tra sự sạch bệnh của cụm chồi tái sinh sau 70 ngày nuôi cấy

Những kết quả thu được:

Bước đầu xác định được mức độ ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt đến chồi

lan Mokara dòng Đỏ lá quặt (Mokara cv Do La Quat) thông qua việc xử lý nhiệt ở

370C trong bể điều nhiệt các cụm chồi lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro một

tháng tuổi, cao từ 2- 3cm

Các chồi lan Mokara dòng Đỏ lá quặt in vitro có xử lý nhiệt và không xử lý

nhiệt được tiến hành cô lập đỉnh sinh trưởng Các đỉnh sinh trưởng được cô lập thành công ở kích thước 0,5 - 1mm

Tiến hành khảo sát và đã tìm được môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự phát

triển của đỉnh sinh trưởng cô lập từ chồi lan Mokara dòng Đỏ lá quặt (Mokara cv Do

La Quat)

Qua quá trình nuôi cấy đã tạo được cây lan Mokara dòng Đỏ lá quặt in vitro

sạch bệnh virus từ nguồn mẫu nhiễm bệnh bằng cách kiểm tra và đánh giá sự sạch bệnh (loại trừ virus) của các chồi/ cụm chồi tái sinh

SUMMARY

"THE CONSTRUCTING OF THE PROCESS TO EXCLUDE CyMV FROM THE

VIRUS INFECTED MOKARA cv DO LA QUAT BY THE MERISTEM

CULTURED TECHNIQUE"

Topic was conducted from 01/02/2010 to 01/07/2010 in the Biotechnology

Center of Ho Chi Minh City with Mokara cv Do La Quat in vitro orchid The free shoot tip was made from the infected shoots of the in vitro orchid plant by heating

virus-treatment method combined meristem culture The meristem in size from 0.5 to 1 mm, after separated, were cultured on Knudson C medium in the liquid shake cultured conditions The regenerated shoots were cultured on MS medium with BA 2,5 mg/l

and NAA 0,5 mg/l The last step, checking the virus-free of the in vitro regenerated

shoots after 70 days culture

3 Finding the appropriate culture medium for the development of meristem

separated from Mokara cv Do La Quat in vitro buds

4 Checking and estimating the virus- free status (excluding virus) of regenerated shoots

5 Producing the virus- free Mokara cv Do La Quat orchidaceous in vitro

strain from the infected virus sources

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt v

Danh sách các bảng vi

Danh sách hình và sơ đồ vii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu 1

1.2 Yêu cầu 2

Nội dung thực hiện 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về lan Mokara 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc 3

2.1.3 Sự phân bố 3

2.1.4 Đặc điểm hình thái và sinh trưởng 3

2.2 Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây lan Mokara 3

2.2.1 Đặc điểm thực vật học 3

2.2.2 Đặc điểm sinh thái 5

2.3 Một số bệnh thường gặp ở cây lan Mokara 6

2.4.Sơ lược về virus thực vật 7

2.4.1 Hình thái của virus thực vật 7

2.4.2 Cấu tạo 7

2.4.2 Sự di chuyển của virus 9

2.5 Sơ lược về virus gây bệnh trên lan 9

2.6 Cymbidium mosaic virus (CyMV) 10

2.6.1 Nguồn gốc và cấu tạo 10

2.6.2 Triệu chứng của Cymbidium mosaic virus (CyMV) trên lan 11

2.7 Giới thiệu sơ lược về RT-PCR 12

2.7.1 Định nghĩa 12

2.7.2 Nguyên tắc của phương pháp RT-PCR 12

2.7.3 Thành phần cơ bản của một phản ứng RT-PCR 13

2.8 Phương pháp tạo cây sạch virus 14

2.8.1 Cơ sở của các phương pháp tạo cây sạch virus 14

2.8.2 Các phương pháp tạo cây sạch virus 14

2.9 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 14

2.9.1 Đỉnh sinh trưởng 14

2.9.2 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 15

2.9.3 Lịch sử phát triển và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy ĐST 16

2.9.4 Một số lưu ý trong quá trình nuôi cấy ĐST 17

2.9.5 Các bước trong nuôi cấy ĐST cây lan Mokara in vitro 19

2.9.6 Ảnh hưởng của ánh sáng, nhiệt độ và ẩm độ trong quá trình nuôi cấy ĐST 19

2.9.8 Xử lý nhiệt 20

Chương 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Vật liệu 21

3.1.1 Vật liệu thí nghiệm 21

3.1.2 Hóa chất 21

3.1.3 Trang thiết bị thí nghiệm 21

3.1.4 Địa điểm thực hiện 22

3.2 Phương pháp 22

3.2.1 Kiểm tra sự có mặt của CyMV trong nguồn mẫu ban đầu 22

3.2.1.1 Ly trích virus 22

3.2.1.2 Thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR 23

3.2.2 Nuôi cấy và nhân nhanh cụm chồi để tạo nguồn mẫu ban đầu 23

3.2.3 Xử lý nhiệt cụm chồi in vitro 24

3.2.4 Cô lập và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ chồi ngọn 24

3.2.5 Nuôi cấy tăng sinh protocorm 25

3.2.6 Kiểm tra sự sạch bệnh của mẫu cấy 25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả kiểm tra sự có mặt của CyMV trong nguồn mẫu ban đầu 26

4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 370C đến sự phát triển cụm chồi lan Mokara 26

4.3 Kết quả của quá trình cô lập và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 28

4.3.1 Cô lập 28

4.3.2 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 29

4.4 Kết quả nuôi cấy tăng sinh protocorm 32

4.5 Kết quả kiểm tra sự hiện diện virus CyMV trong các chồi tái sinh 32

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34

5.1 Kết luận 34

5.2 Đề nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

¾ cDNA : complementary deoxynucleic acid

¾ CyMV : Cymbidium mosaic virus

¾ DNA : Deoxyribonucleic acid

¾ ĐST : Đỉnh sinh trưởng

¾ ORSV : Odontoglossum ringspot virus

¾ PCR : Polymerase Chain Reaction

¾ PLB : Protocorm like body

¾ RNA : Ribonucleic acid

¾ RT-PCR : Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

¾ TMV : Tobacco mosaic virus

¾ Tp HCM : Thành phố Hồ Chí Minh

DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang

Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của một phản ứng RT-PCR thể tích 20 µl 13

Bảng 3.1 Thành phần của phản ứng multiplex RT-PCR 23

Bảng 4.1 Ảnh hưởng quá trình XLN đến sự phát triển cụm chồi lan Mokara 27

Bảng 4.2 Ảnh hưởng nồng độ BA đến sự tái sinh của ĐST 29

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của quá trình XLN đến thời gian tái sinh của ĐST 31

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của quá trình XLN đến sự phát triển của ĐST 31

Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra sạch virus 33

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Trang

Hình 2.1 Rễ và lá của lan Mokara 4

Hình 2.2 Hoa Mokara dòng Đỏ lá quặt (Mokara cv Do La Quat) 4

Hình 2.3 : Lan Mokara dòng Đỏ lá quặt(Mokara cv Do La Quat) 6

Hình 2.4 Sơ đồ cấu tạo virus 7

Hình 2.5 Hình dạng của CyMV (Navalinskiene và cs, 2005) 10

Hình 2.6 Cấu trúc bộ gen của CyMV 10

Hình 2.7 Triệu chứng khảm vàng trên lá lan Hồ Điệp 11

Hình 2.8 Triệu chứng vệt hoại tử trên hoa lan Cattleya 11

Hình 2.9 : Cấu tạo chung của mô phân sinh chồi đỉnh 14

Hình 3.1 Cụm chồi lan Mokara in vitro sau một tháng nuôi cấy 23

Hình 3.2 Cụm chồi lan Mokara in vitro được xử lý nhiệt trong bể điều nhiệt 24

Hình 3.4 Đỉnh sinh trưởng sau khi tách được nuôi cấy lỏng lắc 25

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR kiểm tra nguồn mẫu ban đầu 26

Hình 4.2 Ảnh hưởng quá trình XLN đến sự phát triển chồi lan Mokara 27

Hình 4.3 Cô lập ĐST từ chồi lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro 28

Hình 4.4 Sự tái sinh của ĐST ở các nồng độ BA khác nhau 29

Hình 4.5 Sự phát triển của ĐST ở các nồng độ BA khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy lỏng lắc 30

Hình 4.6 Sự phát triển của ĐST đã qua XLN và chưa qua XLN 31

Hình 4.7 Sự phát triển của protocorm tái sinh từ ĐST đã qua XLN và chưa qua XLN 32

Hình 4.8 Kết quả phát hiện virus trên các cụm PLBs lan Mokara cv Do La Quat in vitro đã qua XLN bằng phương pháp PCR 33

Hình 4.9 Kết quả phát hiện virus trên các mẫu lan Mokara cv Do La Quat in vitro chưa qua XLN bằng phương pháp PCR 33

Mokara là loài lan lai giữa ba giống Arachnis (lan bò cạp), Ascoentrum và

Vanda, do đó có những đặc tính nổi bật từ bố mẹ: như dạng hoa và màu sắc đẹp từ

Vanda, tăng trưởng nhanh từ Ascocenda (Ascocentrum x Vanda) Chính nhờ những đặc tính nổi trội đó mà việc trồng và kinh doanh lan Mokara ngày một phát triển Đây

là một trong những giống lan cắt cành mang lại giá trị kinh tế không nhỏ cho ngành trồng Lan (Dương Công Kiên, 2002)

Tuy nhiên quá trình trồng và phát triển các giống lan nói chung hay lan Mokara

nói riêng thường gặp một trở ngại rất lớn đó là sự gây hại nghiêm trọng của các tác nhân gây bệnh cho cây lan, gồm có côn trùng, nấm, vi khuẩn, virus Trong đó, mức độ tác hại do virus gây ra là nghiêm trọng nhất vì khó phát hiện sớm ở giai đoạn đầu, mức độ lây lan cao và khi phát hiện lan đã nhiễm virus thì thường phải loại bỏ

Có hơn 25 loại virus đã được biết là gây hại trên lan (theo Jane Moran, Knoxfield) Trong đó Cymbidium mosaic virus và Odontoglossum ringspot virus là 2

loài phổ biến nhất (Zettler và cs 1990; Flynn, 1996)

Phân bố rộng trên khắp thế giới, CyMV là virus gây ra đốm hoại tử trên lá và hoa làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng cũng như tính thương mại của lan Đã có rất nhiều biện pháp được đưa ra nhằm mục đích phòng ngừa, ngăn chặn (đối với những cây chưa nhiễm virus) hoặc khôi phục lại những giống lan đã nhiễm virus, nhưng cho đến nay phương pháp khôi phục lại những giống lan đã nhiễm virus bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được xem là có hiệu quả hơn cả khi mà các phương pháp

khác vẫn còn đang trong giai đoạn nghiên cứu hoặc còn gặp nhiều vấn đề về kỹ thuật

và lý luận

Trong phạm vi đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu và xây dựng quy trình

phục hồi giống lan Mokara dòng Đỏ lá quặt (Mokara cv Do La Quat) đã nhiễm Cymbidium mosaic virus (CyMV) bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

1.2 Yêu cầu

Xây dựng thành công quy trình phục hồi giống lan Mokara dòng Đỏ lá quặt (Mokara cv Do La Quat)đã nhiễm Cymbidium mosaic virus (CyMV) bằng kỹ thuật

nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Tạo tiền đề cho các nghiên cứu cùng lĩnh vực sau này

1.3 Nội dung thực hiện

¾ Xác định mức độ ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt đến chồi lan Mokara dòng Đỏ lá quặt (Mokara cv Do La Quat)

¾ Cô lập ĐST từ chồi ngọn cây lan Mokara dòng Đỏ lá quặt in vitro ở kích thước

0,5 - 1mm

¾ Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự phát triển của ĐST cô lập từ

chồi lan Mokara dòng Đỏ lá quặt (Mokara cv Do La Quat)

¾ Kiểm tra và đánh giá sự sạch bệnh (loại trừ virus) của các chồi/ cụm chồi tái sinh

¾ Tạo cây lan Mokara dòng Đỏ lá quặt in vitro sạch bệnh virus từ nguồn mẫu

nhiễm bệnh

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về lan Mokara

Tên lai: Mokara (viết tắt Mkra)

2.1.2 Nguồn gốc

Năm 1969, cây lan lai tên Mokara Wai Liang đầu tiên trên thế giới đã ra đời ở

Singapore, dưới bàn tay tài hoa của C.Y Mok (Dương Công Kiên, 2003)

2.1.3 Sự phân bố

Loài lan Mokara được nhập từ quê hương Băng Cốc và Singapore, hiện nay

được trồng với mục đích thương mại ở nhiều nơi kéo dài từ Philippine đến Nam Á, Hawaii,… (Dương Công Kiên, 2003)

2.1.4 Đặc điểm hình thái và sinh trưởng

Lan Mokara là loài đơn thân, dễ trồng, dễ tách chiết, hệ số nhân cao, sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nóng ẩm Hoa Mokara có nhiều màu

sắc đẹp, thông dụng nhất là các màu vàng chanh, hồng sáng, đỏ và tím

2.2 Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây lan Mokara

2.2.1 Đặc điểm thực vật học

a) Thân : Có cấu tạo đơn thân tương tự như các giống Mokara khác Chiều cao

của thân biến động từ 0,1 - 0,2 đến 3 - 4 m (Dương Công Kiên, 2003)

Thân Mokara luôn mọc cao về phía đỉnh Sự mọc dài của đỉnh không giới hạn

nên cây chỉ có một thân phát triển không giới hạn theo chiều thẳng đứng Sự phát triển

Hình 2.1 Rễ và lá của lan Mokara

Hình 2.2 Hoa Mokara dòng Đỏ lá

quặt (Mokara cv Do La Quat)

này chỉ dừng lại khi ngọn bị tổn thương, lúc đó chồi bên xé rách bẹ lá để mọc dài ra thành nhánh Các nhánh này cũng phát triển vô hạn về phía đỉnh

Thân mang rễ và lá, rễ và lá mọc theo hai chiều thẳng góc, phát hoa mọc trên

thân ở nách lá, song song với rễ và thẳng góc với lá

b) Lá :Lá có dạng đơn nguyên hình giáo thuôn dài

Lá dày và cứng màu xanh bóng, đậm và nhẵn Cây

trưởng thành cao khoảng 2 m có từ 40 đến 50 lá

c) Rễ : Rễ lan Mokara thuộc loại rễ trần (rễ phơi

ra ngoài không khí) nên đòi hỏi ẩm độ của vườn rất cao

Từ bẹ lá các rễ chính mọc thành nhiều tầng vuông góc

với trục thân và lá, rễ chính thường có màu xanh Từ rễ

chính mọc ra các rễ phụ màu trắng, chóp rễ màu nâu, rễ

phụ thường mềm và mọng nước

d) Hoa : Hoa Mokara có 5 cánh với nhiều màu

sắc đẹp, Cánh hoa thường có chấm, có đốm hoặc hình

carô rất đẹp Hoa mọc thành từng phát hoa, từ nách lá

giữa thân, mỗi đợt ra hoa, cây có thể cho từ 2 đến 3 phát

hoa, mỗi phát hoa có từ 8 đến 16 hoa (Dương Hoa Xô,

2008)

Cành hoa lan Mokara có kết cấu tỏa đều với các

cánh hoa sắp xếp dày, đều về bốn phía, cọng hoa mập

cứng không thuân lợi để đóng gói bao bì khi vận chuyển

Đây chính là một bất lợi lớn của lan Mokara so với

Dendrobium

e) Quả : Cũng như các loài lan khác quả của lan

Mokara thuộc loại quả nang mở bằng ba khe hay sáu khe

nứt dài theo 2 bên đường của giá noãn

f) Hạt : Thông thường hạt lan Mokara cần trải

qua hơn một năm mới chín Hạt nhỏ nhiều phôi chưa

phân hóa, đó cũng là đặc điểm của hầu hết các loại lan

Hạt lan Mokara rất nhỏ được gió mang đi như hạt bụi phần lớn bị chết vì không

có chất dự trữ để sử dụng lúc nảy mầm hoặc chết do rơi vào môi trường không thích hợp để nảy mầm Các hạt lan muốn nảy mầm phải cộng sinh được với nấm để lấy thức

ăn từ nấm cung cấp Trong thiên nhiên, hạt lan chỉ nảy mầm khi có được sự cộng sinh với loài nấm phù hợp (Dương Công Kiên, 2003)

2.2.2 Đặc điểm sinh thái

a) Nhiệt độ: Mokara thuộc nhóm lan ưa nóng Nhiệt độ thích hợp ban ngày

không dưới 210C Nhiệt độ ban đêm không dưới 18,50C

b) Ánh sáng: Mokara là loài cây ưa sáng Ánh sáng yếu,làm cho cường độ

quang hợp giảm, cây thiếu dinh dưỡng và không ra hoa Cây sẽ phát triển tốt với độ che nắng 50-60% ánh sáng tự nhiên

c) Ẩm độ: Mokara cần độ ẩm cao, nên mùa khô tăng cường tưới nước để tránh

hiện tượng rụng lá và giảm cường độ quang hợp

d) Độ thông thoáng: Môi trường thiếu thông thoáng dễ gia tăng bệnh cho lan Trái lại ở nơi quá thoáng, sự thoát hơi nước gia tăng, môi trường có độ ẩm thấp như đồng trống gia tăng bốc hơi nước làm cho môi trường có độ ẩm thấp, cây thoát hơi nước mạnh làm cho cây kém phát triển

e) Kiểu trồng : Lan Mokara có thể được trồng trên lưới, hay trên luống có chứa

vỏ đậu, trong các chậu gốm, nhựa không có chất trồng hoặc có chất trồng là xơ dừa,

vỏ đậu, than; hoặc được trồng bằng cách bó vào trụ xi măng đứng Tuy nhiên kiểu trồng trên các luống có chứa vỏ đậu là cách trồng phổ biến nhất và hiệu quả nhất

f) Đất trồng : Đất chọn trồng Mokara phải cao ráo, thoáng mát và có tỷ lệ cát

cao

g) Chuẩn bị luống trồng : Luống trồng làm thành khung hình chữ nhật để cho

vỏ đậu vào không bị trôi chảy

2.3 Một số bệnh thường gặp ở cây lan Mokara

- Bệnh cháy lá vì dư ánh sáng

- Bệnh đốm vàng (bệnh thối) do mưa nhiều

- Bệnh thiếu các yếu tố đa vi lượng: đạm, lân, kali, magie, canxi, sắt, Bo, mangan

• Bệnh thối đen: bệnh do 2 loại nấm Pythium sp Và Phytophthora sp gây

ra, gặp nhiều trên lá đang thối

• Bệnh đốm vàng: do nấm Colletotrichum sp gây ra

Hình 2.3 : Lan Mokara dòng Đỏ lá quặt(Mokara cv Do La Quat)

Hình 2.4 Sơ đồ cấu tạo virus

• Bệnh khô cháy lá: do nấm thuộc giống Phylostica

• Bệnh đốm nâu: do nấm Phllostictina piriformis gây ra

• Bệnh đốm vàng: do nấm Cercospora sp có bào tử màu nâu đen

• Bệnh héo rễ: do nấm Sclerotium rolfsii làm cho rễ khô dần (Dương

Công Kiên, 2002)

- Bệnh do virus

- Bệnh do động vật, côn trùng: các động vật cắn phá trực tiếp lan, chúng ăn đọt non, chồi mới, nụ hoa, đầu rễ, cắn nhụy hút nhựa làm cho cây lan không phát triển được

2.4 Sơ lược về virus trên thực vật

2.4.1 Hình thái của virus thực vật

Virus thực vật có hình thái và kích thước rất đa dạng Virus có thể có dạng hình gậy (virus khảm thuốc lá - TMV, virus khảm sọc lá lúa mạch…), hình cầu (virus khảm dưa chuột, virus khảm súp lơ), hình khối đa diện hay hình sợi (virus X khoai

tây, Clostero virus…)…

2.4.2 Cấu tạo

Theo Caspar và cộng sự (1962), virus thuộc loại ký sinh phân tử không có cấu tạo tế bào Nhìn chung các loại virus bao gồm các thành phần sau:

- Protein vỏ

- Nucleic acid (DNA hoặc RNA)

- Màng bao- envelop (có ở một số virus)

a) Vỏ (Capsid)

Sự sắp xếp một cách phức tạp

của các đại phân tử tạo thành lớp vỏ

của virus thực sự có thể được coi là

công trình kiến trúc kỳ diệu Những

yêu cầu đặc biệt của mỗi loại virus dẫn

đến sự đa dạng về bố cục lập thể của

lớp vỏ Tuy vậy, vẫn có thể khái quát

những đặc điểm cơ bản về hình dạng

của lớp vỏ protein của các loại virus (Nguyễn Bá Tiếp, 2007)

Đã có rất nhiều nhà khoa học đưa ra khái niệm cho lớp vỏ protein của virus nhưng nhìn chung không được chấp nhận Cho đến năm 1962, Caspar và cộng sự đưa các khái niệm về lớp vỏ protein virus và đã được chấp nhận:

- Capsid: là lớp vỏ protein của virus bao bọc nucleic acid và được cấu thành từ các đơn vị cấu trúc Các đơn vị cấu trúc là đơn vị cấu tạo nhỏ nhất của lớp vỏ với chức năng kiến tạo tương đồng

- Capsomer: là các đơn vị hình thái quan sát được trên bề mặt của các hạt virus tương ứng với tập hợp các đơn vị cấu trúc

- Nucleocapsid: nucleic acid được "gói" bên trong các capsid Nucleocapsid có thể được "khoác" một lớp vỏ bọc (envelop) mang các vật liệu có nguồn gốc từ tế bào chủ cũng như từ bản thân virus

- Các virion là các hạt virus hoàn chỉnh và có khả năng nhiễm vào tế bào chủ Chức năng của Capsid:

- Bảo vệ nucleic acid của virus khỏi sự tác động của các enzyme

- Các vị trí đặc biệt trên lớp vỏ cho phép các virion gắn vào tế bào chủ

- Cung cấp các protein tạo điều kiện để virion thâm nhập qua màng tế bào chủ Trong một số trường hợp, lớp vỏ có tác dụng đưa nucleic acid của virus vào tế bào chủ (Citovsky V and Zambryski P., 1991)

Vỏ capsid có kích thước và cách sắp xếp khác nhau khiến cho virus có hình dạng khác nhau, có thể chia ra ba loại cấu trúc: đối xứng xoắn, đối xứng hình khối và cấu trúc phức tạp (Lawson R H and Brannigan M., 1986)

b) Lớp vỏ bọc bên ngoài (envelop)

Nhiều virus còn có lớp vỏ glycoprotein bao bọc bên ngoài Capsid Lớp vỏ bọc này được tạo thành từ hai lớp lipid xen kẽ với các phân tử protein (lipoprotein bilayer) Các phân tử lipid được lấy từ màng của tế bào chủ trong khi những phân tử protein do virus tổng hợp Chính vì vậy, có thể gọi đây là lớp màng "lai tạo" (Lawson

R H and Brannigan M., 1986)

Các protein do virus tổng hợp để tạo thành lớp màng này gồm hai loại chính:

(1) Matrix protein liên kết với phần capsid bên trong;

(2) Glycoprotein nằm xuyên qua màng, gồm hai loại:

+ Glycoprotein ngoài (external glycoprotein) có phần lớn nằm bên ngoài màng tạo thành các "gai" (spike) quan sát được trên bề mặt virus bằng kính hiển vi điện tử Phần nằm bên trong tạo thành chiếc "đuôi" ngắn Loại protein này là thành phần kháng nguyên chính của lớp vỏ virus (Nguyễn Bá Tiếp, 2007)

+ Protein tạo các kênh vận chuyển nhiều cấu trúc kỵ nước và nằm xuyên qua màng các kênh ion giúp cho virus có khả năng thay đổi tính thấm của màng

2.4.3 Sự di chuyển của virus

Ở góc độ tế bào, virus di chuyển theo dòng tế bào chất hay di chuyển theo dòng nhựa nguyên và nhựa luyện của cây Theo các mạch dẫn, virus được truyền trong cây

từ vùng này sang vùng khác Nhờ cầu nối nguyên sinh virus có thể di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác

Trong phạm vi quần thể bao gồm những cây nhiễm virus và những cây không

bị nhiễm virus, virus chỉ có thể truyền sang cây khỏe nhờ vào môi giới truyền bệnh (vector) Ngoài ra, virus có thể lan truyền trên diện rộng (không nhờ môi giới) do nguồn giống, nguyên liệu nhân giống ban đầu không sạch virus Trên thực tế, diện tích cây trồng bị nhiễm virus ngày càng lan rộng vì nguồn giống ban đầu chưa đảm bảo sạch virus nói riêng và các mầm bệnh khác nói chung; từ đó, các loại môi giới tiếp tục truyền virus sang cây khỏe giúp virus thực hiện quá trình xâm nhiễm, gây bệnh (Citovsky V và Zambryski P, 1991)

2.5 Sơ lược về virus gây bệnh trên lan

Virus cũng là một trong những loài gây hại nghiêm trọng trên hoa lan (Seoh và

cs, 1998) Có ít nhất 25 loại virus gây bệnh trên lan đã được đề cập, trong đó

Cymbidium mosaic virus và Odontoglossum ringspot virus là 2 loài phổ biến nhất

(Zettler và cs 1990; Flynn, 1996) Cả hai loại virus CyMV và ORSV đều gây nhiễm trên nhiều giống lan nhưng CyMV dường như phổ biến hơn Những virus này cũng có

Hình 2.5 Hình dạng của CyMV (Navalinskiene

và cs, 2005). 

thể nhiễm trên nhiều loại thực vật khác nhưng chỉ có các giống lan là bị thiệt hại về mặt kinh tế Do chưa có thông báo xác nhận về sự gây nhiễm tự nhiên bởi CyMV hay ORSV trên các giống lan hoang dại nên nguồn gốc của các loại virus này vẫn chưa được làm rõ (Zetter và cs, 1990)

2.6 Cymbidium mosaic virus (CyMV)

2.6.1 Nguồn gốc và cấu tạo

Cymbidium mosaic virus

(CyMV) (giống Potexvirus, họ

Flexiviridae) hay còn gọi là virus khảm

vàng, được mô tả lần đầu tiên bởi

Jensen Đây là một trong những loại

virus quan trọng và phổ biến nhất gây

nhiễm các loại lan trên thế giới (Wong

và cộng sự, 1997) Phần tử virus có

dạng sợi, không màng bao, dài 480 nm,

rộng 13 nm Virus này có vật chất di truyền là RNA, mạch đơn, sợi dương, có chiều dài 6227 nucleotide không tính đuôi poly A ở đầu tận cùng 3’

Bộ gen chứa RNA mạch đơn, sợi dương, có mũ chụp ở đầu 5’ và đuôi polyA ở đầu 3’ Tổ chức bộ gen được bảo tồn cao và bao gồm 3 vùng: RdRp (RNA-dependent RNA polymerase – RNA polymerase phụ thuộc RNA), TGB (triple-gene-block – nhóm gen bộ ba) và CP (coat protein – protein vỏ) (Hình 2.6) Dựa trên sự so sánh về phát sinh loài của RdRp và protein vỏ cho thấy CyMV có mối liên hệ gần với các virus như PAMV, NMV, WC1MV và SMYEaV (Wong và cs, 1997)

Hình 2.6 Cấu trúc bộ gen của CyMV

2.6.2 Triệu chứng của Cymbidium mosaic virus (CyMV) trên lan

CyMV gây ra hiện tượng vàng lá thể khảm đi kèm với sự hóa đen và chết của những vùng lá dọc theo gân lá (Moran và Knoxfield, 1999) Sự hoại tử lá gây ra bởi CyMV có lẽ là bệnh virus phổ biến nhất trên nhiều loại lan Cây bị nhiễm virus có các đốm và vệt mô chết kéo dài, màu nâu đến đen, không đều trên cả 2 mặt của các lá già Các lá có triệu chứng này thường lão hóa nhanh và khô (University of Illinois, 1990)

Ở các giống lan Phalaenopsis, Cattleya, Dendrobium và nhiều giống khác, virus gây

ra các đốm hoại tử đen và các kiểu đường hoại tử với các vết lõm xuống trên lá (Marais, 2000) Triệu chứng trên hoa thường ít biểu hiện, nhưng hoa có thể nở với hình dạng kém phát triển Nếu lá chết trước khi trưởng thành, hoa thường có kích thước nhỏ và số lượng hoa ít (University of Illinois, 1990) Trong trường hợp có triệu chứng, trên hoa có thể xuất hiện các vệt hoại tử trong một vài ngày khi hoa đang nở Tuy nhiên, các triệu chứng trên hoa thường chỉ biểu hiện sau khoảng 2 tuần và đặc

biệt dễ dàng nhận thấy trên hoa Cattleya trắng (Marais 2000) Ngoài ra, virus này còn tạo ra sự khảm màu (thường đậm hay nhạt hơn màu hoa) trên hoa Cattleya (Moran và

Knoxfield, 1999)

Nói chung, CyMV gây ra một loạt các sự biến đổi bất thường trên lan, với các triệu chứng thay đổi rất lớn trong các giống lan khác nhau bị nhiễm cùng một loại virus Các triệu chứng nổi bật nhất là vàng lá (mất diệp lục) và chết mô (hoại tử) cũng như sự cằn cỗi cây Các triệu chứng này có thể xảy ra riêng biệt, kết hợp với nhau hoặc hoàn toàn không biểu hiện do điều kiện nuôi trồng tốt ngăn cản sự phát triển

triệu chứng Các cây ở trong điều kiện stress thường có xu hướng biểu hiện triệu chứng nghiêm trọng khi bị nhiễm virus (Marais, 2002)

Sự thay đổi của các triệu chứng virus phụ thuộc vào nhiều yếu tố như dòng virus, loài thực vật bị nhiễm và các điều kiện môi trường như cường độ sáng, nhiệt độ,

dinh dưỡng và sự ngộ độc Ure (biểu hiện triệu chứng giống với nhiễm Cymbidium mosaic virus trên lá Cymbidium) (Marais, 2002) Sự mất cân bằng dinh dưỡng, ngộ

độc muối, cường độ ánh sáng cao, côn trùng, bệnh do nấm hay sự rối loạn di truyền có thể gây ra các triệu chứng tương tự như bệnh virus (Flynn, 1996)

2.7 Giới thiệu sơ lược về RT-PCR

2.7.1 Định nghĩa

RT-PCR là phương pháp PCR mà nucleic acid đích cần nhân bản là RNA Để

có thể thực hiện được phản ứng RT-PCR thì trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược thành cDNA, rồi sau đó sẽ dùng PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự này.Vì phải thực hiên RT rồi mới đến PCR nên kỹ thuật này được gọi là RT-PCR (Phạm Hùng Vân, 2009)

2.7.2 Nguyên tắc của phương pháp RT-PCR

Giai đoạn phiên mã ngược (reverse transcription, RT) là một bước hết sức quan trọng quyết định sự thành công của kỹ thuật RT-PCR Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) dùng trong giai đoạn này được tách chiết từ Moloney murine leukemia virus (MMLV) gây bệnh ung thư bạch cầu trên chuột hay Avian myeloblastosis virus (AMV) gây bệnh ung thư tủy trên gia cầm Enzyme này là một loại DNA polymerase không chịu nhiệt, sử dụng mạch đơn RNA làm sợi khuôn tổng hợp sợi DNA bổ sung nên giai đoạn phiên mã ngược còn được gọi là giai đoạn tổng hợp cDNA (Phạm Hùng Vân, 2009)

Để enzyme phiên mã ngược tổng hợp được cDNA từ sợi khuôn RNA đơn cần phải có mồi đặc hiệu bám trên sợi khuôn RNA Mồi được sử dụng trong giai đoạn RT

có thể là mồi đặc hiệu cho trình tự RNA sẽ được phiên mã ngược thành cDNA, và mồi này có thể là mồi xuôi hay mồi ngược của giai đoạn PCR tùy chiều 5’ đến 3’ của RNA bắt cặp được với mồi nào Ngoài ra cũng có thể sử dụng một loại mồi ngẫu nhiên (random hexamer) gồm 6 nucleotide có thứ tự ngẫu nhiên để phiên mã ngược toàn bộ RNA có trong mẫu thành các cDNA Tuy nhiên, mồi ngẫu nhiên chỉ có hiệu quả khi

phiên mã ngược các đoạn DNA dài dưới 600 bases, còn với những đoạn dài hơn thì phải dùng mồi đặc hiệu mới đạt hiệu quả (Phạm Hùng Vân, 2009)

Tiếp sau giai đoạn RT là PCR, nguyên tắc chủ yếu dựa trên khả năng tự nhân đôi, biến tính và hồi tính của DNA Giai đoạn này làm gia tăng số lượng bản sao DNA một cách nhanh chóng giúp việc phát hiện DNA trong mẫu dễ dàng hơn

2.7.3 Thành phần cơ bản của một phản ứng RT-PCR

Đối tượng của RT là RNA đích Bản chất của RNA là rất dễ bị phân hủy trong môi trường cũng như bị enzyme RNAse tiết ra từ các vi sinh vật trong môi trường, chai lọ thiết bị, dụng cụ và dung dịch Enzyme RNAse lại rất bền và khó bị phân hủy bởi nhiệt độ Do vậy thao tác trong pha chế các thuốc thử dùng cho phản ứng RT phải tuyệt đối tôn trọng nguyên tắc vô trùng và thực hiện với các dụng cụ, thiết bị,thuốc thử, tinh sạch Để pha dung dịch cho phản ứng RT cần phải chuẩn bị đầy đủ các điều kiện như là cách pha PCR mix Tùy thuộc vào enzyme reverse transcriptase thuộc loại nào, do hãng nào sản xuất mà có thể pha dung dịch phản ứng RT

Recombinant® Rnasin Ribonuclease Inhibitor (RNAsin) 1U/µl

Mồi đặc hiệu(nếu dùng mồi ngẫu nhiên hay mồi

poly T thì cho 0,5 µg/µg RNA được phiên mã)

15 – 100 pm