XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN HAEMOPHILUS PARASUIS TRÊN HEO CAI SỮA CÓ DẤU HIỆU RỐI LOẠN HÔ HẤP

TÓM T ẮT Đề tài “Xây dựng quy trình PCR phát hiện Haemophilus parasuis trên heo cai sữa có dấu hiệu rối loạn hô hấp” được thực hiện từ tháng 02/2013 đến tháng 07/2013 tại phòng xét nghi

B Ộ GIÁO DỤC vàĐÀO TẠO

TR ƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y

*************************

XÂY D ỰNG QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN HAEMOPHILUS

PARASUIS TRÊN HEO CAI S ỮA CÓ DẤU HIỆU RỐI LOẠN

HÔ HẤP

Sinh viên th ực hiện : PHẠM TRƯỜNG AN

L ớp: DH08TY Ngành: Thú y Niên khóa : 2008 - 2013

Tháng 09/2013

B Ộ GIÁO DỤC vàĐÀO TẠO

TR ƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y

*************************

PH ẠM TRƯỜNG AN

XÂY D ỰNG QUY TRÌNH PCRPHÁT HIỆN HAEMOPHILUS

PARASUISTRÊN HEO CAI S ỮA CÓ DẤU HIỆU RỐI LOẠN

HÔ H ẤP

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y

Giáo viên hướng dẫn

ThS ĐỖ TIẾN DUY

TS LÊ THANH HI ỀN

XÁC NH ẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực hiện: PHẠM TRƯỜNG AN

Tên đề tài: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN

HAEMOPHILUS PARASUIS TRÊN HEO CAI SỮA CÓ DẤU HIỆU RỐI

LO ẠN HÔ HẤP”

Đã hoàn thành theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến đóng góp, nhận xét của hội đồng chấm thi tốt nghiệp ngày ………

L ỜI CẢM ƠN

Đầu tiên con xin gửi lời biết ơn chân thành đến Bố Mẹ đã sinh thành, không

quản nắng mưa vất vả nuôi nấng, dạy dỗ con được như ngày hôm nay Gia đình mình đã luôn bên con mọi lúc mọi nơi, là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con trong cuộc sống này

ThS Đỗ Tiến Duy và TS Lê Thanh Hiền đã hết lòng hướng dẫn, động viên

em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận!

BSTY Nguyễn Phạm Huỳnh vàBSTY Lê Thị Hạnh Dung đã tận tình hướng

dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực tập tốt nghiệp!

Xin c ảm ơn

Ban quản lý Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM

Các anh chị đang công tác và cùng làm đề tài tốt nghiệp tại Bệnh Viện Thú Y

đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian thực tập

Tập thể lớp DH08TY đã quan tâm, giúp đỡ, động viên chia sẻ những vui buồn cùng tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

PHẠM TRƯỜNG AN

TÓM T ẮT

Đề tài “Xây dựng quy trình PCR phát hiện Haemophilus parasuis trên heo

cai sữa có dấu hiệu rối loạn hô hấp” được thực hiện từ tháng 02/2013 đến tháng 07/2013 tại phòng xét nghiệm sinh học phân tử - tế bào thuộc Bệnh Viện Thú y, khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình PCRphát hiện vi khuẩn H parasuis một cách nhanh chóng, chính xác và hiệu quả, từ đó có những biện pháp

hữu hiệu để phòng chống và ngăn ngừa sự lây lan của bệnh

Kết quả đạt được như sau:

• Quy trình PCR có nồng độ primerHPF-cysS; HPR-cysS là 0,5 µM

• Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: tiền biến tính ở 95 o

C trong 7 phút

• Quy trình PCR sau khi tối ưu đã được ứng dụng trên mẫu thực địa

M ỤC LỤC

TRANG

Trang tựa i

Phiếu xác nhận của giáo viên hướng dẫn ii

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

Danh sách sơ đồ xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Bệnh do vi khuẩn H parasuis gây ra 3

2.1.1 Khái niệm 3

2.1.2 Lịch sử nghiên cứu 3

2.1.3 Đặc điểm của H parasuis 4

2.1.4 Dịch tễ học 4

2.1.5 Cơ chế sinh bệnh 5

2.1.6 Triệu chứng 5

2.1.7 Bệnh tích 7

2.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) 9

2.2.1 Định nghĩa phản ứng PCR 9

2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR 9

2.2.3 Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR 11

2.2.3.1 Primer 11

2.2.3.2 DNA bản mẫu 11

2.2.3.3 Nồng độ MgCl2 11

2.2.3.4 dNTP 12

2.2.3.5 Taq-polymerase 12

2.2.3.6 Số chu kỳ trong phản ứng PCR 13

2.2.4 Đọc kết quả phản ứng PCR 13

2.2.5 Ứng dụng của kỹ thuật PCR 14

2.2.6 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật PCR 14

2.3 Phản ứng multi PCR 15

2.4 Quy trình ly trích DNA 15

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 17

3.2 Nội dung thực hiện 17

3.3 Vật liệu và hóa chất 17

3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 17

3.3.2 Hóa chất 17

3.3.3 Thiết bị 18

3.4 Phương pháp nghiên cứu 19

3.4.1 Kiểm tra độ đặc hiệu và khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp của primer 19

3.4.2 Xác định nồng độ primer tối ưu cho phản ứng PCR 20

3.4.3 Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng PCR 20

3.4.4 Xác định nồng độ Master mix tối ưu cho phản ứng PCR 22

3.4.5 Ứng dụng quy trình PCR trên mẫu thực địa 23

3.4.6 Đánh giá mức độ thống nhất giữa kết quả của s-PCR và m-PCR 23

3.4.6.1 Quy trình m-PCR phát hiện H pasasuis 24

3.4.6.2 Hệ số Kappa 25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer 26

4.2 Kết quả xác định nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp tối ưu 30

4.3 Kết quả xác định nồng độ Master mix tối ưu 33

4.4 Kết quả giải trình tự gen sản phẩm PCR 34

4.5 Ứng dụng quy trình PCR trên mẫu thực địa 36

4.5.1 Kết quả ứng dụng quy trình PCR trên mẫu thực địa 36

4.5.2 Đánh giá mức độ thống nhất giữa kết quả của s-PCR và m-PCR 37

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 41

DANH SÁCHCÁC CH Ữ VIẾT TẮT

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetate

dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate

H parasuis Haemophilus parasuis

m-PCR Multiplex Polymerase Chain Reaction

NAD Nicotinamide Adenin Dinucleotide

NCBI the National Center for Biotechnology Information

PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

s-PCR Single Polymerase Chain Reaction

DANH SÁCH CÁC B ẢNG

TRANG

Bảng 3.1 Cặp pimer sử dụng trong phản ứng PCR phát hiện H parasuis 19

B ảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR xác định nồng độ primer 20

B ảng 3.3 Thí nghiệm về nhiệt độ bắt cặp trong quá trình luân nhiệt 21

B ảng 3.4 Các nghiệm thức xác định nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp 22

B ảng 3.5 Thành phần Go taq® green Master mix 23

Bảng 3.6 Thành phần phản ứng m-PCR phát hiện H parasuis 24

Bảng 3.7 Chu trình luân nhiệt phản ứng m-PCR phát hiện H parasuis 24

B ảng 4.1 Các đặc tínhcơ bản của cặp primer 26

B ảng 4.2 Kết quả cấu trúc thứ cấp mang năng lượng thấp nhất 27

B ảng 4.3 Kết quả phân tích BLAST của cặp primer 29

B ảng 4.4 Kết quả xác định nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp 30

Bảng 4.5 Kết quả phản ứng s-PCR và m-PCR phát hiện H parasuis 37

B ảng 4.6 So sánh sự phù hợp giữa kết quả của s-PCR và m-PCR 38

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TRANG

Hình 2.1 Nhuộm Gram vi khuẩn H parasuis 4

Hình 2.2 Triệu chứng lâm sàng của heo nhiễm H parasuis 6

Hình2.3 Viêm phổi sợi huyết trong bệnh Glasser 7

Hình 2.4Viêm phúc mạc và viêm màng ngoài tim sợi huyết 8

Hình 2.5 Dịch màng bao tim đục và có sợi huyết ở màng ngoài tim 8

Hình 2.6 Một chu kỳ phản ứng PCR 10

Hình 3.1 Máy ly tâm – Máy điện di 18

Hình 3.2 Máy luân nhiệt 18

Hình 4.1 Kết quả khảo sát nồng độ primer ở 52o C 31

Hình 4.2 Kết quả khảo sát nồng độ primer ở 54o C 32

Hình 4.3 Kết quả khảo sát nồng độ primer ở 56o C 32

Hình 4.4 Kết quả khảo sát nồng độ primer ở 58o C 33

Hình 4.5 Kết quả khảo sát nồng độ Master mix 34

Hình 4.6 Kết quả BLAST sản phẩm của phản ứng PCR phát hiện H parasuis 35

Hình 4.7Kết quả ứng dụng quy trình s-PCR trên mẫu thực địa 36

Hình 4.8 Xử lý số liệu với phần mềm WINEPISE 2.0 38

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

TRANG

Sơ đồ 3.1 Bố trí khảo sát 19

ngừng phát triển nhằm cung cấp nguồn thực phẩm dồi dào cho thị trường và mang

lại hiệu quả kinh tế cho nhà chăn nuôi

Tuy nhiên, khó khăn gây trở ngại lớn cho ngành chăn nuôi heo hiện nay là tình hình các bệnh trên đường hô hấp thường xuyên xảy ra, gây thiệt hại đáng kể về mặt kinh tế và xã hội Với đặc thù khí hậu nhiệt đới ở Việt Nam, cùng với sự gia tăng

mật độ đàn heo và việc chưa xem trọng vấn đề an toàn sinh học trong chăn nuôi, càng làm tình trạng này trở nên nghiêm trọng hơn Bệnh hô hấp trên đàn heo có thể

do một hay nhiều vi khuẩn hoặc virus gây ra như Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis, Haemophilus parasuis, hội

chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên heo (PRRS - Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome),…trong đó Haemophilus parasuis là một tác nhân gây bệnh

phổ biến Heo nhiễm H parasuis thường có biểu hiện ho, thở khó, thở thể bụng;

viêm phổi sợi huyết, dính sườn, viêm khớp, viêm tràn dịch, viêm màng não và có

thể dẫn đến chết

Các phương pháp phát hiện H parasuis như đánh giá bệnh tích đại thể, phân

lập nuôi cấy,…đạt hiệu quả chưa cao.H parasuis là loài vi khuẩn khó nuôi cấy, đòi

hỏi nhiều yếu tố cho sự phát triển, do đó tỉ lệ phân lậpH parasuis từ mẫu bệnh

phẩm khá thấp Theo Nguyễn Trung Ngoan (2005) tỷ lệ phân lập thành công H parasuis trên mẫu phổi heo mắc bệnh hô hấp là 1,92%, Bùi Thị Hương Linh (2013)

tỷ lệ này là 0% Do vậy việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện nhanh và chính xác mầm bệnh là một yêu cầu cần thiết, có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác phát hiện sớm và điều trị bệnh kịp thời, giúp giảm thiệt hại kinh tế cho nhà chăn nuôi

Xuất phát từ thực tiễn trên, được sự đồng ý Khoa Chăn nuôi – Thú y, Bệnh

viện Thú y trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và dưới sự hướng

dẫn của ThS Đỗ Tiến Duy và TS Lê Thanh Hiền, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây

dựng quy trình PCR phát hiện Haemophilus parasuis trên heo cai sữa có dấu

hi ệu rối loạn hô hấp”

1.2 M ục tiêu và yêu cầu

1.2.1 M ục tiêu

Xây dựngquy trình PCR phát hiện H parasuis và phục vụ cho nhu cầu chẩn

đoán mầm bệnh này ở phòng xét nghiệm

1.2.2 Yêu c ầu

Xác định nồng độ primer tối ưu cho phản ứng PCR phát hiện H parasuis

Xác định nhiệt độ bắt cặp của chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR phát

hiện H parasuis

Xác định nồng độ Master mix tối ưu cho phản ứng PCR phát hiện H parasuis

Áp dụng quy trìnhPCR phát hiệnH parasuis trên 30 mẫu thực địa Đánh giá

mức độ thống nhất giữa quy trình s-PCR và m-PCR

Chương 2

2.1 Bệnh do vi khuẩn Haemophilus parasuis gây ra

2.1.1 Khái ni ệm

H parasuislà vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm trên đường hô hấpxảy ra trên heo ở mọi lứa tuổi, nguyên nhân gây nên bệnh Glasservới cácdấu hiệu lâm sàng bao

gồm sốt, chán ăn, sưng khớp với sự di chuyển khó khăn, khó thở và các dấu hiệu

thần kinh Bệnh tích đặc trưng do xâm nhiễm có hệ thống, nhiễm khuẩn huyết và

hậu quả là gây ra hội chứng “polyserositis” (viêm đa xoang dạng sợi huyết có mủ, viêm phúc mạc, viêm màng ngoài tim, viêm màng phổi, viêm màng não và viêm

khớp)

2.1.2 L ịch sử nghiên cứu

Bệnh do H parasuis đã được Glasser phát hiện đầu tiên vào năm 1910, trên

heo bệnh có biểu hiện viêm đa khớp – viêm thanh dịch Năm 1931, vi khuẩn được phân lập từ heo bị cúm và được đặt tên Haemophilus influenzae suis Đến năm

1943, bệnh đã được Hiare và Wramby nghiên cứu về căn bệnh và đặt tên

làHaemophilus suis.Sau đó, vào năm 1976, qua những nghiên cứu đáng tin cậy, vi khuẩn được đặt tên như hiện nay là Haemophilus parasuis.Ngoài ra theo Tô Minh

Châu và Trần Thị Bích Liên (2001) trước đó căn bệnh do Haemophilus đã được

Pleiffer phân lập lần đầu tiên trong những bệnh phẩm từ bệnh nhân bị cúm trong

thời gian có dịch cúm vào năm 1892 Đến 1918 người ta mới phát hiện ra chúng là

những nguyên nhân thứ hai sau virus cúm và thường xuyên xuất hiện cùng với virus cúm ở heo Bệnh xảy ra ở hầu hết đàn heo trên thế giới, tỉ lệ mắc bệnh có thể lên

đến 100% nhưng tỉ lệ chết dao động từ 5 – 10%.H parasuis là nguyên nhân gây

viêm phổi và viêm đa thanh mạc (viêm màng phổi, viêm màng bao tim, viêm

khớp,…kèm sợi huyết) trên heo

2.1.3 Đặc điểm của Haemophilus parasuis

H parasuislà vi khuẩn có hình trực khuẩn, Gram âm, có tiêm mao và giáp mô,

hiếu khí hay yếm khí tùy nghi, nhiệt độ thích hợp là 37o

C và pH 7,4–7,8 Khác với

những loài Haemophilus khác, sự phát triển của H parasuis chỉ cần yếu tố V

(Nicotinamide Adenine Dinucleotide – NAD) mà không cần yếu tố X (Hemin).15 serovar của H parasuis đã được xác định, serovar 4 và 5 được phân lập nhiều nhất

Vi khuẩn có sức đề kháng kém, dễ bị tiêu diệt bởi các chất sát trùng thông thường, nhạy cảm với sự khô hạn và ánh sáng mặt trời

Hình 2.1 Nhuộm Gram vi khuẩn H parasuis

(Nguồn: Theo Virginia Aragón, 2009)

Miễn dịch từ mẹ truyền giảm sau 2-4 tuần, vì vậy thời kỳ này bệnh có thể xảy

ra trên heo 2-15 tuần, nhưng heo thời kỳ cai sữa 5-8 tuần tuổi thường mắc phải, tỷ lệ

tử vong là 5–10% nhưng có thể lên tới 50% Vi khuẩn có nhiều serovar nên có thể

có nhiều hơn một serovar gây bệnh cho một đàn và có nhiều serovar không độc lực

ở mũi heo Miễn dịch thường chỉ chống với serovars nhiễm, đối với serovar khác thì không có, hoặc nếu có thì cũng rất kém

2.1.5 Cơ chế sinh bệnh

Các yếu tố gây stress như thay đổi thời tiết đột ngột, ẩm độ cao kết hợp với độ thông thoáng kém, vận chuyển, thay đổi thức ăn, cai sữa, là những yếu tố mở đường cho bệnh phát triển nhanh Bệnh phát triển mạnh trên đàn heo khi thời tiết

khắc nghiệt.H parasuis định cư ở xoang mũi và khí quản mà không gây bệnh hoặc

ở dạng độc lực yếu làm hư hại lông rung và phá hủy tế bào biểu mô

Sau khi xâm nhập qua đường hô hấp vào phổi, vi khuẩn cư trú và nhân lên ở

phế nang, sau 12 giờ vi khuẩnbị thực bào nhanh chóng bởi đại thực bào phế nang và

sản sinh độc tố dung giải tế bàovào máu và gây nhiễm trùng huyết, H parasuis đặc

biệt ưa thích phát triển trên bề mặt màng thanh dịch (màng bụng, màng phổi, màng ngoài tim, màng não, khớp) và hậu quả là gây viêm thanh dịch, viêm dính sườn, viêm màng phổi sợi huyết, viêm màng não có mủ,… Khi nhiễm qua đường phế

quản có thể gây viêm khí quản phổi, H parasuis nhân lên ở niêm mạc phế quản hơn

là tế bào có tiêm mao đường hô hấp

2.1.6 Tri ệu chứng

Triệu chứng bệnh có thể thay đổi tùy theo sức khỏe và khả năng miễn nhiễm

của thú, môi trường và mức độ bộc phát của yếu tố gây bệnh.Triệu chứng bệnh xuất

hiện rất sớm sau khi nhiễm với biểu hiện sốt và suy hô hấp

Thể cấp tính bệnh có thể xảy ra trên heo 5-8 tuần tuổi, ở một hay nhiều heo trong cùng một bầy hoặc khác bầy thú đột nhiên yếu ớt, sốt với thân nhiệt 40-41,5oC Heo bỏ ăn, có triệu chứng hô hấp, ho, khó thở, thở thể bụng, nhịp tim tăng (160 nhịp/phút) đặc biệt heo bị khập khiễng hoặc ngồi kiểu chó (tư thế ngồi để dễ

thở) Khi vi khuẩn xâm nhiễm vào não, màng não, tủy sống sẽ gâyrối loạn thần kinh

hầu với các biểu hiện co giật, mất vận động, sau cùng là ngã vật xuống, nằm nghiêng sang một bên.Hầu hết các khớp đều sưng phồng và đau đớn, đi lại khó khăn, có thể thấy thủy thũng ở mi mắt, ở tai và mặt Thú sẽ chết trong vòng 2-5 ngày, heo chết thường có biểu hiện đỏ đến tím xanh trên da

Ở thể mãn tính, bệnh sẽ phát triển khi biểu hiện bệnh cấp tính biến mất sau 5 ngày, những heo sống sót sẽ chuyển qua viêm khớp mãn tính, viêm nội tâm mạc, viêm dính ruột, viêm màng não Heo mãn tính có thể chết đột ngột

2.1.7 B ệnh tích

Thể cấp tính: Khí quản, phế quản chứa đầy chất nhầy, phổi bị phù và xuất huyết, biểu hiện rõ viêm màng phổi nhiều sợi huyết, viêm kẽ, thủy thũng, viêm dính

giữa phổi và thành ngực, cơ hoành và màng ngoài tim, xoang ngực chứa đầy dịch

Hình 2.2 Triệu chứng lâm sàng của heo nhiễm H parasuis: thở khó,

ngồi kiểu chó, khớp sưng, xuất huyết trên da (Nguồn: Bùi Thị Hương Linh, 2013)

viêm Ngoài ra, có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm khớp có dịch khớp đục, viêm màng não cũng thường xảy ra

Thể mãn tính: thường xuất hiện với những dạng bệnh tích kết dính có sợi huyết, viêm màng ngoài tim cùng với biểu hiện suy tim, thủy thũng phổi, xoang

ngực chứa nhiều dịch

Hình 2.3 Viêm phổi sợi huyết trong bệnh Glasser (Nguồn: Theo Virginia Aragón, 2009)

Hình 2.4 Viêm phúc mạc và viêm màng ngoài tim sợi huyết

(Nguồn: Theo Virginia Aragón, 2009)

Hình 2.5 Dịch màng bao tim đục và có sợi huyết ở màng ngoài tim

(Nguồn: Tổ chức Hợp tác Quốc tế Nhật Bản, 2001)

2.2 Polymerase chain reaction (PCR)

2.2.1 Định nghĩa phản ứng PCR

Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNAdựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượngbản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzym DNApolymerase và một cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA này Nhờ enzym DNApolymerase xúc tác trên các mạch khuôn DNA tổng hợp nên các mạch đơn mới Cácmạch đơn mới được tổng hợp lại được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợpmạch mới của chu kỳ tiếp theo Sự

tổng hợp mạch đơn DNA mới cần có sự tham gia của các primer tạo các nhóm 3’

OH tự do Các nucleotid được gắn ở vị trí nhóm OHkéo dài tạo thành mạch đơn

mới (Khuất Hữu Thanh, 2006)

2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Giai đoạn biến tính (denaturation): nhiệt độ được nâng lên 95o

C Liên kết hydro bị phá vỡ, các đoạn xoắn kép của DNA đều được tách ra, DNA biến tính từ

mạch đôi thành mạch đơn Có thể biến động trong khoảng từ 93 – 100o

C

Giai đoạn bắt cặp (hybridization): hạ nhiệt độ phản ứng xuống (thấp hơn

nhiệt độ nóng chảy Tmcủa primer được sử dụng) cho phép các primer tìm kiếm và

bắt cặp bổ sung đặc hiệu với DNA khuôn mẫu, dao động vào khoảng 40 – 70o

C, tùy thuộc Tmcủa các primer và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

Giai đoạn kéo dài (extention): nâng nhiệt độ lên 72oC đểTaq-polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất, kéo dài các mạch DNA.Taq-polymerase sẽ lấy các dNTP từ

môi trường phản ứng để gắn vào đầu 3’ của primer theo nguyên tắc bổ sung với trình tự DNA đích Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA

mẫu, thường kéo dài từ 1 giây đến nhiều phút

Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi Đây là sự nhân bản theo cấp số nhân Như vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với

n chu kỳ sẽ tạo thành 2n

bản sao phân tử DNA

Hình 2.6 Một chu trình phản ứng PCR Giai đoạn 1: Biến tính ở 94o

C/1 phút Giai đoạn 2: Bắt cặp ở 54o

C/45 giây Giai đoạn 3: Kéo dài ở 72o

C/2 phút (Nguồn: Ghent University, 1999)

2.2.3 Các y ếu tố quan trọng trong phản ứng PCR

2.2.3.1 Primer

Primer là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide),cần thiết cho việc xúc tiến

phản ứng dây truyền tổng hợp DNA Chúng bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA

mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản Các primer này có chiều ngược nhau, bao gồm

một primer xuôi (F: forward) và một primer ngược (R: reverse) Xuôi và ngược là

so với chiều sao mã

Primer là một trong những yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng PCR.Chọnprimer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR, cần tuân thủ một số nguyên tắc nhất định: trình tự của primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa hai primer hay giữa

một primer với chính nó (trình tự của chúng không được bổ sung nhau); Tm của haiprimer không quá cách xa nhau; thành phần nucleotic củaprimer cần tránh các

cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần; trình tự của primer phải đặc trưng cho trình tự DNA

cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gene; trình tự giữa hai primer không quá lớn, phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb, kích thước khoảng 18 – 24 base (Phan Cự Nhân, 2001)

2.2.3.2 DNA b ản mẫu (DNA template)

Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất ức chế

phản ứng: SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, heparin…) PCR vẫn cho

kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay những mẫu DNA không được

xem là tối ưu, nhưng nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thí nghiệm (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2008)

Nồng độ Mg2+

cao sẽ làm phân tử dây đôi ổn định hơn, kiềm hãm sự biến tính hoàn toàn các sợi đôi, làm cho kết quả PCR ít đi Sự dư thừa Mg2+

còn làm cho hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu xảy ra nhiều hơn,hiện tượng này làm primer bắt cặp ở

những vị trí không chuyên biệt trên DNA khuôn tạo ra các sản phẩm không mong

muốn với số lượng lớn

Ngược lại nếu nồng độ Mg2+

quá thấp (<0,5 mM) thì quá trình kéo dài xảy ra không hoàn toàn, tạo ra những sản phẩm DNA ngắn hơn bình thường Đó là do trong phản ứng PCR, Mg2+đóng vai trò Co-factor của Taq-polymerase nên nếu lượng Mg2+

quá thấp thì Taq-polymerase sẽ không hoạt động bình thường trong giai

đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lan, 1999)

2.2.3.4 dNTPs

Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA Hỗn hợp dNTPs gồm 4

loại: dATP, dTTP, dGTP, dCTP và thường được sử dụng ở nồng độ 20 – 200μM cho mỗi nucleotide

Điều quan trọng là thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng, sự mất cân bằng thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase

2.2.3.5 Taq-polymerase

Là một DNA polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ một vi khuẩn suối

nước nóng có tên Thermus aquaticus do nhà vi sinh vật học Thomas Brock phát

hiện Taq-polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của phản ứng PCR và

hoạt động tối ưu ở 68 –72o

C

Nồng độ enzyme Taq-polymerase được sử dụng thông thường là 0,5 – 5 đơn

vị trên 100μl dung dịch phản ứng Nếu nồng độ Taq quá cao có thể tạo ra những sản

phẩm không chuyên biệt, làm sai lệch kết quả Nếu nồng đọ Taq quá thấp, phản ứng

sẽ không có đủ lượng enzyme cần thiết để tạo ra sản phẩm PCR theo mong muốn (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

2.2.3.6 S ố chu kỳ trong phản ứng PCR

Số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản sao ban đầu của mẫu

Ví dụ nếu lượng bản mẫu ban đầu là 105

thì cần 25 – 30 chu kỳ, nếu lượng ban mẫu

là 102 – 103 thì số chu kỳ là 35 – 40

Trong thực tế, không nên thiết lập số chu kỳ quá lớn cho một phản ứng PCR,

vì phản ứng PCR diễn biến qua 2 giai đoạn, ở giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng lên theo cấp số nhân của lượng mẫu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng; Sự xuất

hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng; Các bản sao vừa được tổng hợp không kết

hợp với primer mà bắt cặp với nhau (Phan Cự Nhân, 2001)

2.2.4 Đọc kết quả phản ứng PCR

Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di Nguyên tắc của phương pháp điện di được dựa trên đặc tính cấu trúc DNA DNA là các đại phân tử điện tích âm, DNA sẽ di chuyển về điện cực dương của từ trường

Dưới tác động của điện trường, sự di chuyển của các phân tử trong bản gel phụ thuộc vào khối lượng phân tử (số nucleotide) và nồng độ các chất cấu thành gel, điện thế của điện trường Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc

thẳng đứng Để nhận biết phân tử DNA di chuyển đến đâu trong bản gel, người ta

có thể sử dụng một dung dịch có màu (loading dye) được nhuộm chung với sản

phẩm PCR khi cho chúng vào những lỗ nhỏ trên gel (gọi là giếng-well) Trong một

số dung dịch đệm vẫn có thể có màu, khi đó không cần dùng đến loading dye Trong quá trình điện di, phân tử có màu này sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử DNA

và ta có thể nhìn thấy một vạch dài có màu này Sau khi điện di, bản gel sẽ được nhuộm với dung dịch ethidium bromide Ethidium bromide có khả năng gắn xen

giữa các base của nucleic Chất này sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV (bước sóng λ=300nm) tạo thành vạch đỏ da cam (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí

Bửu, 2005) Để ước lượng kích thước phân tử DNA trên gel agasore, người ta sử

dụng một yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker – MWM) Đây là một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước đã biết (DNA ladder)

Trong sinh học, PCR sử dụng để phát hiện đột biến, phục hồi các gen đã tồn

tại hàng triệu năm, lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn, nghiên cứu tiến hóa phân tử, xác định các loài mới, các loài đặc hữu bằng phương pháp di truyền phân tử

Trong y khoa, PCR sử dụng chẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các

bệnh di truyền, xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm…

2.2.6 Ưu và nhược của kỹ thuật PCR

Ưu điểm: độ nhạy cao, thời gian thực hiện nhanh, thao tác đơn giản, yêu cầu

về độ tinh sạch của mẫu không cao, lượng mẫu cần ít

Nhược điểm: bên cạnh những ưu điểm đáng kể trên, để thực hiện phương

pháp PCR cần có DNA primer đặc trưng cho DNA cần khuếch đại, để có đoạn primer này cần phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb, cần thận trọng đặc biệt trong thao tác tiến hành dễ dẫn đến ngoại nhiễm

2.3 Ph ản ứng Multiplex – PCR

Phản ứng multiplex PCR được cải tiến từ phản ứng PCR thông thường, trong

đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng cùng lúc nhiều cặp primer trong một phản ứng

Phương pháp này được thử nghiệm thành công vào năm 1988 và được áp dụng thành công trong nhiều nghiên cứu gồm có phân tích mất đoạn, đột biến, đa hình hoặc trong các phương pháp định lượng và kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR) Cho đến nay chưa có nguyên tắc chung hay thành phần chuẩn nào cho việc

tối ưu hóa phản ứng multiplex-PCR Do đó, ứng với mỗi phản ứng cần phải điều

chỉnh cho phù hợp với mục đích mong muốn

2.4 Quy trình ly trích DNA

Bước 1: Phá vỡ màng tế bào: thông thường tế bào hoặc mô được nghiền trong

hỗn hợp dung dịch chiết gồm Tris – HCl 1M (pH 7,5), NaCl 5M, EDTA 0,5M, sodium dodecyl sulfat 10% (SDS) Hỗn hợp này phá vỡ tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA, ngoài

ra trong thành phần ly trích còn có mercaptoethanol có tác dụng bảo vệ DNA không

bị tiêu hủy bởi các proteinase trong tế bào

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn chủ yếu là protein: loại bỏ

protein và phức hợp CTAB – polysaccharide – protein bằng hỗn hợp

phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Phenol và chloroform sẽ làm biến tính protein Ngoài ra chloroform còn làm cho pha nước và pha hữu cơ dễ tách rời nhau, isoamyl alcohol hạn chế sự nổi bọt trong suốt quá trình ly trích Sử dụng thêm chloroform sẽ giúp loại bỏ tất cả các dấu vết còn sót lại của phenol trong nucleic acid Protein bị biến tính sẽ không hòa tan trong nước có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha hữu cơ, pha nước có

chứa nucleic acid được thu nhận lại

Bước 3: Tủa nucleic acid trong isopropanol: các DNA có trọng lượng phân tử

thấp không bị tủa nên có thể loại bỏ chúng bằng tủa trong isopropanol Acid nucleic

sẽ được thu nhận lại trong ly tâm Sau đó cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70%

để loại bỏ muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại