KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BA, IBA VÀ NAA ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI VÀ RA RỄ CỦA BA GIỐNG HOA ĐỒNG TIỀN IN VITRO

Với các chất điều hòa sinh trưởng BA, IBA, NAA là các chất điều hòa sinh trưởng được ứng dụng rộng rãi trong nuôi cấy in vitro, đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA, IBA và NAA đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

TP Hồ Chí Minh, tháng 08/2013

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BA, IBA VÀ NAA ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI VÀ RA RỄ CỦA BA

GIỐNG HOA ĐỒNG TIỀN IN VITRO

Tác giả

LÊ THỊ KIỀU LOAN

Khóa luận tốt nghiệp được đệ trình để đáp ứng yêu cầu

cấp bằng Kỹ sư ngành Nông học

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN:

TS PHẠM THỊ MINH TÂM ThS LÊ NGUYỄN LAN THANH

TP Hồ Chí Minh, tháng 08/2013

LỜI CẢM ƠN

Để đi hết quãng đường 4 năm đại học và hoàn thành khóa luận này, đó không

chỉ là sự cố gắng của bản thân tôi mà còn có sự dạy dỗ tận tình của thầy cô, sự giúp đỡ

của bạn bè và công ơn nuôi dưỡng của cha mẹ, sự động viên của anh chị em trong gia

đình

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến chị

Lê Nguyễn Lan Thanh, các chị ở Bộ môn Hoa  Cây cảnh – Viện Cây Ăn Quả Miền

Nam đã giúp đỡ em rất nhiều từ lúc bở ngỡ bước chân vào phòng thí nghiệm cho đến

hôm nay TS Phạm Thị Minh Tâm, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và bảo ban

em trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Cây Ăn Quả Miền Nam đã tạo

điều kiện tốt nhất để giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này

Xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô bộ môn Rau – Hoa – Cây lương thực, các thầy

cô khoa Nông học và trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã truyền đạt, bổ

sung kiến thức cho tôi trong suốt thời gian thực tập, tích lũy tri thức tại trường và hoàn

thành khóa luận tốt nghiệp

Cảm ơn các bạn lớp DH09NH đã luôn động viên, giúp đỡ và chia sẻ với tôi

những lúc khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài

Và lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất con xin gửi đến cha mẹ, các anh chị

TÓM TẮT

Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA, IBA và NAA đến khả năng

nhân nhanh chồi và ra rễ của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro” được tiến hành từ

tháng 3 đến tháng 7 năm 2013, tại phòng nuôi cấy mô Bộ môn hoa  cây cảnh, Viện Cây Ăn Quả Miền Nam Đề tài gồm 3 thí nghiệm đều là thí nghiệm 2 yếu tố được

bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lập lại

 Thí nghiệm 1: yếu tố A: 3 giống hoa Đồng Tiền in vitro (Sarinah, Esmara,

Violente), yếu tố B: nồng độ BA (0 mg/L; 0,5 mg/L; 1 mg/L; 1,5 mg/L; 2 mg/L) nhằm xác định nồng độ BA thích hợp cho khả năng nhân nhanh chồi

 Thí nghiệm 2: yếu tố A: 3 giống hoa Đồng Tiền in vitro (Sarinah, Esmara,

Violente), yếu tố B: môi trường MS+BA 0,5 mg/L kết hợp nồng độ IBA (0mg/L; 0,1 mg/L; 0,3 mg/L; 0,5 mg/L; 1 mg/L) nhằm xác định nồng độ IBA thích hợp để nhân nhanh và nâng cao chất lượng chồi

 Thí nghiệm 3: yếu tố A: 3 giống hoa Đồng Tiền in vitro (Sarinah, Esmara,

Violente), yếu tố B: nồng độ NAA (0 mg/L; 0,5 mg/L; 1 mg/L; 1,5 mg/L; 2 mg/L) thích hợp cho tạo rễ của ba giống hoa Đồng Tiền

Kết quả đạt được như sau:

 Môi trường MS + BA 0,5 mg/L là môi trường thích hợp nhất cho nhân

nhanh chồi ba giống hoa Đồng Tiền in vitro thí nghiệm

 Môi trường MS + BA 0,5 mg/L + IBA 0,3 mg/L là môi trường thích hợp để nhân nhanh và nâng cao chất lượng chồi hai giống hoa Đồng Tiền Sarinah và Violente

 Môi trường MS/2 + NAA 1 mg/L cho tỷ lệ ra rễ cao, số rễ nhiều, dài, màu trắng thích hợp cho việc ra cây ngoài vườn ươm đối với giống Sarinah

MỤC LỤC

Trang

Trang tự………i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục iv

Danh sách chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình……… viii

Chương 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích – Yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.2.3 Giới hạn đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 3

2.1 Giới thiệu tổng quan về cây hoa Đồng Tiền 3

2.1.1 Nguồn gốc, phân bố 3

2.2 Tình hình sản xuất, tiêu thụ hoa Đồng Tiền ở Việt Nam 4

2.3.2 Một số nghiên cứu nuôi cấy mô hoa Đồng Tiền 14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………16

3.1 Nội dung nghiên cứu 16

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

3.3 Vật liệu nghiên cứu 16

3.3.1 Giống 16

3.3.2 Thiết bị và dụng cụ 16

3.4 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi của ba

giống hoa Đồng Tiền in vitro 18

3.4.1 Phương pháp thí nghiệm 18

3.4.2 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi 20

3.5 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng nhân nhanh chồi của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro 20

3.5.1 Phương pháp thí nghiệm 20

3.5.2 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi 22

3.6 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro 22

3.6.1 Phương pháp thí nghiệm 22

3.6.2 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi 23

3.7 Phương pháp xử lý và thống kê số liệu 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro 25

4.2 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng nhân nhanh chồi của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro 40

4.3 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro 54

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

5.1 Kết luận 64

5.2 Đề nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

PHỤ LỤC 68

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến thời gian ra chồi của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro 23 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến hệ số nhân chồi của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro qua các giai đoạn 24 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến số lá của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro qua các

giai đoạn 28

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến chiều cao cụm chồi của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro sau 35 ngày nuôi cấy 31

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến trọng lượng cụm chồi của ba giống hoa Đồng Tiền

in vitro sau 35 ngày nuôi cấy 32 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến chất lượng chồi của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro sau 35 ngày nuôi cấy 33

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến thời gian hình thành chồi của ba giống Đồng Tiền

in vitro 36 Bảng 4.8: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến hệ số nhân chồi của ba giống Đồng Tiền in vitro

qua các giai đoạn 37

Bảng 4.9: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến số lá của ba giống ba Đồng Tiền in vitro qua các

giai đoạn 40

Bảng 4.10: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến chiều cao cụm chồi của ba giống Đồng Tiền in vitro 35 ngày sau cấy 44 Bảng 4.11: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến trọng lượng cụm chồi của ba giống Đồng Tiền in vitro 35 ngày sau cấy 45 Bảng 4.12: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến chất lượng chồi của ba giống Đồng Tiền in vitro

35 ngày sau cấy 46 Bảng 4.13: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến thời gian hình thành rễ của ba giống Đồng Tiền

in vitro 49 Bảng 4.14: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tỷ lệ ra rễ của ba giống Đồng Tiền in vitro qua

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh của ba giống hoa

Đồng Tiền in vitro sau 35 NSC………39

Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng nhân nhanh chồi của ba giống

Đồng Tiền in vitro 35 NSC……… 53

Hình 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của ba giống hoa Đồng

Tiền in vitro 28 NSC………63

Tuy nhiên, diện tích trồng hoa Đồng Tiền trong cả nước còn thấp, hoa Đồng Tiền được trồng chủ yếu ở một số địa phương như: Đà Lạt, Hải Phòng, Hà Nội, Thành Phố

Hồ Chí Minh, chất lượng hoa của một số vùng còn yếu, chưa đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao của người dân Đồng bằng sông Cửu Long là vùng đất phát triển, người dân có nhu cầu cao về hoa tươi đặc biệt là dip lễ, tết Việc thiếu giống tốt, không chủ động được giống cây, phải nhập giống cũng như hoa thương phẩm từ Đà Lạt hoặc nhập khẩu từ Trung Quốc dẫn đến giá hoa thương phẩm và chi phí sản xuất cao Bên cạnh đó với điều kiện trồng trọt ở vùng nhiệt đới, hoa Đồng Tiền thường nhiễm bệnh nhất là nấm nên các giống hoa Đồng Tiền dễ bị thoái giống là những nguyên nhân cản trở một số làng hoa (làng hoa Sa Đéc, Tân Mỹ Chánh, Mỹ Phong…) ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long phát triển việc trồng hoa Đồng Tiền

Đứng trước tình hình đó, để nâng cao chất lượng hoa, sản xuất đồng loạt, giảm chi phí sản xuất thì việc tạo được cây con khỏe mạnh, đồng đều, chất lượng hoa cao

bằng phương pháp nhân giống vô tính in vitro cho vùng Đồng bằng sông Cửu Long là

điều cần thiết Tuy nhiên sự thành công của phương pháp này phụ thuộc vào nhiều yếu

tố, một trong những yếu tố quan trọng đó là việc tìm được nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho nuôi cấy Với các chất điều hòa sinh trưởng BA, IBA, NAA là các

chất điều hòa sinh trưởng được ứng dụng rộng rãi trong nuôi cấy in vitro, đề tài: “Khảo

sát ảnh hưởng của nồng độ BA, IBA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi và ra rễ của

ba giống hoa Đồng Tiền in vitro” được thực hiện nhằm xác định nồng độ BA, IBA,

NAA thích hợp để góp phần khắc phục những nhược điểm cũng như đáp ứng yêu cầu nhanh chóng về cây giống hoa Đồng Tiền hiện nay của vùng Đồng bằng sông Cửu Long

1.2 Mục đích – Yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Xác định nồng độ BA, IBA, NAA thích hợp cho khả năng nhân nhanh, nâng

cao chất lượng chồi và khả năng rễ của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro

1.2.2 Yêu cầu

- Theo dõi khả năng tái sinh chồi và sự sinh trưởng, phát triển của chồi qua các chỉ tiêu: thời gian hình thành chồi, hệ số nhân chồi, chiều cao chồi, số lá và trọng lượng cụm chồi

- Theo dõi khả năng tạo rễ khi bổ sung NAA qua các chỉ tiêu: thời gian hình thành rễ, số rễ, chiều dài rễ và tỷ lệ ra rễ

1.2.3 Giới hạn đề tài

Do thời gian thực hiện đề tài ngắn, nên chỉ khảo sát giai đoạn nhân nhanh chồi

và tái sinh cây hoàn chỉnh

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu tổng quan về cây hoa Đồng Tiền

2.1.1 Nguồn gốc, phân bố

Hoa Đồng Tiền có tên khoa học là Gerbera jamesonii Hoa Đồng Tiền gồm nhiều

loài thuộc chi Gerbera Chi này có khoảng 30-100 loài sống hoang dã, phân bố ở Nam

Mỹ, Châu Phi đại lục, Madagascar và vùng nhiệt đới Châu Á Chi Gerbera rất phổ biến

và được trồng tại vườn chủ yếu là các giống lai giữa Gerbera jamesonii và một loài khác

ở Nam Phi là Gerbera hybrida Hiện nay, hoa Đồng Tiền tồn tại hàng trăm giống khác

nhau trên thế giới ( Đặng Văn Bông, Đinh Thế Lộc, 2003)

2.1.2 Đặc điểm

Hoa Đồng Tiền thuộc loại hoa lưu niên ra hoa quanh năm, độ bền hoa cắt cao, được coi là một loài hoa đẹp trong thế giới hoa Dựa vào hình thái hoa, người ta chia thành 3 nhóm: hoa đơn, hoa kép và hoa đơn nhị kép

 Nhóm 1  hoa đơn: hoa chỉ có một hoặc hai tầng cánh, xếp xen kẽ nhau tạo

vòng tròn Hoa mỏng và yếu hơn hoa kép, màu sắc hoa ít hơn, điển hình là màu trắng,

đỏ, tím, hồng

 Nhóm 2  hoa kép: cành hoa to, gồm hơn hai tầng cánh, bông to, đường

kính hoa có thể đạt tới 12 - 15 cm, cánh hoa tụ lại thành bông nằm ở đầu trục chính, cuống dài 40 - 60 cm Màu sắc đa dạng như màu trắng, đỏ, vàng, hồng, màu gạch cua

 Nhóm 3  hoa đơn nhị kép: bên ngoài cùng cánh đơn, bên trong cánh kép

dày đặc, thường màu trắng trong lớp cánh kép màu cánh sen nhưng nhóm này không đẹp bằng hoa kép

Theo Đặng Văn Bông, Đinh Thế Lộc (2003), hoa Đồng Tiền có các đặc điểm:

* Đặc điểm hình thái

 Thân, lá: thân ngầm, không phân cành, chỉ đẻ nhánh, có chiều cao từ 45 –

63 cm, có khoảng 10 lá trên một cây Lá và hoa phát triển từ thân cây, lá mọc chếch một góc so với mặt đất một góc 15 – 45 0 , hình dáng lá thay đổi theo sinh trưởng của cây (từ hình trứng thuôn đến thuôn dài); lá dài 15 – 25 cm, rộng 5 – 8 cm, có hình lông chim, xẻ thùy nông hoặc sâu (tùy thuộc vào từng loại giống), mặt thân của lá có lớp lông nhung

 Rễ: thuộc dạng rễ chùm, hình ống, phát triển khỏe, ăn ngang và nối với một phần trên mặt đất, vươn dài tương ứng với diện tích lá tỏa ra

 Hoa: hoa là dạng hoa tự đơn hình đầu và bông hoa được tạo bởi hai loại cánh hoa hình lưỡi và hình ống Cánh hình lưỡi lớn hơn, xếp thành một vòng hoặc một vài vòng phía ngoài; cánh hình ống nhỏ hơn, do sự thay đổi hình thái và màu sắc nên được gọi là mắt hoa hoặc tâm hoa Trong quá trình hoa nở, cánh hoa hình lưỡi nở trước, cánh hoa hình ống nở sau theo thứ tự từ ngoài vào trong theo từng vòng một Cụm hoa đầu có bề ngoài dường như là một bông hoa, trên thực tế là một tập hợp của hàng trăm hoa nhỏ riệng biệt Tùy theo từng giống mà phân cấp theo chiều dài cành và kích thước đường kính hoa

* Đặc điểm sinh thái

Hoa Đồng Tiền được trồng hiện nay đều thích hợp ở khoảng nhiệt độ từ 15 

25 0 C, tuy nhiên có một số giống chịu được nhiệt độ cao hơn 30  34 0

C Nếu nhiệt độ nhỏ hơn 12 0 C hoặc lớn hơn 35 0 C, cây phát triển kém, màu sắc hoa nhợt nhạt, chất lượng hoa xấu Ẩm độ đất từ 60  70%, độ ẩm không khí 55  65% thuận lợi cho hoa

Đồng Tiền sinh trưởng, phát triển

2.2 Tình hình sản xuất, tiêu thụ hoa Đồng Tiền ở Việt Nam

* Tình hình sản xuất

Hoa Đồng Tiền là một trong mười loại hoa quan trọng nhất trên thế giới, sau hoa Hồng, Cúc, Lan, Cẩm Chướng, Lay Ơn

Ở Việt Nam giống hoa Đồng Tiền đơn được nhập về trồng đầu tiên khoảng từ những năm 1940 Đặc điểm của giống hoa đơn này là cây sinh trưởng khỏe, thích nghi tốt với điều kiện tự nhiên, nhưng nhược điểm là hoa nhỏ, cánh đơn, màu sắc đơn điệu, vì vậy hiện nay người ta ít trồng Từ những năm 1990, một vài công ty và những nhà trồng hoa Việt Nam bắt đầu nhập các giống Đồng Tiền lai (hoa kép) từ Đài Loan, Hà Lan, Trung Quốc về trồng Các giống này tỏ ra có nhiều ưu điểm: hoa to, cánh dày, gồm nhiều tầng xếp lại với nhau, màu sắc phong phú, hình dáng hoa cân đối, rất đẹp, năng suất cao Vì vậy, những giống này đã được tiếp nhận và phát triển mạnh mẽ ở khắp mọi vùng, mọi tỉnh thành trên cả nước

Trong các loại hoa Đồng Tiền đã và đang trồng tại Việt Nam thì hoa Đồng Tiền kép nhập nội là một trong những cây cho hiệu quả kinh tế cao nhất Từ một sào hoa Đồng Tiền giống mới chăm sóc đúng kỹ thuật có thể cho thu nhập gần 50 triệu/sào/năm (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

* Tình hình tiêu thụ

Hiện nay, hoa Đồng Tiền là loài hoa rất được ưu chuộng với giá cả phải chăng Nhưng tình trạng sản xuất hoa Đồng Tiền của Việt Nam (cũng như các sản phẩm cây cảnh khác) khó xâm nhập vào thị trường thế giới Vì chất lượng, chủng loại, kích cỡ không đồng đều, chưa đáp ứng được thị hiếu của khách hàng quốc tế

Sự chênh lệch về giá cả giữa thị trường hoa Việt Nam và thị trường hoa thế giới cũng thể hiện rõ Ở hoa Đồng Tiền, khi bán tại ruộng giá dao động từ 500  1.500 đồng/ bông, bán trên thị trường giá trong khoảng từ 1.500  2.500 đồng/bông (tùy theo mùa, dịp lễ mà giá bông khác nhau) Trong khi đó, giá bán hoa Đồng Tiền tại Mỹ là 20.000- 25.000 đồng/bông (Nguyễn Văn Hồng, 2009)

Trước tình hình đó, để nâng cao chất lượng hoa, sản xuất đồng loạt, nâng cao giá bán thì việc tạo được cây con khỏe mạnh, đồng đều, chất lượng cao là điều cấp bách

Trong các phương pháp nhân giống thì phương pháp nhân giống vô tính in vitro tỏ ra

hiệu quả đáp ứng được các nhu cầu trên Do đó phương pháp này đang được ứng dụng mạnh mẽ trong việc nhân giống hoa Đồng Tiền

2.3 Một số nghiên cứu về nuôi cấy mô hoa Đồng Tiền

2.3.1 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.1.1 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Dương Công Kiên (2002), có một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật:

 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chóp đỉnh và chồi bên) sau khi vô trùng mẫu và được nuôi cấy trên môi trường thích hợp Môi trường thích hợp thay đổi theo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cấy, nhưng cơ bản môi trường chứa đầy đủ chất dinh dưỡng gồm các nguyên tố đa lượng, vi lượng và được bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp

Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Sau đó, chồi tiếp tục phát triển vươn ra thân, lá, rễ trở thành một cây hoàn chỉnh

Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được áp dụng với những cây trồng quan trọng như: Khoai tây, Thuốc lá, Lily….Một số cây thân gỗ như anh đào, mâm xôi, nho…

 Nuôi cấy mô sẹo (Callus)

Trong điều kiện sự cân bằng các chất kích thích sinh trưởng trong thực vật thay đổi, cụ thể trong tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra nuôi cấy riêng lẻ trên môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành Mô sẹo là một khối tế bào phát triển

vô tổ chức và có màu trắng Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị

tế bào soma lại cao hơn

Lần đầu tiên, năm 1939 callus được nuôi cấy từ rễ Cà rốt do Gautheret thực hiện Ngày nay, người ta có thể kích thích tạo callus từ bất cứ cơ quan nào, mô nào của cây, song mức độ dễ dàng tạo callus không phụ thuộc vào loài và mô cấy

 Nuôi cấy tế bào đơn

Khi mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành cụm

tế bào mô sẹo Khi trên môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin – auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

 Nuôi cấy protoplast

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast

có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành

mô sẹo Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội

1.3.1.2 Các giai đoạn trong nhân giống in vitro

Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), các giai đoạn trong nhân giống in vitro bao

gồm các giai đoạn:

* Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cấy

Mẫu cấy là mảnh thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy Để tiến

hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý của

cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu đó Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và

khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, sodium dichloroisocyanurate, clorua thủy ngân…

* Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu cấy

Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hoá sâu Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi

* Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ số nhân,

ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokynin, Gibberellin…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

* Giai đoạn 4: Tạo cây con hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường ra rễ Thường sau 2-3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này các chất IAA; IBA; NAA; 2,4-D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi

* Giai đoạn 5: Đưa cây con ra đất

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong

thực tiễn sản xuất Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị

dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất

2.3.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy

* Mẫu nuôi cấy

Mẫu thường được dùng là các mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định sẽ tát sinh tốt hơn mô già hay mô thành thục

Mẫu cấy thích hợp cho nuôi cấy mô phải có mô phân sinh hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn thể (Dương Công Kiên, 2002)

* Môi trường nuôi cấy

Công thức môi trường nuôi cấy phổ biến là MS (Murashige và Skoog, 1962) thích hợp cho phần lớn các loại cây trồng Để hình thành chồi nách, thường yêu cầu nồng độ tương đối thấp của auxin và cytokinin Để phát triển chồi bất định cần nồng

độ cao cytokinin và thêm một lượng auxin thích hợp Để tạo mô sẹo cần nồng độ cao auxin kết hợp với nồng độ thấp cytokinin Sự lựa chọn môi trường đặc hay lỏng cũng quan trọng do yêu cầu của từng loại cây trồng Có thể sử dụng môi trường lỏng trên máy lắc khoảng 30 vòng/phút hay không lắc (Dương Công Kiên, 2002)

* Đường

Trong nuôi cấy in vitro, đường là nguồn carbon để cho mô, tế bào thực vật tổng

hợp các chất hữu cơ và qua đó các tế bào phân chia, tăng sinh khối Hai loại đường thường được sử dụng là saccharose và D-glucose (Trần Văn Minh, 2005)

* Ánh sáng

Nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng hấp thu đóng vai trò quan trọng trong tạo

hình nuôi cấy in vitro Việc nuôi cấy tốt nhất trong điều kiện ánh sáng khoảng 1000 lux Trong giai đoạn chuẩn bị cây in vitro trước khi đem trồng ngoài vườn ươm thì cần

cường độ ánh sáng tăng khoảng 3000 đến 10.000 lux (Dương Công Kiên, 2002)

* Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây nuôi cấy Mỗi loại cây trồng có nhiệt độ tối ưu cho sự tạo hình, hầu hết thích hợp ở nhiệt độ từ

20 - 27 0 C khi nuôi cấy

2.3.1.4 Những vấn đề thường gặp trong nhân giống in vitro

Theo Dương Công Kiên (2002), trong nuôi cấy mô tồn tại những vấn đề:

* Tính bất định về mặt di truyền

Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh trưởng Tần số biến dị thường khác nhau và không lặp lại Việc nuôi cấy mô sẹo tế bào đơn thường tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Tần số biến dị xảy

ra còn phụ thuộc vào các yếu tố:

Có hai tác nhân làm hư mẫu nuôi cấy in vitro là bị vi sinh vật xâm nhập mẫu

trước khi cấy vào môi trường hoặc bị virus xâm nhiễm, tuy không hại mẫu nhưng có ảnh hưởng về sau Tuy nhiên, có sự xâm nhiễm của vi sinh vật như Agrobacterium, Bacillus và Pseudomonas vào nhu mô dẫn truyền sẽ hại mẫu khi tế bào bắt đầu phân chia Để làm giảm tác nhân lây nhiễm, sử dụng mẫu cấy là mô phân sinh đỉnh do ở đó

tế bào nhu mô chưa xảy ra quá trình biệt hóa

* Việc sản xuất chất gây độc từ mẫu cấy

Hiện tượng hóa nâu hay hóa đen mẫu là hiện tượng thường thấy trong nuôi cấy

in vitro, sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay làm hư mẫu Hiện tượng này là do mẫu

nuôi cấy có chứa nhiều chất tannin hay hydroxyphenol có nhiều trong mô già hơn mô non

Than hoạt tính được đưa vào môi trường để hấp thu hoạt chất phenol, ngăn chặn quá trình hóa nâu hay đen mẫu Hoặc dùng polyvinylpyrolidone, một hợp chất thuộc loại polyamide Có nhiều phương pháp làm giảm sự hóa nâu được đề nghị và được nhiều nhà khoa học đồng ý như:

- Sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô non

- Gây ít vết thương trên mẫu khi khử trùng

- Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid và citric acid vài giờ trước khi cấy

- Nuôi cấy trong môi trường lỏng, O 2 thấp, không có đèn 1- 2 tuần

Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng thấp sang môi trường

có nồng độ cao hơn

* Sử dụng thuốc kháng sinh

Có nhiều loại thuốc kháng sinh được sử dụng trong nuôi cấy mô, nhằm hạn chế

sự hại mẫu của vi sinh vật như: penicillin, rifambicin, vancomycin,…Mô thực vật rất nhạy cảm với tác động của kháng sinh và phản ứng khác nhau lên gen, do đó cần cẩn thận trong khi sử dụng

* Hiện tượng thuỷ tinh thể

Hiện tượng này có đặc điểm là thân, lá phồng to, chứa nhiều nước, cây có dạng trong Đây là một dạng bệnh lý thường thấy khi cây được nuôi trên môi trường mà việc trao đổi khí giữa cây và môi trường bên ngoài bị ngưng lại, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây

Qua quá trình nghiên cứu, có một số phương pháp làm giảm quá trình hóa thủy tinh thể như sau:

- Giảm sự tăng hấp thu nước của cây bằng cách tăng nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy và dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao

- Giảm sự gây vết thương trên mẫu cấy qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi trường cấy ít nhất

- Giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy

- Giảm khí ethylene trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng cường ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy

2.3.1.5 Một số chất điều hòa sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những hợp chất hữu cơ khác với những chất dinh dưỡng, với một hàm lượng nhỏ kích thích, ức chế hoặc bổ sung bất kì một quá trình sinh lý nào trong thực vật Chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sẽ thể hiện tác động kích thích ở nồng độ thấp và tăng dần đến ảnh hưởng tối đa Khi nồng độ vượt qua mức kích thích tối đa sẽ gây ảnh hưởng ức chế (Nguyễn Minh Chơn, 2004) Mặc dù chúng không tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất, nhưng có tác dụng đến quá trình sinh trưởng phát triển của cây

* Auxin

Auxin là một chất có nhân Idol, có công thức hóa học là C 10 H 9 O 2 N Auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol acetic acid (IAA) IAA có dẫn xuất là naphthyl acetic acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxyl acetic acid (2,4-D) NAA được Went và Thimann phát hiện năm 1937 và là một auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA Trong cây IAA tập trung nhiều trong các mô non (chồi, lá đang phát triển), trong hạt được hình thành, trong hạt nảy mầm (Trịnh Xuân Vũ và ctv, 1976)

 Tác động sinh lý của auxin:

- Có vai trò điều hòa quan trọng trong việc kìm hãm sự phát triển của chồi bên (duy trì hiện tượng ưu thế ngọn)

- Gây tính hướng động của cây (hướng quang và hướng địa)

- Kích thích quá trình tăng trưởng nhờ tác dụng kéo giãn tế bào Sự kéo tế bào diễn ra đồng thời trên hai trục (trục ngang và trục dọc) Nhờ vào tác dụng này mà auxin giúp tăng diện tích lá, tăng đường kính và chiều dài cành, thân, rễ; làm củ, quả phình to ra

- Kích thích sự tăng trưởng của quả, ngăn ngừa hiện tượng rụng lá, quả, kích thích sự ra rễ (Nguyễn Văn Uyển, 1998)

 Ứng dụng:

 IAA kích thích sự ra rễ đặc biệt là rễ bất định trên cành giâm, cành chiết

và trên mô nuôi cấy Trong nuôi cấy mô, auxin (IBA và NAA) cũng có tác dụng tạo rễ tốt

 Để kéo dài sự chín của quả và dùng bảo quản quả lâu, sử dụng dug dịch NAA (10-20 ppm)

 Để tăng đậu quả, tăng sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt, người ta

xử lý auxin dưới dạng NAA 20 ppm; 2,4-dichlorophenoxyl acetic acid (2,4-D) 10 ppm cho một số cây trồng như cà chua, cam, chanh

 2,4 - D nồng độ cao có tác dụng diệt cỏ hại cây trồng

 2,4 - D có hiệu quả trong việc tạo mô sẹo ở nhiều loại thực vật

Vũ và ctv, 1976)

 Vai trò sinh học và ứng dụng:

- Trong giai đoạn đầu của phát sinh phôi soma, sự có mặt của auxin là rất cần thiết để kích thích sự phân bào, nhưng giai đoạn sau phôi phải được nuôi cấy trên môi trường có cytokinin để biệt hóa chồi (Vũ Văn Vụ, 1999) Cytokinin cùng auxin điều tiết chu trình tế bào, kích thích sự phân chia tế bào một cách mạnh mẽ Nếu auxin/cytokinin > 1: kích thích ra rễ; auxin/cytokinin < 1: kích thích hình thành chồi; auxin/cytokinin = 1: kích thích hình thành mô sẹo (Nguyễn Văn Uyển và cs, 1993)

- Cytokinin kích thích sự phát triển mầm hoa

- Cytokinin cảm ứng hình thành chồi cây từ mô sẹo nuôi cấy, duy trì sự trẻ hóa của các cơ quan và loại bỏ ưu thế ngọn cũng như hạn chế sự phát triển của rễ

Cytokinin được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô thực vật: TDZ (thidiazuron), BA (6-benzylaminopurine), Kinetin (6-furfuryl amino purine) và cytokinin tự nhiên trong nước dừa được ứng dụng rộng rãi trong môi trường tạo chồi

in vitro

2.3.2 Một số nghiên cứu nuôi cấy mô hoa Đồng Tiền

* Thế giới

Theo điều tra nghiên cứu về công nghệ sinh học thực vật trên thế giới ở hoa Đồng Tiền, người ta có thể sử dụng đỉnh sinh trưởng, đế hoa, lá, cuống lá, bầu nhụy, noãn,…làm mẫu cấy Việc tái sinh mẫu từ lá non là thành công nhất, khi sử dụng mẫu cấy là đỉnh sinh trưởng trải qua nhiều công đoạn để tạo ra một khối lượng sinh khối lớn

Theo kết quả của viện nghiên cứu nông nghiệp Ấn Độ, sự phát sinh cơ quan và

sự hình thành của chồi từ mô sẹo ở hoa Đồng Tiền có hệ số nhân cao Các mô sẹo này phát triển trong môi trường MS bổ sung 0,4 mg BAP/lít dung dich môi trường, 4 mg NAA/lít dung dịch môi trường và 3%succrose Có 2 loại mô sẹo được hình thành: một loại riêng rẽ và không chứa chất diệp lục tố được hình thành chủ yếu trên bề mặt vết cắt của mô nuôi cấy, và một tập hợp mô sẹo chứa chất diệp lục tố Tỉ lệ chồi tái sinh hình thành được khẳng định là có liên quan đến nồng độ chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy Khi cấy mô sẹo vào môi trường MS có bổ sung 2 mg NAA/lít dung dịch môi trường và 1 mg BAP/lít dung dịch môi trường, mô tái sinh được hình thành với tỉ lệ cao 83,3% (Trích dẫn bởi Nguyễn Thị Diễm Chi, 2010).

Theo Skoog và Miller (1958), quá trình phát triển của mô sẹo hoa Đồng Tiền cần

có cả cytokinin và auxin Mô sẹo không hình thành khi môi trường nuôi cấy chỉ chứa BAP hay chỉ chứa NAA Mô sẹo hình thành tốt nhất ở nồng độ NAA cao và BAP thấp Pierik và Segers (1973), sự hình thành mô sẹo bởi cytokinin sẽ tăng lên khi có mặt auxin trong môi trường, đặc biệt là IBA Cytokinin hiệu quả nhất là BAP Kết quả nghên cứu của Jerzy và Lubonskg (1991) cho thấy số chồi hình thành cao nhất (8-11 chồi) trong môi trường MS bổ sung có 10 mg BAP/lít dung dịch môi trường, nhưng có vài chồi yếu

và xuất hiện hiện tượng thủy tinh thể (Trích dẫn bởi Nguyễn Thị Diễm Chi, 2010)

Theo viện nghiên cứu nông nghiệp Banglaclech, trong nhân giống hoa Đồng Tiền

in vitro, những nồng độ khác nhau của các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau (IAA;

NAA; 2,4-D và kinetin) có thể sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau trong sự tái sinh chồi cũng như trong quá trình hình thành mô sẹo trên những mô cấy khác nhau của cây

hoa Đồng Tiền trong điều kiện in vitro Trong quá trình tái sinh chồi và nhân lên của

chồi thì những mẫu cấy ban đầu là đỉnh chồi hoặc rễ cây in vitro tỏ ra có hiệu quả hơn

so với các mẫu từ các mô khác của cây Ngoài ra, những mô sẹo phân chia, phát sinh

phôi khi nuôi cấy lá và cuống lá in vitro trên môi trường MS bổ sung thêm 0,4 mg 2,4

D/lít dung dịch môi trường

* Việt Nam

Tại Việt Nam, việc ứng dụng nuôi cấy mô cho cây Đồng Tiền cũng đang phát triển mạnh Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2002 ) đã phát triển quy trình nhân nhanh cây Đồng Tiền

Hiện nay, tại các trung tâm nghiên cứu hoặc những cơ sở nuôi cấy mô vừa và nhỏ trên địa bàn Đà Lạt – Lâm Đồng đã và đang phát triển mạnh mẽ phương pháp nhân giống cây trồng, nhất là những cây có giá trị cao Trong đó, hoa Đồng Tiền cũng

là một trong những giống hoa ưu tiên hàng đầu Tại những nông trại lớn có vốn đầu tư của nước ngoài như Hasfarm, Bonniefarm, nông trại tư nhân như Langbiang farm và các trung tâm nghiên cứu như Phân viện Sinh học, Trung tâm Nghiên cứu Khoai Tây,

Rau & Hoa đã bước đầu thành công và là nơi cung cấp giống hoa Đồng Tiền in vitro

Với đặc điểm vùng khí hậu của Đồng bằng sông Cửu Long là nóng ẩm, cùng theo đó nhu cầu về cây giống tại chỗ nhằm giảm giá thành cho sản xuất, việc nghiên cứu nhân những giống hoa Đồng Tiền chịu nhiệt bằng phương pháp nhân giống vô

tính in vitro để cung cấp cây con giống phù hợp cho vùng Đồng bằng sông Cửu Lòng

là cấp bách nên Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh cây Đồng Tiền đáp ứng nhu cầu của người dân nơi đây

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nội dung nghiên cứu

Đề tài gồm 3 thí nghiệm:

 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân

nhanh chồi của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro

 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng nhân

nhanh chồi của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro

 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm đã được tiến hành từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2013 (Viện Cây

Ăn Quả Miền Nam)

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Giống

Chồi in vitro của ba giống hoa Đồng Tiền (Sarinah, Esmara, Violente) 2 tháng

tuổi Kích thước chồi: Thí nghiệm 1 và 2: 0,2 x 2 cm (đường kính x chiều cao chồi) Thí nghiệm 3: 0,2 x 3 cm (đường kính x chiều cao chồi) được thu thập tại Viện Cây

Ăn Quả Miền Nam

3.3.2 Thiết bị và dụng cụ

- Phòng chuẩn bị

Dùng để pha môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, dụng cụ nuôi cấy và bảo quản dung dịch nhẹ

Phòng chuẩn bị môi trường cần một số thiết bị: tủ sấy, nồi hấp vô trùng, tủ lạnh, cân kỹ thuật, máy đo pH, ống đong pipet

- Phòng cấy vô trùng

Gồm các thiết bị: tủ cấy vô trùng, đèn UV và các dụng cụ nuôi cấy đã hấp vô trùng

- Môi trường nuôi cấy

Môi trường được sử dụng là môi trường khoáng cơ bản của Murashige và Skoog (1962) (môi trường MS) gồm các thành phần:

CaCl 2 2H 2 O MgSO 4 7H 2 O

22,3 8,6 6,2 0,83 0,25 0,025 0,025

FeSO 4 7H 2 O

37,3 27,8

Nicotinic Acid Pyridoxine-HCl Glycine

Myo-Inositol

0,1 0,5 0,5

2

100

Và môi trường MS/2 là môi trường khoáng cơ bản của Murashige và Skoog (1962) được giảm ½ nồng độ các chất thành phần

* Các chất điều hoa sinh trưởng: BA, IBA, NAA (sản phẩm của công ty hóa chất MERCK – Đức)

* Các chất khác:

Đường sucrose: 30 g/L

+ Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH 5,8

+ Môi trường được khử trùng bằng Autoclave ở nhiệt độ 121 0 C, áp suất 1 atm trong 30 phút

- Phòng nuôi cấy

Gồm các bình, chai mẫu, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, máy điều hòa nhiệt độ

- Điều kiện nuôi cấy

 Cường độ ánh sáng: 2500 - 3000 lux

 Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 26 ± 2 0

C

 Ẩm độ phòng nuôi cấy: 60 - 80%

 Thời gian chiếu sáng: 8h/ngày

3.4 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân

nhanh chồi của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro

3.4.1 Phương pháp thí nghiệm

Chọn những chồi (mẫu) có kích thước tương đồng 0,2 x cm (đường kính thân x chiều dài chồi), cắt còn lại 3 lá, cấy vào bình có chứa môi trường MS có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau

*Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm 2 yếu tố (A và B) được bố trí theo kiểu hoàn

toàn ngẫu nhiên, với 15 nghiệm thức, 3 lần lập lại

Yếu tố A: 3 giống Đồng Tiền

A 1 : Sarinah

A 2 : Esmara

A 3 : Violente Yếu tố B: nồng độ BA

*Quy mô thí nghiệm

 Số chai cho một nghiệm thức: 5 chai

 Tổng số chai thí nghiệm: 5 chai/NT x 15 NT x 3 LLL = 225 chai

 Tổng số mẫu: 3 mẫu/chai x 225 chai = 675 mẫu

3.4.2 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

- Thời gian tái sinh chồi (NSC): được tính khi có 50% số mẫu/nghiệm thức tạo thành chồi (Quy ước: mẫu được ghi nhận là chồi khi mẫu đã có sự phân hóa ổn định,

có thể phân biệt thân, lá)

- Số chồi (chồi/cụm): theo dõi định kỳ 7 ngày/lần từ ngày cấy

- Số lá (lá/cụm): theo dõi định kỳ 7 ngày/lần từ ngày cấy (Quy ước: mẫu được ghi nhận là lá phân biệt rõ cuống lá và phiến lá)

- Hệ số nhân chồi:

Hệ số nhân chồi = Σ số chồi tạo được/Σ số chồi cấy

- Chiều cao chồi trung bình (cm): đo vào ngày 35 sau cấy Dùng thước nhôm có chia milimet đã được hấp khử trùng đặt trên giấy cấy Đo chiều dài chồi từ phần thân chồi tái sinh đến chóp lá

- Trọng lượng chồi (g/cụm chồi): dùng cân điện tử đã được cách ly vô trùng cân mẫu chồi của từng nghiệm thức vào ngày thứ 35 sau cấy

+ Chồi kém (+): Chồi thấp (< 1,5 cm), ốm, xanh nhạt hoặc chồi dị dạng

3.5 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng nhân

nhanh chồi của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro

2.5.1 Phương pháp thí nghiệm

Chọn những chồi (mẫu) có kích thước tương đồng 0,2 x 2 cm (đường kính thân

x chiều dài chồi), cắt còn lại 3 lá, cấy vào bình có chứa môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/L (môi trường nền) và bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau

*Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm 2 yếu tố (A và B) đƣợc bố trí theo kiểu hoàn

toàn ngẫu nhiên, với 15 nghiệm thức, 3 lần lập lại

Yếu tố A: 3 giống Đồng Tiền

A 1 : Sarinah

A 2 : Esmara

A 3 : Violente Yếu tố B: nồng độ IBA

*Quy mô thí nghiệm

 Số chai cho một nghiệm thức: 5 chai

 Tổng số chai thí nghiệm: 5 chai/NT x 15 NT x 3 LLL x= 225 chai

 Tổng số mẫu: 3 mẫu/chai x 225 = 675 mẫu

3.5.2 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Tương tự thí nghiệm 1

3.6 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của

ba giống hoa Đồng Tiền in vitro

3.6.1 Phương pháp thí nghiệm

Chọn những chồi (mẫu) có kích thước tương đồng 0,2 x 3 cm (đường kính thân

x chiều dài chồi), có 3 lá, cấy vào bình có chứa môi trường MS/2 có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau

*Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm 2 yếu tố (A và B) được bố trí theo kiểu hoàn

toàn ngẫu nhiên, với 15 nghiệm thức, 3 lần lập lại

Yếu tố A: 3 giống Đồng Tiền

A 1 : Sarinath

A 2 : Esmara

A 3 : Violient Yếu tố B: nồng độ NAA

*Quy mô thí nghiệm

 Số chai cho một nghiệm thức: 2 chai

 Tổng số chai thí nghiệm: 2 chai/NT x 15 NT x 3 LLL = 90 chai

 Tổng số mẫu: 10 mẫu/chai x 90 = 900 mẫu

3.6.2 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

-Thời gian hình thành rễ (ngày): được tính từ khi cấy đến khi có trên 50% số mẫu ra rễ

- Tỷ lệ chồi ra rễ: Tiến hành theo dõi sau cấy định kỳ 7 ngày/lần

Tỷ lệ chồi ra rễ =  chồi ra rễ(chồi)/  chồi cấy(chồi)

- Số rễ trên cây: Tiến hành đếm số rễ của cây vào ngày thứ 28

Số rễ/cây (rễ) = Tổng số rễ ra/Tổng số cây

- Chiều dài rễ /cây (cm): đo vào ngày 28 sau cấy Dùng thước nhôm có chia milimet đã được hấp khử trùng đặt trên giấy cấy Đo chiều dài rễ từ gốc đến hết chiều dài rễ

3.7 Phương pháp xử lý và thống kê số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.1 Phân hạng các mức của từng yếu tố và phối hợp giữa hai yếu tố bằng LSD với α = 0,05 hoặc 0,01.

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi của ba giống hoa

Đồng Tiền in vitro

Tạo được số lượng chồi lớn phục vục cho công tác nhân giống là khâu quan

trọng trong nuôi cấy in vitro Để đạt được số chồi và chất lượng chồi như mong muốn

thì việc chọn môi trường nuôi cấy là yếu tố quyết định Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự phân chia của tế bào, hình thành và phân hóa các cơ quan đặc biệt

là sự phân hóa chồi giúp cây nẩy chồi sớm và số chồi hình thành trên cây nhiều (Dương Công Kiên, 2002) Tùy theo loại cây mà người ta có thể bổ sung Cytokinin vào môi trường nuôi cấy với các nồng độ khác nhau để thu được hệ số nhân chồi cao

và chất lượng chồi tốt Thí nghiệm này sử dụng BA (Cytokinin được sử dụng phổ biến

trong nuôi cấy in vitro) để nhân nhanh chồi của ba giống hoa Đồng Tiền Kết quả bước

đầu thu được:

Từ kết quả bảng 4.1 cho thấy:

Giống Sarinah có thời gian ra chồi nhanh nhất (5,67 ngày), tiếp theo là giống Esmara (5,8 ngày), giống Violente  có thời gian ra chồi chậm nhất (7,8 ngày) Khi nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung BA, thời gian ra chồi nhanh nhất (4,46 ngày) khác biệt rất có ý nghĩa thống kê với môi trường MS có bổ sung BA Môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/L có thời gian hình thành chồi lâu nhất (7,67 ngày)

Giống Sarinah khi nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung BA có thời gian hình thành chồi nhanh nhất (3 ngày), chậm nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS

bổ sung 0,5 mg/L (7 ngày) Giống Esmara có thời gian ra chồi nhanh nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung BA, chậm nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS

bổ sung BA 0,5 mg/L và 1,5 mg/L Trong khi đó giống Violente nuôi cấy trên

môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/L và 1 mg/L có thời gian hình thành chồi chậm nhất (9 ngày), nhanh nhất là khi nuôi cấy trên môi trường MS (7 ngày)

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến thời gian ra chồi của ba giống hoa Đồng

Từ kết quả bảng 4.2 cho thấy:

Sau 7 ngày sau cấy:

Giống Sarinah có hệ số nhân chồi cao nhất (1,08) khác biệt rất có ý nghĩa thống

kê với hai giống còn lại Giống Violente có hệ số nhân chồi thấp nhất (0,96) Khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA với mức nồng độ 2 mg/L thì hệ số nhân chồi cao nhất (1,07), khi nuôi cấy ở môi trường MS không bổ sung BA có hệ số nhân chồi thấp nhất (0,95)

Giai đoạn 14 ngày sau cấy:

Giống Sarinha có hệ số nhân chồi cao nhất (3,4) khác biệt rất có ý nghĩa thống

kê với hai giống còn lại Giống Violente có hệ số nhân chồi thấp nhất (1,55) Trên môi trường MS không có bổ sung BA hệ số nhân chồi thấp nhất (1,01) khác biệt rất có

ý nghĩa thống kê với khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA Khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA 2 mg/L có hệ số nhân chồi cao nhất (2,81) tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa thống kê với khi nuôi cấy trên các môi trường MS bổ sung BA 1 mg/L và 1,5 mg/L với hệ số nhân chồi là 2,78

Trong giai đoạn này giống Sarinah khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung

2 mg/L có hệ số nhân chồi cao nhất (4,51) nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê với khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 1 mg/L (4,1) và 1,5 mg/L (4,02) Cả hai giống Esmara và Violente có hệ số nhân chồi thấp nhất (1) khi nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung BA Trong khi đó giống Esmar có hệ số nhân chồi cao nhất (2,77) khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 1,5 mg/L Giống Violente có hệ

số nhân chồi cao nhất (1,89) khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 1 mg/L

Sau 21 ngày sau cấy:

Về giống, giống Sarinah có hệ số nhân chồi cao nhất (4,41) khác biệt rất có ý nghĩa thống kê đối với hai giống còn lại Ở các mức nồng độ BA, giai đoạn này nồng

độ BA ở mức 1 mg/L có hệ số nhân chồi cao nhất (3,75), thấp nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung BA (1,05)

Ở giai đoạn này đối với giống Sarinah khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung

BA 1 mg/L có hệ số nhân chồi cao nhất (5,76) khác biệt rất có ý nghĩa với khi nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung BA (1,09), nhưng không khác biệt với khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/L (5,25) và 1,5 mg/L (5,20) Với giống Esmara khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 1,5 mg/L có hệ số nhân chồi cao nhất (3,94) Trong khi đó giống Violente khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA

1 mg/L có hệ số nhân chồi cao nhất (2,22)

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến hệ số nhân chồi của ba giống hoa Đồng

Tiền in vitro qua các giai đoạn

Sau 28 ngày nuôi cấy:

Về giống, giống Sarinah có hệ số nhân chồi cao nhất (4,93) khác biệt rất có ý nghĩa thống kê đối với hai giống còn lại, giống Violente có hệ số nhân chồi thấp nhất (2,05) Hệ số nhân chôi cao nhất (4,23) khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA với nồng độ 0,5 mg/L khác biệt rất có ý nghĩa thống kê với khi nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung BA (1,05) và bổ sung BA 2 mg/L (3,69), nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê đối với các mức nồng độ BA còn lại

Giống Sarinah ở giai đoạn này khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/L có hệ số nhân chồi cao nhất (6,33) nhưng không khác biệt với khi nuôi cấy ở mức nồng độ BA 1 mg/L (6,30) và 1,5 mg/L (5,60) tuy nhiên các chồi ở các mức nồng

độ BA này nhỏ và chuyển sang màu xanh vàng Đối với giống Esmara hệ số nhân chồi

vẫn cao nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 1,5 mg/L (4,37) khác biệt

không có ý nghĩa thống kê với khi bổ sung BA 1 mg/L (4,02), 1 mg/l (3,73) và

2 mg/L (4,10), nhưng chồi ở ba nồng độ này lại ốm và vàng Giống Violente hệ số

nhân chồi vẫn cao nhất (2,49) khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung nồng độ BA

1 mg/L, thấp nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung BA (1,05)

Sau 35 ngày nuôi cấy hệ số nhân chồi tăng cao

Về giống, giống có hệ số nhân chồi cao nhất là giống Sarinah (6,11) khác biệt

rất có ý nghĩa thống kê với hai giống còn lại, thấp nhất là giống Violente (2,51) Trong

5 mức nồng độ BA, hệ số nhân chồi thấp nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS không

có bổ sung BA (1,08) Hệ số nhân chồi đạt cao nhất (5,71) khi nuôi cấy ở nồng độ BA

0,5 mg/L khác biệt rất có ý nghĩa thống kê với khi nuôi cấy trên môi trường MS không

bổ sung BA (1,08) và bổ sung BA 2 mg/L (4,43)

Giống Sarinah khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/L cho hệ

số nhân chồi cao nhất (8,51) khác biệt không có ý nghĩa thống kê với khi nuôi cấy trên

môi trường có bổ sung BA với nồng độ 1 mg/L (7,59), thấp nhất khi nuôi cấy trên môi

trường MS không bổ sung BA (1,13) Giống Esmara có hệ số nhân chồi cao nhất

(5,02) khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/L khác biệt rất có ý nghĩa

với khi nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung BA (1,03) Giống Violente có hệ

số nhân chồi thấp nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung BA (1,09)

khác biệt rất có ý nghĩa với các nghiệm thức còn lại, hệ số nhân chồi cao nhất khi nuôi

cấy trên môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/L (3,58)

Đánh giá chung:

Nồng độ BA có ảnh hưởng đến hệ số nhân chồi Qua thí nghiệm 1 cho thấy: khi

nuôi cấy ở nồng độ BA 0,5 mg/L cho hệ số nhân chồi cao nhất (5,71), hệ số nhân chồi

thấp nhất (1,08) khi nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung BA Khi nồng độ BA

vượt qua mức 0,5 mg/L thì chồi có xu hướng giảm, như vậy cứ không hẳn tăng nồng

đội BA sẽ tăng hệ số nhân chồi của chồi hoa Đồng Tiền, vượt quá ngưỡng này có thể

gây ức chế chồi hoa Đồng Tiền  chất lượng chồi không tốt, chồi hình thành dạng hoa

thị hoặc những nốt nhỏ ở cuối gốc Như vậy, nếu sử dụng nồng độ BA cao thì sẽ tạo ra

những chồi không bình thường Còn nếu sử dụng BA ở nồng độ thấp thì hiệu quả nhân chồi sẽ không cao.

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến số lá của ba giống hoa Đồng Tiền in vitro

qua các giai đoạn

Số lá (lá/cụm)

Giai đoạn

Nồng độ

BA (mg/L)

Giống

TB nồng độ

BA Sarinah Esmara Violente