PHÁT HIỆN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE (APP) VÀ XÁC ĐỊNH TÝP 1, 2, 5, 8 BẰNG KỸ THUẬT PCR

Trong đó, bệnh viêm phổi – màng phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae APP gây ra trên heo lây lan mạnh ở mọi lứa tuổi với tỉ lệ bệnh có thể lên đến 40% và tỉ lệ chết lên đến

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y

****************

(APP) VÀ XÁC ĐỊNH TÝP 1, 2, 5, 8 BẰNG KỸ THUẬT PCR

Sinh viên th ực hiện: PHẠM NGỌC NHƯ Ý

L ớp: DH08DY

Ngành: Dược Thú Y

Niên khóa: 2008 – 2013

Tháng 08/2013

(APP) VÀ XÁC ĐỊNH TÝP 1, 2, 5, 8 BẰNG KỸ THUẬT PCR

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y

Giáo viên hướng dẫn

TS NGUY ỄN ĐÌNH QUÁT

Tháng 08/2013

ii

XÁC NH ẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực tập: Phạm Ngọc Như Ý

Tên luận văn: “Phát hiện Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) và xác

định týp 1, 2, 5, 8 bằng kỹ thuật PCR”

Đã hoàn thành khóa luận theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các

ý kiến nhận xét, đóng góp của Hội đồng chấm báo cáo tốt nghiệp ngày …/…/2013

Ngày tháng năm 2013 Giáo viên hướng dẫn

TS Nguyễn Đình Quát

iii

L ỜI CẢM TẠ

Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến công ơn sinh thành, dưỡng dục và hy sinh của Ba Mẹ đã tận tụy lo cho con đến ngày hôm nay, cùng những người thân luôn yêu thương, giúp đỡ và động viên con trong những năm qua

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Đình Quát đã hết lòng giảng

dạy, hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo tôi suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn

tốt nghiệp

Luôn ghi nhớ và cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP

Hồ Chí Minh và Ban chủ nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y cùng toàn thể quý thầy cô

đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua

Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc và các anh chị Bệnh Xá Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt quá trình thực tập tốt nghiệp

Cảm ơn tập thể lớp DH08DY đã cùng chung sức và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp

iv

TÓM T ẮT

Đề tài “Phát hiện Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) và xác định týp 1,

2, 5, 8 bằng kỹ thuật PCR”đã được tiến hành tại phòng Phân Tử và Nuôi Cấy Tế Bào thuộc Bệnh Xá Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh từ ngày 02/02/2013 đến 15/06/2013

Mục đích: xây dựng quy trình PCR phát hiện APP và các týp 1, 2, 5, 8 trên

mẫu phổi heo

Kết quả thu được như sau:

Đã bước đầu xây dựng thành công qui trình PCR phát hiện APP trên mẫu

phổi heovới đoạn mồi xuôi: 5’-TAGAACCTTGTAAGCCTCGTCCATA-3’, đoạn

mồi ngược: 5’-CGTTTGTTAAGTGGTGTTGAGC-3’ và chương trình chạy trên máy luân nhiệt là: 95 o

C trong 3 phút (biến tính); 35 chu kỳ gồm 95 o

C trong 1 phút (biến tính), 56 o

C trong 45 giây (bắt cặp), 72 o

C trong 45 giây (kéo dài); và 72 oC trong 10 phút (kéo dài cuối)

Tỉ lệ mẫu dương tính với APP bằng kỹ thuật PCR là 32 %

Không xác định được các týp 1, 2, 5, 8 trên các mẫu dương tính với APP

v

M ỤC LỤC

TRANG

TRANG TỰA i

PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ii

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Đặc điểm sinh lí hô hấp của heo 3

2.1.1 Các đường dẫn khí 3

2.1.2 Cấu tạo phổi 3

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến bệnh đường hô hấp 4

2.1.3.1 Yếu tố không truyền nhiễm 4

2.1.3.2 Yếu tố truyền nhiễm 4

2.2 Bệnh do Actinobacillus pleuropneumoniae 6

2.2.1 Khái niệm 6

2.2.2 Lịch sử 6

2.2.3 Căn bệnh học 7

2.2.4 Độc lực 8

2.2.5 Dịch tễ 9

vi

2.2.6 Cách sinh bệnh 10

2.2.7 Triệu chứng 11

2.2.8 Bệnh tích 12

2.2.8.1 Bệnh tích đại thể 12

2.2.8.2 Bệnh tích vi thể 13

2.2.9 Chẩn đoán 13

2.2.10 Điều trị 13

2.2.11 Phòng bệnh 14

2.2.11.1 Vệ sinh phòng bệnh 14

2.2.11.2 Phòng bệnh bằng vaccine 15

2.3 Giới thiệu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 17

2.3.1 Kỹ thuật PCR 17

2.3.2 Phương pháp ly trích DNA 17

2.3.3 Định tính và định lượng DNA 18

2.3.4 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR 19

2.3.5 Primer 19

2.3.6 Nguyên tắc của phương pháp PCR 20

2.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 20

2.3.8 Các hạn chế của PCR 22

2.3.9 Giá trị sử dụng của PCR 23

2.3.10 Đọc kết quả 23

2.4 Những công trình nghiên cứu có liên quan 24

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Thời gian và địa điểm 26

3.1.1 Thời gian 26

3.1.2 Địa điểm thực hiện 26

3.2 Đối tượng nghiên cứu 26

3.3 Nội dung nghiên cứu 26

3.4 Phương pháp nghiên cứu 26

vii

3.4.1 Thiết bị, dụng cụ và vật liệu thí nghiệm 26

3.4.2 Thu thập mẫu phổi có bệnh tích viêm màng phổi 27

3.4.3 Qui trình xét nghiệm APP bằng kỹ thuật PCR 28

3.4.3.1 Đoạn mồi 28

3.4.3.2 Qui trình tách chiết DNA 28

3.4.3.3 Qui trình thực hiện PCR 29

3.4.3.4 Phương pháp chạy điện di 29

3.4.4 Qui trình định týp 1, 2, 5, 8 của APP trên các mẫu dương tính bằng kỹ thuật PCR 30

3.4.4.1 Đoạn mồi 30

3.4.4.2 Qui trình thực hiện PCR 30

3.4.4.3 Phương pháp chạy điện di 31

3.5 Công thức tính 31

Ch ương 4KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Xây dựng qui trình xét nghiệm APP bằng kỹ thuật PCR 32

4.2 Xác định tỉ lệ dương tính với APP trên mẫu phổi thu thập tại cơ sở giết mổ Nam Phong 35

4.3 Xác định týp 1, 2, 5, 8 của APP trên các mẫu dương tính 37

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

5.1 Kết luận 39

5.2 Đề nghị 39

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 40

viii

DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APP : Actinobacillus pleuropneumoniae

CAMP : Christae Ackins And Much Petersen

dATP : deoxyadenosine triphosphate

SDS : Sodium Dodecyl Sulphate

SPF : Specific Pathogen Free

Tm : Melting temperature

ix

DANH SÁCH CÁC B ẢNG

B ảng 3.1 Trình tự đoạn mồi cho phản ứng PCR xét nghiệm APP

B ảng 3.2 Trình tự đoạn mồi cho phản ứng PCR định týp 1, 2, 5, 8 của APP

B ảng 3.3Chương trình chạy PCR định týp 1, 2, 5, 8 của APP

B ảng 4.1 Tỉ lệ dương tính với APP bằng kỹ thuật PCR

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1Bệnh tích viêm màng phổi nghi ngờ do APP

Hình 4.1 Kết quả PCR xét nghiệm APP với nhiệt độ ủ bắt cặp 60 o

C

Hình 4.2 Kết quả PCR xét nghiệm APP với nhiệt độ ủ bắt cặp 56 o

C

Hình 4.3Kết quả PCR xét nghiệm APP trên một số mẫu đại diện

Hình 4.4 Kết quả PCR đại diện cho xét nghiệm APP định týp 1, 2, 5, 8 âm tính

bệnh bị còi cọc, chậm lớn, tiêu tốn thức ăn nhiều nhưng chậm tăng trọng và chi phí

điều trị lớn Trong đó, bệnh viêm phổi – màng phổi do vi khuẩn Actinobacillus

pleuropneumoniae (APP) gây ra trên heo lây lan mạnh ở mọi lứa tuổi với tỉ lệ bệnh

có thể lên đến 40% và tỉ lệ chết lên đến 24% (Biberstein và ctv, 1999) là một trong

những bệnh đường hô hấp gây nhiều thiệt hại kinh tế đáng kể cho các nhà chăn nuôi Theo Nicolet (1992), ở nước ta bệnh xảy ra phổ biến, xuất hiện trong mọi hình

thức chăn nuôi, đặc biệt nghiêm trọng ở các trại chăn nuôi tập trung quy mô lớn có điều kiện vệ sinh không đảm bảo, heo không được tiêm phòng Do đó, nhu cầu phát

hiện heo nhiễm APP bằng phương pháp chẩn đoán nhanh, có độ chính xác cao và ít

tốn kém để kịp thời đề ra các biện pháp can thiệp và xử lý ngày càng bức thiết

2

Xuất phát từ tình hình trên và được sự cho phép của Khoa Chăn nuôi Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Đình Quát, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Phát hiện Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) và xác định týp 1, 2,

Thu thập mẫu phổi nghi nhiễm APP tại cơ sở giết mổ Nam Phong

Thử nghiệm quy trình PCR để phát hiện APP

Thử nghiệm quy trình PCR để xác định týp 1, 2, 5, 8 trên các mẫu dương tính với APP

3

Chương 2

T ỔNG QUAN

2.1 Đặc điểm sinh lí hô hấp của heo

Theo Lâm Thị Thu Hương (2005), hô hấp là sự trao đổi khí liên tục giữa cơ

thể sống và môi trường xung quanh.Trong cơ thể luôn có sự oxy hóa chất dinh dưỡng để sản xuất nhiệt độ, công, các sản phẩm chế tiết,… nhờ oxy lấy từ môi trường

2.1.1 Các đường dẫn khí

Các đường dẫn khí gồm có xoang mũi, thanh quản, khí quản, phế quản, tiểu

phế quản Đường hô hấp được lót bằng biểu mô có nhung mao nhằm thải ra ngoài các vật lạ đồng thời tiết chất nhầy và sưởi ấm không khí

2.1.2 C ấu tạo phổi

Phổi gồm hai lá phổi: phải và trái Thông thường, dung tích của lá phổi phải

lớn hơn lá phổi trái Phổi trái có ba thùy: thùy đỉnh, thùy tim và thùy hoành cách

mô Phổi phải tương tự như phổi trái nhưng có thêm thùy Azygot hay thùy giữa (Phan Quang Bá, 2007)

Phổi được bao bọc bởi màng phổi có cấu tạo bởi mô liên kết, mô đàn hồi và

sợi cơ trơn Màng phổi được duy trì trong tình trạng căng rất cần cho cử động co giãn của hai lá phổi Lớp màng phổi được nối tiếp với mô gian bào Mô gian bào này chia các tiểu thùy càng lúc càng nhỏ Mỗi tiểu thùy có tiểu phế quản tận cùng chia làm 2 - 4 vi phế quản Các vi phế quản dẫn không khí đến phế nang bằng các ống phế nang Phế nang được xếp kế tiếp nhau, ngăn cách nhau bởi những vách

mỏng và thông thương với nhau nhờ ống phế nang Đường kính phế nang khoảng 0,15 - 0,5 µm, thành phế nang là những tế bào biểu mô lát đơn với nhiều nơi dầy lên

từ 0,1 - 0,5 µm, gọi là “tâm vô hạch” Phế nang có hệ thống ti thể dồi dào tham gia

4

vào việc thực bào bảo vệ cơ thể Biểu mô phế nang tựa lên sườn collagen và sợi đàn

hồi để liên hệ trực tiếp với lớp nội ngoại mạc của mạng lưới mao quản phổi Mạch máu, mạch bạch huyết, dây thần kinh đều nằm trong gian bào Máu đến phổi có 2 đường: hệ tuần hoàn cơ năng và hệ tuần hoàn nuôi dưỡng phổi Thần kinh đến phổi

gồm sợi giao cảm và sợi phó giao cảm (Ngô Phương Nghi, 2003)

2.1.3 Các y ếu tố ảnh hưởng đến bệnh đường hô hấp

Theo Trần Thanh phong (1996), bộ máy hô hấp trên heo là cơ quan thường xuyên tiếp xúc với môi trường bên ngoài Do đó nếu hàng rào bảo vệ (niêm mạc,

dịch tiết, lông rung) đường hô hấp bị suy yếu hoặc không còn hiệu lực thì các tác nhân gây bệnh sẽ dễ dàng xâm nhập và gây bệnh Bệnh đường hô hấp xảy ra do nhiều yếu tố khác nhau:

2.1.3.1 Y ếu tố không truyền nhiễm

Dinh dưỡng: mức độ cảm nhiễm với thú bệnh tăng lên khi khẩu phần không cung cấp đủ vitamin và khoáng Ngoài ra sức đề kháng còn phụ thuộc vào thành

phần thức ăn Tính chất thức ăn cũng ảnh hưởng đến đường hô hấp, thức ăn dạng

bột có bụi cao làm cho heo dễ bị hắt hơi, viêm phổi

Môi trường: nhiệt độ, ẩm độ, chuồng trại, tiểu khí hậu chuồng nuôi ảnh hưởng trực tiếp đến sức tăng trưởng và sức đề kháng của heo Ngoài ra, còn tạo điều

kiện cho mầm bệnh xâm nhập và phát triển Chuồng trại không thông thoáng kết

hợp với chiếu sáng không thích hợp gây kích ứng niêm mạc dẫn đến tình trạng mất bão hòa hệ hô hấp

Di truyền: cũng liên quan đến rối loạn hô hấp

Chăm sóc quản lý: có ảnh hưởng trực tiếp đến sức đề kháng của cơ thể đối

với mầm bệnh

2.1.3.2 Y ếu tố gây bệnh

Trong môi trường có rất nhiều mầm bệnh ảnh hưởng đến đường hô hấp Khi

gặp điều kiện thuận lợi (sức đề kháng của thú giảm) chúng sẽ xâm nhập, phát triển

và gây bệnh Những mầm bệnh gây bệnh hô hấp có thể là vi khuẩn, virus hay ký sinh trùng

5

 Bệnh do vi khuẩn:

- Bệnh viêm phổi do Mycoplasma hyopneumoniae gây viêm phổi mãn tính với

những vùng gan hóa (đỏ, xám) có tính đối xứng

- Bệnh tụ huyết trùng do Pasteurella multocida với đặc điểm gây viêm phổi

thùy lớn, phổi có nhiều vùng gan hóa, viêm phổi – màng phổi, viêm màng phổi dính

lồng ngực, phổi có abscess

- Bệnh do Haemophilus parasuis với đặc điểm là viêm đa khớp, viêm màng

phổi sợi huyết, viêm màng não

- Bệnh viêm phổi – màng phổi do Actinobacillus pleuropneumonia

- Bệnh viêm teo xoang mũi truyền nhiễm do Bordetella bronchiseptica

- Bệnh do Streptococcus spp gây bệnh tích viêm phúc mạc có sợi huyết, sung

huyết gan và phổi

- Bệnh do Staphylococcus spp

- Bệnh phó thương hàn do Salmonella cholerae suis

 Bệnh do virus:

- Bệnh dịch tả heo do virus thuộc họ Flaviviridae

- Bệnh cúm heo do virus thuộc họ Orthomyxoviridae

- Bệnh giả dại do virus thuộc họ Herpesviridae suisHerpesvirus

- Bệnh cảm nhiễm đường hô hấp ở heo thuộc họ Coronaviridae

 Bệnh do kí sinh trùng:

Giun phổi Metastronggylus spp tác động lên bộ máy hô hấp bằng cách phá

hủy niêm mạc, tiết độc tố làm suy giảm hệ thống tạo kháng thể, và hầu hết đều gây

chứng ho, viêm phế quản, viêm phổi

Một số loài khác không định vị trên đường hô hấp nhưng trong chu trình phát triển chúng di hành qua bộ máy hô hấp và các cơ quan gây nên tổn thương các cơ quan chúng đi qua (Lương Văn Huấn và Lê Hữu Khương, 1997) Theo Alfonso (1995), trong suốt quá trình di hành ngang qua phổi heo, ấu trùng của Ascaris suum

có thể gây phù thũng, hình thành những ổ xuất huyết dưới màng phổi và gây viêm

phổi kẽ

6

2.2 Bệnh do Actinobacillus pleuropneumoniae

2.2.1 Khái niệm

APP là tác nhân gây viêm phổi – màng phổi trên heo APP phân bố trên khắp

thế giới và gây nhiều thiệt hại kinh tế đối với các nhà chăn nuôi Tại Việt Nam, vi khuẩn này cũng đã được phân lập và được đánh giá là một bệnh quan trọng ở các

trại heo (Yoshikazu và ctv, 2005) Heo là ký chủ duy nhất của bệnh này, với đặc điểm gây bại huyết, viêm nội tâm mạc, viêm khớp trên heo 1 - 6 tuần tuổi Trên heo

lớn gây bệnh tích ngoài da, viêm màng phổi, có mức độ truyền lây rất cao từ đàn này sang đàn khác qua các phương tiện vận chuyển (Macinnes và Rosendal, 1988) Triệu chứng bệnh do APP rất thay đổi, có thể gây chết, gây mãn tính hoặc không có triệu chứng (Taylor, 1999) Hầu hết những nỗ lực để kiểm soát và ngăn ngừa bệnh

tỏ ra chưa có hiệu quả (trích dẫn của Lo, 1997)

2.2.2 L ịch sử

Vào năm 1902, Ligniere và Spritz đã mô tả căn bệnh nhưng chưa hề đề cập ở nước ta Theo Pattinson và ctv quan sát ca bệnh đầu tiên vào năm 1957, kế đến là Matthews và Pattinson (1961), Olander (1963) và Shope (1964) phát hiện tại một nông trại ở Argentina, Anh Quốc và Mỹ Vào thời điểm đầu tiên phân lập có thể là

một trong 3 loài: Haemophilus liticus, H parafluenza, H pleuropneumoniae Vào năm 1983, Pohl và các cộng sự đã phân biệt H influenza và H pleuropneumoniae

và chứng minh mối liên hệ giữa H pleuropneumoniae và Actinobacillus lignieresi

từ đó vi khuẩn này được đặt tên là A pleuropneumoniae (APP) Theo Bertschinger

và Seifert (1978) mô tả các vi khuẩn trông giống như Pasteurella haemolytica, được

xem là nguyên nhân gây viêm màng phổi hoại tử, chúng có liên quan đến NAD (Nicotinamide Adenin Dinucleotide) không phụ thuộc vào biovar của APP(Pohl và ctv, 1983) và bây giờ là APP biovar 2 (Taylor, 1999)

Hiện nay, APP đã xuất hiện ở Việt Nam và trong nền chăn nuôi công nghiệp

Úc, APP được xem là căn bệnh chính gây viêm màng phổi trên heo (Mireya, 2004)

7

2.2.3 Căn bệnh học

APP gây bệnh viêm phổi – màng phổi heo là vi khuẩn Gram âm, trực khuẩn

có capsule, không di động, không lông rung, không nha bào, kỵ khí tùy nghi Kích thước khuẩn lạc khoảng 0,5 - 1 mm, khuẩn lạc mọc tốt ở 37 0C trên môi trường có thêm 5 - 10 % CO2 Sau 24 giờ nuôi cấy trên thạch máu khuẩn lạc dung huyết kiểu

β Theo Phillips (1990), có 2 loại khuẩn lạc được tìm thấy, một loại tròn màu xám

và một loại mềm, dẹt, bóng, cả hai đều gây dung huyết và cho phản ứng CAMP (+)

với đường dung huyết của vi khuẩn Staphylococcus Vi khuẩn không phát triển

trong môi trường thạch máu khi chưa được bổ sung NAD Ngày nay người ta đã

chứng minh biovar 1 phụ thuộc NAD, biovar 2 không phụ thuộc NAD nhưng đòi

hỏi các nucleotid của pyridin hoặc tiền chất pyrindin nucleotid để tổng hợp NAD (Niven và Levesque, 1988) Có thể phân biệt Haemophilus parasuis với

Actinobacillus pleuropneumoniae bằng vòng dung huyết quanh khuẩn lạc trên môi trường thạch máu (Taylor, 1999)

APP biovar 1 chia làm 12 serovar Serovar 5 chia thành 2 type 5A và 5B Tính đặc hiệu của huyết thanh được xác định bởi lớp vỏ polysaccharide và lypopolysaccharide của màng tế bào Tuy nhiên vài serovar có cấu trúc tương tự

hoặc chuỗi lipopolysaccharide O giống nhau Điều này nhằm giải thích phản ứng chéo giữa serovar 1, 9 và 11; serovar 3, 6 và 8; serovar 4 và 7 (Perry và ctv, 1990) Biovar 2 có 3 serovar được xác định (Taylor, 1999)

Lớp vỏ bao quanh thành tế bào vi khuẩn đã được nghiên cứu và xác định các serovar Dạng vi khuẩn không vỏ bọc cũng được nghiên cứu Có 3 loại protein tiết

ra bên ngoài (ngoại độc tố) thuộc họ RTX (Repeats-in-toxin) là: ApxI, ApxII, ApxIII Độc tố ApxI gây dung huyết mạnh, có khối lượng phân tử là 105 - 110 KDa

hiện diện trong các serovar 1, 5, 9, 10 Độc tố ApxII gây dung huyết có khối lượng phân tử là 103 - 105 KDa, hiện diện trong tất cả các dòng trừ serovar 10 Độc tố ApxIII không gây dung huyết có khối lượng phân tử 120 KDa, hiện diện trong serovar 2, 3, 4, 6 và 8 (Taylor, 1999)

tố, lipopolysaccharide (LPS) và capsule là những yếu tố quan trọng tạo nên độc lực

của vi khuẩn Chúng đóng vai trò mấu chốt quyết định sự bảo vệ và nhận diện kháng nguyên APP Các yếu tố độc lực được tóm tắt như sau:

 Ngoại độc tố

Ngoại độc tố APP liên quan đến các dấu hiệu lâm sàng (Rosendal và Mitchell, 1980), dịch huyền phù từ APP có thể gây hoại tử và xuất huyết kết hợp

với viêm màng phổi Ở nồng độ cao, độc tố APP là cytolysin có khả năng phân giải

hồng cầu và giết chết tế bào lympho, tế bào biểu mô, lympho T và đại thực bào (Macinnes và Smart, 1993) Đặc tính thủy phân hồng cầu và gây độc tế bào của APP do sự phối hợp ít nhất của 3 loại protein: ApxI, ApxII và ApxIII Mỗi loại độc

tố sẽ thủy phân hồng cầu và gây độc tế bào theo những cách khác nhau tùy theo

chủng (Frey, 1995)

Độc lực của các serotype APP thay đổi từ mạnh đến yếu Sự thay đổi này do các loại độc tố của mỗi serotype tạo ra Serotype 5 bị đột biến sẽ không tiết ApxI hay ApxII không gây bệnh cho heo và chuột Điều này cho thấy ngoại độc tố là yếu

tố độc lực quan trọng của APP serotype 5 (Inzana, 1991)

 Lipopolysaccharide

Lipopolysaccharide (LPS) là thành phần chủ yếu cấu tạo nên màng bên ngoài

của APP và có khả năng gây hư hại mô LPS tinh khiết có khả năng gây gây hư hại

phổi khác với những tổn thương xuất huyết và hoại tử do nhiễm APP (Udeze và cs, 1987) Sự tương tác giữa LPS và ngoại độc tố làm tăng độc lực của APP (Izana, 1991) Theo Belanger và ctv (1990) báo cáo rằng 83 % serotype có LPS ít trơn, gây dính ít và ở những chủng có vỏ capsule nhỏ, LPS là chất bám vào màng niêm của

với thành phần cấu trúc đặc trưng tạo ra miễn dịch đơn độc (Perry và ctv, 1990) Capsule APP có tính kháng nguyên yếu (Fenwick và Osburn, 1986; Izana và Mathison, 1987) Capsule tinh khiết không thể kích hoạt dòng thác bổ thể và không

thể hiện độc lực (Warol và Izana, 1994; Fenwick và Osburn, 1986) Không có biểu

hiện lâm sàng nào cũng như tổn thương ở phổi được tìm thấy khi đưa capsule tinh khiết vào trong phế quản (Fenwick và Osburn, 1986) Vai trò chính là để bảo vệ vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi bổ thể trong trường hợp có và không có kháng thể

chống capsule đặc hiệu (Izana và ctv, 1988) Tuy nhiên, serotype 5 đột biến không capsule trở nên nhạy cảm với sự tiêu diệt của bổ thể trong trường hợp không có kháng thể đặc hiệu (Ward và Izana, 1994) Điều này cho thấy capsule góp phần quan trọng trong việc kháng lại tác động gián tiếp của bổ thể Ngoài ra các serotype khác nhau có mức độ độc lực khác nhau Các serovar có capsule lớn và dính hơn thì

có độc lực cao hơn (Jensen và Bertram, 1986) Điều này cho thấy capsule có thể là

một trong các yếu tố ảnh hưởng đến độc lực của các serotype

2.2.5 D ịch tễ

APP không tồn tại lâu trong môi trường xung quanh, đặc biệt trong môi trường khô ráo APP có thể truyền trực tiếp từ heo bệnh sang heo nhạy cảm (Wilson và ctv, 1987) hay truyền qua các dụng cụ chăn nuôi và phương tiện vận chuyển đã bị nhiễm chất tiết của heo bệnh (Nicolet, 1992) Thời gian ủ bệnh rất thay đổi, trong thực nghiệm thời gian từ lúc biểu hiện bệnh đến khi chết khoảng vài giờ đến vài ngày Mặc dù mọi lứa tuổi đều nhạy cảm với bệnh nhưng heo choai là nhạy

cảm nhất Các yếu tố như vận chuyển, dồn chuồng, điều kiện khí hậu bất lợi có ảnh

10

hưởng đến khả năng chống bệnh của con vật (Nicolet, 1992) Trong heo nhiễm bệnh APP trú ẩn ở hạch hạnh nhân, xoang mũi và những vùng phổi bị tổn thương

APP phân bố khắp nơi trên thế giới, vài serotype được xem là có độc lực

thấp và không có ý nghĩa ở nước này nhưng lại là tác nhân gây bệnh ở một số nước khác APP chủng A2 và An5 từng được phân lập ở một số tỉnh ở miền Bắc Việt Nam (Nicolet, 1992; trích dẫn bởi Yoshikazu Iritani, 2005) Theo Robert (2003),

hiếm có sự bảo hộ chéo giữa các chủng Miễn dịch mẹ truyền kéo dài khoảng 6

tuần Trong ổ dịch APP, tỉ lệ bệnh là 50 % và tỉ lệ chết có thể lên đến 10 % (Fewick

và Henry, 1994)

2.2.6 Cách sinh b ệnh

Cách sinh bệnh của bệnh viêm màng phổi đã được nghiên cứu rất nhiều, cả

về sự phát triển bệnh tích lẫn mối quan hệ giữa vi khuẩn với các mô ở mức phân tử Gây bệnh thực nghiệm đã chỉ rõ rằng vi khuẩn sinh sống ở hạch hạnh nhân và định

cư ở biểu mô phế nang Trong tự nhiên vi khuẩn kết bám nhờ fibrin Trong phổi, APP bị thực bào nhanh chóng bởi các đại thực bào phế nang và sản sinh độc tố ApxI, ApxII và ApxIII Tất cả các loại độc tố đó có chất độc tiềm tàng cho đại thực bào, tế bào nội mô, tế bào biểu mô của phế nang và tế bào nội bì của mao mạch ở thành phế nang ApxII kháng một cách đặc hiệu với đại thực bào ở phế nang Vi khuẩn dường như được bảo vệ bởi hiện tượng đại thực bào nhờ lớp vỏ bọc của chúng và dường như cũng đề kháng với hoạt động của bổ thể Cảm nhiễm đi cùng

với các cytokine chẳng hạn như interleukin – 1β và IL – 8 trong dịch phế nang, cũng xuất hiện trong mô bệnh tích rất sớm (Baarsch và ctv, 1995) Mô hư hỏng do độc tố và cytokine cùng với cảm nhiễm làm cho bệnh tích phát triển Thể cấp tính

và quá cấp thú có đáp ứng tương tự như trường hợp sốc nhiễm trùng trên người Sự khác nhau về độc lực của serovar hoặc ngay cả trong những serovar giống nhau, sự khác nhau này do cấu trúc của lớp vỏ, thành phần LPS hoặc kiểu dung huyết Nhìn chung các serovar 1, 5, 9, 10 và 11 độc lực cao hơn các serovar khác (Taylor, 1999)

Bệnh tích phổi là kết quả của các độc tố xảy ra 3 giờ sau khi gây bệnh thực nghiệm và ngày càng trở nên rõ ràng hơn Thành phế nang tích dịch và mao mạch tụ

11

huyết Dãn mạch bạch huyết với sự hiện diện của tế bào viêm, sợi huyết và dịch

chất Tụ tập nhiều tiểu cầu và bạch cầu trung tính trong thành phế nang bị hư hại, huyết khối hiện diện trong các tiểu động mạch lẫn thành mạch hoại tử rồi phát triển thành nhồi huyết (infarct) Vi khuẩn tụ tập trong phế nang bệnh và nhiễm trùng huyết có thể xảy ra Bờ của vùng bệnh tích chứa đầy đại thực bào chết hay hư hỏng

hoặc nhiều mảnh tế bào và có thể dễ thấy phần ranh giới với mô phổi chung quanh sau 4 ngày cảm nhiễm Dịch chứa vi khuẩn trong các tiểu phế quản, cho nên vùng trung tâm trở nên hoại tử và mô lành được hóa thớ

Kháng thể hình thành sau 14 ngày cảm nhiễm, hàm lượng kháng thể đạt tối

đa trong vòng 4 - 6 tuần cảm nhiễm và tồn tại ở mức thấp trong nhiều tháng Nái truyền kháng thể qua sữa đầu cho heo con sơ sinh và tồn tại trong 4 - 5 tuần và trong vài trường hợp bảo hộ này đạt tối đa trong 3 tuần Kháng thể này chống lại được tất cả các phần kháng nguyên của vi khuẩn bao gồm vỏ bọc, kháng nguyên LPS, toxin, protein màng ngoài, Superoxide dismutase và protein liên kết với sắt

Cả kháng thể IgA và IgG đều hình thành (Taylor, 1999)

2.2.7 Tri ệu chứng

Bệnh có thể chia thành 3 dạng: quá cấp, cấp tính và mãn tính Triệu chứng thay đổi tùy theo sức khỏe và khả năng miễn nhiễm của thú, điều kiện môi trường

và mức độ bộc phát của yếu tố gây bệnh

Ở thể quá cấp, một hay nhiều heo trong bầy hoặc khác bầy đột nhiên yếu ớt

và sốt với thân nhiệt cao 41,5 0

C, thờ ơ và bỏ ăn, có thời kỳ ngắn ói mửa, tiêu chảy;

chảy máu mũi, miệng Thú bệnh nằm bẹp không có triệu chứng hô hấp nhưng tim

và tuần hoàn yếu Thú chết trong vòng 24 - 36 giờ, trước khi chết trong miệng thú luôn có nhiều dịch tiết lẫn bọt máu Hiếm có trường hợp thú chết đột ngột mà không

có biểu hiện triệu chứng của bệnh (Taylor, 1999)

Trong thể cấp tính, thân nhiệt của thú tăng từ 40,5 - 41 0

C, thú khó chịu và hôn mê, thú giảm tính thèm ăn và uống ít nước, triệu chứng hô hấp là thở khó, tuần hoàn và tim yếu, tụ máu ở các phần thấp Ở dạng cấp tính có thể chết hoặc hồi phục, khi bệnh nổ ra qua 4 ngày mà heo còn sống sót thì cũng có khả năng hồi phục

12

Thể mãn tính phát triển sau khi triệu chứng cấp tính biến mất, thú sốt hoặc không sốt, ho liên tục hoặc cắt quãng với cường độ khác nhau, thú ăn ít và giảm tăng trọng, thể mãn tính thường chỉ phát hiện lúc giết mổ với bệnh tích đặc trưng

của phổi Bệnh mãn tính là nguyên nhân lây lan mầm bệnh giữa các đàn

Phát hiện thú bệnh bằng cách quan sát vận động miễn cưỡng của chúng Khi thú di chuyển, chúng tụt lại phía sau của bầy và vùng vẫy yếu ớt khi bị cầm cột Trong đàn thú bệnh mãn tính thường có nhiều thú không triệu chứng Các triệu

chứng đó có thể do các cảm nhiễm khác ở đường hô hấp Bệnh nguyên phát có thể quan sát sẩy thai trên đàn nái bệnh, nhất là SPF (Specific Pathogen Free) Các triệu

chứng khác như viêm nội tâm mạc, viêm khớp và abscess xuất hiện ở các vị trí khác trên cơ thể heo là do serovar 3, mặc dù các serovar khác hiện nay cũng ghi nhận

bệnh tích tương tự Gần đây viêm tai giữa kết hợp với APP được ghi nhận (Taylor, 1999)

Dạng cấp tính của bệnh được xác định bằng vùng phủ fibrin và xuất huyết trên phổi (Macinnes và Smart, 1993)

Trong giai đoạn sau của thể cấp tính, vùng phổi viêm sậm và rắn chắc với ít

hoặc nhiều viêm màng phổi sợi huyết, mặt cắt bở (dễ vỡ) Viêm màng phổi sợi huyết rõ rệt với thú bệnh chết trong giai đoạn cấp tính, ít nhất 24 giờ sau khi nhiễm

và xoang ngực chứa dịch chất thấm máu, viêm phổi dính sườn xảy ra được quan sát sau khi hạ thịt Bệnh tích ban đầu màu đỏ nâu hay đen trở nên sáng và rắn chắc hơn

Bệnh tích co rút lại xem như sự phân giải đang tiến triển, cho đến khi bệnh tích kinh niên thì các cục bướu kích thước khác nhau vẫn còn, hầu hết ở các thùy hoành cách

ở mao quản, thũy thũng phân tán và dịch chất có fibrin Nếu đáp ứng cấp tính, đại

thực bào xâm nhập, chung quanh vùng hoại tử hóa sợi đáng kể và viêm màng phổi hóa sợi (Taylor, 1999)

2.2.9 Ch ẩn đoán

Có thể chẩn đoán APP dựa trên những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích trên

phổi Nuôi cấy trong phòng thí nghiệm là một phương pháp cũng thường được áp

Phương pháp PCR đã được một số nhà khoa học đề xuất Lo (1997) đã phát

hiện và định danh APP serotype 5 bằng kỹ thuật multiplex PCR Chiers và ctv (2001) cho biết kỹ thuật PCR phát hiện đoạn gen omlA mã hóa protein màng của

APP Tuy nhiên, tiến hành PCR từ mẫu là toàn bộ hạch hạnh nhân sẽ cho độ nhạy cao hơn mẫu sinh thiết hạch hạnh nhân (Fittipaldi và ctv, 2003)

2.2.10 Điều trị

APP thì nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh nhưng sự đề kháng cũng rất nhanh khi sử dụng kháng sinh thường xuyên (Macinnes và ctv, 1990) Serotype 5 được phân lập ở Ontario thì kháng với tetracyline, serotype 7 thường xuyên kháng

trộn kháng sinh vào nước uống cho hiệu quả tốt Tuy nhiên, liệu pháp kháng sinh không loại trừ hết căn bệnh mà chỉ làm giảm biểu hiện lâm sàng của bệnh

Abscess ở phổi hoặc hạch hạnh nhân của thú bệnh mãn tính là nguồn chứa

mầm bệnh quan trọng cho các đợt cảm nhiễm trong đàn Chữa trị nên chữa ngay giai đoạn đầu của bệnh bằng cách chia nhóm nuôi trong môi trường không khí tốt

và duy trì mãi cho đến khi hạ thịt, nơi nào không có điều kiện thì kiểm soát các yếu

tố môi trường như nhiệt độ, độ thông thoáng và dùng vách ngăn thú bệnh trong ô chuồng để giảm tối đa sự phát triển và lây lan bệnh Tiếp tục sử dụng thuốc và nâng

liều sử dụng, không sử dụng một loại thuốc trong thời gian dài, liên tục giám sát sự kháng thuốc của vi khuẩn Chiến lược sử dụng thuốc đặt mục tiêu vào những thời điểm nguy cơ, điều này có thể được khẳng định bằng cách theo dõi triệu chứng,

kiểm tra phủ tạng sau khi hạ thịt và phát hiện kháng thể trong đàn Phải hủy bỏ toàn

bộ phổi và hạch lâm ba phổi, thịt được phép sử dụng (Taylor, 1999)

2.2.11 Phòng b ệnh

2.2.11.1 V ệ sinh phòng bệnh

Ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn bằng cách nhập heo ở những cơ sở

giống an toàn dịch bệnh, có nguồn gốc lý lịch rõ ràng Cần phải thực hiện các bước

kiểm dịch và xét nghiệm kỹ lưỡng, tiêm phòng vaccine và nuôi cách ly theo dõi 2 tháng trước khi nhập đàn

Quản lý chặt chẽ các khâu xuất, nhập tuân thủ phương pháp “cùng vào – cùng ra” (“all in – all out”)

15

Chuồng trại chăn nuôi phải đảm bảo cách ly với các khu vực khác, phải có hàng rào ngăn không cho súc vật, các loài gặm nhấm và hạn chế côn trùng ra vào trang trại Đầu chuồng, đầu trại phải có hố sát trùng, tiêu độc

Toàn bộ công nhân trại chăn nuôi, nhân viên kỹ thuật, khách tham quan, phương tiện vận chuyển ra vào trại phải được vệ sinh, tiêu độc, khử trùng, mặc đồ

bảo hộ lao động,…

Định kỳ phun tiêu độc khử trùng chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi bằng các

loại thuốc sát trùng Phân, nước tiểu, chất thải trong chăn nuôi phải được xử lý hợp

lý, đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y

Đảm bảo duy trì nhiệt độ, ẩm độ, độ thông thoáng, mật độ nuôi nhốt thích

hợp và ổn định

Đảm bảo các điều kiện chăm sóc và nuôi dưỡng đầy đủ dinh dưỡng Cho ăn

bằng thức ăn viên hoặc rưới nước vào thức ăn bột lúc cho ăn để giảm bụi

Đối với trại đã mắc bệnh thì tuyệt đối không xuất bán giống Nếu giết mổ

phải chở thẳng tới lò mổ, heo nọc không cho phối giống trực tiếp, tốt nhất nuôi vỗ béo không làm giống và heo nái cũng nên vỗ béo, heo con mắc bệnh dùng nuôi thịt (Hồ Thị Thanh Thảo, 2004)

2.2.11.2 Phòng b ệnh bằng vaccine

Hai loại vaccine đã được sử dụng là vaccine chết và tái tổ hợp Vaccine chết

sử dụng các serovar đặc hiệu, có thể miễn nhiễm chéo với các serovar khác Vaccine này có thể chống được các serovar trong khu vực bệnh đang lưu hành Các

chất bổ trợ đã được sử dụng, một vài vaccine gây bệnh tích hạt tại nơi tiêm chủng Vaccine thứ hai là loại tái tổ hợp từ các gen chịu trách nhiệm sản sinh toxin và protein màng ngoài, protein liên kết với sắt Loại vaccine này chống lại được tất cả các serovar (Hồ Thị Thanh Thảo, 2004)

Một số vaccine phòng bệnh viêm phổi – màng phổi do APP

 Vaccine Coglapix®

Thành phần: vaccine chứa các dòng vi khuẩn APP, được làm bất hoạt bằng formaldehyde, với tá dược là merthiolate và chất bổ trợ là hydroxit nhôm dạng keo

16

Đặc tính: vaccine chứa các kháng nguyên thân và các giải độc tố ApxI, ApxII và ApxIII của APP Tạo miễn dịch chủ động chống lại tất cả các kiểu huyết thanh đã được biết của APP

Chỉ định: tạo miễn dịch chủ động cho heo chống lại bệnh viêm phổi – màng

phổi gây ra bởi APP

Chống chỉ định: sản phẩm không được dùng trong giai đoạn mang thai và tiết

sữa

Liều lượng và cách dùng: chích bắp, mỗi liều 2ml theo chương trình sau đây:

2 lần chích cách nhau 2 đến 3 tuần bắt đầu từ lúc 7 tuần tuổi

Thời gian ngưng thuốc: 0 ngày

Thời gian sử dụng: 24 tháng Vaccine phải được dùng ngay sau khi mở nắp

Bảo quản: ở nhiệt độ 2 - 8 0

C, tránh ánh sáng trực tiếp Không được trữ đông

 Vaccine Porcilis APP

Mô tả: Porcilis APP (APP heo) chứa protein màng ngoài và 3 độc tố ApxI, ApxII, ApxIII, được sản xuất bởi các chủng APP Sản phẩm có khả năng phòng tất

cả các serotype của APP đã được phát hiện trên thế giới

Thành phần: Độc tố ApxI, ApxII, ApxIII và protein màng ngoài của APP

Những thành phần hoạt hóa này được pha thành huyễn dịch trong chất bổ trợ

Dạng sản phẩm: vaccine vô hoạt được pha chế sẵn để sử dụng kiểm soát

bệnh

Chỉ định: tạo miễn dịch chủ động cho heo cai sữa để kiểm soát bệnh viêm màng phổi do APP gây ra

Lịch tiêm chủng: miễn dịch bảo hộ tối đa trước khi heo bước vào giai đoạn

vỗ béo Heo có thể được tiêm vaccine từ tuần thứ 6 trở đi Cần đạt được hai mũi cách nhau ít nhất 4 tuần Khuyến cáo nên tiêm lúc 6 và 10 tuần tuổi

Đường tiêm: 2 ml theo đường tiêm bắp

Thời gian ngưng thuốc: 0 ngày

Cách trình bày: lọ chứa 100 ml (50 liều)