KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO KHÔNGSỬ DỤNG CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG TRÊN MỘT SỐ TỔ HỢP LAI LAN DENDROBIUM MINI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO KHÔNGSỬ DỤNG CHẤT ĐIỀU HOÀ SI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO

KHÔNGSỬ DỤNG CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG

TRÊN MỘT SỐ TỔ HỢP LAI LAN DENDROBIUM MINI

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG THẾ PHONG Niên khoá: 2011 - 2013

Tháng 12/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO

KHÔNG SỬ DỤNG CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG

TRÊN MỘT SỐ TỔ HỢP LAI LAN DENDROBIUM MINI

ThS NGUYỄN VĂN VINH

i

LỜI CẢM ƠN

Để trưởng thành và đạt được kết quả như ngày hôm nay, trước tiên con xin gửi

lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn ủng hộ, động viên và là chỗ dựa tinh thần

vững chắc nhất cho con trong suốt thời gian học đại học cũng như trong quá trình thực

hiện đề tài

Tôi chân thành gửi lời cám ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm

Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả

thầy cô đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian theo học tại trường

Tôi xin chân thành gửi lời biết ơn đến Thầy Bùi Minh Trí đã quan tâm, tận tình chỉ

bảo và cho tôi những ý tưởng, định hướng đề tài, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi

trong quá trình làm đề tài

Tôi cũng xin gửi lời biết ơn đến Thầy Nguyễn Văn Vinh đã trực tiếp hướng dẫn

tận tình và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu

Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn đến Sở Khoa Học Công Nghệ Thành phố Hồ

Chí Minh đã cung cấp kinh phí cho đề tài “Nghiên cứu lai tạo, đột biến và chọn lọc

một số dòng lan Dendrobium mini mới có triển vọng”, chủ nhiệm đề tài Thạc sĩ

Nguyễn Văn Vinh

Tôi xin chân thành cảm ơn các cô, chú tại “Trạm huấn luyện và thực nghiệm nông

nghiệp Văn Thánh” thuộc “Trung tâm khuyến nông thành phố Hồ Chí Minh” đã tạo

điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin cảm ơn các anh chị thuộc phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học thực vật

Đại học Nông Lâm Tp.HCM và tập thể lớp LT11SH đã hướng dẫn, giúp đỡ, cũng như

chia sẻ với tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Một lần nữa xin chân thành cảm ơn

Trương Thế Phong

TÓM TẮT

Dendrobium mini thuộc giống Dendrobium nhưng có thân cây thấp, dễ trồng

không đòi hỏi nhiều diện tích trồng, cây cho hoa quanh năm và lâu tàn Hiện nay, trên

thị trường Việt Nam giống Dendrobium mini chưa có độ đa dạng cao, nhiều giống còn

mang những khuyết điểm như: thân cây yếu, phát hoa ngắn Nên việc tạo ra giống lan

Dendrobium mini mới để thỏa mãn nhu cầu thị hiếu của khách hàng và thu lại lợi ích

kinh tế là việc làm cần thiết

Thí nghiệm được tiến hành trên đối tượng là ba tổ hợp lai lan Dendrobium mini

24 x 11, 13 x 16A, 13 x 21A được sử dụng vào ba môi trường Murasgige và Skoog (MS), ½ MS (đa lượng giảm ½ so với MS), Vacind và Went (VW) có bổ sung 150 ml/lit nước dừa, 20 g/lit đường, 7g/lit agar và 0,5 g/lit than hoạt tính Thí nghiệm được

bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Môi trường thích hợp cho hạt nảy mầm là môi trường ½ MS + 7 g/lit agar+ 30 g/lit đường môi trường Môi trường nhân nhanh chồi tốt nhất là môi trường ½ MS + 150ml/lit nước dừa + 20g/litđường + 7g/lit agar + 0,5 g/lit than hoạt tính môi trường Môi trường tạo rễ tốt nhất là môi trường MS + 150ml/lit nước dừa + 20g/litđường + 7g/lit agar + 0,5g/lit than hoạt tính môi trường

Từ khóa: Dendrobium, nuôi cấy mô, nhân giống hoa lan

iii

SUMMARY

Dendrobium mini is genus of Dendrobium with lower trunk, easy to grow not

require a lot of acreage, tree to flower all year Currently, Dendrobium mini have not

high diversity in Vietnam market, many still carry the same defects such as weak

trunk, short inflorescence So creating new Dendrobium mini orchids to satisfy the

needs and tastes of customers capture economic benefits is necessary

The experiment was conducted on three Dendrobium mini orchid hybrid

combinations24 x 11, 13 x 16A, 13 x 21A seeds more sown in three media was Murasgige and Skoog (MS), ½ MS (macro half compared with MS), Vacind and Went (VW) supplemented with 150 ml/ lit of coconut water, 20 g sugar/ lit, 7 g agar/ lit and 0,5 g/ lit activated charcoal The experiment layout was completely randomifed design with 3 repetitions

The appropriate medium for seed germination was ½ MS + 7 g agar + 30 g sugar/liter medium The best shoots multiply medium was ½ MS + 150 ml coconut water + 20 g sugar + 7 g agar + 0.5 g activated carbon/liter medium The best medium for rooting was MS + 150 ml coconut water + 20 g sugar + 7 g agar + 0.5 g activated carbon/liter medium

Key words: Dendrobium, tissue culture, orchid breeding

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình và biểu đồ viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2.Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về giống lan Dendrobium và Dendrobium mini 3

2.1.1 Đặc điểm của lan Dendrobium 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái 5

2.1.3 Ảnh hưởng của điều kiện sinh thái đến sinh trưởng, phát triển của lan Dendrobium 7

2.1.3.1 Yêu cầu nhiệt độ 7

2.1.3.2 Yêu cầu độ ẩm và chế độ tưới nước 7

2.1.3.3 Yêu cầu ánh sáng 8

2.1.3.4 Nhu cầu dinh dưỡng 8

2.1.3.5 Sâu bệnh và các vấn đề khác 8

2.2 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.3 Những khó khăn và lợi ích trong nhân giống in vitro 10

2.3.1 Những khó khăn trong nhân giống in vitro 10

2.3.2 Những lợi íchtrong nhân giống in vitro 10

2.4 Các phương pháp nhân giống lan Dendrobium 11

2.4.1 Các phương pháp nhân giống Dendrobiumngoài thiên nhiên 11

v

2.4.1.1 Nhân giống vô tính 11

2.4.1.2 Nhân giống hữu tính 11

2.4.2 Nhân giống Dendrobiumtrong phòng thí nghiệm 12

2.5 Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

2.5.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật 13

2.5.2 Kỹ thuật gieo cấy hạt lan trong phòng thí nghiệm 13

2.5.2.1 Đặc điểm của hạt lan 13

2.5.2.2 Khử trùng trái lan 13

2.6 Các công trình nghiên cứu về môi trường nuôi cấy lan Dendrobium và Dendrobium mini 14

2.7 Kỹ thuật lai tạo lanDendrobium 15

2.7.1 Chọn lọc bố mẹ 15

2.7.2 Kỹ thuật thụ phấn 15

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Vật liệu giống nghiên cứu 17

3.3 Hóa chất và vật tư 18

3.4 Dụng cụ và thiết bị 18

3.5 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

3.5.1 Thí nghiệm 1 19

3.5.2 Thí nghiệm 2 20

3.5.3 Thí nghiệm 3 21

3.6 Xử lý số liệu 22

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Môi trường gieo hạt thích hợp cho 3 tổ hợp lan laiDendrobium mini 23

4.1.1 Tổ hợp 24(♀) x 11(♂) 23

4.1.2 Tổ hợp 13(♀) x 16A(♂) 25

4.1.3 Tổ hợp 13(♀) x 21A(♂) 27

4.2 Môi trường nhân chồi thích hợp cho 3 tổ hợp lai lan Dendrobium mini 29

4.2.1 Tổ hợp 24(♀) x 11(♂) 29

4.2.2 Tổ hợp 13(♀) x 16A(♂) 31

4.2.3 Tổ hợp 13(♀) x 21A(♂) 32

4.3 Môi trường ra rễ thích hợp cho 3 tổ hợp lan lai Dendrobium mini 34

4.3.1 Tổ hợp 24(♀) x 11(♂) 35

4.3.2 Tổ hợp 13(♀) x 16A(♂) 36

4.3.3 Tổ hợp 13(♀) x 21A(♂) 38

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC

vii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BAP 6-benzyl aminopurine

NAA α-naphthaleneacetic acid

Murasgige và Skoog MS

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Thông tin các tổ hợp lai sử dụng nhân giống 17

Bảng 3.2 Các nghiệm thức gieo hạt lan lai Dendrobium mini 19

Bảng 3.3 Các nghiệm thức nhân chồi lan lai Dendrobium mini 20

Bảng 3.4 Các nghiệm thức tạo rễ lan lai Dendrobium mini 21

Bảng 4.1 Sự chuyển biến hình thái của hạt lan lai của tổ hợp 24(♀) x 11(♂) khi được nuôi cấy trên 3 môi trường khác nhau 23

Bảng 4.2 Sự chuyển biến hình thái của hạt lan lai của tổ hợp 13(♀) x 16A(♂) khi được nuôi cấy trên 3 môi trường khác nhau 25

Bảng 4.3 Sự chuyển biến hình thái của hạt lan lai của tổ hợp 13(♀) x 21A(♂) khi được nuôi cấy trên 3 môi trường khác nhau 27

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng, phát triển chồi của tổ hợp lan lai 24(♀) x 11(♂) 29

Bảng 4.5Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng, phát triển chồi của tổ hợp lan lai 13(♀) x 16A(♂) 31

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng, phát triển chồi của tổ hợp lan lai 13(♀) x 21A(♂) 33

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự ra rễ của tổ hợp lan lai 24(♀) x 11(♂) 35

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự ra rễ của tổ hợp lan lai 13(♀) x 16A(♂) 37

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự ra rễ của tổ hợp lan lai 13(♀) x 21A(♂) 38

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Trang

Hình 2.1 Lan Dendrobium mini 4

Hình 2.2 Cấu tạo cơ quan sinh sản của lan Dendrobium 6

Hình 2.3 Một số giống hoa Dendrobium 9

Hình 3.1 Hạt lan Dendrobium mini trước và sau khi cấy 17

Hình 4.1 Sự chuyển biến hình thái của hạt lan lai Dendrobium minitổ hợp 24(♀) x 11(♂) 24

Hình 4.2Sự chuyển biến hình thái của hạt lan lai Dendrobium minitổ hợp 13(♀) x 16A(♂) 26

Hình 4.3 Sự chuyển biến hình thái của hạt lan lai Dendrobium minitổ hợp 13(♀) x 21A(♂) 28

Hình 4.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển của chồi lan lai tổ hợp 24(♀) x 11(♂) 30

Hình 4.5 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển của chồi lan lai tổ hợp13(♀) x 16A(♂) 32

Hình 4.6 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển của chồi lan lai tổ hợp 13(♀) x 21A(♂) 34

Hình 4.7 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự ra rễ của tổ hợp lai 24(♀) x 11(♂) 36

Hình 4.8 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự ra rễ của tổ hợp lai 24(♀) x 11(♂) 37

Hình 4.9Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự ra rễ của tổ hợp lai 13(♀) x 21A(♂) 39

khẩu chiến lược của nhiều quốc gia

Chẳnghạnchỉvới loạihoachủ lực làDendrobium,TháiLanđãxuấtkhẩuđạt

doanhthugần600triệuUSDmỗinăm.TheothốngkêcủaBộNôngnghiệpHoaKỳ, năm 2000,tổngsảnlượnglanbánrathị trườngđạtxấp xỉ100.000.000USD,trongđó

Phalaenopsischiếm 75 %(Griesbach,2002).Bêncạnhđó,ởcácnướcpháttriển như Anh,

Mỹ, Đức, Ý, Singapore, Hồng Kông đều nhập khẩu rấtnhiều phong lan ViệtNam chúngtacũngcónhiềutriểnvọngkinhdoanhxuấtkhẩuphonglan(Huỳnh Văn Thới, 2005)

Hiện nay, các loài Dendrobium mini đang được ưa chuộng tại Việt Nam và các thị

trường khác như Nhật Bản và Hàn Quốc với nhiều nguyên nhân khác nhau như giá thành

rẻ, dễ trồng, không đòi hỏi nhiều diện tích trồng, cây cho hoa quanh năm và lâu tàn (2 – 3 tháng) nên mang lại lợi nhuận cao (Nguyễn Thị Mỹ Duyên, 2004) Một số giống lan

Dendrobium mini với sắc hoa từ trắng tuyền đến hồng, hồng phớt, hồng nhạt và điểm

vàng Tuy nhiên, thị trường Việt Nam hiện nay, giống lan Dendrobium mini màu sắc

không đa dạng, nhiều giống còn mang những khuyết điểm như thân cây yếu, phát hoa

ngắn Nên việc tạo ra và nhận nhanh giống lan Dendrobium mini mới để thỏa mãn nhu

cầu thị hiếu của khách hàng và thu lại lợi ích kinh tế là một việc làm cần thiết

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, đề tài được thực hiện: “Khảo sát môi trường nuôi

cấy in vitro không sử dụng chất điều hoà sinh trưởng trên một số tổ hợp lai lan

Dendrobium mini”

1.2 Yêu cầu

Xác định được môi trường nuôi cấy thích hợp cho ba tổ hợp lai lan Dendrobium

mini

1.3Nội dung thực hiện

- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển của hạt lan lai từ ba tổ hợp 24(♀) x 11(♂), 13(♀) x 16A, 13(♀) x 21A(♂)

- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển của chồi lan lai từ ba tổ hợp 24(♀) x 11(♂), 13(♀) x 16A, 13(♀) x 21A(♂)

- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo rễ của ba tổ hợp lai lan 24(♀) x 11(♂), 13(♀) x 16A, 13(♀) x 21A(♂)

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về giống lan Dendrobiumvà lan Dendrobiummini

Dendrobium là loài lan sống trên các cành cây nhưng không cộng sinh, phân

bố nhiều ở Châu Âu và Nam Thái Bình Dương, được tìm thấy nhiều ở Châu Úc,

Tân Guinea, Thái Lan, Việt Nam và dãy núi Himalaya Dendrobium được trồng phục vụ cho lan chậu và lan cắt cành Hiện nay, thị trường Dendrobium ngày càng

đa dạng và phong phú do các loại lan lai có nguồn gốc khác nhau Dendrobium là loại hoa cắt cành phổ biến ở Thái lan như: Dendrobium Anna, Blue, Bangkok Land,

Big White, Candy, Candy Kiss, Casablanca, Caesar, Channel, Chidchom, Intuwong, Juliana, Madame Pompadour, Marco Polo Madame Pompadour, Mary Mak, Missteen, Nina, Royal Pink, Sabin, Sakura, Siam Ruby, Sonia, Walter Oumae, Yoko, Waipahu (Dương Công Kiên, 2003)

Dendrobium là loài đa thân với nhiều giả hành, các giả hành thường mang

một thân với nhiều lá mọc xen kẽ, trên thân có rất nhiều mắt ngủ Hoa có thể mọc từ thân thành từng chùm hay từng hoa Hoa có màu trắng, vàng đến tím Thường lá đài sau nằm một mình, hai lá đài bên dài ra dính lại với nhau ở mép dưới và dính vào đáy của trụ tạo thành một phần dưới chân của trụ phía dưới gọi là cằm Môi gắn vào cằm, đôi khi kéo dài về phía sau tạo thành cựa, móc hay túi Môi nguyên hay có thùy, gai, sọc có lông hoặc không Hai cánh hoa bên giống như hai lá đài Trụ thấp, phần đực của đỉnh trụ có nắp đậy, nắp gắn vào trụ nhờ một chỉ ngắn về phía sau, bốn khối phấn nhỏ dính lại với nhau từng cặp (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

Lan Dendrobium mini là một loài lai tạo, thân đứng Loài lan này được chọn lọc từ

Thái Lan và được du nhập vào nước ta Đặc điểm của loài lan này là cây dạng bụi, lùn (chỉ cao 15 – 20 cm), nhưng rất siêng hoa, hoa nở quanh năm Cây nhỏ nhưng nhảy chồi rất mạnh, nhảy chồi ngay cả trên các thân già hay cây suy yếu Hoa có kích thước không lớn chỉ khoảng 4 x 5cm nhưng hoa rất đẹp, số hoa trên cành nhiều từ 6 - 13 hoa, hoa rất bền lâu tàn (1,5 – 2 tháng) Thông thường trên một giả hành có tới 3 - 4 phát (cành) hoa, nếu cây tốt có thể lên đến 5 phát hoa (Nguyễn Thị Mỹ Duyên, 2009)

2.1.1 Đặc điểm lan Dendrobium

Dendrobium thuộc lớp một lá mầm Monocotyledones, bộ Orchidales,

họOrchidaceae, họ phụ Epidendroideae, tông Epidendreae, giốngDendrobium

HọOrchidaceaecókhoảng750chi,25.000loài,chiếm vịtríthứhaisauhọCúc trongngànhthựcvậthạtkínvàlàhọlớnnhấttrongngànhmộtlámầm.Cácloàitrong hệ thốngnàyphânbốrấtrộng,dođóhìnhtháivàcấu tạo cũnghếtsứcđadạngvàphức tạp (Dương Công Kiên, 2006)

Hình 2.1 Lan Dendrobium mini

Theo Huỳnh Văn Thới (2005), tên Dendrobiumcó nguồn gốctừ chữ Hy Lạp Dendronnghĩalàcâygỗvàbioslàtôisống.Dendrobium làgiốngphụ sinh, sống trên cây gỗ

Có người gọi là Hoàng Lan, có người gọi là Đăng Lan.Dendrobiumcótrên 1.600 loài

và chia thành 2 dạng chính:

+ Dạng đứng(Dendrobium phalaenopsis) thườngmọc ở xứnóng,chịu ẩm và rất

siêng ra hoa với các giống tiêu biểu như: Nhất điểmhồng, Nhất điểmhoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên, Sonia

+Dạngthòng (Dendrobiummobile) chịukhíhậu mátmẽ với các giống tiêu biểu

như:Giảhạc,Hạcvĩ,Long tu, Phi điệpvàng

Với1.600loàikhácnhauđòihỏinhiềucáchchămsóckhácnhau,nguyêndolà

vìchúngdunhậptừnhiềuđịadanhkhácnhau như:NhậtBản, TriềuTiênvàNewzealand, đặc

biệt là Guinea là nơisản sinh ra nhiều loài Dendrobiumnhất (Thiên Ân, 2002) ỞViệtNam,Dendrobiumcóđến100loài,xếptrong14tôngđượcphânbiệt bằng thân (giả

hành), lá và hoa (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

2.1.2 Đặc điểm hình thái

TheoNguyễnCôngNghiệp(2004)thìkhôngcómộthìnhdạngchungnhấtvề

hoavàdạngcâydosốlượngquálớn,phânbốrộngrãi.RiênggiốnglanDendrobium đều có bộ

phận sinh dưỡng như rễ, thân, giả hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, trái

Dendrobium cóhệrễkhísinh,cómộtlớphútẩm dàybaoquanhgồm nhữnglớptế

bàochếtchứađầykhôngkhínênrễánhlênmàuxanhbạc.Vìvậyrễhútđượcnước

mưachảydọctrênvỏ câygỗhaynướclơ lửngtrongkhôngkhí,hơi sươngvàhơinước, giúp cây hút dinh dưỡng và chấtkhoáng,mặt khác giúp cây bám chặt vào giá thể, không bịgiócuốn.Mộtsốloàicóthânlákém pháttriển thậmchítiêugiảm hoàntoàn,cóhệrễ chứadiệplụctốgiúpcâyhấpthụánhsángcầnthiếtchosựrahoavàquanghợp (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

RễlanDendrobium cũnggiốngnhưrễlanVũNữ,Cattleyathuộcloại rễbángió,

khôngchịuđượclạnh,nếubịlạnhtrongthờigiandài rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị chết(Dương Công Kiên, 2006)

Nhómnàythườngcórễnhỏnhưngrấtnhiềurễ,chủyếubámvàogiáthể,vàothâncây

đểhútdưỡngchấtdínhvàogiáthểnhưnước,chonênkhitrồngvàochậu,phảiđểgiá

thểnhiềuhơn,gầnnhưtoànbộrễđềubám vàogiáthể,vàothànhchậu,chỉcómộtsốít rễchìarangoài.Đốivớilan rễbángióphảitrồngvớigiáthể nhỏhơnvànhiềuhơn,để bộ rễ bámdàyđặc hút nhiều dưỡngchất (Huỳnh Văn Thới, 2005)

Thân: Dendrobium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là nhóm hợp trục) có hệ

thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ

Một số Dendrobium lá chỉ có ở các mầm non, là loài chống tàn, chống vàng úa và

rụng vào mùa thu, thân phình to giống như củ không có lá là nơi dự trữ năng lượng (Trần Văn Bảo, 1999)

Giả hành: Là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân có lá mọc xen kẽ Một số loài ở xứ lạnh chỉ

Các loài thuộc giống Dendrobium vùng nhiệt đới nói riêng và họ Orchidaceae

nói chung đôi khi rụng lá vào mùa khô hạn Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi mới (Trần Văn Bảo, 1999)

Hoa: Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá Chồi hoa mọc từ các mắt

ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn cây Sự biểu hiện trước khi ra hoa khác biệt như có nhiều loài rụng hết lá trước khi ra hoa Thời gian ra hoa đầu mùa

mưa hay đầu tết Giống Dendrobium khi đủ dinh dưỡng thì cho hoa thành từng chùm,

phát hoa dài và thời gian ra hoa trung bình 1-2 tháng (Nguyễn Công Nghiệp, 2004) Trái: Họ Orchidaceae đều có quả thuộc loại quả nang, khi hạt chín, các nang bung ra chỉ còn dính nhau ở phần đỉnh và gốc Ở một số loài, khi chín quả không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát (Dương Công Kiên, 2002)

Hình 2.2 Cấu tạo cơ quan sinh sảncủa lan Dendrobium a Cấu tạo hoa chi tiết,

b Quả lan khi chín

b

a

2.1.3 Ảnh hưởng của điều kiện sinh thái đến sinh trưởng, phát triển của lan

Dendrobium

2.1.3.1 Yêu cầu nhiệt độ

Nhiệt độ tác động ở cây lan qua con đường quang tổng hợp, cường độ quang hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10% thì tốc độ quang hợp tăng lên gấp đôi Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến sự ra hoa ở một số loài lan như lan Bạch Câu

Dendrobium crumenatum đòi hỏi giảm nhiệt độ khoảng 5 - 6oC trong vài giây thì 9 ngày sau chúng sẽ nở hoa đồng loạt Ở 18,5oC Dendrobium nobile chỉ tăng trưởng mà không ra

hoa nhưng chúng sẽ ra hoa khi nhiệt độ hạ xuống 13oC hay thấp hơn (Trần Hợp, 1998)

Căn cứ vào nhu cầu nhiệt độ, có thể tạm chia Dendrobium thành hai nhóm

chính:

- Nhóm ưa lạnh sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ lý tưởng là 150C, gồm các giống được lấy từ các vùng cao nguyên ở độ cao trên 1.000m các loài này nếu được trồng ở nhiệt độ cao hơn hoặc bằng 25oC, thì cây vẫn sống nhưng hiếm khi ra hoa

- Nhóm ưa nóng, nhiệt độ thích hợp cho các loài của nhóm này

là 25oC, gồm đa số các giống Dendrobium ở vùng nhiệt đới, và các loài của giống

Dendrobium lai hiện đang trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam

(Nguyễn Xuân Linh, 2002)

Ngoài ra, còn có một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng lạnh

và vùng nóng, nhưng ở vùng lạnh cây sinh trưởng và ra hoa nhiều hơn như

Dendrobium primulinum, Dendrobium farmeri nhiệt độ lý tưởng của các loài này là 20oC (http://orchid.com.vn)

2.1.3.2 Yêu cầu độ ẩm và chế độ tưới nước

Các cây lan, sống bám trên các cây cao, chúng lấy nước từ các trận mưa, từ hơi nước trong không khí Chính ẩm độ quyết định sự hiện diện của các loài phong lan Trong thời kỳ sinh trưởng cần tưới đủ, nhất là vào mùa nóng Giữa các lần tưới cần xem xét các giá thể trồng có bị đọng nước không Khô hoặc gần khô là tốt nhất Phải đảm bảo cho giá thể trồng được thông thoáng làm cho rễ lan có lúc khô, và được khô từng lúc là điều rất quan trọng Chế độ thở của lan có một phần nhờ vào rễ.Thời kỳ sinh trưởng độ ẩm cần từ 60 đến 70 % Thời kỳ nghỉ cần giảm thích đáng (http://orchid.com.vn)

2.1.3.3 Yêu cầu ánh sáng

Dendrobium là loài lan ưa sáng (60 – 70 %), rất thích hợp với ánh sáng mạnh, có

những loài yêu cầu ánh sáng tới 80 – 90 % Nhờ đó mà chúng phát triển được các giả hành thật mạnh mẽ, tất nhiên không để ánh nắng chiếu trực tiếp có thể làm cháy lá (Vũ Ngọc Phương và cs, 2007) Do đặc tính này nên việc nuôi trồng trong nhà hoặc dùng ánh sáng nhân tạo thực tế không thuận tiện, dễ dàng

2.1.3.4 Nhu cầu dinh dưỡng

Dendrobium thân đứng đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần rất nhiều phân bón

và có thể dùng nhiều dạng phân bón khác nhau Còn các loại Dendrobium thân

thòng hấp thu phân chậm nên phải dùng nồng độ thật loãng

Các loại phân hữu cơ như: phân heo, bánh dầu khô, phân tôm cá, phân trâu

có thể dùng rất tốt bằng cách phân bò khô pha loãng với nước rồi tưới, hoặc vò chặt từng viên đặt trên bề mặt giá thể, rễ lan sẽ hấp thụ dần dần các dưỡng chất được phóng thích qua quá trình tưới nước Các loại phân vô cơ được dùng thường có công thức 30 – 10 – 10 dùng 3 lần/tuần với nồng độ 1 muỗng cà phê/4 lít Trong suốt mùa tăng trưởng, ta bón phân 10 – 20 – 30 làm 2 lần/tuần để tạo một sức chịu đựng cho cây trước khi bước vào mùa nghỉ Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, thay phân 30 –

10 – 10 bằng phân 10 – 20 – 20 với chu kỳ bón như trên cho đến khi hoa tàn

Trong mùa nghỉ hoàn toàn không bón phân cho Dendrobium, hay đúng hơn giảm

và không bón phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời kì tăng trưởng hằng năm của

nó Thường phân bón được dùng ở dạng hỗn hợp và bổ sung thêm các chất phụ gia là các sinh tố và các nguyên tố vi lượng (www.hoacaycanh.com)

2.1.3.5 Sâu bệnh và các vấn đề khác

Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và môi

trường xơ dừa sẽ mục nát sau một thời gian ngắn được trồng Đây là 2 nguyên nhân gây ra nhiều sâu bệnh hại

Một loại rệp dính màu vàng, kích thước rất bé thường xuất hiện trên bề mặt lá Loại này gây tác hại trên cây qua việc hút nhựa

Đối với các loài côn trùng cắn phá Dendrobium thì loại trừ chúng tương đối dễ

dàng bằng thuốc bảo vệ thực vật như: Serpa, Bassa, nồng độ 1/500

Mặc dù Dendrobium là cây kháng bệnh rất mạnh, tuy nhiên cây vẫn bị nấm và

virus tấn công nếu điều kiện vệ sinh quá kém Nguy hiểm nhất là bệnh khô thân gần gốc giả hành do một loài virus thâm nhập làm cho các giả hành bị khô và chết

Có thể ngừa bệnh bằng cách xịt Topsil, Zineb, Benomyl với nồng độ 1/400 định

kỳ nửa tháng một lần (www.hoacaycanh.com)

2.2 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Phươngphápnàycóýnghĩavôcùngto lớnđối vớiviệcnghiêncứulýluậnsinh học cơ bản,đồng thời cógiá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống

Vềmặtlýluậnsinhhọccơbản:đãmởrakhảnăngtolớnchoviệctìmhiểu

sâusắcvềbảnchấtcủasựsống.Thựctếđãchophéptáchvànuôicấytrước

hếtlàmôphânsinh(meristem)rồitừđóchoranhómtếbàokhôngchuyênhoágọilà

môsẹo(callus)vàtừmôsẹothìcó thể kích thích tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh

Về mặt thực tiễn sản xuất: Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quí, có giá trị kinh tế cao Hiện nay phương pháp này đã

Hình 2.3 Một số giống hoa Dendrobium

trở thành phổ biến và áp dụng trong công tác chọn giống cây trồng Ngoài ra, bằng phương pháp này chỉ sau thời gian ngắn có thể tạo được sinh khối lớn có hoạt chất sinh học được tạo ra vẫn giữ nguyên được hoạt tính của mình (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.3 Nhữngkhókhăn và lợi ích trong nhân giống in vitro

2.3.1 Khó khăn trong nhân giống in vitro

Tuynhângiốnginvitro đạtđượcnhữngthànhtựuto lớnnhưngcạnhđóđãgặp không ít

khó khăn,theo Nguyễn Văn Uyển và cs (1984) thì có một số khó khăn sau:Nhângiốngtrênmôitrườngagarthìgiáthànhsảnxuấtvẫncòncaovàthời gian nhân giống dài.Khisảnxuấtởquimôcôngnghiệpthìchiphíchonănglượngvànhâncông vẫn còn ở mức cao.Đôi khi xảy ra biến dịsomatrong quá trình nuôi cấy, đặc biệtlàtáisinhthông qua mô sẹo.Giớihạnsựđadạngcủadòngsảnphẩmnhângiốngdocâycontạorathườngđồng nhất về mặt di truyền.Quá trình nhân giốngphức tạp.Tính bất định về mặt di truyền

Nhângiống invitro là tạoquầnthểđồngnhấtvớisố lựợng lớn.Tuynhiêntrong một số

trường hợp phương pháp này cũng tạo ra biến dị soma, mà tế bào môsẹo thì có nhiều biến dị hơn so vớiđỉnh chồi Những nhân tố thường gây ra biến dị soma là:

+ Kiểudichuyền:cácloàicâykhácnhauthìtạo racácbiến dịkhácnhau,nói chung cây càng có mứcđộ bội thể cao thì càng dễ biến dị

+ Số lầncấychuyền:số lầncấy chuyềncàngnhiềuthìđộ biếndịcàngcao Khi nuôi cấy dài hạnthường gây ra biến dị nhiễmsắc thể

+ Ngoài ra, khi cấy chuyền nhiều lần, môi trường phát triển các chồingang cóthể chuyểnsangtạoracácbấtđịnh(adventitiousshoots).Kếtquảlàcóthểtạoracácbiến dị tế bàosoma.Vìvậycâycontạo ra không đồng nhất Đốivớimục đích vi nhân giống, sự tạochồinganglàkỹthuậtthíchhợpđangđượcsử dụng Theonguyêntắc,cáchnày tạo ra đúngkiểu cây (Dương Công Kiên, 2003)

2.3.2 Những lợi ích trong nhân giống in vitro

Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giốngin vitro cónhững ưu điểmsau:Tạo các cây

conđồng nhất và giống cây mẹ.So vớikiểu nhân giống thông thường (chiếtcành,hom),nhângiống bằng nuôi cấymôcóưuđiểm làcó thểnhânmộtsố lượngcâycon lớn từmộtcáthểbanđầutrong một thời gian ngắn.Không chiếmnhiều diện tích trồng.Cóthểcungcấpcâygiốngbấtcứ thờiđiểm nàovìchủđộngđược,dokhôngbị ảnh hưởng bởi thời tiết,điều kiện ngoại cảnh vàtạo ra các cây con sạch bệnh bằng phương

pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp xử lý nhiệt và vi ghép trong ốngnghiệm và

chuyểngen.Mộtsốcâyquícóthểnhânnhanhđểđưavàosảnxuấtvàviệctraođổigiống được dễ dàng

Ngoài ra, kỹ thuật nuôi cấy mô còn giúp cho việc nhân giống hữu tính cácđối tượngquímàvớikỹthuậtnhângiốngthôngthườngkhóthựchiệnđược(nhưtrường

hợpgieohạtlan).Ngàynayđãcónhiềucôngthức môi trường gieo hạt chotừng loại lan (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

2.4 Các phương pháp nhân giống lan Dendrobium

2.4.1 Nhân giống lan Dendrobium ngoài thiên nhiên

2.4.1.1 Nhân giống vô tính

Phương pháp tách bụi là phương pháp đã được các nghệ nhân sử dụng đối với

các giống lan đa thân nhưCattleya, Dendrobium, Cymbidium,

Paphiopelium…ởCattleya, Dendrobium, và những giống tương tự.Ở mỗi gốc của giả

hành thường có ít nhất một mắt ngủ nên có thể tách mỗi hành giả thành một đơn vị để trồng

Phương pháp chiết cành ở Dendrobium thường tạo ra cây con trên giả hành (Keiki)

một cách tự nhiên Khi các cây con này khá mạnh, có rễ tốt,có thể tách ra khỏi giả hành để trồng

2.4.1.2 Nhân giống hữu tính

Sự thụ phấn: Trong thiên nhiên sự thụ phấn ở lan do côn trùng thực hiện Cấu trúc của hoa lan là hoàn toàn để thích ứng cho sự thụ phấn ấy

Có hai phương pháp thụ phấn:

- Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa của bông hoa này được rơi vào nuốm của chính hoa ấy Điều này hiếm khi xảy ra trong tự nhiên ở hoa lan vì cấu trúc của bộ phận sinh dục đực và cái ở hoa lan

- Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này được để vào nuốm của hoa khác của cùng cây hay cùng loài (thường xảy ra trong thiên nhiên do côn trùng thực hiện), hoặc khác loài, khác giống (Nguyễn Vũ Thị Hoàng Uyên, 2005)

- Sự hình thành quả lan: Nếu sự thụ phấn có kết quả, thì có thể ngay trong ngày hay sang ngày hôm sau, các phiến hoa héo lại nhưng không rụng Và để tránh sự thụ

+Rhizoctonia repens giúp nảy mầm ở Cattleya, Laelia, Angraecum, Cypripedium

(Paphiopedilum)

+Rhizoctonia mucoroides giúp nẩy mầm ở Vanda, Phalaenopsis

+Rhizoctonia lanugiosa giúp cho hột nẩy mầm ở Oncidium, Odontoglossum và

Miltonoa (Nguyễn Vũ Thị Hoàng Uyên, 2005)

2.4.2 Nhân giống lan Dendrobium trong phòng thí nghiệm

Trong phòng thí nghiệm lan Dendrobium được nhân giống bằng phương pháp gieo hạt in vitro Trong thiên nhiên, vì hạt lan quá nhỏ, không chứachất dự trữ và chỉ có một

phôi chưa phân hóa, nên không thể phát triển theo một phương cách bình thường được và

vì vậy mà việc cho hạt lan nẩy mầm và phát triển thành cây lan trưởng thành là vấn đề khó khăn Người trồng lan đã tìm nhiều cách gieo hạt nhưng không thành công Năm 1922, Knudson ở Mỹ, thành công trong việc thay thế nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hạt Phương pháp này có ưu điểm là kết hợp được với kỹ thuật lai giống tạo ra nhiều giống lan mới cung cấp cho thị trường, giúp bảo tồn các loài lan quý và nhân nhanh số lượng giúp cho công tác bảo tồn (trích dẫn Nguyễn Tiến Bân, 1990)

2.5 Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức

nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định điều

kiện vô trùng Kỹ thuật in vitro dựa trên nguyên lý là tế bào thực vật có tính toàn thể,

nghĩa là từ một mô, một cơ quan hoặc một tế bào của bất kỳ bộ phận nào của cây đều

có thể phát triển thành một cây hoàn chỉnh nếu được nuôi trong môi trường thích hợp

2.5.1 Điều kiện nuôi cấy tế bào thực vật

Yêu cầu cơ bản nhất của phòng nuôi cấy mô là phải đảm bảo vô trùng Khái niệm vô trùng này bao gồm vô trùng môi trường nuôi cấy và cả sự bảo đảm sao cho mẫu nuôi cấy được hoàn toàn vô trùng

Các yêu cầu cơ bản của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật:

+ Khi thiết lập phòng nuôi cấy mô thực vật phải đảm bảo được tính liên tục thuận lợi cho các thao tác, các giai đoạn trong suốt quá trình nuôi cấy mô

+ Đảm bảo được vệ sinh (tính vô trùng) của sản phẩm cuối cùng

+ Chuẩn bị môi trường đúng cách, chọn đúng môi trường cho từng loại thực vật

và từng giai đoạn nuôi cấy

+ Chọn và xử lý mô thích hợp trước khi cấy (Dương Công Kiên, 2003)

2.5.2 Kỹ thuật gieo cấy hạt lan trong ống nghiệm

2.5.2.1 Đặc điểm của hạt lan

Không giống những loại hạt khác, hạt lan rất nhỏ, như hạt bụi và không chứa nguồn dự trữ thức ăn Trong tự nhiên, hạt có thể nẩy mầm nhưng sẽ không phát triển nếu không có sự tác động của nấm mycorrhizal Loại nấm này tiêu hóa các vật chất hữu cơ trên cây chủ hoặc trong đất, chuyển hóa thành các đường đơn giản giúp hạt lan nẩy mầm và giúp phôi phát triển Khi hạt lan đã nẩy mầm, nó sẽ tạo ra một lượng lớn các tế bào không phân hóa được gọi là protocorm Nếu tất cả đều tốt, protocorm sẽ tiếp tục trong vài tuần, vài tháng, thậm chí cả năm tùy loài, cho đến khi đủ lớn để tạo thân

và rễ Ở các loài lan đất, duy trì mối quan hệ cộng sinh này rất quan trọng trong suốt giai đoạn đầu tiên của cây, vì protocorm nằm dưới đất nên không thể tự tổng hợp thức

ăn Ở các loài lan phụ sinh, protocorm thường xanh, và vì thế nó có thể tự tổng hợp được một ít thức ăn (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

2.5.2.2 Khử trùng trái lan

Việc khử trùng trái lan có thể thực hiện theo hai phương pháp:

- Quả lan sau khi mổ ra, hạt thu được trước khi đem gieo cần tuyển chọn các hạt chắc, các hạt lép không thụ tinh cần phải loại bỏ đi bằng cách đem ly tâm trong nước cất, các hạt lan tốt sẽ lắng phía dưới ống nghiệm, hạt lép nổi lên trên, được gạn bỏ đi Các hạt tốt được tiếp tục khử trùng bằng Hypochlorite calcium 10 % Sau đấy, cho hạt lan và nước khử trùng vào ống nghiệm, vừa đủ phủ kín hạt lan, lắc mạnh, đều và để

yên trong vòng 10 phút, sau đó đổ nước khử trùng ra bằng ống hút, và tiếp tục rửa hạt lan 3 lần bằng nước cất vô trùng Cuối cùng hạt lan đã khử trùng sẽ được gieo vào các bình chứa môi trường

- Khi quả lan đã được cắt trên cây, mang vào phòng thí nghiệm, cần để nơi sạch

sẽ, thoáng mát Nếu chưa gieo hạt ngay thì có thể giữ quả trong tủ lạnh, trong vòng 3 -

4 ngày Khi gieo hạt, trước tiên quả lan cần cắt bỏ các cuống dài, đuôi còn sót lại các lá đài, cánh hoa Dùng bông gòn có tẩm cồn 70o (Nguyễn Vũ Thị Hoàng Uyên, 2005)

2.6 Các công trình nghiên cứu về môi trường nuôi cấy lan Dendrobiumvà Dendrobium

mini

Nền môi trường nuôi cấy với nồng độ và tỷ lệ khác nhau của các nguyên tố đa

lượng, vi lượng, vitamin có ảnh hưởng rất rõ đến nuôi cấy in vitro cây lan Nhiều tác

giả đã xác nhận dùng các môi trường Vacin Went (VW), Murashige và Skoog (MS), Knudson (KC) rất tốt cho cấy mô các loài thuộc họ lan (Vũ Ngọc Lan, 2013)

Năm 2013, Vũ Ngọc Lan đã nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất

điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa

Dendrobiumnobile Lindl, Dendrobium chrysanthum Lindld tại Hà Nội

Năm 2011, Nguyễn Văn Song cũng nhân nhanh in vitro loài lan rừng có nguy cơ

tuyệt chủng với nguồn nguyên liệu ban đầu là gieo hạt trên môi trường MS + 15% đường sacarose + 2,0mg/l BA

Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2009) đã nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium

anosmum và Dendrobium mini bằng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường

MS và ½ MS

Năm 2007, Bùi Thị Tường Thu và Trần Văn Minh cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến nuôi cấy mô lan Trong năm loại môi trường nghiên cứu (MS, VW, KC, Orchmax và Lindemann), môi trường tốt nhất cho cây

Dendrobium lai là môi trường MS và cho cây Cymbidium lai là môi trường Orchimax

Năm 2011, Asghar S và cộng sự đã đề xuất môi trường nhân nhanh chồi lan là

MS + 100ml/l nước dừa + 20g/l đường + 60g chuối chín/l + 6g agar/l

Đối với giống lan Vanda dearei và Cymbidyum findlaysonianum sự sinh trưởng

của PLB tốt nhất là trên môi trường ½ MS sau đó đến môi trường KC và VW (Tawaro

và cs, 2008)

Năm 2006, Luan và cs đã nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium sp bằng phương pháp gieo hạt in vitro trên nền môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA

Sagawa và Shoji, 1967; Kim và cs 1970 Nuôi cấy đỉnh chồi của loài thuộc chi

Dendrobium trên môi trường Vacin và Went có bổ sung 150ml/l CW, mẫu cấy tạo

PLB sau ba tháng

Năm 1967, Sagawa Y và Shoji T cũng nuôi cấy mô phân sinh ngọn và mô phân

sinh bên của một giống Dendrobium trên môi trường Knudson C lỏng + 5% nước dừa

có loài màu sắc đẹp, mùi hương đặc trưng nhưng không thích hợp cho việc nuôi trồng với mục đích kinh tếnhư hoa không bền, không cắt cành được, đã đáp ứng phần nào các yêu cầu ngày càng đa dạng về mặt sưu tập, thưởng ngoạn và từng bước tạo ra những tiền đề cho việc khai thác kinh tế hoa lan cắt cành Tùy theo, mục đích của người tạo giống, trước khi thực hiện phép lai cần cân nhắc chọn giống bố mẹ một cách thích hợp, tuy nhiên một số chỉ tiêu sau không thể bỏ qua khi chọn giống và thụ phấn: Chọn cây bố mẹ khỏe mạnh, có sức sinh trưởng tốt không bị nhiễm sâu bệnh.Phát hoa dài, siêng bông, năng suất cao, thời gian nở hoa kéo dài, màu sắc hoa tương phản để tạo ưu thế lai và một số tính trạng khác lạ cần khai thác

Nên chọn bố mẹ cùng loài, cùng chi, các trường hợp bố mẹ khác loài khác chi thường khó tạo quả, hoặc có hình thành quả nhưng không có hạt (Dương Hoa Xô, 2011)

2.7.2 Kỹ thuật thụ phấn

Các giống hoa đưa vào tổhợp lai phải có thời gian ra hoa đồng pha, khi cây ra hoa, tiến hành thụphấn nhân tạo Nên chọn những hoa còn tươi, hoa mới nở từ 2 - 4 ngày Các bước tiến hành thụ phấn trên lan gồm 5 bước theo Dương Hoa Xô (2011): Bước 1: Dùng que tăm lấy bỏ hạt phấn trên hoa mẹ, tránh không để hạt phấn rơi vào vòi nhụy, đặc biệt phải thao tác nhẹ nhàng để không tổn thương bộ phận truyền giống

Bước 2: Lấy một cái tăm mới hay cây nhíp đã khử trùng đểlấy phấn hoa bố Đưa đầu tăm gắp nhẹ nhàng nắp bao phấn hoặc khối phấn ra khỏi hoa bố Đôi khi khối phấn không dính vào que tăm, trong trường hợp này, có thểchấm đầu tăm vào chất nhầy trong nhụy cái lúc đó khối phấn sẽ dễ dàng dính vào đầu tăm Đặt nhẹ nhàng khối phấn vào đĩa petry hay tờ giấy sạch

Bước 3: Đè nhẹ vào khối phấn, đưa đầu tăm vào nhụy cái cho chất keo dính bám vào đầu tăm, sau đó dính vào hạt phấn và nhẹ nhàng đưa hạt phấn vào nhụy cái của hoa mẹ, đẩy càng gần ống dẫn trứng càng tốt Nên thụ phấn vào buổi sáng sớm hoặc buổi chiều khi hoa hoàn toàn khô nước

Bước 4: Loại bỏ hết hoa và nụ không được thụ phấn trên phát hoa, để cây tập trung chất dinh dưỡng cho quá trình thụ tinh và nuôi quả mới lai

Bước 5: Buộc thẻ ghi chú vào hoa vừa thụ phấn Trên thẻ ghi ngày thụ phấn, phép lai giữa hai giống bố mẹ và người thực hiện Có thể ghi ký hiệu cặp lai trên thẻ đeo, nhưng tên bố mẹ của cặp lai phải được ghi cẩn thận và rõ ràng vào sổ theo dõi, kết hợp với việc lưu giữ hình ảnh để sau này làm cơ sở chọn lọc cặp lai có triển vọng Mỗi phép lai thực hiện từ 3 - 5 quả để chọn lọc và hạn chế rủi ro trong quá trình chờ quả chín hoàn toàn

Cần lưu ý rằng sau khi hoa nở từ 3 - 4 ngày là thời điểm để lai, chọn những hoa phía phần gốc của phát hoa Trước và sau khi lai sử dụng giấy sáp bọc hoa, 3 ngày sau khi lai cánh hoa bắt đầu héo, cắt bỏ lớp giấy màng và phần cánh hoa để tránh cho cánh hoa héo bị thối lây sang quả lan Cắt bỏ những hoa không lai, tránh làm suy kiệt cây (Đỗ Khắc Thịnh, 2011)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiêncứu

Đề tài được tiến hành từ tháng 06 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013 tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và phòng nuôi cấy mô Trạm Huấn luyện và Thực nghiệm Nông nghiệp Văn Thánh – Trung tâm Khuyến nông Tp.Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành trên đối tượng là ba tổ hợp lai lan Dendrobium mini 24 x

11, 13 x 16A, 13 x 21A được Trạm Huấn luyện và thực nghiệm Nông nghiệp Văn Thánh – Trung tâm Khuyến nông Tp.Hồ Chí Minh cung cấp

Bảng 3.1 Thông tin các tổ hợp lai sử dụng nhân giống

Tên tổ hợp Mẹ(♀) x Bố(♂) Ngày lai Ngày gieo hạt

3.3 Hóa chất và vật tư

- Khoáng đa lượng: KNO3, NH4NO3, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O,

Na2EDTA sản xuất tại Trung Quốc

- Khoáng đa lượng: MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, H3BO3, KI, CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O, Na2MoO4.2H2O sản xuất tại Trung Quốc

-Vitaminvàcácchấthữucơ:Glycine,ThiamineHCl,PyridoxinHCl,Acid nicotinic sản xuất tại Trung Quốc

- Đường saccharose và Agar sản xuất tại Việt Nam

- Môi trường nuôi cấy

+ Môi trường MS (Murashige - Skoog)

+ Môi trường ½ MS (thành phần đa lượng giảm một nửa so với MS)

+ Môi trường VW (Vacinand - Went )

+ Ống đong, ống hút, đũathủy tinh, kẹp dài 25 – 30 cm, kéo cắt mẫu cấy

+ Dao cắt mẫu cấy (loạisố 10)

+ Bình nuôi cấy - chai thuỷ tinh 500ml chịunhiệt hàng Việt Nam

+ Đèn cồn, bình tia, bình xịt đựng cồn, giấy lọc hấp khử trùng

+ Cốc thủy tinh chia vạch: 50 ml, 100 ml, 200 ml, 1000 ml

- Thiết bị gồm có cânphântích, máyđopH (Đức),bếpđiện (Trung Quốc),tủcấyvôtrùng,tủsấy,tủlạnhdùngđểtrữ hóa chất, nồi hấp autoclave (Tomy Seiko, Nhật Bản)

3.5 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát

triển của hạt lan lai từ ba tổ hợp 24(♀) x 11(♂), 13(♀) x 16A, 13(♀) x 21A

- Mục đích: Xác định được môi trường thích hợp cho hạt nẩy mầm tốt nhất

+ Mẫu cấy là những cụm hạt được lấy ra từ quả của ba tổ hợp 24(♀) x 11(♂),

13(♀) x 16A, 13(♀) x 21A

+ Điều kiện thí nghiệm: Ba môi trường gieo hạtMurasgige và Skoog (MS), ½ MS

(đa lượng giảm ½ so với MS), Vacind Went (VW) bổ sung 30 g/ l đường và 7 g/ l agar

- Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, mỗi tổ hợp lai bao gồm 3

nghiệm thức và 3 lần lặp lại mỗi lần lặp lại được thực hiện trên 3 bình, mỗi bình cấy 6

cụm hạt

Bảng 3.2 Các nghiệm thức gieo hạt lan lai Dendrodium mini

Trái lan sau khi được thụ phấn khoảng 2 – 2,5 tháng được cắt đem lên phòng Nuôi

cấy mô khử trùng bằng xà phòng 5 phút → rửa dưới vòi nước chảy 10 phút → ngâm trong

dung dịch Hypochloride Calcium Ca(OCl)2 trong 5 – 7 phút (trong tủ cấy vô trùng) → rửa

3 - 4 lần với nước cất vô trùng (trong tủ cấy) → Gắp trái ra và xẻ lấy hạt cấy vào môi

trường đã được chuẩn bị sẵn, mỗi chai cấy 6 cụm (Nguyễn Thị Mỹ Duyên, 2006)

- Chỉ tiêu theo dõi

+ Màu sắc hạt (trắng, vàng)

+ Thời điểm hạt chuyển thành màu xanh (ngày sau gieo hạt)

+ Thời điểm nảy chồi (ngày sau gieo)

+ Tỷ lệ nẩy chồi (%): đếm số hạt nảy chồi

Thời gian lấy chỉ tiêu: 15, 30, 45, 60 ngày sau khi cấy cụm hạt lan Dendrobium

- Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, mối tổ hợp lai bao gồm 3 nghiệm thức và 3 lần lặp lại mỗi lần lập lại được thực hiện trên 3 bình, mỗi bình cấy 9 chồi

Bảng 3.3 Các nghiệm thức nhân chồi lan lai Dendrobium mini

Chọnnhữngchồicóchiềucaokhoảng0,2 – 0,3cm vàcó 1-2 lá mầm ở thí nghiệm 1 cấy

sang môi trường nhân chồiđãchuẩn bị sẵn

- Chỉtiêutheodõi

Quansátvàghinhậnảnhhưởngcủaba môi trường lên sự nhân chồi lan lai thông qua

các chỉ tiêu:

+ Số chồi (chồi/mẫu cấy): đếm số chồi trên một mẫu cấy

+ Chiều cao chồi (cm): chiều cao của chồi được đo từ gốc chồi đến nách lá trên

cùng

+ Số lá (lá/chồi): đếm trung bình của tổng số lá trên các chồi mới tạo thành

Thời gian lấy chỉ tiêu: 15, 30, 45, 60 ngày sau khi cấy

3.5.3Thínghiệm3Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo rễ của ba tổ hợp

lai lan 24(♀) x 11(♂), 13(♀) x 16A, 13(♀) x 21A

- Mục đích của thí nghiệm này là xác định môi trường thích hợp cho sự ra rễ của tổ

hợp lai lan

- Điều kiện thí nghiệm: Ba môi trường nhân chồiMurasgige và Skoog (MS), ½ MS

(đa lượng giảm ½ so với MS), Vacind và Went (VW), 150ml/l nước dừa, 50g/l khoai

tây, 0,5g/l than hoạt tính

- Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, mỗi tổ hợp lai bao gồm 3

nghiệm thức và 3 lần lặp lại mỗi lần lặp lại được thực hiện trên 3 bình, mỗi bình cấy 9

chồi

Bảng 3.4 Các nghiệm thức tạo rễ lan lai Dendrobium mini

+ Số rễ (rễ/mẫu cấy): đếm tổng số rễ trên một mẫu cấy

+ Chiều dài rễ (cm): được đo từ gốc rễ đến chóp rễ

+ Chiều cao chồi chính (cm): chiều cao của chồi được đo từ gốc chồi đến nách lá trên cùng

+ Số lá trên chồi chính (lá/chồi chính): đếm số lá có trên chồi chính

Thời gian lấy chỉ tiêu: 15, 30, 45, 60 ngày sau khi cấy

3.6 Xửlýsốliệu

Số liệu từ các thí nghiệm được tổng hợp bằng phần mềm Microsoft Excel, và xử lý thống kê bằng phần mềm MSTATC

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Môi trường thích hợp cho việc gieo hạt đối với lai lan Dendrobium mini

Gieo hạt là bướcđầu tiên do đó nó là một bước rất quan trọng trong quy trình

nhân nhanh giống lai lan Dendrobium mini bằng nuôi cấy in vitro Nếu bước gieo hạt

không thành công thì các bước tiếp theo không thể tiến hành và do đó toàn bộ quy trình nhân nhanh sẽ không thực hiện được

4.1.1 Tổ hợp lai 24(♀) x 11(♂)

Bảng 4.1 Sự chuyển biến hình thái của hạt lan lai tổ hợp 24 x 11 khi được nuôi cấy

trên ba môi trường khác nhau

Môi

trường

Thời điểm sau khi gieo hạt (ngày sau gieo)

MS chuyển xanh Bắt đầu + ++ +++ +++ ++++

½ MS chuyển xanh Bắt đầu + ++ +++ +++ ++++

VW Bắt đầu

+: hạt có màu xanh, hạt nảy chồi < 50%, ++ : hạt có màu xanh, hạt nảy chồi ≥ 50% < 69%, +++: hạt có màu xanh, hạt nảy chồi ≥ 70% < 84% , ++++ : hạt có màu xanh, hạt nảy chồi ≤ 85%

Sau 15 ngày gieo hạt thì hạt lan trên ba môi trường bắt đầu chuyển hoá và có màu xanh do có sự tiếp xúc với ánh sáng tạo được diệp lục tố, hạt bắt đầu biến đổi tạo thành một đám tế bào có màu xanh (hình 4.1.a) Đến ngày thứ 30 sau khi gieo hạt lan được gieo cấy trên ba môi trường vẫn không có sự khác biệt rõ (hình 4.1.b) Vì lúc này hạt sử dụng các yếu tố nội sinh chưa cần đến yếu tố ngoại sinh nên yếu tố môi trường không ảnh hưởng đến hoá xanh của hạt Sau 45 ngày gieo hạt, hạt trên cả ba môi trường đều có màu xanh và hạt nảy chồi trong khoảng 70 đến 84 % nhưng trên môi trường VW tạo chồi có đường kính nhỏ và có màu xanh nhưng hơi trắng (hình 4.1.c)

Hình 4.1 Sự chuyển biến hình thái của hạt lan lai Dendrobium mini từ tổ hợp 24 x 11 khi

được nuôi cấy trên ba môi trường nuôi cấy khác nhau ở các thời điểm.(a): 15 ngày, (b): 30 ngày, (c): 45 ngày, (d): 60 ngày

Tại thời điểm 60 ngày sau khi gieo, các chồi lan trên môi trường MS và ½ MS có đường kính khoảng 3 – 4 mm, có lông hút, lá mầm dài khoảng 4 – 5 mm, các chồi phát triển đồng đều với nhau có nhiều lá mầm khoẻ, màu xanh tươi, tỷ lệ nảy chồi lớn hơn

85 % Bên cạnh đó môi trường VW cũng có tỷ lệ nảy chồi lớn hơn 85 %, tuy nhiên do thành phần dinh dưỡng thấp hơn nên chồi lan nhỏ và có màu xanh nhưng hơi trắng không phát triển nhanh như môi trường MS (hình 4.1.d)

Môi trường MS Môi trường ½ MS Môi trường VW

a)

b)

c)

d)

Môi trường ½ MS tuy hàm lượng đa lượng chỉ bằng một nửa so với môi trường

MS, nhưng trong giai đoạn gieo hạt tỷ lệ nảy chồi và chất lượng chồi giống như môi trường MS, vì trong giai đoạn này các chồi còn nhỏ nên sử dụng các nguyên tố đa lượng ít

4.1.2 Tổ hợp lai 13(♀) x 16A(♂)

Bảng 4.2 Sự chuyển biến hình thái của hạt lan lai tổ hợp 13 x 16A khi được nuôi cấy

trên ba môi trường khác nhau

½ MS chuyển xanh Bắt đầu + ++ +++ +++ ++++

VW chuyển xanh Bắt đầu + ++ ++ +++ ++++

+ : hạt có màu xanh, hạt nảy chồi < 50%, ++ : hạt có màu xanh, hạt nảy chồi ≥ 50% < 69%, +++: hạt có màu xanh, hạt nảy chồi ≥ 70% < 84% , ++++ : hạt có màu xanh, hạt nảy chồi ≤ 85%

Tại các thời điểm định kỳ theo dõi, ảnh hưởng của môi trường đến sự nảy chồi của hạt trên tổ hợp 13 x 16A cũng tương đương như tổ hợp 24 x 11 (hình 4.2)

y sau khi gie

1A(♂)

ờng đến sự

và 13 x 16A

½ MS đã có hạt nảy chồi

đó, trên mô

Môi trư

ợp 13 x 16A : 15 ngày, (b

13 x 21A c sau khi gieo ường còn lạ

ôi trường M

ường VW

A khi b) 30

cũng

o các

ại, số

MS và

VW số lượng hạt nảy chồi nhỏ hơn 85% Có thể do tổ hợp lan này bản thân nó có khả năng thích ứng cao, sinh trưởng mạnh hơn nên qua 45 ngày sau gieo hạt đã thích nghi tốt và thể hiện đặc tinh thích nghi với môi trường rõ hơn (hình 4.3.c)

Bảng 4.3 Sự chuyển biến hình thái của hạt lan lai tổ hợp 13 x 21A khi được nuôi cấy

trên ba môi trường nuôi cấy khác nhau

Môi

trường

Thời điểm sau khi gieo hạt (ngày sau gieo)

MS chuyển xanh Bắt đầu + ++ +++ +++ ++++

½ MS chuyển xanh Bắt đầu + ++ +++ ++++ ++++

VW Bắt đầu

+: hạt có màu xanh, hạt nảy chồi < 50%, ++ : hạt có màu xanh, hạt nảy chồi ≥ 50% < 69%, +++: hạt có màu xanh, hạt nảy chồi ≥ 70% < 84% , ++++ : hạt có màu xanh, hạt nảy chồi ≤ 85%

Nhiều tác giả đã xác nhận dùng các môi trường Vacind và Went (VW), Murasgige

và Skoog (MS) rất tốt cho cấy mô các loài thuộc họ lan (Vũ Ngọc Lan, 2013)

Năm 2007, Kong và cs đã nghiên cứu và đề xuất môi trường nhân nhanh chồi trên

giống lan Dendrobium strongylanthum là môi trường ½ MS bổ sung 0,5mg/lít BAP

So sánh với các công trình đã công bố cho thấy, kết quả nghiên cứu này tiến hành trên đối tượng loài lan khác nhau nhưng có kết quả tương tự nhau Điều này cho thấy môi trường ½ MS là môi trường phù hợp cho gieo hạt các loài lan

Tóm lại, từ kết quả trên xác định được môi trường ½ MS là môi trường sử dụng

phù hợp trong gieo hạt lan Dendrobium mini lai

ày sau khi gi

Môi trư

minitừ tổ hợp (a): 15 ngày

n, giá khi được

y, (c): 45

thành sản phẩm hạ cho hiệu quả kinh tế cao, do đó nó có ý nghĩa rất lớn trong nhân

giống in vitro (Nguyễn Thị Tuyết Mai, 2011)

VW 2,95b± 0,79 0,39b± 0,02 3,74b ± 0,42

45

MS 4,62b± 0,79 0,79a± 0,05 7,02a ± 0,47 1/2 MS 6,90a ± 0,58 0,69a ± 0,06 8,41a ± 0,65

VW 4,05b± 0,51 0,46b± 0,08 4,58b ± 0,25

60

MS 5,95b± 0,35 1,25a± 0,06 7,61b ± 0,58 1/2 MS 8,92a ± 0,46 1,28a± 0,24 9,92a ± 0,72

VW 4,77b± 0,59 0,72b± 0,06 6,28b ± 0,37

Trong cùng một cột các giá trị có ký tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P < 0,01)

Vào thời điểm 15 ngày sau khi cấy các chồi vào ba loại môi trường MS, ½ MS,

VW, thời gian này các chồi bắt đầu cảm ứng với môi trường mới nên chưa có biểu hiện khác biệt nhiều, việc xuất hiện chồi mới ở cả ba môi trường là do trong cây có chứa hàm lượng cytokinin nội sinh cao, nên tự có khả năng nảy chồi

Thông qua bảng 4.4 ta thấy các kết quả ở 30 ngày sau khi cấy, giữa các môi trường đã có sự khác biệt thống kê Ở thời điểm này môi trường ½ MS là môi trường

có xuất hiện số chồi nhiều nhất 5,853 chồi, khác biệt thống kê có ý nghĩa ở mức 0,01

so với môi trường VW, nhưng không khác biệt thống kê so với môi trường MS

Về chiều cao chồi môi trường MS là môi trường có giá trị cao nhất, khác biệt thống kê có ý nghĩa ở mức 0,01 so với môi trường VW, nhưng khác biệt thống kê không có ý nghĩa so với môi trường ½ MS Cùng thời điểm này cũng nhận thấy được chỉ tiêu về số lá cũng có sự khác biệt giữa ba môi trường, trên môi trường ½ MS cho

số lá nhiều nhất Sự tăng trưởng về chiều cao tương ứng với sự phát triển số lá của cây