KÍCH THÍCH SỰ GIA TĂNG TINH DẦU, , MENTHOL VÀ METHONE TRONG CÂY BẠC HÀ ( (M Me en nt th ha a p pi ip pe er ri it ta a L L. .) ) B BẰ ẰN NG G C CÁ ÁC C C CH HẤ ẤT T Đ ĐI IỀ ỀU U H HÒ ÒA A S SI IN NH H T TR RƯ ƯỞ ỞN NG G

Các mẫu tinh dầu được thực hiện sắc ký lớp mỏng để định lượng tương đối hàm lượng menthol, menthone nhằm chọn ra nồng độ chất điều hòa sinh trưởng cho hàm lượng menthol, menthone cao nhấ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Y Z

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

BẰNG CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG

Sinh viên thực hiện : ĐINH CÁT ĐIỀM Niên khóa : 2006 - 2010

Tháng 07/2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Y Z

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

BẰNG CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG

Tháng 07/2010

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

- Đặc biệt tôi xin chân thành cảm ơn cô: TS Trần Thị Lệ Minh và KS Trịnh Thị Phi Ly đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này

- Anh Nguyễn Sĩ Tuấn đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm đề tài

- Các Thầy Cô tại Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp

- Các Thầy Cô phụ trách phòng thí nghiệm Hóa Lý tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã nhiệt tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

- Bạn Nguyễn Trần Lâm Thanh và các bạn thực tập tại Bộ môn Công nghệ Sinh học

đã quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt đề tài

- Toàn thể các bạn lớp DH06SH thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thời gian làm đề tài

Con vô cùng biết ơn gia đình và người thân đã nuôi dạy, giúp đỡ, yêu thương và động viên con trong những năm tháng học tập tại trường Chân thành cảm ơn!

Tháng 07 năm 2010

Đinh Cát Điềm

TÓM TẮT

Bạc hà là một trong những cây thảo dược quan trọng nhất trên thế giới Tinh dầu Bạc hà có nhiều công dụng nhờ vào hợp chất menthol, menthone được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm Tuy nhiên, hàm

lượng tinh dầu Bạc hà Mentha piperita L.trồng ở Việt Nam rất thấp do thời tiết, đất đai

và sâu bệnh Tinh dầu Bạc hà hiện nay được tổng hợp hóa học để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con người Đất nước ngày càng phát triển nên nhu cầu trở về sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên là điều rất phổ biến Mục đích của đề tài

là sử dụng GA3 và IAA để kích thích gia tăng hàm lượng tinh dầu Bạc hà, menthol và

menthone trong cây bạc hà Mentha piperita L

Chúng tôi tiến hành trồng và khảo sát các chỉ tiêu số lá, số cành và cũng như chiều cao cây, trọng lượng thân lá tươi của giống Bạc hà Châu Âu sau khi xử lý với GA3 (50 và 100 mg/L) và IAA (0,1; 1 và 10 mg/L) Chiết xuất tinh dầu Bạc hà bằng phương pháp chưng cất hơi nước Các mẫu tinh dầu được thực hiện sắc ký lớp mỏng

để định lượng tương đối hàm lượng menthol, menthone nhằm chọn ra nồng độ chất điều hòa sinh trưởng cho hàm lượng menthol, menthone cao nhất Định lượng hàm lượng menthol, menthone bằng sắc ký khí các mẫu tinh dầu Bạc hà đề chọn ra chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ cho hàm lượng menthol và menthone cao nhất Kết quả cho thấy GA3 và IAA có tác dụng tốt lên sự tăng trưởng của lá, cành, chiều cao cây và trọng lượng thân tươi của các cây bạc hà Cây Bạc hà xử lý với IAA

10 mg/L và GA3 100 mg/L có hàm lượng tinh dầu cao nhất trong các nồng độ IAA và GA3 thí nghiệm Trong đó, Bạc hà được xử lý với IAA 10 mg/L cho hàm lượng menthol và menthone cao nhất

SUMMARY

“Stimulate the yield of essential oil, menthol and menthone in mint (Mentha

piperita L.) by growth hormones”

Mentha piperita L is considered as one of the most important herbal throughout

the world The mint essential oil has many components are widely used as flavorings

in the food, cosmetic and pharmaceutical industries such as menthol and menthone The aim of this thesis was to establish the procedure using GA3 and IAA for stimulating the yield of essential oil, menthol and menthone

We observed the number of leaves, branchs and also tree height, tree fresh mass after treating with GA3 (50 and 100 mg/L) and IAA (0.1; 1 and 10 mg/L) Steam distillation has been used for the extraction of mint oil which was analysed by thin layer chromatography and gas chromatography for determining the optimal treatment

In results, GA3 and IAA had good effects on the growth of mint-including leaf, branch, tree height and tree mass In particular, mint were treated with IAA 10 mg/L had the highest content of essential oil, menthol and menthone

Keywords: Mentha piperita L., growth hormones, GA3, IAA, TLC, GC, menthol,

menthone, essential oil

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây Bạc hà 3

2.1.1 Phân loại thực vật 3

2.1.2 Nguồn gốc 4

2.1.3 Đặc điểm thực vật học 4

2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển 5

2.1.5 Điều kiện sinh thái 6

2.1.6 Thời vụ 7

2.1.7 Công dụng và giá trị kinh tế 8

2.1.7.1 Công dụng 8

2.1.7.2 Giá trị kinh tế 8

2.2 Kỹ thuật trồng Bạc hà 9

2.2.1 Giống và chất lượng giống Bạc hà 9

2.2.2 Cách ươm cây Bạc hà 9

2.2.3 Đất trồng Bạc hà 9

2.2.4 Bón phân cho Bạc hà 10

2.2.5 Chăm sóc Bạc hà 10

2.2.6 Phòng trừ sâu bệnh cho Bạc hà 10

2.2.7 Thu hoạch Bạc hà 11

2.3 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 12

2.3.1 Giới thiệu các chất điều hòa sinh trưởng 12

2.3.2 Vai trò của auxin 13

2.3.2.1.Auxin hoạt động trong sự kéo dài tế bào 13

2.3.2.2.Auxin hoạt động trong sự phân chia tế bào 14

2.3.2.3.Auxin hoạt động trong sự phát sinh hình thái 15

2.3.3 Vai trò của gibberrellin 16

2.3.3.1 Sự kéo dài tế bào của gibberellin 16

2.3.3.2 Sự kéo dài thân của gibberellin 17

2.3.3.3 Sự kéo dài lóng và tăng trưởng lá của gibberellin 17

2.3.3.4 Sự nảy mầm, nảy chồi của gibberellin 17

2.3.3.5 Sự ra hoa, quả nhờ gibberellin 17

2.4 Tinh dầu Bạc hà 18

2.4.1 Tinh dầu Bạc hà 18

2.4.2 Thành phần hóa học trong tinh dầu Bạc hà 18

2.5 Phương pháp chưng cất hơi nước 20

2.5.1 Phương pháp chưng cất bằng nước 20

2.5.2 Phương pháp chưng cất bằng nước và hơi nước 20

2.5.3 Phương pháp chưng cất bằng hơi nước 21

2.6 Giới thiệu sắc ký lớp mỏng và sắc ký khí 22

2.6.1 Sắc ký lớp mỏng 22

2.6.2 Sắc ký khí 24

2.6.3 Sắc ký khí ghép khối phổ 24

2.7 Các nghiên cứu khoa học liên quan 25

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 26

3.2 Vật liệu 26

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

3.2.2 Hóa chất và thiết bị 26

3.2.3 Nội dung nghiên cứu 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.3.1 Nhân giống Bạc hà trên đồng ruộng 27

3.3.2 Chuẩn bị cây con trong vườn ươm 27

3.3.3 Chuẩn bị IAA, GA3 27

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của IAA, GA3 đến khả năng sinh trưởng của cây Bạc hà 27

3.3.5 Xác định hàm lượng tinh dầu Bạc hà 28

3.3.6 Định lượng tương đối menthol và menthone trong tinh dầu bằng SKLM 29

3.3.7 Định lượng menthol và menthone trong tinh dầu bằng sắc ký khí 30

3.3.8 Xử lý số liệu 31

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Khảo sát ảnh hưởng của IAA, GA3 đến đặc điểm sinh trưởng của cây Bạc hà 32

4.2 So sánh hàm lượng tinh dầu 34

4.3 So sánh hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu bằng sắc ký lớp mỏng 35

4.4 Xác định hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu Bạc hà bằng sắc ký khí 37

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA : Analysis Of Variance

CRD : Completely Randomized Design

ĐC : Đối chứng

GA3 : Gibberellic acid hay gibberellin 3

GC - MS : Gas Chromatography – Mass Spectrometry

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của GA3 và IAA đến cây Bạc hà 29

Bảng 4.1 Chỉ tiêu tăng trưởng của cây Bạc hà sau 45 ngày trồng xử lý GA3 và IAA 33

Bảng 4.2 Kết quả hàm lượng tinh dầu (%) cây xử lý GA3 và IAA 34

Bảng 4.3 Kết quả đường chuẩn menthol bằng SKLM 35

Bảng 4.4 Kết quả hàm lượng menthol (%) bằng SKLM 36

Bảng 4.5 Kết quả hàm lượng menthol (%) bằng SKK 37

Bảng 4.6 Kết quả hàm lượng menthone (%) bằng SKK 38

DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Bạc hà Châu Âu (Mentha piperita L.) 3

Hình 2.2 Tác động của auxin làm giãn tế bào 14

Hình 2.3 Tác động của auxin vào sự tổng hợp các chất protein 15

Hình 2.4 Con đường sinh tổng hợp monoterpene trong cây Bạc hà 20

Hình 2.5 Mô hình SKLM hiện các vết mẫu trong khoảng thời gian 10 phút 24

Hình 4.1 Bạc hà xử lý với GA3 32  

Hình 4.2 Bạc hà xử lý với IAA 32  

Hình 4.3 Sắc ký lớp mỏng tinh dầu Bạc hà 35 

Hình 4.4 Đường chuẩn sắc ký lớp mỏng của menthol 36

Hình 4.5 Đường chuẩn sắc ký khí của menthol 37

Hình 4.6 Đường chuẩn sắc ký khí của menthone 38

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là một quốc gia nằm trong vùng nhiệt đới Thời tiết của nước ta thích hợp cho sự phát triển của rất nhiều loài thực vật Trong đó, các loại cây chứa tinh dầu

đã và đang được khai thác để phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu

Hiện nay, nhiều loại tinh dầu đang được sử dụng rất phổ biến như: tinh dầu hoa hồng, tinh dầu hoa lài, tinh dầu Bạc hà, tinh dầu Sả, tinh dầu Cam Chanh,… Trong đó,

tinh dầu Bạc hà từ cây Bạc hà Châu Âu (Mentha piperita L.) đang được quan tâm nhiều do các tác dụng của nó Bạc hà Mentha piperita L thuộc họ hoa môi Lamiaceae

là cây thảo dược quan trọng nhờ chứa một lượng tinh dầu trong thân, lá và hoa Bạc hà

có vị cay, tính mát, có hương thơm dịu được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như: dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm Tinh dầu Bạc hà dùng làm thuốc sát khuẩn xoa bóp nơi sưng, gây tê tại chỗ, kích thích sự tiết dịch tiêu hóa nhất là mật và có tác dụng chống viêm Những tác dụng trên phần lớn là do hợp chất menthol có trong tinh dầu Bạc hà

Do đó, nhiều sản phẩm được con người tạo ra có bổ sung menthol như: dầu gió, kem đánh răng, nước súc miệng, kẹo singum, dầu gội, nước uống, mứt kẹo và hương liệu

Tuy nhiên, giá thành tinh dầu Bạc hà thiên nhiên khá cao nên phần lớn các sản phẩm trên được bổ sung hương vị tổng hợp hóa học Bên cạnh đó, năng suất tinh dầu thu được từ cây Bạc hà Châu Âu rất thấp do sâu bệnh và đất đai

Để gia tăng hàm lượng tinh dầu và các chất có trong tinh dầu có thể sử dụng các chất kích thích sinh trưởng như indole-β-acetic-acid, benzyl adenin, gibberellic acid hay các hóa chất như methyl jasmonate, methyl salicylate và acid jasmonic

Từ những yêu cầu đó và được sự phân công của Bộ môn Công nghệ Sinh học dưới sự hướng dẫn của TS Trần Thị Lệ Minh và KS Trịnh Thị Phi Ly, chúng tôi tiến hành đề tài: “Kích thích sự gia tăng tinh dầu, menthol và menthone trong cây Bạc hà

Châu Âu (Mentha piperita L.) bằng các chất điều hòa sinh trưởng”

1.2 Yêu cầu của đề tài

Khảo sát ảnh hưởng của các loại hóa chất gồm IAA, GA3 lên khả năng sinh trưởng, hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone của cây Bạc hà

1.3 Nội dung thực hiện

- Khảo sát ảnh hưởng của IAA và GA3 lên khả năng sinh trưởng của cây Bạc hà

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây Bạc hà

Loài : Mentha piperita

Hình 2.1 Bạc hà Châu Âu (Mentha piperita L.)

Hình do tác giả chụp tại vườn trồng

Bạc hà gồm nhiều chủng loại khác nhau: Bạc hà Âu, Á, húng lũi, húng dổi, húng láng, húng quế Hiện nay Bạc hà được phân theo 2 nhóm lớn:

- Nhóm Bạc hà và tinh dầu Bạc hà Âu (có tên khoa học là Mentha piperita L.): Bạc hà Âu là kết quả của sự lai tạp từ 3 loài khác nhau (Mentha sylves, Mentha

rotundifolia và Mentha aquatica) do đó dễ bị tác động của ngoại cảnh

- Nhóm Bạc hà Á (Bạc hà Nhật có tên khoa học là Mentha arvensis L.) Nhóm

Bạc hà này chiếm sản lượng chủ yếu cũng là nguồn chủ yếu cung cấp menthol cho toàn thế giới

Trong nhóm Bạc hà châu Âu có 2 dạng là :

¾ Dạng thân tím: lá có gân tím, dài, đỉnh hơi nhăn, xổ răng cưa, mang chút ít lông Thân có viền tím đỏ, hoa ra ở chóp cành và trên đầu cây, có màu đỏ nâu Lá khô chứa tới 2,5% tinh dầu, hàm lượng menthol chiếm từ 48 - 68% Loại này cần ít dinh dưỡng, sản xuất nhiều tại Bungari và một số nước châu Âu Trên thế giới được biết với tên Bạc hà đen, tiếng Anh là Black mint rất phổ biến trên thế giới, có tên khoa học là

Mentha piperita var officinalis forma rubescens Camus

¾ Dạng thân xanh: lá dài có gân xanh, hầu như hoàn toàn nhẵn, có xẻ răng cưa sâu, đỉnh ngọn có vẻ nhiều lông, thân màu xanh, hoa trắng Tinh dầu thơm mát, chất lượng tốt, đòi hỏi dinh dưỡng cao hơn Bạc hà tím nhưng năng suất thấp hơn Thế

giới thường biết với tên Bạc hà trắng do có tên tiếng Anh là White mint, có tên khoa

học là Mentha piperita var officinalis palles-cens Camus

Theo Chu Thị Thơm và ctv (2006), trong nhóm Bạc hà châu Á (Bạc hà Nhật) cũng có 2 dạng tím và xanh Chất lượng tinh dầu không cao nhưng hàm lượng menthol lớn chiếm đến 70 – 90%

2.1.2 Nguồn gốc

Trên thế giới có hai loại cây Bạc hà cho hai loại tinh dầu khác nhau: Bạc hà châu

Âu và Bạc hà Châu Á Bạc hà châu Âu có hàm lượng menthol là 45 - 70%, còn Bạc hà

Châu Á là 70 - 90% và trong sản xuất, trong thương mại Mentha piperita L được gọi

là Bạc hà Âu và Mentha arvensis L gọi là Bạc hà Châu Á (hay gọi là Bạc hà Nhật) Bạc hà Châu Á (Mentha arvensis L.): trồng nhiều ở Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn

Độ, Brazil Ở Việt Nam, Bạc hà Châu Á mọc hoang nhiều ở Việt Bắc (Lào Cai, Sơn

La, Lai Châu) được di thực về đồng bằng để trồng trọt nhưng không phát triển Nhiều chủng có năng suất cao hơn như: Bạc hà 974, 975, 976 và Bạc hà Đài Loan Riêng chủng loài 974 được trồng nhiều ở cả 2 miền Nam Bắc vì chủng này có ưu điểm: chịu hạn, chịu rét, chịu sâu bệnh (Nguyễn Khang và Phạm Văn Khiển, 2001)

Bạc hà châu Âu (Mentha piperita L.): nguồn gốc của loài Bạc hà này được coi là

nước Anh - vùng Mitsam, vì trước đây khoảng một trăm năm vùng Mitsam đã trồng và

từ đó lan tràn phần lớn ra các nước khác Đây là giống lai nhưng vẫn giữ nguyên được tính chất từ thế kỷ XIX đến nay Hiện nay, Bạc hà Châu Âu được trồng nhiều ở Anh, Pháp, Mỹ, Australia (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

2.1.3 Đặc điểm thực vật học

Rễ: cấu tạo từ thân ngầm dưới đất Phân bố lớp đất 30 – 40 cm phân nhánh như

rễ phụ, từ các đốt ngầm mọc thân kí sinh Thân ngầm không chứa nhiều tinh dầu, khi

bộ phận khí sinh tàn lụi, thân ngầm vẫn sống qua đông Mùa xuân ấm áp tiếp tục phát triển thành rễ và cho cây Bạc hà mới Khi cây và rễ mới hình thành xong, thân ngầm

cũ héo và chết Tuy cây Bạc hà có thời kỳ sinh trưởng 1 năm, song sinh trưởng của thân ngầm và thân ký sinh lệch pha nhau

Thân ngầm: nằm sâu 3 – 7 cm, không có thời kỳ ngủ nghỉ rõ rệt, thời kỳ ngừng

tạm thời vào tháng 11 Thân ngầm là đối tượng nhân giống và giữ cho tỉ lệ sống sót cao nhất

Thân: thân chính và cành cấp I, II, … tạo thành bộ khung tán cây Giữa thân

chính và tán tạo thành hình dạng chóp nón cho cây Bạc hà Tán càng lớn sản lượng càng cao Thân thảo, tiết diện hình vuông, sinh sản bằng phân nhánh ở phần gốc thân ngay trên hoặc dưới mặt đất Nếu mọc ở gốc thân trên mặt đất tạo thành dải bò màu tím có mang lá Tại các phần đốt sát đất sinh các bó rễ con giữ chặt dải thân với đất Tại các dải thân nơi không tiếp xúc với đất mọc lên các cành thẳng mang lá Trong điều kiện thuận lợi, những nhánh nhỏ phát triển thành bụi rậm gồm những thân chính cao khoảng 80 – 100 cm và nhiều cành

Lá Bạc hà: lá là cơ quan dinh dưỡng quan trọng nhất làm nhiệm vụ quang hợp,

hô hấp, thoát hơi nước và mang tinh dầu Lá là nguyên liệu chính để cất tinh dầu Chiếm 40 – 50 % khối lượng khí sinh, tùy chủng lượng tinh dầu biến đổi từ 2 – 6 %

Lá đơn, mọc đối chéo chữ thập, cuống lá ngắn, lá hình trứng màu xanh thẫm có thể đỏ tím, xẻ răng cưa không đều, dài từ 3 - 6 cm, rộng 1,5 - 3 cm Hai phía mặt lá là túi tinh dầu, mặt trên số lượng nhiều hơn mặt dưới Qua giải phẫu hình thái lá thấy có 2 loại lớp lông đặc biệt: lông thẳng nhọn gồm 3 – 4 tế bào gọi là lông che chở (lông đa bào)

và lông ngắn hơn, tù, có tinh dầu gọi là lông tiết tinh dầu (túi dầu) Cấu tạo một túi dầu gồm 9 tế bào, một tế bào đáy, còn 8 tế bào xếp tròn trên đáy tạo thành một khoang trống Khi chứa đầy tinh dầu thì có màng phủ căng và dễ dàng bị vỡ dưới tác động cơ giới Do đó khi thu hoạch phải thu hoạch đúng lúc và tránh tác động bên ngoài để giảm năng suất tinh dầu thu hoạch được Tế bào tiết tinh dầu trên lá tăng từ đầu lá đến cuống

lá và từ mép lá vào giữa lá Số lượng tùy thuộc vào giống và môi trường trồng trọt

Hoa: cụm hoa bồng hình chóp Trên hoa có cuống ngắn, 5 đài cánh hợp lại tạo

thành chuông Mặt ngoài đài hoa có lông bao phủ Hoa ở Việt Nam và một số nước khác không kết hạt Ở Liên Xô và một số cơ sở nghiên cứu trên thế giới, bằng phương pháp đa bội thể đã làm cho hoa Bạc hà kết hạt Quả Bạc hà là quả bế 4 ngăn, hạt bé có trọng lượng: 1000 hạt nặng 0,065 gam (Đỗ Tất Lợi, 1987; Chu Thị Thơm, 2006)

2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Cây Bạc hà có các thời kỳ sinh trưởng: thời kỳ mọc mầm, thời kỳ phân cành, thời

kỳ làm nụ và thời kỳ nở hoa

Thời kì mọc mầm: thời kỳ này được xác định từ khi cây con mọc đến khi định

rõ hàng trồng, quá trình mọc khoảng 10 – 15 ngày Trong thời kỳ này, thân cây tạo thành các rễ phụ và bộ rễ phát triển mạnh Để Bạc hà ra rễ và nẩy mầm tốt cần chú ý

đến độ ẩm của đất, thiếu ẩm nhiều mầm không đâm thủng mặt đất để mọc lên và làm cho bộ rễ không phát triển được

Thời kì phân cành: nhờ bộ rễ của mình cây mới mọc lên phát triển nhanh về

chiều cao, các mầm nách bắt đầu phát triển cành lá mới Quá trình phân cành theo trình tự sau: trước tiên là những mầm ở đôi lá dưới gốc, vì thân chính tiếp tục phát triển, những cành càng lên gần ngọn càng ra muộn hơn và ngắn hơn Cung cấp không

đủ độ ẩm, dinh dưỡng, nhiệt độ và ánh sáng sẽ ảnh hưởng đến quá trình phát triển và sản phẩm của cây Bạc hà

Thời kì làm nụ: thời kỳ này lá mới không hình thành nữa, thay vào đó ở các

đỉnh sinh trưởng xuất hiện mầm của hoa tự bông Thân và lá tiếp tục lớn lên về kích thước, trọng lượng và tỷ lệ tinh dầu cũng tăng lên Thời kỳ này khoảng 10 – 15 ngày

Thời kỳ hoa nở: nở hoa bắt đầu khi các hoa ở đầu cành (Bạc hà Châu Âu) và hoa

ở cành chính mở ra, theo thứ tự mà chúng sinh ra (Bạc hà Châu Á) Ở thời kỳ này, cây Bạc hà đạt khối lượng chất xanh lớn nhất và hàm lượng tinh dầu cao nhất (Nguyễn Năng Vinh và Trần Thu, 1966)

2.1.5 Điều kiện sinh thái

Nhiệt độ: Sinh trưởng ở nhiệt độ 18 – 25°C; thời kỳ nụ và ra hoa 28 – 30°C Giai

đoạn ngừng sinh trưởng (ngủ nghỉ) có thể chịu nhiệt độ –10°C Cây con nhạy cảm với nhiệt độ thấp và chết ở nhiệt độ từ –7 đến –8°C Thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng của Bạc hà từ 80 – 200 ngày, tùy thuộc vào nhiệt độ: nếu điều kiện nhiệt độ trung bình/ngày mà thấp và kết hợp với điều kiện ngày ngắn cây sẽ không ra hoa (mùa xuân) Nhiệt độ trung bình ngày đêm cao, cây nở hoa càng nhanh

Ẩm độ: Bộ rễ Bạc hà phân bố nông và kém phát triển, sức hút và giữ nước kém,

mẫn cảm với hạn hán, gặp hạn liên tục sẽ bị thất thu Suốt thời kì sinh trưởng nếu độ

ẩm cao Bạc hà đạt tới năng suất chất xanh cực đại, nhưng hàm lượng tinh dầu lại giảm Cần chú ý trước khi thu hoạch 7 – 10 ngày cần làm giảm độ ẩm đất < 50% có tác dụng làm giảm chất xanh tăng tỷ lệ tinh dầu trong lá

Ánh sáng: Bạc hà là cây trồng ngày dài, ưa ánh sáng và phát triển tốt Để phát

triển bình thường cây yêu cầu ánh sáng ban ngày khoảng bằng hoặc hơn 12 giờ Càng lên phía Bắc thời gian sinh trưởng cây Bạc hà càng ngắn lại do thời gian chiếu sáng trong ngày dài hơn Điều kiện ngày dài (14 – 16 giờ) cây chuyển từ sinh trưởng sinh dưỡng sang sinh thực và nở hoa Thời gian sinh trưởng từ nụ đến hoa kéo dài 34 – 40

ngày và nở hoa sớm Thời gian chiếu sáng từ 8 – 10 giờ làm cây không chuyển giai đoạn được, cành gốc trở thành thân ngầm, năng suất chất xanh giảm, tỷ lệ thân ngầm tăng lên Tóm lại, yêu cầu của Bạc hà với ánh sáng là cao, nên khi trồng Bạc hà cần chú ý chế độ ánh sáng hợp lý cho cây, không nên trồng xen khi có sự cạnh tranh về ánh sáng Trồng quá dầy thiếu ánh sáng làm rụng lá, năng suất chất xanh và tinh dầu giảm Ngoài ra 2 yếu tố nhiệt độ và độ dài ngày có tác dụng ảnh hưởng tổng hợp đến hình thái bên ngoài của cây và sự khác nhau trong cụm hoa

Đất đai và dinh dưỡng: Bạc hà ưa đất xốp, có thành phần cơ giới nhẹ, giàu dinh

dưỡng, thoát và giữ hơi nước tốt Các loại đất phù sa ven sông, đất đen, đất có tầng canh tác dày, mực nước ngầm thấp…đều phù hợp với sinh trưởng của Bạc hà Các loại đất không có cấu tượng dễ bị hạn, đất sét nặng làm Bạc hà ung bí, đất cát giữ ẩm kém cũng không thích hợp Yêu cầu đất có độ pH = 6 – 7,5 Đất trồng Bạc hà cần cày bừa

kỹ, bón phân đầy đủ, nhất là đạm, lân và có điều kiện chủ động tưới tiêu tốt Không nên trồng Bạc hà liên canh 2, 3 năm, vì như vậy sâu bệnh sẽ phát triển mạnh, năng suất giảm rõ rệt Cần chú ý hàm lượng kali trong đất quá cao sẽ thúc đẩy quá trình oxy hóa khử làm giảm tích lũy tinh dầu, giảm năng suất(Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

2.1.6 Thời vụ

Ở Việt Nam cũng như các nước khác trên thế giới, trồng Bạc hà vào vụ xuân, thu hoạch vào tháng nóng nhất trong năm Vùng đồng bằng, trung du Bắc bộ: Vụ sớm (trồng 1/12 đến 15/1 thu 3 đợt tháng 5, 8, 11) Vụ chính (trồng 15/1 đến 15/2 thu 3 đợt tháng 6, 9, 12) Vụ muộn (trồng 15/2 đến 15/3 thu 3 đợt tháng 6, 9, 12) Vùng núi Bắc bộ: Trồng 5/3 – 20/4 thu hoạch tháng 7 và tháng 10 Vùng núi khu Bốn (cũ) trồng sớm 1/1 – 10/2 Vùng ngập nước, ven sông, đất bãi cắt 2 lứa trong năm tháng 5, 10 Các tỉnh phía nam trồng tháng 11, 12 Thời vụ trồng Bạc hà không khắt khe lắm, Bạc hà là cây chịu rét tốt, nên tranh thủ trồng sớm để cây có thời gian sinh trưởng dài cho năng suất cao (110 ngày sinh trưởng) Trồng muộn cây có thời gian sinh trưởng ngắn (80 – 90 ngày) nên năng suất thấp (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

2.1.7 Công dụng và giá trị kinh tế

2.1.7.1 Công dụng

Cây Bạc hà, tinh dầu và hoạt chất menthol trong cây Bạc hà được người ta chú ý

và sử dụng với nhiều cách khác nhau Lá Bạc hà giúp cho tiêu hóa, trừ co thắt, trị nôn Các flavonoid có tác dụng lợi mật Dạng dùng là chè thuốc Trong y học cổ truyền

người ta dùng Bạc hà làm thuốc chữa cảm nóng, nhức đầu, ho, viêm khí quản, mụn nhọt, lở ngứa Tinh dầu Bạc hà là thành phần của cao Sao Vàng và các cao, dầu xoa khác để chữa cảm lạnh, nhức đầu, chóng mặt, say tàu xe,… Nó còn là chất thơm dùng trong công nghiệp thuốc lá, thuốc đánh răng, kẹo, mỹ phẩm,…

Menthol có tính sát khuẩn, tiếp xúc với da gây cảm giác mát và tê tại chỗ (do hiện tượng bay hơi) Thuốc bôi chữa đau răng (có tên là thuốc lỏng Bonain) gồm có một phần menthol, một phần phenol và một phần cocain Nhu cầu hàng năm trong nước khoảng 50 tấn tinh dầu (Nguyễn Khang và Phạm Văn Khiển, 2001)

- Y học cổ truyền cũng như tây y đều cho rằng Bạc hà có vị cay mát, làm ra mồ hôi, chữa cảm sốt, nhức đầu, sổ mũi, đau họng, khan tiếng, đầy hơi, mẫn ngứa, kích thích tiêu hóa, các bệnh đường ruột, đi ngoài, kiết lỵ, sát trùng và giảm đau

- Bạc hà là nguyên liệu công nghiệp: là hương liệu trong kỹ nghệ thực phẩm, làm thơm ngon bánh kẹo, rượu khai vị, kem đánh răng, hương liệu trong thuốc lá, các loại

nước giải khát,… thường dùng loại tinh dầu Mentha piperita có mùi thơm nhẹ, hấp

dẫn Sau chưng cất, Bạc hà còn 18 – 24% protein thô, đường 8 – 10%, lipid thô 49,55% cũng như một số acid amin không thay thế với hàm lượng tương đối, được dùng làm phân bón, làm thức ăn gia súc hay sản xuất nấu ăn

2.2 Kỹ thuật trồng Bạc hà

2.2.1 Giống và chất lượng giống Bạc hà

Bạc hà có thể trồng bằng hạt hoặc đoạn thân cành và thân ngầm Hạt thường thu được từ các cây đa bội, ở Việt Nam hạt thường phải nhập từ nước ngoài Chọn thân: có thân cành, thân dải bò và thân ngầm, để có năng suất cao nên chọn thân ngầm để trồng Ngoài ra tuổi phát dục của hom có ảnh hưởng đến năng suất và hàm lượng tinh dầu của Bạc hà Nói chung thân trắng (đoạn gốc) cho năng suất chất xanh và hàm

lượng tinh dầu cao nhất Thân ở trên mọc không đều, yếu, năng suất chất xanh và hàm lượng tinh dầu thấp (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

Chọn những thân ngầm trắng, to, khỏe và tươi ở những ruộng không bị sâu bệnh

để làm giống (Đỗ Tất Lợi, 1987)

Theo Chu Thị Thơm và ctv (2006), xử lý hom giống bằng cách chọn thân ngầm màu trắng hoặc xanh nhạt, rửa sạch, bỏ rác bẩn, chặt thành từng đoạn 10 – 20 cm, nhúng vào dung dịch CuSO4 5% trong 15 phút trước khi trồng Bảo quản hom nơi thoáng mát, chú ý tưới nhẹ Thời gian bảo quản 3 – 5 ngày

2.2.2 Cách ươm cây Bạc hà

Ươm bằng hạt: Hạt được ngâm một đêm bằng nước ấm (với tỉ lệ 2 sôi : 3 lạnh),

bỏ nước đem đi ủ bằng giấy lọc trong 24 giờ, sau đó lấy ra trộn đều với đất bột hoặc cát rồi gieo vãi lên luống Sau khi gieo xong, rắc một lớp đất mùn mỏng không quá 4

mm lên luống, lấy vồ đập nhẹ lên mặt luống, sau cùng là phủ dạ và tưới nước Được 2

- 3 tuần là cây đã mọc Sau khi cây đã mọc đều thì lấy dạ đi, bón phân, tưới nước Khi cây đã mọc cao 7-10 cm thì chọn ngày giâm mát thì nhổ cây đi trồng

Ươm bằng thân ngầm: Chọn những đoạn thân ngầm tốt, cắt thành những đoạn

có chiều dài từ 7 – 10 cm, cứ 23 – 33 cm thì đánh một rãnh, nếu trồng theo từng lỗ thì

cứ cách 23 – 27 cm đào một lỗ sâu 7 cm, mỗi lỗ trồng từ 2 - 3 hom, sau khi đã đặt hom

và lấp đất lại cho mặt luống bằng phẳng Sau khi trồng nên luôn giữ cho mặt luống luôn luôn ẩm, cây chóng mọc Cây mọc được 10 – 13 cm thì có thể nhổ cây khỏi vườn ươm mang trồng ở vườn trồng

Ươm bằng thân, cành: Chọn những thân, cành bánh tẻ để trồng Cắt đoạn dài

10 cm, đặt sâu 2/3, mỗi cây cũng như mỗi hàng cách nhau 5 - 7cm, trồng xong phải che phủ cho giữ ẩm; sau khi trồng được 2 - 3 tuần thì mầm cây đã mọc, mọc cao 10 –

13 cm thì có thể nhổ khỏi vườn ươm (Lê Thị Nhàn, 2009)

Mật độ trồng: cần trồng với mật độ dày hợp lý để năng suất tinh dầu cao nhất

2, 3 phân chuồng bón rải trên mặt luống

Yêu cầu về đạm: là cây lấy thân lá nên cần đạm để tăng cường khối lượng chất xanh, tăng năng suất tinh dầu Đạm bón đủ làm kéo dài thời gian sinh trưởng, tăng chiều cao cây, số cành, lá và trọng lượng lá Có thể nói đạm là yếu tố tăng sản lớn nhất Lượng thích hợp 250 – 300 kg/ha

Yêu cầu về lân: hiệu quả gần bằng đạm, làm tăng cường chuyển hóa tích lũy chất hữu cơ, 300 – 400 kg/ha

Yêu cầu về kali: cẩn thận trọng khi bón kali, vì tuy làm tăng năng suất chất xanh song làm giảm năng suất tinh dầu, khoảng 400 kg/ha

2.2.5 Chăm sóc Bạc hà

Tưới tiêu cho cây: Sau khi trồng cần tưới nước cho cây mỗi lần 2 lần để hom giống tươi, các nốt rễ phát triển mạnh và mầm mau mọc sớm.Trong quá trình sinh trưởng nếu hạn cần tười nước, nếu úng phải kịp thời tháo nước không để quá 24 giờ Bạc hà sẽ rụng lá mất năng suất Trước thu hoạch 2 tuần, cần để hạn có tác dụng giảm khối lượng chất xanh và tăng tỷ lệ tinh dầu

Tỉa: chỉ tiến hành sau lứa cắt thứ nhất và thứ hai Sau khi cắt lứa 1, 2 nhặt bớt thân ngầm dày đặc, sửa lại luống để Bạc hà lứa sau bớt dày mà sinh trưởng tốt hơn Trừ cỏ: là khâu quan trọng nhất trong sản xuất Bạc hà lấy tinh dầu, phải làm cỏ sau mỗi lứa cắt Trước khi thu hoạch cần nhổ cỏ để Bạc hà không lẫn cỏ khi đem khi đem chưng cất

2.2.6 Phòng trừ sâu bệnh cho Bạc hà

Sâu hại Bạc hà: có sâu xám thường cắn ngnag cây, lá non sâu đa thực phá hoại từ tháng 10, 11 đến tháng 4, 5 năm sau; sâu đo, sâu xanh, sâu khoang, bọ nhấy, rệp, sâu đục thân và nhện Các loại thuốc phòng trừ: Moniter 0,1 – 0,2%; Bi58 0,2 – 0,3%,

Bệnh rỉ sắt Bạc hà: xuất hiện vào cuối mùa xuân, đầu mùa hè (nhiệt độ khoảng

22 – 24oC) Biểu hiện bệnh là những đốm vàng trên lá, gây rụng lá, làm giảm sản lượng đến 50% Biện pháp phòng trừ: dùng lưu huỳnh, vôi và nước tỷ lệ 0,5 – 0,5 –

200 phun 300 – 400 lít/ha Phun Selinon 1% có hiệu lực cao nhất

Bệnh phấn trắng: xuất hiện tháng 4, 5 Phòng trừ: phun Karathane WD 3, 4 lần 1kg/500 lít nước cho 1 ha Khi có bệnh giảm bón đạm tăng cường bón lân

Bệnh đốm vàng: xuất hiện vào mùa hè, lá có những đốm tròn, nâu thẫm, phòng trừ như bệnh rỉ sắt

Bệnh thối thân ngầm: làm lá úa vàng, cây cằn cỗi, héo, giảm năng suất

Bệnh đốm lá: do nấm hại từ giai đoạn cây ra nụ nở hoa, làm rụng lá, điều kiện ẩm

độ và nhiệt độ tăng bệnh hại nặng Cách phòng trừ: dùng Boócđô 0,1% phun 800 –

1000 lít/ha có thể diệt triệt để

Để phòng trừ chung cho Bạc hà cần chú ý:

- Không lấy giống Bạc hà ở ruộng bị bệnh, ruộng bị bệnh phải nhổ cây đem đốt

- Không trồng trên ruộng đã bị bệnh hai năm

- Trước khi trồng phải rửa sạch, xử lý bằng CuSO4 0,5%

- Thường xuyên luân canh để hạn chế sâu bệnh

Trước khi thu hoạch 20 ngày không phun thuốc làm ảnh hưởng đến phẩm chất tinh dầu (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

2.2.7 Thu hoạch Bạc hà

Để Bạc hà cho năng suất tinh dầu cao cần thu hoạch đúng thời vụ, đúng lúc và chưng cất đúng quy cách Cần dựa vào:

- Tình trạng cây: hoa bắt đầu nở hay cây ngừng sinh trưởng, lá chuyển sang màu

xanh thẫm, mặt trên bóng, các lá già có hiện tượng rụng sinh lý là có thể thu hoạch

- Tỷ lệ ra hoa: bắt đầu thu hoạch khi có 30% hoa nở và kết thúc khi có 70% hoa nở

- Thời tiết, đất đai: lúc trời nắng ấm, nhiệt độ cao, nhiều ánh sáng, đất khô ráo

Nên thu hái vào khoảng thời gian 8 – 15 giờ, tốt nhất là 8 – 9 giờ hàng ngày

Sau khi thu hoạch Bạc hà, có thể đem chưng cất ngay hay để héo 20 – 30% độ ẩm

để tăng trọng tải nồi chưng cất Không nên chất đống sau khi thu hoạch sẽ làm nhiệt

độ tăng cao, men hoạt động làm tinh dầu có mùi hôi phẩm chất kém đi hoặc có thể làm tăng độ ẩm dẫn đến nấm mốc Sau khi thu hoạch cần tưới nước cho ruộng Bạc hà, làm

cỏ và chăm sóc kịp thời để vụ sau phát triển (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

2.3 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

2.3.1 Giới thiệu các chất điều hòa sinh trưởng (Nguyễn Như Khanh, 2007)

Chất điều hòa sinh trưởng nội bào thực vật còn gọi là phytohormone, là những sản phẩm bình thường của quá trình sống ở thực vật được tham gia vào điều khiển quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành mới các cơ quan ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây có mặt cùng lúc nhiều phytohormone khác nhau với những tỷ lệ khác nhau

Đặc điểm quan trọng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là với một hàm lượng rất ít nó có thể gây nên những tác động lớn làm thay đổi những đặc trưng về hình thái sinh lý của thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình điều khiển sinh trưởng, phát triển của cây Nói một cách khác, hầu như tất cả các quá trình hoạt động của cây đều có sự tham gia của các chất điều hòa sinh trưởng Tùy thuộc vào từng loại chất điều hòa sinh trưởng mà chúng có thể tham gia vào các quá trình như: điều khiển quá trình ra lá, phát chồi, tăng trưởng chiều cao, đường kính cây; điều khiển quá trình ra hoa, đậu quả (chính vụ và trái vụ); điều khiển quá trình ra rễ, cành giâm, cành chiết; quá trình bảo quản hoa, quả; quá trình già của các bộ phận trên cây

Hiện có 3 con đường thu nhận các chất điều hòa sinh trưởng:

¾ Chiết xuất từ thực vật: các chất điều hòa sinh trưởng đều có mặt trong các bộ

phận của cây trồng nhưng ở nồng độ rất thấp do vậy con đường chiết xuất từ thực vật

có hiệu suất thu hồi thấp, giá thành cao nên trong thực tế phương pháp này ít được thực hiện

¾ Thu nhận bằng con đường lên men vi sinh vật: sẽ thu được chất điều hòa sinh

trưởng nổi tiếng và mang lại nhiều ứng dụng nhất là gibberellin Phương pháp: bằng

kỹ thuật lên men, các nhà khoa học đã nuôi cấy nấm Fusarium moniliforme, trong quá

trình phát triển loại nấm này sẽ tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng gibberellin

và tiết vào môi trường lên men Bằng kỹ thuật tách chiết, gibberellin sẽ được tách khỏi dịch nuôi cấy và kết tinh dưới dạng tinh thể màu trắng

¾ Thu nhận bằng con đường hóa học: sẽ thu được nhiều chất điều hòa sinh

trưởng như: nhóm chất auxin, etylen,… đây là con đường sản xuất kinh tế nhất

Phytohormone điều tiết quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật đã được

khẳng định là: auxin, gibberellin, cytokinine, acid abscisic và ethylene

2.3.2 Vai trò của auxin

Auxin là một hợp chất tương đối đơn giản, có nhân indole, có công thức nguyên là: C10H9O2N, tên của nó là indol- β-acetic acid (IAA)

Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm và cả ở vi khuẩn Ở thực vật bậc cao IAA được tổng hợp chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn và từ đó được vận chuyển xuống dưới với vận tốc 0,5 - 1,5 cm/h Sự vận chuyển của auxin trong cây có tính chất phân cực rất nghiêm ngặt, tức là chỉ vận chuyển theo hướng gốc

Chính vì vậy mà càng xa đỉnh ngọn, hàm lượng auxin càng giảm dần tạo nên một gradient nồng độ giảm dần của auxin từ đỉnh ngọn xuống gốc của cây Ngoài đỉnh ngọn ra auxin còn được tổng hợp ở các cơ quan còn non khác như lá non, quả non, phôi hạt đang sinh trưởng, mô phân sinh tầng phát sinh Quá trình tổng hợp auxin xảy

ra thường xuyên và mạnh mẽ ở trong cây dưới xúc tác của các enzyme đặc hiệu IAA

là loại auxin phổ biến trong cây, được tổng hợp từ tryptophan bằng con đường khử amin, cacboxyl và oxy hóa

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tuỳ thuộc vào nồng độ và các sự hỗ tương qua lại của chúng với các chất điều hoà khác

2.3.2.1 Auxin hoạt động trong sự kéo dài tế bào

Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào ở ngọn chồi Sự kéo dài tế bào là một quá trình phức tạp, kết hợp nhiều hiện tượng: hấp thu nước; dãn dài vách với sức trương; đặt các hợp chất mới của vách giữa các mạng vi sợi cellulose, sinh tổng hợp protein và các chất khác

Vai trò của auxin là gây nên sự giảm pH của thành tế bào bằng cách hoạt hóa bơm proton (H+) nằm trên màng ngoại chất Khi có mặt của auxin thì bơm proton hoạt động và bơm H+ vào thành tế bào làm giảm pH và hoạt hóa enzyme xúc tác cắt đứt các cầu nối ngang của các polysaccaride Enzyme tham gia vào quá trình này là pectinmetylesterase khi hoạt động sẽ metyl hóa các nhóm cacboxyl và ngăn chặn cầu nối ion giữa nhóm cacboxyl với canxi để tạo nên pectate canxi, do đó mà các sợi cenlulose tách rời nhau

Hình 2.2 Tác động của auxin làm giãn tế bào

2.3.2.2 Auxin hoạt động trong sự phân chia tế bào

- Kích thích sự phân chia tế bào tượng tầng: Auxin kích thích rất mạnh sự phân

chia tế bào tượng tầng (tầng phát sinh libe - mộc), nhưng hầu như không tác động trên

mô phân sinh sơ cấp Như vậy, auxin tác động trên sự tăng trưởng theo đường kính Ở nồng độ cao, auxin kích thích sự tạo mô sẹo từ các tế bào sống nhờ vào chất

“histogene” (là chất tạo ra nhiều tế bào giống nhau hoàn toàn) Đây là đặc tính tốt được áp dụng trong nuôi cấy tế bào

- Phân hóa mô dẫn: auxin kích thích phân chia của tượng tầng, đồng thời giúp sự

phân hóa của các mô dẫn (libe và mạch mộc) Auxin có khả năng cảm ứng trực tiếp sự phân hóa tế bào nhu mô thành các tổ chức mô dẫn

2.3.2.3 Auxin hoạt động trong sự phát sinh hình thái (rễ, chồi, quả)

- Kích thích phát triển chồi: auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng

chồi non và khởi phát sự tạo mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô Tuy nhiên, ở nổng độ cao, auxin cản sự phát triển của phát thể chồi vừa thành lập hay chồi nách (các chồi bây giờ vào trạng thái tiềm sinh)

- Auxin gây hiện tượng ưu thế ngọn: hiện tượng ưu thế ngọn là một hiện tượng

phổ biến ở trong cây Khi chồi ngọn hoặc rễ chính sinh trưởng sẽ ức chế sinh trưởng của chồi bên và rễ bên Ðây là một sự ức chế tương quan vì khi loại trừ ưu thế ngọn bằng cách cắt chồi ngọn và rễ chính thì cành bên và rễ bên được giải phóng khỏi ức chế và lập tức sinh trưởng Hiện tượng này được giải thích rằng auxin được tổng hợp chủ yếu ở ngọn chính và vận chuyển xuống dưới làm cho các chồi bên tích luỹ nhiều auxin nên ức chế sinh trưởng Khi cắt ngọn chính, lượng auxin tích lũy trong chồi bên giảm sẽ kích thích chồi bên sinh trưởng

- Kích thích phát triển rễ: auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phát

thể non của rễ), nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi này Đặc tính này được ứng dụng phổ biến trong giâm cành Sự hình thành rễ phụ trong giâm cành có thể chia làm

3 giai đoạn: giai đoạn đầu là phản phân hoá tế bào trước tầng phát sinh, tiếp theo là xuất hiện mầm rễ và cuối cùng mầm rễ sinh trưởng thành rễ phụ chọc thủng vỏ và ra ngoài Giai đoạn đầu cần hàm lượng auxin cao, giai đoạn rễ sinh trưởng cần ít auxin và

có khi không cần có auxin

- Kích thích sự hình thành, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt: tế

bào trứng sau khi thụ tinh tạo nên hợp tử và sau phát triển thành phôi Phôi hạt là nguồn tổng hợp auxin nội sinh quan trọng, khuyếch tán vào bầu và kích thích sự sinh trưởng của bầu để hình thành quả Vì vậy, quả chỉ được hình thành khi có sự thụ tinh Nếu không có quá trình thụ tinh thì không hình thành phôi và hoa sẽ bị rụng Việc xử

lý auxin ngoại sinh cho hoa sẽ thay thế được nguồn auxin nội sinh vốn được hình thành trong phôi và do đó không cần quá trình thụ phấn thụ tinh nhưng bầu vẫn lớn lên thành quả nhờ auxin ngoại sinh Trong trường hợp này quả không qua thụ tinh và do

đó không có hạt

- Kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả của cây: Auxin ức chế sự hình thành tầng rời ở

cuống lá, hoa, quả vốn được cảm ứng bởi các chất ức chế sinh trưởng Vì vậy phun

auxin ngoại sinh có thể giảm sự rụng lá, tăng sự đậu quả và hạn chế rụng nụ, quả non

làm tăng năng suất Cây tổng hợp đủ lượng auxin sẽ ức chế sự rụng hoa, quả, lá 2.3.3 Vai trò của gibberellin

Gibberellin là những terpenoid, được cấu tạo từ 4 đơn vị isoprene (C5):

CH2=C(CH3)-CH=CH2 Các đơn vị này ít nhiều bị biến đổi trong phân tử gibberellin Theo lý thuyết, các gibberellin có 20C, nhưng nhiều chất chỉ còn 19C (do một –CH3 bị oxi hóa thành –COOH, và nhóm này được khử carboxyl)

Acid mevalonic (C6), có nguồn gốc từ acetyl CoA trong con đường hô hấp, là chất khởi đầu của các sinh tổng hợp terpenoid Từ acid mevalonic, các isoprene được thành lập và kết hợp nhau qua nhiều giai đoạn để cho kaurene (C20), sản phẩm chuyên biệt đầu tiên trong con đường sinh tổng hợp gibberellin Mọi chất có hoạt tính gibberellin đều có nhân gibberellan, khởi đầu là GA12-aldehyde Tóm lại, các giai đoạn chính của con đường sinh tổng hợp các gibberellin là: acetyl CoA Æ acid mevalonic

Æ kaurene Æ GA12-aldehyde Æ các GA… Trong số các gibberellin, GA1 là chất chính kích thích sự kéo dài thân ở thực vật Gibberellic acid (GA3) được sản sinh từ

nấm Gibberella fujikuroi là gibberellin được xác định cấu trúc đầu tiên và là

gibberellin quan trọng nhất và được nghiên cứu nhiều nhất

Gibberellin được tổng hợp trong phôi đang sinh trưởng, trong các cơ quan đang sinh trưởng khác như lá non, rễ non, quả non và trong tế bào thì được tổng hợp mạnh ở trong lục lạp Gibberellin vận chuyển không phân cực, có thể hướng ngọn và hướng gốc tùy nơi sử dụng Gibberellin được vận chuyển trong hệ thống mạch dẫn với vận tốc từ 5 - 25 mm trong 12 giờ Gibberellin ở trong cây cũng tồn tại ở dạng tự do và dạng liên kết như auxin, chúng có thể liên kết với glucose và protein

2.3.3.1 Sự kéo dài tế bào của gibberellin

Gibberellin kiểm soát hướng đặt các vi sợi cellulose (vừa mới được tổng hợp nhờ cellulose synthetase) trong vách tế bào, hướng đặt này lại do hướng đặt của các vi ống

ở ngoại vi tế bào quyết định Gibberellin cảm ứng sự đặt các vi ống theo hướng ngang

ở nhiều kiểu tế bào (kể cả các tế bào mà gibberelin không kích thích sự kéo dài) Tuy nhiên, sự phối hợp hoạt động giữa gibberelin và auxin trong sự đặt các vi ống chưa được biết

Gibberelin hạ thấp nồng độ Ca2+ trong vách, và do đó giúp sự kéo dãn vách, vì

Ca2+ cản sự kéo dãn vách ở dicot (không cản ở monocot) Trong hoạt động này, vách

tế bào không bị acid hoá bởi gibberellin (khác với hoạt động nhanh của auxin) Gibberellin cản hoạt động của các peroxidase vách tế bào, do đó làm chậm sự hoá cứng của vách, hiện tượng do sự tạo lignin dưới tác dụng của các peroxidase

2.3.3.2 Sự kéo dài thân của gibberellin

Hiệu quả sinh lý rõ rệt nhất của gibberellin là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dài của thân, sự vươn dài của lóng Hiệu quả này có được là do của gibberellin kích thích mạnh lên pha giãn của tế bào theo chiều dọc Vì vậy khi xử lý của gibberellin cho cây đã làm tăng nhanh sự sinh trưởng dinh dưỡng nên làm tăng sinh khối của cây Dưới tác động của gibberellin làm cho thân cây tăng chiều cao rất mạnh (đậu xanh, đậu tương thành dây leo, cây đay cao gấp 2 - 3 lần) Nó không những kích thích sự sinh trưởng mà còn thúc đẩy sự phân chia tế bào

2.3.3.3 Sự kéo dài lóng và tăng trưởng lá của gibberellin

Kích thích sự kéo dài lóng, vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia tế bào thân, là đặc tính nổi bật của gibberellin Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào nhu

mô vỏ và biểu bì Xử lý gibberellin làm tăng năng suất mía cây và đường (do kích thích sự kéo dài lóng) Gibberellin liều cao (hay phối hợp với cytokinine) kích thích mạnh sự tăng trưởng lá (diện tích có thể gấp đôi bình thường)

2.3.3.4 Sự nảy mầm, nảy chồi của gibberellin

Gibberellin kích thích sự nảy mầm, nảy chồi của các mầm ngủ, của hạt và củ, do

đó nó có tác dụng trong việc phá bỏ trạng thái ngủ nghĩ của chúng Hàm lượng gibberellin thường tăng lên lúc chồi cây, củ, căn hành hết thời kỳ nghỉ, lúc hạt nảy mầm Trong trường hợp này của gibberellin kích thích sự tổng hợp của các enzyme amilaza và các enzyme thuỷ phân khác như protease, photphatase và làm tăng hoạt tính của các enzyme này, vì vậy mà xúc tiến quá trình phân hủy tinh bột thành đường cũng như phân hủy các polime thành monome khác, tạo điều kiện về nguyên liệu và năng lượng cho quá trình nảy mầm Trên cơ sở đó, nếu xử lý gibberellin ngoại sinh thì

có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt, củ, căn hành kể cả trạng thái nghỉ sâu

2.3.3.5 Sự ra hoa, quả nhờ gibberellin

Trong nhiều trường hợp của gibberellin kích thích sự ra hoa rõ rệt Ảnh hưởng đặc trưng của sự ra hoa của gibberellin là kích thích sự sinh trưởng kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa Ngoài ra, gibberellin kích thích cây ngày dài ra hoa trong điều kiện ngày ngắn

Gibberellin ảnh hưởng đến sự phân hóa giới tính của hoa, ức chế sự phát triển hoa cái và kích thích sự phát triển hoa đực Gibberellin có tác dụng giống auxin là làm tăng kích thước của quả và tạo quả không hạt Hiệu quả này rõ rệt khi phối hợp tác

có mùi thơm đặc biệt và vị cay mát

Với tinh dầu Bạc hà giàu menthol (trên 70%), có thể chiết xuất một phần menthol, tinh dầu còn lại vẫn đạt tiêu chuẩn dược điển Nguyên tắc chiết xuất là làm lạnh tinh dầu từ nhiệt độ 14oC rồi đến 10oC, 5oC Nên để tinh dầu ở mỗi mức độ lạnh thấp dần từ 1 đến 2 lần, mỗi lần 1 – 2 ngày Khi thấy menthol không kết tinh thêm, mới đưa xuống nhiệt độ lạnh hơn Lọc menthol phải được tiến hành ở nhiệt độ thấp Menthol thu được đem rửa nhiều lần bằng nước lạnh để lọai hết tinh dầu còn dính lại Cần tập trung nước rửa này để thu hồi tinh dầu Hong khô tự nhiên menthol trên khay

ở nhiệt độ 25 – 26oC Menthol thu được đạt tiêu chuẩn dược điển Việt Nam (Lê Ngọc Thạch, 2003)

2.4.2 Thành phần hóa học trong tinh dầu Bạc hà

Thành phần hóa học trong tinh dầu Châu Âu bao gồm: menthol (30 – 50%),

menthone (20 – 35%), menthyl acetate (4 – 10%), menthofuran (2 – 10%), α-pinene,

β-pinene, camphene, limonene, pulegone, piperitone, cineol, isomenthol, neomenthol, octanol,… (Lê Ngọc Thạch, 2003)

Theo Mahmoud và Croteau (2001), Bạc hà đã được phát triển như một hệ thống

mô hình cho việc nghiên cứu sự trao đổi chất monoterpene Tinh dầu Bạc hà là phức hợp các chất hóa học và con đường sinh tổng hợp hàng đầu tạo ra menthol là thành phần chính monoterpene Bao gồm một loạt các phản ứng đặc trưng cho quá trình trao đổi chất terpenoid Con đường sinh tổng hợp monoterpene được thể hiện trong sơ đồ hình 2.4

Điều kiện tiên quyết cơ bản cho chất lượng tốt nhất của tinh dầu Bạc hà là ít nhất 45% menthol và 15 - 18% menthone và isomenthone Trong khi nồng độ của

menthofuran không mong muốn thấp hơn 1,5% Menthol, menthone và isomenthol, isomenthone, menthylacetate, isomenthone xảy ra chủ yếu trong lá, trong khi menthofuran giảm trong lá tại giai đoạn ra hoa và tăng nhanh trong những bông hoa

Về năng suất, trung bình sản lượng dầu 65 - 80 kg/ha là cần thiết (Maffei, 1994) Theo Voirin và cộng sự (1990), trong giai đoạn ngắn ngày, menthofuran là monoterpene chính trong tất cả các lá, trong khi menthone của tinh dầu Bạc hà có mặt với tỷ lệ phần trăm rất thấp

Hình 2.4 Con đường sinh tổng hợp monoterpene trong cây Bạc hà

(Mahmoud và Croteau, 2001)

2.5 PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT HƠI NƯỚC

Phương pháp chưng cất hơi nước dựa trên sự khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao Người ta chia các phương pháp chưng cất hơi nước làm ba loại chính: chưng cất bằng nước, chưng cất bằng nước và hơi nước, chưng cất bằng hơi nước Cả ba loại này đều có lý thuyết giống nhau chỉ khác nhau ở cách thực hiện

2.5.1 Phương pháp chưng cất bằng nước

Cho nước phủ kín nguyên liệu, nhưng phải chừa một khoảng không gian tương đối lớn phía bên trên lớp nước để tránh khi nước sôi mạnh làm văng chất nạp qua hệ thống hoàn lưu Nhiệt cung cấp có thể đun trực tiếp bằng củi lửa hoặc đun bằng hơi nước dẫn từ nồi hơi vào (sử dụng bình có hai lớp đáy) Trong trường hợp chất nạp quá mịn lắng chặt xuống đáy nồi gây hiện tượng cháy khét nguyên liệu ở mặt tiếp xúc với đáy nồi, lúc đó nồi phải trang bị những cánh khuấy trộn đều bên trong suốt thời gian chưng cất

Sự chưng cất này thường không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy giải Những nguyên liệu xốp và rời rạc thích hợp cho phương pháp này Những cấu phần có nhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi với lượng lớn nước phủ đầy, khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những hợp chất này Vì thế người ta chỉ dùng phương pháp này khi không thể sử dụng các phương pháp khác

2.5.2 Phương pháp chưng cất bằng nước và hơi nước

Nguyên liệu được xếp trên một vỉ đục lỗ và nồi cất được đổ nước sao cho nước không chạm đến vỉ Nhiệt cung cấp có thể là ngọn lửa đốt trực tiếp hoặc dùng hơi nước

từ nồi hơi dẫn vào lớp bao chung quanh phần đáy nồi Ta có thể coi phương pháp này là một trường hợp điển hình của phương pháp chưng cất bằng hơi nước với hơi nước ở áp suất thường Như vậy chất ngưng tụ sẽ chứa ít sản phẩm phân hủy hơn trường hợp chưng cất bằng hơi nước trực tiếp, nhất là ở áp suất cao hay hơi nước quá nhiệt Việc chuẩn bị nguyên liệu trong trường hợp này quan trọng hơn nhiều so với phương pháp trước, vì hơi nước tiếp xúc với chất nạp chỉ bằng cách xuyên qua nó nên phải sắp xếp thế nào cho chất nạp tiếp xúc tối đa với hơi nước thì mới có kết quả tốt Muốn vậy thì chất nạp nên có kích thước đồng đều không sai biệt nhau quá

Nếu chất nạp được nghiền quá mịn, nó dễ tụ lại vón cục và chỉ cho hơi nước đi qua một vài khe nhỏ do hơi nước tự phá xuyên lên Như vậy phần lớn chất nạp sẽ không được tiếp xúc với hơi nước Ngoài ra, luồng hơi nước đầu tiên mang tinh dầu có thể bị ngưng tụ và tinh dầu rơi ngược lại vào lớp nước nóng bên dưới gây hư hỏng thất thoát Do đó việc chuẩn bị chất nạp cần được quan tâm nghiêm túc và đòi hỏi kinh nghiệm tạo kích thước chất nạp cho từng loại nguyên liệu Tốc độ chưng cất trong trường hợp này không quan trọng như trong trường hợp chưng cất bằng hơi nước Tuy nhiên tốc độ nhanh sẽ có lợi vì ngăn được tình trạng quá ướt của chất nạp và gia tăng vận tốc chưng cất Về sản lượng tinh dầu mỗi giờ, người ta thấy nó khá hơn phương pháp chưng cất bằng nước nhưng vẫn còn kém hơn phương pháp chưng cất hơi nước

So với phương pháp chưng cất bằng nước, ưu điểm là ít tạo ra sản phẩm phân hủy Do đó dù với thiết bị loại nào đi nữa thì ta phải đảm bảo là chỉ có phần đáy nồi được phép đốt nóng và giữ cho phần vỉ chứa chất nạp không tiếp xúc với nước sôi Phương pháp này cũng tốn ít nhiên liệu, tuy nhiên nó không thể áp dụng cho những nguyên liệu dễ bị vón cục

Khuyết điểm chính của phương pháp là do thực hiện ở áp suất thường nên những cấu phần có nhiệt độ sôi cao sẽ đòi hỏi một lượng rất lớn hơi nước để hóa hơi hoàn toàn và như thế sẽ tốn rất nhiều thời gian Về kỹ thuật, khi xong một lần chưng cất, nước ở bên dưới vỉ phải được thay thế để tránh cho mẻ sản phẩm sau có mùi lạ

2.5.3 Phương pháp chưng cất bằng hơi nước

Hơi nước tạo ra từ nồi hơi thường có áp suất cao hơn không khí được đưa thẳng vào bình chưng cất Trong kỹ nghệ ngày nay, phương pháp này thường dùng để chưng cất tinh dầu từ các nguyên liệu thực vật Điểm ưu việt của phương pháp này là người

ta có thể điều chỉnh áp suất, nhiệt độ như mong muốn để tận thu sản phẩm, nhưng phải giữ nhiệt độ ở mức giới hạn để tinh dầu không bị phân hủy

Việc sử dụng phương pháp này cũng lệ thuộc vào những điều kiện hạn chế như

đã trình bày đối với hai phương pháp chưng cất trên cộng thêm 2 yếu tố nữa là yêu cầu hơi nước không quá nóng và quá ẩm Nếu quá nóng nó có thể phân hủy những cấu phần có nhiệt độ sôi thấp, hoặc làm chất nạp khô quăn khiến hiện tượng thẩm thấu không xảy ra Do đó trong thực hành nếu dòng chảy của tinh dầu ngưng lại sớm quá, người ta phải chưng cất tiếp bằng hơi nước bão hòa trong một thời gian cho đến khi sự khuếch tán hơi nước được tái lập lại, khi đó mới tiếp tục dùng lại hơi nước quá nhiệt