KHẢO SÁT MÔ BỆNH HỌC PHỔI VIÊM VÀ TỶ LỆ NHIỄM CSFV, PCV2 TRÊN HEO SAU CAI SỮA MẮC BỆNH HÔ HẤP PHỨC HỢP TẠI MỘT SỐ TRẠI HEO Ở KHU VỰC NAM BỘ

XÁC NH ẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ và tên sinh viên thực hiện: LÊ THỊ BÍCH THỦY Tên đề tài: “Khảo sát mô bệnh học phổi viêm và tỷ lệ nhiễm CSFV, PCV2 trên heo sau cai sữa mắc bệnh hô h

B Ộ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

٭٭٭٭٭٭٭٭٭٭٭٭

PHỨC HỢP TẠI MỘT SỐ TRẠI HEO Ở KHU VỰC NAM BỘ

Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ BÍCH THỦY

Lớp: DH08DY

Ngành: DƯỢC THÚ Y Niên khóa: 2008 – 2013

Tháng 9/2013

B Ộ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

٭٭٭٭٭٭٭٭٭٭٭٭

LÊ TH Ị BÍCH THỦY

PHỨC HỢP TẠI MỘT SỐ TRẠI HEO Ở KHU VỰC NAM BỘ

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp

bằng Bác sỹ Thú y chuyên ngành dược

Giáo viên hướng dẫn

ThS ĐỖ TIẾN DUY

TS NGUY ỄN TẤT TOÀN

XÁC NH ẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực hiện: LÊ THỊ BÍCH THỦY

Tên đề tài: “Khảo sát mô bệnh học phổi viêm và tỷ lệ nhiễm CSFV, PCV2 trên heo sau cai sữa mắc bệnh hô hấp phức hợp tại một số trại heo ở khu vực Nam

Bộ”

Đã hoàn thành theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến đóng góp, nhận xét của hội đồng chấm thi tốt nghiệp ngày ………

L ỜI CẢM ƠN

Xin g ửi lời biết ơn: đến ba mẹ, người đã hết lòng chăm lo, nuôi dưỡng con

khôn lớn

Xin c ảm ơn: Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP HCM và Ban

chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi – Thú Y đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin trân tr ọng biết ơn: tất cả quý thầy cô trong Khoa Chăn nuôi – Thú Y đã

truyền đạt cho sinh viên chúng em những kiến thức quý giá và kinh nghiệm bổ ích

Xin được khắc ghi: công ơn dạy dỗ của ThS Đỗ Tiến Duy cùng với TS

Nguyễn Tất Toàn đã hết lòng dìu dắt, tận tình hướng dẫn và động viên em hoàn tất

đề tài

Xin c ảm ơn: Ban giám đốc Bệnh viện Thú Y, các thầy cô và anh chị làm việc

tại Bệnh viện Thú Y đã giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho em thực hiện đề tài tốt nghiệp

Cu ối cùng: cảm ơn tất cả các bạn bè đã giúp đỡ, chia sẻ những vui buồn, khó

khăn trong suốt thời gian học tập và thực tập

TÓM T ẮT

Đề tài nghiên cứu “Khảo sát mô bệnh học phổi viêm và tỷ lệ nhiễm CSFV, PCV2 trên heo sau cai sữa mắc bệnh hô hấp phức hợp tại một số trại heo ở khu vực Nam Bộ” được tiến hành tại Phòng xét nghiệm, Bệnh viện thú y, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM từ 1/03/2013 đến 1/08/2013 Mục đích nghiên cứu này nhằm

khảo sát sự biến đổi mô bệnh học phổi viêm và xác định sự hiện diện của CSFV, PCV2 trên heo mắc bệnh hô hấp phức hợp

23 heo có dấu hiệu hô hấp đặc trưng được thu thập mẫu phổi và ghi nhận được triệu chứng lâm sàng xuất hiện với tỷ lệ cao nhất là thở khó (56,52%), viêm

khớp (52,17%), tiêu chảy (34,78%) và ho (34,78%) Bệnh tích thường gặp trên phổi heo mổ khám là viêm phổi kẽ (91,30%), nhục hóa (52,17%)

Phổi ghép các dạng bệnh lý trên cùng một phổi khá cao (100% viêm kẽ xuất

hiện trong phổi PRDC, 72,72% viêm phế quản phổi, 45,45% viêm phổi nghi ngờ

MH, và viêm màng phổi là 18,18%) Trong ca bệnh PRDC, tổn thương mô phổi được ghi nhận cao nhất là viêm phế quản, tiểu phế quản hay tiểu phế quản hô hấp (84,62%), kế đến là bệnh lý hư hại biểu mô tiểu phế quản và biến đổi hình thái, kích thước tiểu phế quản, phế nang đông đặc do tích tụ nhiều bạch cầu đơn nhân ở phế nang (76,92%), tăng sinh mô lympho xung quanh tiểu phế quản (61,53%), phế nang đông đặc do tích tụ nhiều bạch cầu trung tính, dịch viêm có fibrin ở phế nang, phù thũng/ viêm mô kẽ/ vách liên tiểu thùy (53,84%), tăng sinh vách phế nang (46,15%),

phù thủng phế nang, xơ hóa/ tăng sinh mô sợi ở mô kẽ/ vách gian tiểu thùy (38,45%)

Tỷ lệ nhiễm PCV2 và CSFV trong 23 heo khảo sát lần lượt là 91,30% (60,87% trong phổi PRDC, 30,43% trong phổi viêm kẽ) và 39,13% (21,74% trong

phổi PRDC, 17,39% trong phổi viêm kẽ) và tỷ lệ nhiễm ghép PCV2 và CSFV là 21,74% trong phổi PRDC, 8,7% trong phổi viêm kẽ

M ỤC LỤC

TRANG

TRANG T ỰA i

XÁC NH ẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ii

L ỜI CẢM ƠN iii

TÓM T ẮT iv

M ỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CH Ữ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH CÁC B ẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Cấu tạo của phổi và sinh lý bệnh đường hô hấp trên heo 3

2.1.1 Cấu tạo của phổi 3

2.1.2 Sinh lý bệnh hô hấp 4

2.1.2.1 Cơ chế sinh bệnh hô hấp 4

2.1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến bệnh đường hô hấp 4

2.2 Bệnh hô hấp phức hợp (PRDC) 6

2.2.1 Cơ chế sinh bệnh 6

2.2.2 Nguyên nhân gây bệnh 6

2.2.2.1 Căn nguyên vi-rút 8

2.2.2.2 Căn nguyên vi khuẩn 11

2.2.3 Triệu chứngPRDC 13

2.2.4 Bệnh tích PRDC 14

2.2.5 Chẩn đoán 15

2.2.6 Điều trị 16

2.2.7 Phòng ngừa 16

2.3 Phương pháp PCR 17

2.3.1 Giới thiệu sơ lược về PCR 17

2.3.2 Nguyên tắc của phương pháp PCR 17

2.3.3 Thành phần của phản ứng PCR 18

2.3.4 Ưu nhược điểm của kỹ thuật PCR 19

2.3.5 Phương pháp điện di trên gel 20

2.4 Lược duyệt một số công trình nghiên cứu về bệnh hô hấp trên heo và kỹ thuật PCR/ RT - PCR tìm căn nguyên 21

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 23

3.1 Thời gian và địa điểm 23

3.1.1 Thời gian 23

3.1.2 Địa điểm 23

3.2 Đối tượng nghiên cứu 23

3.3 Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm 23

3.3.1 Dụng cụ 23

3.3.2 Vật liệu 23

3.4 Nội dung khảo sát 24

3.5 Phương pháp tiến hành 24

3.5.1 Bố trí khảo sát 24

3.5.2 Đánh giá triệu chứng lâm sàng bệnh hô hấp trên heo mổ khám 25

3.5.3 Khảo sát mô bệnh học trên phổi heo nghi ngờ mắc bệnh hô hấp phức hợp 25

3.5.4 Xác định tỷ lệ nhiễm CSFV, PCV2 bằng kỹ thuật PCR/RT-PCR 26

3.5.4.1 Mục đích 26

3.5.4.2 Quy trình ly trích 27

3.5.3.3 PCR/RT-PCR 28

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 28

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả đánh giá triệu chứng lâm sàng bệnh hô hấp trên heo mổ khám 29

4.2 Phân loại dạng phổi viêm và mức độ hư hại 30

4.2.1 Kết quả đánh giá dạng phổi viêm qua bệnh tích đại thể 30

4.2.2 Kết quả đánh giá biến đổi mô bệnh phổi viêm qua bệnh tích vi thể 32

4.3 Kết quả xác định căn nguyên bằng phương pháp PCR/ RT - PCR 38

4.3.1 Tỷ lệ nhiễm vi-rút CSFV, PCV2 theo từng dạng phổi viêm 38

4.4 Tỷ lệ nhiễm CSFV, PCV2 theo bệnh tích trên cơ quan nội tạng khác 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 41

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 42

DANH SÁCH CÁC CH Ữ VIẾT TẮT

CSFV Classical Swine Fever Virus Vi-Rút Dịch tả heo

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Kỹ thuật miễn dịch hấp

syndrome

Hội chứng gầy còm trên heo sau cai sữa PRCV Porcine Respiratory Coronavirus -

PRDC Porcine respiratory disease complex Phức hợp bệnh hô

hấp trên heo

PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory

DANH SÁCH CÁC B ẢNG

TRANG

B ảng 3.1 Nguồn gốc thu thập mẫu 25

B ảng 3.2 Tên và trình tự đoạn mồi 28

B ảng 4.1 Tỷ lệ triệu chứng lâm sàng trên heo mổ khám (n=23) 29

B ảng 4.2 Bệnh tích thường gặp trên phổi heo (n=23) 30

B ảng 4.3 Tỷ lệ phổi có bệnh tích ghép theo đại thể 32

B ảng 4.4 Các dạng viêm xuất hiện trên phổi PRDC 33

B ảng 4.5 Mô học vi thể trên phổi PRDC (n=13) 34

B ảng 4.6 Tỷ lệ nhiễm vi-rút CSFV, PCV2 theo từng dạng phổi viêm 38

B ảng 4.7 Tỷ lệ nhiễm CSFV, PCV2 theo bệnh tích trên cơ quan nội tạng khác 39

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

TRANG

Sơ đồ 2.1 Các nhóm nguyên nhân gây ra bệnh hô hấp phức hợp trên heo 7

Sơ đồ 3.1 Bố trí khảo sát 24

Hình 4.1 Viêm phổi kẽ 36

Hình 4.2 Hình ảnh đại thể và vi thể phổi viêm trong khảo sát 37

bậc trong xu thế toàn cầu hóa cùng với việc Việt Nam trở thành thành viên chính

thức của Tổ chức Thương Mại Thế Giới WTO (World Trade Organization) đã mở

ra thời kỳ mới thời kỳ của sự cạnh tranh, hội nhập và phát triển

Tuy nhiên, chăn nuôi hiện nay kể cả chăn nuôi công nghiệp hay quy mô nhỏ thì nguy cơ dịch bệnh vẫn là mối đe dọa lớn Do điều kiện khí hậu nóng ẩm cộng

với hình thức chăn nuôi tập trung nên dễ phát sinh nhiều dịch bệnh nguy hiểm Trong đó bệnh đường hô hấp là mối quan tâm hàng đầu Bệnh hô hấp trên heo có

thể do một hay nhiều nguyên nhân gây ra và có xu hướng tạo thành bệnh hô hấp

phức hợp (PRDC) Vi-rút dịch tả heo (CSFV), Porcine circovirus type 2 (PCV2),

vi-rút tai xanh (PRRSV), Mycoplasma hyopneumoniae (MH), và Swine influenza virus

(SIV) được xem là tác nhân chính gây ra bệnh hô hấp phức hợp Ngoài ra, những

mầm bệnh vi khuẩn khác như Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella

multocida, Haemophilus parasuis, Streptococcus suis … cũng đóng vai trò quan

trọng trong viêm phổi dạng hô hấp phức hợp (Thacker và Thanawongnuwech, 2002)

Qua những nghiên cứu trước đây (Bochev, 2007; Hansen và ctv, 2010), bệnh

hô hấp phức hợp đang có những diễn biến phức tạp và chiếm một tỷ lệ khá cao trong các bệnh gây ra trên heo Chẩn đoán lâm sàng và phi lâm sàng để có cái nhìn

chính xác hơn về nguyên nhân gây ra bệnh hô hấp phức hợp là yêu cầu cần thiết để

đề ra biện pháp phòng trị hiệu quả nhằm hạn chế thiệt hại cho các nhà chăn nuôi

Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự đồng ý của Bộ môn Truyền Nhiễm

và Thú Y Cộng Đồng; và Bộ môn Thú Y Lâm Sàng, Khoa Chăn Nuôi Thú Y

Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM và dưới sự hướng dẫn của ThS Đỗ Tiến Duy

và TS Nguyễn Tất Toàn, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát mô

bệnh học phổi viêm và tỷ lệ nhiễm CSFV, PCV2 trên heo sau cai sữa mắc bệnh hô

hấp phức hợp tại một số trại ở khu vực Nam Bộ”

Thu thập mẫu phổi và các cơ quan khác (gan, lách, hạch, thận), phân loại

phổi heo có dấu hiệu hô hấp qua bệnh tích đại thể và vi thể

Thực hiện phản ứng PCR/RT-PCR để xác định tỷ lệ nhiễm CSFV, PCV2

Chương 2

T ỔNG QUAN

2.1 C ấu tạo của phổi và sinh lý bệnh đường hô hấp trên heo

2.1.1 C ấu tạo của phổi

Phổi gồm hai lá, phải và trái Thông thường, dung tích của lá phổi phải lớn hơn lá phổi trái Phổi trái có ba thùy là thùy đỉnh, thùy tim, thùy hoành cách mô

Phổi phải tương tự như phổi trái nhưng có thêm thùy Azygot hay thùy giữa (Phan Quang Bá, 2008)

Phổi được bao bọc bởi màng phổi có cấu tạo của mô liên kết, mô đàn hồi và

sợi cơ trơn Màng phổi luôn luôn được duy trì trong tình trạng căng cần cho cử động của hai lá phổi Lớp màng phổi được nối tiếp với mô gian bào Mô gian bào này chia phổi thành các tiểu thùy càng lúc càng nhỏ Mỗi tiểu thùy có tiểu phế quản

tận cùng chia làm 2–4 tiểu phế quản hô hấp Các tiểu phế quản hô hấp dẫn không khí đến các phế nang bằng các ống phế nang Phế nang được xếp kế tiếp nhau, ngăn cách nhau bằng những vách rất mỏng và thông với nhau nhờ ống phế nang Đường kính phế nang khoảng 0,15–0,5 mm, thành phế nang là những tế bào biểu mô lát đơn Biểu mô phế nang tựa lên sườn collagen và sợi đàn hồi để liên hệ trực tiếp với

lớp nội mạc của mạng lưới mao quản phổi, mạch máu, mạch bạch huyết và dây thần kinh đều nằm trong gian bào Máu đến phổi có hai đường là hệ tuần hoàn cơ năng

và hệ tuần hoàn nuôi dưỡng phổi

2.1.2 Sinh lý b ệnh hô hấp

2.1.2.1 Cơ chế sinh bệnh hô hấp

R ối loạn quá trình thông khí

Quá trình hô hấp ngoài được bảm đảm là nhờ ở thành phần và áp lực không khí thở bình thường cũng như hoạt động tốt của bộ máy hô hấp Một trong các yếu

tố này thay đổi sẽ gây rối loạn thông khí

Rối loạn thông khí do khí thở: có thể do độ cao, do không khí tù hãm và do

ngạt Hoạt động cơ học bình thường của bộ máy hô hấp đảm bảo không khí từ ngoài vào đến phế nang Đó là nhờ hoạt động nhịp nhàng của các cơ hô hấp, sự lành lặn

của lồng ngực và sự thông thoáng của khí - phế quản Sự rối loạn thông khí sẽ xảy

ra khi liệt cơ hô hấp do tổn thương lồng ngực hay do có chướng ngại đường hô hấp,

do dịch viêm, khối u đường hô hấp hoặc do các hiện tượng bệnh lý hẹp hay tắc phế

quản, thú bị viêm thanh quản, liệt thanh quản, khí quản bị chèn ép, viêm phế quản, viêm phổi, tràn dịch hay tràn khí màng phổi…(Văn Đình Hoa và Nguyễn Ngọc Lanh, 2007)

R ối loạn khuếch tán do giảm diện tích màng trao đổi

Trong hoạt động của phổi chỉ diện tích chức năng mới có ý nghĩa trong khuếch tán Đó là diện tích phế nang được thông khí tốt và được hệ tiểu tuần hoàn tưới máu đầy đủ Giảm diện khuếch tán do giảm khối nhu mô phổi gặp trong trường

hợp phổi bị cắt thùy hay lá phổi, trướng phế nang (những phế nang trướng to mất

lớp vách ngăn và làm xẹp các phế nang bên cạnh), viêm phổi (phế nang chứa dịch đông đặc), phù phổi, nhất là phù phổi cấp (lòng phế nang đầy dịch phù)…(Văn Đình Hoa và Nguyễn Ngọc Lanh, 2007)

2.1.2.2 Các y ếu tố ảnh hưởng đến bệnh đường hô hấp

Bộ máy hô hấp là cơ quan thường xuyên tiếp xúc với môi trường bên ngoài nên hô hấp sẽ rất dễ xảy ra rối loạn nếu hàng rào bảo vệ (niêm mạc, các dịch tiết, lông rung bao phủ đường hô hấp) của cơ thể bị suy yếu (Đặng Thị Thu Hường, 2005)

Có thể nói bệnh đường hô hấp được xem là hậu quả của nhiều tác động khác nhau như vi sinh vật gây bệnh, môi trường và quản lý (cách cho ăn, loại thức ăn,

kiểu chuồng…) Khi xác định nguyên nhân gây bệnh trên đường hô hấp, cần có

nhận định tổng quát để không bỏ sót các yếu tố tác động đến bệnh bên cạnh yếu tố

vi sinh vật (Đặng Thị Thu Hường, 2005)

(1) Y ếu tố truyền nhiễm

Một số nguyên nhân vi khuẩn truyền nhiễm gây bệnh hô hấp có thể kể đến

như Streptococcus spp gây viêm phúc mạc có sợi huyết và sung huyết, Mycoplasma

hyopneumoniae gây viêm ph ổi mãn tính, Mycobacterium gây bệnh lao và làm cho

phổi nhiễm thứ cấp từ những bệnh ở vùng bụng, Pasteurella multocida gây bệnh tụ

huyết trùng, Haemophilus parasuis gây viêm màng phổi sợi huyết, viêm đa khớp, viêm màng não, Salmonella choleraesuis gây b ệnh thương hàn, Bordetella

bronchiseptica là tác nhân gây bệnh viêm teo xương mũi truyền nhiễm (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)

Ký sinh trùng

Ngoài vi khuẩn và vi-rút, một số kí sinh trùng như Metastrongylus (giun

phổi), Ascaris suum (giun đũa)… cũng là nguyên nhân gây ra các bệnh trên đường

hô hấp

(2) Y ếu tố không truyền nhiễm

Mật độ chăn nuôi cao tại các trại chăn nuôi là một yếu tố ảnh hưởng quan

trọng đến bệnh hô hấp trên heo Trong tất cả các yếu tố khí hậu, tác động lớn nhất là

sự biến động nhiệt độ quá lớn giữa ban ngày và ban đêm, không khí ô nhiễm với bụi (thường là bụi do thức ăn), nồng độ amoniac tăng (> 50 ppm) (Robertson, 1993; trích dẫn bởi Bochev, 2007) Lượng nước uống và thức ăn không đầy đủ cũng ảnh

hưởng đến mức độ nghiêm trọng của sự nhiễm trùng bệnh hô hấp phức hợp Ngoài

những yếu tố thường dẫn đến nhiễm trùng đường hô hấp còn có những nguyên nhân quan trọng khác như đàn gia súc quy mô lớn với nhiều độ tuổi khác nhau, thường xuyên di chuyển đàn, không thực hiện “cùng vào – cùng ra”, trước khi nhập đàn không kiểm tra tình trạng sức khỏe hoặc sức khỏe heo kém, thay đổi điều kiện khí

hậu gây stress

2.2 B ệnh hô hấp phức hợp (PRDC)

PRDC là một thuật ngữ mô tả hội chứng bệnh nghiêm trọng hiện nay làm suy hô hấp nặng hơn, hự hại phổi nhiều hơn và hiệu quả can thiệp điều trị rất thấp

do nhiều nguyên nhân gây ra trên heo Hội chứng này phổ biến ở giai đoạn15 đến

20 tuần tuổi PRRSV, CSFV, PCV2, MH và một số vi khuẩn cơ hội kết hợp gây ra các hư hại trên đường hô hấp (Brogden and Guthmiller, 2003)

Bệnh hô hấp phức hợp là mối quan tâm lớn của ngành chăn nuôi heo ở các nước có ngành chăn nuôi phát triển trong những năm gần đây Tỷ lệ mắc bệnh khác nhau giữa các trang trại ở Mỹ từ 30% đến 70% Tỷ lệ tử vong khoảng 4-6% (Thacker và Thanawongnuwech, 2002; trích dẫn bởi Bochev, 2007) Tuy nhiên, tỷ

lệ tử vong có thể lên tới 15% ở một số trang trại (Choi và ctv, 2003; trích dẫn bởi Bochev, 2007)

2.2.1 Cơ chế sinh bệnh

Cơ chế sinh bệnh PRDC là hệ thống phòng vệ đường hô hấp bị tổn thương

do nhiễm trùng nguyên phát bởi các mầm bệnh PRRSV, SIV, PCV2, CSFV và

Mycoplasma hyopneumoniae kết hợp với điều kiện nuôi dưỡng kém gây mất khả năng đề kháng, đường hô hấp trở nên mẫm cảm với các tác nhân gây bệnh đường

hô hấp thứ phát như Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus

pleuropneumoniae và Haemophilus parasuis

2.2.2 Nguyên nhân gây b ệnh

Phân loại mầm bệnh theo tác nhân gây bệnh chính và tác nhân gây bệnh cơ

hội (Susan và ctv, 2002) Tác nhân gây bệnh chính có khả năng phá vỡ cơ chế bảo

vệ và tạo sự nhiễm trùng trên cơ thể vật chủ Các tác nhân gây bệnh cơ hội xâm

nhập và gây bệnh khi cơ thể bị giảm sức đề kháng bởi tác nhân gây bệnh chính Tác nhân gây bệnh sơ khởi trên heo có thể kể đến là các vi-rút như PRRSV, SIV, CSFV, PRCV, PCV2 và các vi khuẩn gây bệnh nguyên phát thường gặp nhất liên quan đến

phức tạp này bao gồm: Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus

pleuropneumoniae, Bordetella bronchioseptica Các vi khuẩn gây bệnh thứ cấp bao

gồm: Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Streptococcus suis,

Actinomyces pyogenes, Actinobacillus suis

Ngoài ra, bệnh hô hấp phức hợp còn là hậu quả của các tác nhân không nhiễm trùng Nguyên nhân không nhiễm trùng (quản lý và các yếu tố môi trường) góp phần gia tăng bệnh trên đường hô hấp, bằng cách làm tăng sự lây lan của các

mầm bệnh, tạo ra “stress” cho heo do điều kiện sống không thuận lợi Trong 30 năm qua, ngành chăn nuôi đã phát triển với quy mô đàn lớn hơn với mật độ nuôi nhốt cao và hệ thống thông gió không phù hợp có thể dẫn đến quá nóng hoặc lạnh, tăng stress và tăng nồng độ khí độc hại (amoniac và bụi), gây tác động tiêu cực đối với hàng rào phòng thủ của hệ hô hấp Trong các trại, sự pha trộn heo từ nhiều nguồn và nhóm tuổi khác nhau cũng đóng góp vào sự lây lan của bệnh (Susan và ctv, 2002)

Vi khuẩn: MH, APP, B

bronchiseptica, P multocida, H

parasuis, S suis.

Vi-rút: PRRSV, SIV, PCV2, PRV, PRCV

BỆNH HÔ HẤP PHỨC

HỢP TRÊN HEO

Quản lý môi trường: mật độ chăn nuôi,

sự thông thoáng, nhiệt độ, nguồn nước,

hệ thống xử lý chất thải

Sơ đồ 2.1 Các nhóm nguyên nhân gây ra bệnh hô hấp phức hợp trên heo

(Brockmeier và ctv, 2003)

2.2.2.1 Căn nguyên vi-rút

Porcine circovirus type 2 (PCV2)

Khi nghiên cứu về Circovirus, thấy có hai loại PCV: Porcine circovirus type

1 (PCV1) không gây bệnh và Porcine circovirus type 2 (PCV2) PCV2 gây hội

chứng gầy còm sau cai sữa (PMWS), PRDC (Porcine respiratory disease complex),

có kích thước rất nhỏ (17 nm), không vỏ bọc, virion hình cầu, chứa một AND sợi đơn dạng vòng Năm 1991, một “vi-rút lạ” gây chứng bệnh còi cọc, giảm tăng trọng đột ngột đã xảy ra trên heo sau cai sữa trong một đàn heo tại Canada Năm 1995,

bệnh đã xuất hiện với phạm vi ảnh hưởng lớn hơn và được gọi là “Hội chứng còi

cọc trên heo sau cai sữa” (Postweaning multisystemic wasing syndrome) (Harding, 1997) Nhiều năm tiếp theo bệnh lần lượt được thông báo tại nhiều quốc gia như mỹ (1996), Anh (1998), Đức (2000), Thụy Điển (2003)… kể cả các nước châu Á: Đài Loan (1995), Thái Lan (1999), Philippine (2001)… Bệnh trở thành vấn đề thời sự

với số ca bệnh không ngừng tăng và đứng đầu trong chương trình nghị sự của nhiều

cuộc họp thú y trên thế giới Năm 1997, nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Saskatchewan (Clark, Ellis, Harding, West) đã phân lập PCV2 từ những ca PMWS

Từ đó, người ta đã thực hiện thành công thí nghiệm gây nhiễm PCV2 trên heo

Các dấu hiệu lâm sàng thường gặp nhất của PMWS bao gồm giảm tăng

trọng, viêm phổi mãn tính (thở nhanh và thở khó), tiêu chảy, xanh xao và vàng da

Tỷ lệ mắc bệnh thấp (5-50%) nhưng tỷ lệ chết thường rất cao Lứa tuổi heo thường

bị bệnh là heo con sau cai sữa từ 4-16 tuần tuổi, nhưng tập trung nhiều nhất là 8-10

tuần tuổi Sự phân bố bệnh PMWS trong đàn heo nhiễm cũng rất thay đổi Trong

một số trại, một số heo có thể mắc chứng PMWS và chết nhưng số còn lại vẫn khỏe

mạnh và phát triển bình thường (Vigre và ctv, 2005) Trong các trại chăn nuôi, hội

chứng PMWS có thể tồn tại rất dai dẳng, từ 4 tháng đến trên 18 tháng Bằng thực nghiệm, người ta ghi nhận PCV2 có thể lây truyền ngang hoặc dọc, theo các đường

hô hấp, đường máu, nhau thai và sinh dục Vi-rút PCV2 tồn tại trong heo mang trùng từ 5-6 tháng Phân, nước tiểu, máu, dịch tiết ở mũi của những heo còn nhỏ bị

nhiễm PCV2 có chứa acid nucleic của PCV2 và là phương tiện lan truyền vi-rút trong đàn (Muirhead, 2002)

Sự biến đổi mô học vi thể đặc trưng bao gồm sự suy giảm của nang bạch huyết và viêm u hạt của các mô bạch huyết, gan, tuyến tụy và một loạt các mô khác

Tổn thương phổi được đặc trưng bởi viêm phổi kẽ với mức độ nghiêm trọng khác nhau Bong tróc biểu mô đường hô hấp và tăng sinh mô sợi với nhiều mức độ Viêm

tiểu phế quản và viêm phế quản tắc nghẽn thường gặp trong các trường hợp bệnh

nặng

Khi PCV2 kết hợp với PRRSV gây bệnh hô hấp sẽ không phân biệt được

những dấu hiệu lâm sàng cũng như bệnh tích mô học riêng biệt của hai tác nhân này Trong trường hợp nhiễm cùng lúc hai vi-rút đó, những heo sau cai sữa mắc hội

chứng PMWS sẽ có biểu hiện lâm sàng nặng hơn và có thể chết (Larochelle và ctv, 1999; trích dẫn bởi Phan Thanh Đoàn, 2012)

Classical Swine Fever Virus (CSFV)

Họ Flaviridae, giống Pestivirus, không nhân lên ở động vật không xương

sống, có phản ứng chéo giữa các vi-rút trong giống, kích thước 40nm, đối xứng 2

mặt, có vỏ bọc Xâm nhập qua đường tiêu hóa là chủ yếu ngoài ra có thể qua đường

hô hấp, sinh dục, qua da bị tổn thương Lây lan trực tiếp qua nuôi nhốt chung nhất

là mật độ đông, lây gián tiếp qua thức ăn, nước uống, phân, nước tiểu, dụng cụ chăn nuôi, động vật trung gian mang truyền mầm bệnh (chó, ruồi, muỗi…) Thời gian nung bệnh từ 5-10 ngày Thể quá cấp: heo sốt 41-420

C, phần da móng ửng đỏ, chết nhanh 1-2 ngày Có thể chết một vài heo con (5-30 kg) và những con khác có triệu

trứng cấp tính trong bầy Thể cấp tính: heo có biểu hiện ủ rũ, kém ăn, táo bón, thở

mạnh, khát nước, trên da xuất hiện những vết xuất huyết Rối loạn tiêu hóa: tiêu

chảy, phân vàng, nâu hoặc đỏ, giai đoạn cuối heo có triệu chứng thần kinh Bệnh tích trên da có xuất huyết điểm hay xuất huyết đốm Sưng hạch hầu họng, hạch hàm dưới, hạch bẹn Thận xuất hyết điểm hay đốm, lách nhồi huyết ở rìa Giai đoạn cuối

ở ruột non, mảng Payer, van hồi manh tràng xuất hiện nốt loét hình cúc áo Bạch

cầu giảm (<10000), phổi xuất huyết điểm hay nhồi huyết

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS)

Đặc điểm: vi-rút thuộc họ Arteriviridae, giống Artervirus, có cấu trúc ARN

sợi đơn có vỏ bọc, kích thước 45-55 nm PRRSV có hai chủng: chủng I gồm những vi-rút dòng châu Âu độc lực thấp, chủng II gồm những vi-rút thuộc dòng Bắc Mỹ độc lực cao Chúng tồn tại lâu trong nhiệt độ lạnh, đề kháng kém với pH acid và

chất sát khuẩn (Trần Thanh Phong, 1996) Bệnh lần đầu tiên được thông báo ở Mỹ năm 1987 Năm 1991 bệnh này mang tên chính thức là “Hội chứng rối loạn sinh sản

và hô hấp trên heo” viết tắt PRRS (Porcine Reproductive Respiratory Syndrome)

Có những dấu hiệu lâm sàng chứng tỏ rằng PRRSV liên quan đến sự bùng phát của các tác nhân gây bệnh khác và PRRSV là vi-rút phổ biến nhất được phân

lập từ các ca bệnh hô hấp phức hợp Bằng nghiên cứu thực nghiệm cho thấy heo bị nhiễm bệnh PRRS sẽ tăng nhiễm trùng huyết và tỷ lệ tử vong khi kết hợp với S suis

và tăng nhiễm trùng phổi với B bronchiseptica (Susan và ctv, 2002)

Sự nhiễm trùng nguyên phát với PRRSV và B Bronchiseptica dẫn đến heo

dễ mắc nhiễm trùng phổi thứ phát với P multocida Bên cạnh đó cũng có bằng

chứng cho thấy PRRSV tương tác với các vi-rút hô hấp như PCV2, PRCV và SIV trên heo Trong các trường hợp heo nhiễm PRRSV có đến 90% trường hợp phát

hiện có PCV2, 60% nhiễm kèm với những nguyên nhân khác (Ohlinger và Keller, 2002; trích dẫn bởi Phan Thanh Đoàn, 2012) Những kết quả này cho thấy bản chất

thật sự phức tạp của bệnh hô hấp phức hợp trên heo

Swine influenza viru (SIV)

Vi-rút có cấu trúc ARN thuộc họ Orthomyxoviridae, gây bệnh trên heo gồm

hai giống A và C, có tính hướng phổi, đường kính là 100-120 nm Đặc trưng của

bệnh xảy ra đột ngột, gây ho, khó thở, sốt cao, sau đó phục hồi nhanh chóng nhưng đôi khi cũng có trường hợp bị viêm phổi nghiêm trọng làm heo chết Bệnh tích tập trung chủ yếu trên phổi Viêm phổi cata do vi-rút cúm hoặc viêm phổi có mủ do phụ nhiễm vi khuẩn Trường hợp mãn tính, phổi viêm và xẹp có ranh giới rõ rệt với vùng phổi lành

Theo Brockmeier và ctv (2002), mặc dù SIV được thường xuyên được phân

lập từ heo mắc bệnh hô hấp phức hợp nhưng vai trò của nó trong cơ chế sinh bệnh này là chưa rõ ràng SIV có thể làm cho căn bệnh nghiêm trọng hơn trong lúc kết

hợp với các vi-rút hô hấp khác Theo Harm và ctv (2001) (trích dẫn bởi Phan Thanh Đoàn, 2003), tỷ lệ SIV nhiễm ghép với PCV2 là 19,3% và khi SIV nhiễm ghép với PRRSV hoặc MH sẽ làm bệnh đường hô hấp trở nên nặng hơn

Pseudorabies virus (PRV)

Là một vi-rút DNA thuộc họ Herpesviridae, kích thước 180nm, có vỏ bọc và

có sức đề kháng cao, tồn tại lâu trong môi trường bên ngoài PRV tác động lên hệ

thần kinh và hô hấp PRV ban đầu nhân lên trong biểu mô của vòm họng và amidan, sau đó lây lan đến các hạch bạch huyết và hệ thần kinh, vào trong máu và đến khắp các mô của cơ thể Vi-rút phá hủy niêm mạc của đường hô hấp nên dẫn đến hư hại lông rung Những rối loạn hô hấp do PRV gây ra bao gồm viêm mũi hắt hơi và chảy nước mũi có thể tiến triển đến viêm phổi với ho và khó thở Tổn thương ở đường hô

hấp bao gồm viêm mũi, viêm amiđan, viêm thanh quản có thể lan rộng xuống khí

quản và phổi Trong viêm phổi, bệnh tích đặc trưng bởi phù phổi, xuất huyết và ổ

hoại tử Bệnh tích vi thể được mô tả bởi sự tắc nghẽn phổi, xuất huyết, vách phế nang dày và hoại tử Bằng thực nghiệm cho thấy PRV đã làm trầm trọng thêm bệnh

với một số vi khuẩn như A pleuropneumoniae, P multocida, S suis, M

tiếp với lông rung, sản sinh độc tố, tấn công làm tê liệt hệ thống lông rung Sau đó,

MH gây thoái hóa, hoại tử các lông rung, phá hỏng hệ thống tiết dịch nhầy, thậm chí làm hư hại tế bào biểu mô Từ đó để lại các tổn thương trên niêm mạc phế quản

tạo hiện tượng viêm phế quản và vùng rìa của các thùy phổi, làm suy giảm chức

năng hô hấp và làm chảy nước mũi (Baskrville, 1972; trích dẫn bởi Đỗ Tiến Duy, 2004)

Bệnh do M Hyopneumoniae thường ở thể mãn tính và có xu hướng nhẹ nếu

không có biến chứng Hầu hết các trường hợp viêm phổi do MH là nhiễm phức hợp

giữa MH cùng với PRRSV và P Multocida (đây là sự kết hợp phổ biến nhất của

các tác nhân gây bệnh hô hấp phức hợp) Nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng

MH tăng cường sự nghiêm trọng và thời gian gây bệnh của PRRSV trên phổi viêm (Susan và ctv, 2002)

Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)

Trong bệnh hô hấp phức hợp, APP đóng vai trò là mầm bệnh thứ phát, khi APP nhiễm ghép với PCV2 sẽ làm diễn biến bệnh viêm phổi thêm trầm trọng (Krakowka, 2006; trích dẫn bởi Phan Thanh Đoàn, 2012)

APP là tác nhân gây bệnh viêm màng phổi truyền nhiễm trên heo (Corinne

và ctv, 2008) APP có 12 type huyết thanh Bùng phát bệnh do APP thường là do stress, thay đổi môi trường, nhiễm vi-rút hoặc MH Bệnh biểu hiện lâm sàng thường

ở thể quá cấp tính với cái chết đột ngột, cấp tính cùng với các dấu hiệu lâm sàng đặc trưng như sốt rất cao, khó thở, hôn mê, tím tái và chảy dịch mũi có máu hoặc một hình thức bán cấp/mãn tính sau khi các dấu hiệu cấp tính biến mất Tùy thuộc vào giai đoạn của bệnh, các tổn thương bệnh lý bao gồm viêm màng phổi sợi huyết và

hoại tử Tổn thương tạo thành áp xe khi bệnh trở thành mãn tính và viêm màng phổi

tiến triển thành xơ dính Heo sống sót sau nhiễm trùng cấp tính trở thành heo mang trùng, APP sẽ tồn tại dai dẳng trong mô phổi bị hoại tử, hạch amidan và thỉnh thoảng ở xoang mũi

Haemophilus parasuis (HPS)

Tỷ lệ phân lập được Haemophillus parasuis có tỷ lệ thuận với ca bệnh hô

hấp phức hợp trong các trường hợp viêm phổi (Susan và ctv, 2002) Haemophilus

parasuis là cầu khuẩn trực khuẩn Gr - có tiêm mao và giáp mô, gây ra bệnh Glasser

(viêm đa xoang thanh dịch) và viêm phổi trên heo 15 serovar của H parasuis đã được xác định, serovar 4 và 5 được phân lập nhiều nhất H parasuis định cư ở

xoang mũi và khí quản mà không gây bệnh hay có thể ở dạng có độc lực làm hư hại lông rung và phá hủy tế bào biểu mô Các dấu hiệu lâm sàng bao gồm sốt, chán ăn, sưng khớp với sự di chuyển khó khăn, khó thở và các dấu hiệu thần kinh Bệnh tích đặc trưng do xâm nhiễm có hệ thống, nhiễm khuẩn huyết và hậu quả là gây ra hội

chứng “polyserositis” (viêm đa xoang dạng sợi huyết có mủ, viêm phúc mạc, viêm màng ngoài tim, viêm màng phổi, viêm màng não và viêm khớp)

Pasteurella multocida (Pm)

P multocida là vi khu ẩn Gr -, thuộc họ Pasteurellaceae, gây viêm teo xương

mũi và viêm phổi trên heo Có 5 type huyết thanh nhưng trên heo chỉ thấy type A và

D Type A thường được phân lập từ viêm phổi và type D thì được phân lập từ các trường hợp viêm teo xương mũi, nhưng cả hai loại đều có liên quan đến cả hai bệnh

Độc tố của Pasteurella là yếu tố độc lực chính trong bệnh viêm teo xương mũi

truyền nhiễm Qua thí nghiệm cho thấy rất khó để gây nhiễm P multocidacho heo,

mặc dù vi khuẩn này thường hiện diện trong hạch amidan của heo, do đó nó thường được coi là một nhiễm trùng cơ hội Tuy nhiên, gần đây có một số báo cáo cho thấy

số lượng ngày càng tăng của các trường hợp viêm phế quản phổi nặng kết hợp với viêm màng phổi do nhiễm trùng đơn lẻ do P multocida type A hoặc type D; vì vậy

có lẽ nên xem vi khuẩn này là tác nhân gây bệnh chính trong bệnh hô hấp Triệu

chứng lâm sàng thường là ho dai dẳng, thở khó và chậm lớn Bệnh tích đặc trưng là viêm dính màng phổi với vách ngực, viêm phổi–màng phổi hoặc áp xe phổi

chảy, sưng khớp và què quặt, rối loạn sinh sản và dễ dẫn đến cái chết Ho khan

thường xuyên là một dấu hiệu cho thấy sự tham gia của Mycoplasma

hyopneumoniae (Ross, 1999; trích dẫn bởi Bochev, 2007) Khi bệnh có sự tham gia

của APP, triệu chứng lâm sàng mô tả như trên sẽ trở nên trầm trọng hơn (Taylor, 1999; trích dẫn bởi Bochev, 2007) Những cơn ho bộc phát nhanh và tỷ lệ cao cho

thấy dấu hiệu gây bệnh của vi-rút cúm (Halbur, 1997; trích dẫn bởi Bochev, 2007)

các tác nhân khác được đặt trên tổn thương do Mycoplasma hyopneumoniae gây ra

Nhiễm trùng do Mycoplasma hyopneumoniae đặc trưng bởi sự đông đặc (viêm) đối

xứng các thùy phổi, thường là thùy đỉnh và tim Viêm phổi bắt đầu từ thùy tim lan sang thùy đỉnh, thùy hoành cách mô, thường phát triển ở rìa, vùng thấp của phổi, có tính chất đối xứng và phân biệt rõ với phổi bình thường Chỗ bị viêm cứng dần, màu đỏ nhạt hoặc xám nhạt (hóa gan) Sau đó, vùng phổi bệnh dày đặc lại, cứng và

nhạt màu giống như màu thịt, lúc này phổi đã bị nhục hóa

Khi nhiễm PRRSV, bề mặt của phổi có dạng đốm hay sọc nâu với những vùng có màu phổi không đồng nhất, vách liên tiểu thùy viêm dày lên, phổi viêm

dạng kẽ Quan sát tiêu bản vi thể dưới kính hiển vi có thể thấy thay đổi ban đầu là điển hình cho nhiễm vi-rút PRRS là bạch cầu đơn nhân xâm nhập vào vách phế nang, tăng sinh vách phế nang và tích tụ dịch tiết trong phế nang Trong nhiễm trùng phức hợp giữa PRRSV và Mycoplasma hyopneumoniae, tính chất nhiễm

Mycoplasma hyopneumoniae đặc trưng làm tăng sinh mô lympho xung quanh tiểu

phế quản (Thacker và ctv, 1999; trích dẫn bởi Bochev, 2007)

Trong một thí nghiệm gây đồng nhiễm Mycoplasma hyopneumoniae và

PCV2, các hình ảnh tương tự được quan sát thấy như trong nhiễm trùng

Mycoplasma hyopneumoniae và PRRSV, tổn thương trầm trọng hơn nhiều so với

những trường hợp chỉ nhiễm Mycoplasma hyopneumoniae (Opriesnig và ctv, 2004;

trích dẫn bởi Bochev, 2007) Viêm phổi kẽ với sự xâm nhập của đại thực bào và

nhiều tế bào lympho vào vách phế nang, mô lympho tăng sinh quanh tiểu phế quản

và mạch máu

Trong trường hợp nhiễm ghép Mycoplasma hyopneumoniae và SIV, ở ngày

nhiễm thứ 14, vùng phổi viêm lan rộng hơn so với khi chỉ bị nhiễm MH hoặc SIV

Nhưng khi đến ngày nhiễm thứ 21, vùng viêm có kích thước tương tự như khi chỉ bị nhiễm Mycoplasma hyopneumoniae Quan sát bệnh tích vi thể cho thấy xung quanh

phế nang và mạch máu có sự xâm nhập của tế bào lympho, bong tróc tế bào biểu

mô đường hô hấp (Thacker và ctv, 2001; trích dẫn bởi Bochev, 2007)

Khi các tác nhân gây bệnh hô hấp phức hợp có sự hiện diện của P

multocida, bệnh tích của phổi sẽ nặng hơn rõ rệt với đặc trưng là phần trên của thùy hoành cách mô chuyển từ màu đỏ sẫm sang màu xám và những vùng khác có màu

đỏ hồng hoặc gần như bình thường Mô lành và mô bệnh có ranh giới rõ ràng, có

thể tìm thấy dịch tiết trong đường hô hấp, đôi khi có bệnh tích viêm màng phổi (Schwartz, 2002 và trích dẫn bởi Bochev, 2007)

Sự tham gia của S suis thường dẫn đến áp xe phổi Các sự biến đổi mô khác

nhau tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của bệnh Trong trường hợp APP là tác nhân lây nhiễm thì phổi bị hư hại nghiêm trọng và các vùng viêm lan rộng (Schwartz, 2002; Thacker, 2002; trích dẫn bởi Bochev, 2007 ) APP gây ra hoại tử và viêm

phổi, ảnh hưởng đến toàn bộ lá phổi, đặc trưng bởi viêm màng phổi sợi huyết và viêm dính giữa các thùy (bệnh tích định vị chủ yếu ở thùy hoành cách mô và thùy tim)

Theo Hansen và ctv (2010), trong phổi viêm do bệnh hô hấp phức hợp sự tổn thương cấp tính được xác định rõ khi tế bào bạch cầu trung tính, bạch cầu chiếm ưu

thế trong các tế bào viêm, phù thũng lan rộng hoặc dịch viêm có sợi huyết (fibrin)

2.2.5 Ch ẩn đoán

Vì sự chồng chéo trong các dấu hiệu lâm sàng và tổn thương bệnh lý trong

bệnh hô hấp phức hợp đã làm cho việc chẩn đoán các mầm bệnh liên quan khó khăn hơn nhưng lại rất cần thiết để đưa ra phương pháp phòng và trị bệnh Xác định tác nhân gây bệnh có thể được thực hiện bằng các phương pháp như nuôi cấy phân lập,

phương pháp hóa mô miễn dịch trên mẫu mô thu được, chẩn đoán huyết thanh học

ẩm trước khi cho ăn

và tỷ lệ chết trên heo thịt (Joisel và ctv, 2007) Tại Canada ghi nhận làm giảm tỷ lệ

chết sau 6 tháng sử dụng vắc-xin (Plourde và Machell, 2007) Vắc-xin trên heo con cho thấy giảm nhiễm vi-rút trong máu và bệnh tích vi thể, thậm chí có sự xuất hiện

của kháng thể mẹ truyền (Opriessnig và ctv, 2008), cải thiện rõ nét tình hình heo

bệnh PRDC (Fachinger và ctv, 2008) Một số vắc-xin Dịch tả heo thường dùng hiện nay: Vắc-xin nhược độc đông khô chủng C của NAVETCO, 15-30 ngày tuổi; Vắc-xin nhược độc PESTIFFA của Rhône-Merieux (Pháp), 30 ngày tuổi; Vắc-xin nhược độc PESTVAC (Mỹ), 1 tuần trước tuổi phát bệnh; PORCILIS PESTI (Hà Lan), 6

tuần tuổi (sớm hơn nếu heo có kháng thể mẹ truyền thấp)

Ngoài tiêm phòng và các phương pháp điều trị kháng sinh, thay đổi phương

thức quản lý cũng là một biện pháp giảm thiểu mầm bệnh Hệ thống thông gió không phù hợp, mật độ nuôi quá dày, sự chênh lệch nhiệt độ cần được giải quyết

bởi vì chúng gây stress và tổn hại đường hô hấp Tối ưu biện pháp quản lý đàn heo được thực hiện để làm giảm lây truyền các mầm bệnh Áp dụng các biện pháp an toàn sinh học để tránh lây lan mầm bệnh cũng như tiêu diệt mầm bệnh Giới hạn sự

ra vào khu vực chăn nuôi của những người không phận sự Trại chăn nuôi cần xây

dựng chương trình định kỳ sát trùng chuồng trại

2.3 Phương pháp PCR

2.3.1 Gi ới thiệu sơ lược về PCR

PCR là một phương pháp dùng để khuếch đại đoạn gen lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase và một cặp

mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học và y học nhằm phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen và xác định huyết thống

2.3.2 Nguyên t ắc của phương pháp PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1 (biến tính DNA): ở điều kiên nhiệt độ cao (thường 940

C – 950C trong vòng 30 giây – 1 phút), phân tử DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn Chính hai mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch

bổ sung

Bước 2 (ủ bắt cặp): nhiệt độ hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các

mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 400

C – 700C tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30 –

60 giây tùy thuộc vào kích thước sản phẩm khuếch đại

Bước 3 (kéo dài): nhiệt độ được tăng lên đến 720C, dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch

khuôn Mạch mới tạo thành từ mồi được nối dài Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại

Trong phản ứng PCR, một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ lặp lại nhiều lần, làm gia tăng số lượng sản phẩm theo cấp số nhân Theo tính toán sau 30 đến 40 chu

kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106

bản sao Sau phản ứng PCR, các DNA sản

phẩm có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose

rồi nhuộm bởi ethidium bromide và quan sát dưới tia UV

2.3.3 Thành ph ần của phản ứng PCR

Taq DNA polymerase

Là enzyme poly merase chịu nhiệt, dùng để xúc tác sự tổng hợp đoạn DNA

mục tiêu từ khuôn mẫu

Đoạn mồi hay primer

Là yếu tố quan trọng nhất quyết định đến tính hiệu quả và đặc trưng của

phản ứng khuếch đại Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR và

phải tuân thủ một số nguyên tắc sau:

Cặp mồi gồm một mồi xuôi và một mồi ngược Xuôi và ngược là so với chiều sao mã Trong hầu hết các phản ứng PCR, hai đoạn mồi xuôi và mồi ngược

phải có nồng độ bằng nhau

Trình tự của mỗi đoạn phải được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung

giữa mồi xuôi và mồi ngược và không có sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một mồi

Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa

Mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên gen

Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ

tối ưu trên những mồi có trình tự nhỏ hơn 1kb

Các nucleotide (dNTP)

Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ 20-200µM/ mỗi loại nucleotide Nếu nồng độ cao hơn sẽ dẫn đến sự khuyếch đại sản phẩm dương tính

giả hay tạp nhiễm Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase

MgCl 2

Nồng độ ion Mg2+cũng là một nhân tố ảnh hưởng lớn đến quá trình khuyếch đại Nồng độ Mg2+

cao làm cho phần tử DNA dạng xoắn đôi ổn định hơn và ngăn

cản sự biến tính hoàn toàn của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR

ít đi Lượng Mg2+ dư thừa còn làm cho hiện tượng bắt cặp giả trên dây DNA đơn

xảy ra ổn định hơn cho ra những sản phẩm không mong muốn với số lượng khá lớn Ngược lại nếu nồng độ Mg2+

quá thấp nó sẽ làm xấu đi quá trình kéo dài, trong đó

Mg2+đóng vai trò đồng yếu tố của Taq polymerase

Do đó người ta cần phải xác định nồng độ tối ưu của Mg2+

nhằm đảm bảo số lượng sản phẩm và sự chuyên tính của sản phẩm PCR (Quách Tuyết Anh, 2003)

Buffer

Buffer để duy trì pH cho phản ứng PCR thường là Tris-Cl được điều chỉnh

pH từ 8,3 đến 8,8 ở nhiệt độ phòng, có nồng độ 10 mM trong phản ứng, khi ủ ở

720C (nhiệt độ ở pha kéo dài), pH của toàn bộ hỗn hợp phản ứng là khoảng 7,2

Nước

Nước dùng trong phản ứng PCR là nước cất hai lần đã hấp khử trùng

DNA khuôn m ẫu

Là đoạn DNA chứa trình mục tiêu, có thể được thêm vào hỗn hợp dưới dạng chuỗi đơn hay chuỗi đôi DNA dạng vòng thì không hiệu quả bằng DNA dạng

thẳng Nồng độ DNA mẫu ở khoảng 50ng/µl là thích hợp cho một phản ứng PCR

2.3.4 Ưu nhược điểm của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu quan trọng do các ưu điểm sau:

Độ nhạy rất cao

Thời gian thực hiện nhanh

Độ tinh sạch của mẫu không cần cao

Lượng mẫu cần ít

Tuy nhiên, phương pháp này có nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả, như:

Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuyếch đại là giới hạn đầu tiên Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với

những đoạn DNA lớn hơn 3000 bp Việc thực hiện phương pháp PCR với các DNA

có độ dài dưới 1500 bp cho kết quả tốt Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm

Tiếp đó sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR

Sự sao chép bởi taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10-4

, nghĩa là cứ 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide) Đặc tính này không quan trọng nếu ta

chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của sản phẩm khuyếch đại, nhưng có ý nghĩ lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA

Kỹ thuật viên phải có trình độ chuyên môn cao

Trang bị máy móc hiện đại, đắt tiền

2.3.5 Phương pháp điện di trên gel

Mục đích: Kiểm tra sự hiện diện của DNA

Nguyên tắc của phương pháp điện di: Trong một điện trường các phân tử sẽ

di chuyển với vận tốc tùy thuộc vào điện tích và kích thước của chúng Nếu hai phân tử có cùng khối lượng thì phân tử nào có điện tích cao hơn thì sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn Những phân tử nào có kích thước nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn, những phân tử có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển chậm hơn

Đối với phân tử DNA việc điện di được thực hiện trên giá thể bán rắn dạng gel Gel là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi qua Kích thước phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm Có hai

dạng gel được sử dụng tùy theo kích thước và mức độ phân tách của phân tử acid nucleotide, đó là: gel agrose và gel polyacrylamide

Gel agrose cho những lỗ có đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thước 300-10000 bp Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau

Gel polyacrylamide cho những lỗ nhỏ thích hợp để phân tách những đoạn DNA có kích thước dưới 500bp hiệu quả phân tách có thể đạt 1 nucleotide Gel polyacrylamide ở dạng lỏng là chất gây độc cho hệ thần kinh nên phải cẩn thận khi

miễn dịch dưới kính hiển vi điện tử và thấp nhất là kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

Nghiên cứu của Đỗ Tiến Duy (2004) về chẩn đoán Mycoplasma

hyopneumoniae dựa vào bệnh tích đại thể, vi thể và kỹ thuật ELISA trên heo thịt

giết mổ tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong Tp.HCM Bệnh tích đại thể và

vi thể đặc trưng do MH gây ra, cho kết quả nghi ngờ dương tính cao nhưng không điển hình cho bệnh tích do MH nên các phương pháp này bổ sung cho các phương pháp chẩn đoán khác như ELISA, PCR và nuôi cấy phân lập

Lâm Thị Thu Hương và ctv (2005) bước đầu ghi nhận sự hiện diện của vi-rút PCV2 trên heo có biểu hiện hô hấp tại 4 trại chăn nuôi công nghiệp Các tác giả thu

thập 25 mẫu hạch (hạch bẹn, hạch phổi và hạch ruột) heo còi và sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện Kết quả có ¾ trại dương tính theo tỷ lệ 25 – 60%

Cho đến nay, PCV2 có mặt hầu hết các quốc gia trên thế giới, gây thiệt hại

lớn cho nền chăn nuôi heo, trong đó có Việt Nam Theo kết quả khảo sát của Lâm

Thị Thu Hương và Đường Chi Mai (2006) tại trại heo công nghiệp ở TP HCM và vùng phụ cận cho biết tỷ lệ nhiễm PCV2 ở các trại rất biến động từ 12,5 – 83,33

Lê Tiến Dũng (2006) bằng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) đã phát

hiện 50,77% heo còi dương tính với vi-rút PCV2 tại 17 trên 22 trại khác nhau của 5 trên 6 địa bàn lấy mẫu Tỷ lệ heo còi dương tính với vi-rút có biểu hiện hô hấp là 62,5%

Hansen và ctv (2010) đã khảo sát mô bệnh học phổi viêm và các mầm bệnh

có liên quan đến PRDC ở Đan Mạch bằng phương pháp phân lập vi khuẩn và kỹ