ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG ALPHA TOCOPHEROL TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG ALPHA - TOCOPHEROL TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM BẰ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG ALPHA - TOCOPHEROL TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

Sinh viên thực hiện : TỪ THỊ HỒNG NHI Niên khóa : 2009 – 2013

Tháng 7/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG ALPHA - TOCOPHEROL TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

ThS NGUYỄN THANH ĐIỀN TỪ THỊ HỒNG NHI ThS LÊ VĂN HUY

TP HCM tháng 7 năm 2013

Từ Thị HồngNhi

TÓM TẮT

Từ Thị Hồng Nhi, Đại Học Nông Lâm TP HCM, tháng 7 năm 2013 “Đánh giá hàm lượng alpha – tocopherol(vitamin E) trong một số loại thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)”

GVHD: Th.S Nguyễn Thanh Điền – Th.S Lê Văn Huy – Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Đề tài được tiến hành từ tháng 12 đến tháng 6 năm 2013 tại Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Mục tiêu của đề tài:

Xây dựng quy trình tách, chiết và định lượng α – tocopherol trong một số mẫu thực phẩm (tỏi Trung Quốc, tỏi Lý Sơn, rau cần tây, ớt Đà Lạt, lá dứa, rau ngót, trái khế) bằng phương pháp HPLC

Xây dựng được quy trình định lượng α – tocopherol bằng HPLC đạt được những thông số sau: độ tin cậy đường chuẩn α – tocopherol (R2 = 0,998), hiệu suất thu hồi trung bình 4 mẫu (Rtb = 108%)

Kết quả khảo sát một số mẫu: mẫu rau ngót được phát hiện với hàm lượng αlpha – tocopherol cao hơn hẳn (415,44mg/kg) so với các mẫu tỏi (243,7 mg/kg), ớt

Đà Lạt (99,83 mg/kg) và rau cần tây (60,64 mg/kg)

Results:

Extraction procedure, was conducted on optimum conditions such as purging

N2 at specific time, saponification conditions (KOH concentration: 0,375mol/l, time:

40 minute and temperature: 800C), show a good and stable extraction of α – tocopherol demonstrating by chromatographic profile

Quantitation procedure of α – tocopherol on edible plants by HPLC was well performed with some parameters: high correlation efficiency (R2 = 0,998), high recovery efficiency (108%)

The results of evaluation on some edible plants show that the level of α – tocopherol on sauropus androgynus (415,44 mg/kg) are higer than that levels on garlic (243,7 mg/kg), Dalat chilli (99,83 mg/kg) and local celery (60,64 mg/kg) In addition, the levels of α – tocopherol on local celery, pineapple leaves and carambola fruit are not detectable

MỤC LỤC

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Đối tượng nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về vitamin E 3

2.1.1 Khái niệm vitamin E 3

2.1.2 Lịch sử về vitamin E 3

2.1.3 Nguồn cung cấp vitamin E 3

2.1.4 Một số nghiên cứu định lượng vitamin E trong thực phẩm 4

2.1.5 Cấu trúc hóa học – phân loại 4

2.1.6 Tính chất của vitamin E 6

2.1.6.1 Tính chất vật lý 6

2.1.6.2 Tính chất hóa học 6

2.1.6.3 Tính chất chống viêm 7

2.1.7 Chức năng của vitamin E 7

2.1.8 Nhu cầu sử dụng vitamin E 8

2.1.9 Hoạt tính sinh học của vitamin E 9

2.2 Giới thiệu về HPLC (High pressure liquid chromatography – HPLC) 9

2.2.1 Lịch sử phát triển của sắc ký 9

2.2.2 Hệ thống HPLC 10

2.2.3 Lựa chọn điều kiện sắc ký 12

2.2.3.1 Lựa chọn pha tĩnh 12

2.2.3.2 Lựa chọn pha động 12

2.2.3.3 Lựa chọn đầu dò 12

2.2.3.4 Lựa chọn điều kiện sắc ký trong phân tích Vitamin E 13

2.2.4 Các yếu tố để đánh giá một quy trình phân tích 13

2.2.5 Ứng dụng của sắc ký lỏng cao áp 14

2.2.6 Ưu và nhược điểm của HPLC 14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15

3.1 Thời gian, địa điểm tiến hành 15

3.1.1 Thời gian 15

3.1.2Địa điểm 15

3.2 Vật liệu 15

3.2.1 Phương pháp thu mẫu 15

3.2.2 Hóa chất 15

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ 15

3.2.3.1 Thiết bị 15

3.2.3.2 Dụng cụ 15

3.3 Phương pháp nghiên cứu 15

3.3.1 Nguyên tắc xác định hàm lượng vitamin E 15

3.3.2 Tối ưu quy trình ly trích vitamin E 16

3.3.3 Tối ưu quy trình phân tích HPLC 17

3.3.4 Dựng đường chuẩn α – tocopherol 18

3.3.5 Xác định hàm lượng vitamin E trong mẫu 18

3.3.6 Hiệu suất thu hồi của quy trình ly trích vitamin E 19

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Xây dựng đường chuẩn α – tocopherol 20

4.2 Kết quả tối ưu quy trình ly trích mẫu tỏi 21

4.3 Kết quả tối ưu quy trình phân tích HPLC 23

4.3.1 Ảnh hưởng của tốc độ dòng 23

4.3.2 Ảnh hưởng của bước sóng 24

4.3.3 Ảnh hưởng của pha động 25

4.3.4 Điều kiện sắc ký 26

4.4 Khảo sát hàm lượng α – tocopherol trong các loại mẫu 27

4.5 Kết quả hiệu suấtthu hồi của α – tocopherol trong các loại mẫu 30

_Toc363569277Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

5.1 Kết luận 31

5.2 Đề nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

FAO: Food and Agriculture Organisation

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

MeOH: Methanol

UV: Ultraviolet

LC/MS: Liquid Chromatography - Mass Spectrometry

GC/MS: Gas chromatography - Mass spectroscopy

HPLC – RP: High Performance Liquid Chromatography – Reverse Phase LOD: Limit of detection

LOQ: Limit of quantitation

ACN: Acetonitrile

BHT: Butylated hydroxytoluene

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Nhu cầu RRR – α – tocopherol đối với các độ tuổi 8

Bảng 2.2 Một số dung môi và tính chất của chúng 11

Bảng 2.3 Các yếu tố cơ bản phân biệt pha thường và pha đảo 12

Bảng 2.4 So sánh các loại đầu dò sử dụng trong HPLC 13

Bảng 3.1 Các điều kiện phân tích HPLC 18

Bảng 4.1 Bảng tương quan nồng độ α – tocopherol và diện tích peak 20

Bảng 4.2 Bảng kết quả phân tích hàm lượng α – tocopherol trong mẫu 27

Bảng 4.3 Bảng hiệu suất thu hồi của quy trình trích mẫu 30

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 2.1 Một số nguồn vitamin E 3

Hình 2.2 Các dạng cấu trúc của vitamin E 5

Hình 2.3 Sơ đồ minh họa hệ thống HPLC 10

Hình 3.1 Quy trình ly trích alpha - tocopherol 17

Hình 4.1 Đường chuẩn biểu thị diện tích peak và nồng độ chuẩn α – tocopherol 20

Hình 4.2 Sắc ký đồ của α – tocopherol ở nồng độ chuẩn 119,1 µg/ml 21

Hình 4.3 Sắc ký đồ ly trích mẫu tỏi trong điều kiện không sục khí nitơ 22

Hình 4.4 Sắc ký đồ mẫu tỏi trong điều kiện có sục khí nitơ 22

Hình 4.5 Sắc ký đồ có sục khí nitơ và xà phòng hóa 30 phút, nhiệt độ 800C 23

Hình 4.6 Sắc ký đồ có sục khí nitơ và xà phòng hóa 40 phút, nhiệt độ 800C 23

Hình 4.7 Sắc đồ khảo sát tốc độ dòng 0,5 ml/phút 24

Hình 4.8 Sắc đồ khảo sát bước sóng 254 nm 25

Hình 4.9 Sắc đồ khảo sát dung môi pha động Methanol/nước 30/70 25

Hình 4.10 Sắc đồ khảo sát dung môi pha động Methanol/acetonitrile/nước 26

Hình 4.11 Sắc đồ khảo sát dung môi pha động là dung dịch đệm phosphate 26

Hình 4.12 Sắc ký đồ mẫu tỏi Trung Quốc 28

Hình 4.13 Sắc ký đồ mẫu ớt Đà Lạt 28

Hình 4.14 Sắc ký đồ mẫu khế 29

Hình 4.15 Sắc ký đồ mẫu dứa 29

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Khai thác các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên để phục vụ cho nhu cầu sức khỏe của con người từ lâu là hướng nghiên cứu thu hút sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học Trong đó khai thác các vitamin như: vitamin nhóm B, K, E từ các sản phẩm thiên nhiên được nhiều nhóm nghiên cứu quan tâm Trong các vitamin, vitamin E là một loại chất dinh dưỡng có vai trò hết sức quan trọng với sức khỏe của con người, tác dụng rõ nhất là chất chống oxy hóa, và được xem như hàng rào đầu tiên chống lại những tác động có hại của gốc tự do đối với tế bào (FAO, 2002), phòng ngừa ung thư (Jihyeung và ctv, 2010) Tuy nhiên, cơ thể con người lại không có khả năng tổng hợp nên vitamin E nên cơ thể chỉ có thể thu nhận vitamin E từ nguồn thực phẩm tiêu thụ hàng ngày

Trong các loại thực phẩm, nguồn vitamin E chủ yếu từ mỡ thực vật (vegetable fats) và các loại dầu và những sản phẩm từ dầu Hơn nữa, các vitamin E có nguồn gốc

tự nhiên alpha – tocopherol (RRR – alpha – tocopherol) được đã cho thấy sinh khả dụng (Bioavailability) cao gấp 3 lần các alpha – tocopherol tổng hợp (Chikako Kivose

và ctv, 1996) Do đó, đã có nhiều nghiên cứu đánh giá về hàm lượng của các vitamin E

từ các loại rau ăn khác nhau như tỏi, ớt, rau cần tây, rau ngót Theo Ling Soon Ching

và Suhaila Mohamded, 2001 đã phát hiện có sự thay đổi về hàm lượng alpha – tocopherol trong 62 loài thực vật ở các khu vực khác nhau thuộc vùng khí hậu nhiệt đới như: rau ngót (426,8 mg/kg), tỏi (12,3 mg/kg, rau cần tây (136,4 mg/kg) Do đó đề tài “Đánh giá hàm lượng alpha – tocopherol trong một số loại thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp” được tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá bổ sung thêm các

cơ sở dữ liệu về hàm lượng alpha – tocopherol trên một số loại rau ở Việt Nam Tạo tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về phương pháp phân tích hàm lượng alpha – tocopherol có trong một số loại thực phẩm

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình tách, chiết và định lượng α – tocopherol trong một số mẫu thực phẩm (tỏi Trung Quốc, tỏi Lý Sơn, rau cần tây, ớt Đà Lạt, lá dứa, rau ngót, khế) bằng phương pháp HPLC.Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến việc định lượng hàm lượng α – tocopherol có trong các loại thực phẩm

1.3 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu thực phẩm được mua ngẫu nhiên tại chợ Tân Phú (tỏi Trung Quốc, tỏi Lý Sơn) và chợ Linh Trung(Lá dứa, rau cần tây, rau ngót, trái khế, ớt Đà Lạt), mẫu đựng trong túi nilông và được bảo quản ở nơi khô ráo tránh ánh sáng

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệuvề vitamin E

2.1.1 Khái niệm vitamin E

Vitamin E là tên gọi chung để chỉ hai lớp các phân tử bao gồm: tocopherol và tocotrienol có hoạt tính vitamin E (alpha – tocopherol) trong dinh dưỡng Vitamin E không phải là tên gọi cho một chất hóa học cụ thể, mà chính xác hơn là cho bất kỳ chất nào có trong tự nhiên mà có tính năng vitamin E trong dinh dưỡng

Hình 2.1 Một số nguồn vitamin E (www.google.com.vn)

2.1.2 Lịch sử về vitamin E

Trong quá trình thí nghiệm cho ăn với chuột Herbert McLean Evans kết luận vào năm 1922 với chế độ ăn thiếu vitamin E sẽ nảy sinh các vấn đề liên quan đến sinh sản, mặc dù các chất khác đã có mặt Tình trạng này có thể được thay đổi bằng cách cho ăn bổ sung với mầm lúa mì Phải mất vài năm cho đến năm 1936 khi chất này được phân lập từ mầm lúa mì và công thức C29H50O2 được xác định.Các vitamin đã được đưa ra tên của nó bởi Evans từ từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “mang thai” Cấu trúc chính xác của vitamin E được công bố vào năm 1938.Cũng trong thời gian này, Paul Karrer tổng hợp được vitamin E

2.1.3 Nguồn cung cấp vitamin E

Chủ yếu là dầu thực vật, rau xà lách, rau cải, dầu mầm hạt (mầm lúa mì, lúa và ngô), trong dầu của một số hạt có dầu (đậu tương, vừng, lạc, hạt hướng dương, dầu ô – liu)

hoặc trong tinh dầu của một số loại quả (quả bơ, quả gấc), α – tocopherol có trong hạt cây hướng dương, dầu gấc, dầu bơ, còn đậu tương và dầu ngô lại chứa các dạng khác nhiều hơn (http://vi.wikipedia.org/wiki/Vitamin_E) Ở động vật, vitamin E có trong

mỡ bò, mỡ cá nhưng với hàm lượng thấp

2.1.4 Một số nghiên cứu định lượng vitamin E trong thực phẩm

Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007),vitamin E thuộc nhóm các hợp chất phenol, do đó khi tiến hành ly trích cần sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần: benzene, ethyl eter, chloroform, ethyl acetate, ethanol Koning và ctv (1996) đề xuất quy trình ly trích vitamin E sử dụng dung môi ly trích là hỗn hợp n-Hexane và Ethyl acetate có thêm Butylated hydroxytoluene Kết quả nghiên cứu của Ling Soon Ching và Suhaila Mohamed (2001), dựa trên việc áp dụng quy trình ly trích Koning và ctv đã công bố năm 1996 thì rau ngót có chứa hàm lượng vitamin E cao nhất trong 62 loài thực vật đã được tiến hành nghiên cứu (426,8 mg/100 g phần ăn được) Bên cạnh việc xác định loại dung môi ly trích phù hợp và quy trình ly trích vitamin E hiệu quả thì việc lựa chọn phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác cũng rất quan trọng trong việc khảo sát hàm lượng Vitamin E Các phương pháp phân tích vitamin E thông dụng bao gồm phương pháp sinh hóa (cho phản ứng với HNO3 và FeCl3) và phương pháp sắc ký (phương pháp sắc lý lỏng hiệu năng cao – HPLC) Gần đây đa số các nghiên cứu phân tích vitamin E trên thực phẩm áp dụng phương pháp phân tích là HPLC: nghiên cứu về các vitamin có tác dụng chống oxy hóa có trong ớt đỏ (Daood

và cộng sự, 1996), dùng phương pháp sắc ký lỏng để xác định hàm lượng tocopherol

và tocotrienol có trong các loại rau (Koning và cộng sự, 1996), phân tích vitamin E thu được từ tỏi (Mazhar và cộng sự, 1997), xác định hàm lượng α – tocopherol trong 62 loài thực vật ăn được thuộc vùng khí hậu nhiệt đới (Ling Soon Ching và Suhaila Mohamed, 2001) Do đó, HPLC là phương pháp phân tích vitamin E hiệu quả và có khả năng ứng dụng cao.Vì vậy trong nghiên cứu này, kỹ thuật HPLC được lựa chọn là phương pháp phân tích vitamin E trong các mẫu thực phẩm

2.1.5Cấu trúc hóa học – phân loại

Có hai loại vitamin E: Loại có nguồn gốc thiên nhiên và loại tổng hợp (FAO, 2000) Vitamin E có nguồn gốc thiên nhiên: Ðược chiết xuất từ dầu thực vật như đậu tương, ngô, mầm lúa mạch, các loại hạt có dầu như hạt hướng dương Vitamin E thiên nhiên là một đồng phân duy nhất của d – alpha tocopherol Có 4 loại tocopherol là

alpha, beta, gamma và delta, nhưng alpha là dạng chính (Cũng là vitamin E thiên nhiên) tồn tại trong cơ thể, có tác dụng cao nhất Tuy nhiên các dạng khác như beta, gamma và delta dù hoạt tính thấp hơn loại alpha nhưng cũng có tác dụng hỗ trợ rất lớn cho sức khỏe con người.Mặc dù có tác dụng tốt nhất trong các loại tocopherol, nhưng

do chiết xuất từ các thực phẩm thiên nhiên nên không kinh tế, vì vậy người ta đã sản xuất ra loại vitamin E tổng hợp có công thức là dl – alpha tocopherol, gồm 8 đồng phân nhưng chỉ có một đồng phân giống vitamin E thiên nhiên là d – alpha tocopherol (chỉ chiếm 12,5%), vì vậy tác dụng của vitamin E tổng hợp thấp hơn so với loại có nguồn gốc thiên nhiên

Hình 2.2 Các dạng cấu trúc của vitamin E(www.google.com.vn)

Về cơ chế hấp thu và sử dụng hai loại vitamin E thiên nhiên và tổng hợp trong cơ thể không có gì khác nhau, nhưng loại vitamin thiên nhiên được sử dụng nhiều hơn khoảng 50% so với loại tổng hợp Vì vậy muốn đạt được hiệu quả mong muốn thì khi

sử dụng vitamin E tổng hợp, phải uống tăng liều lên gấp 1,4 lần so với loại thiên nhiên Lượng vitamin E dư thừa trong cơ thể do không được sử dụng sẽ nhanh chóng

bị đào thải (FAO, 2001)

Đối tượng cần quan tâm trong hướng nghiên cứu này là α – tocopherol với cấu trúc như hình 2.2

2.1.6 Tính chất của vitamin E

2.1.6.1 Tính chất vật lý

Các tocopherol có công thức phân tử là C29H50O2

Tocopherol là chất dầu lỏng không màu, hòa tan rất tốt trong dầu thực vật, rượu etylic, đietyl ete, ete dầu hỏa

 – tocopherol thiên nhiên có thể kết tinh chậm trong rượu metylic ở nhiệt độ

350C, sẽ thu được những tinh thể hình kim có nhiệt độ nóng chảy từ 2,5 – 3,50C, nhiệt

độ sôi 200 – 2200C áp suất 0,1 mmHg, Khối lượng riêng 0,950g/cm3

Vitamin E khá bền đối với nhiệt, có thể chịu được nhiệt độ 1700C khi đun

trong không khí (http://vi.wikipedia.org/wiki/Vitamin_E)

Bị phá hủy nhanh chóng bởi tia tử ngoại

2.1.6.2 Tính chất hóa học

a Khả năng bị oxy hóa

Trong số các tính chất hóa học của tocopherol, tính chất quan trọng hơn cả là khả năng bị oxy hóa bởi các chất oxy hóa như sắt (III) clorua FeCl3, axit nitric HNO3, tạo nên các sản phẩm oxy hóa khác nhau

Về khả năng chống bị oxy hóa thì γ – tocopherol mạnh nhất, còn α – tocopherol

mặc dù có hoạt tính sinh học cao song khả năng chống oxy hóa lại thấp hơn (FAO,

2002

b Tính chất chống gốc tự do

Chức vụ thiên nhiên của vitamin E là bảo vệ cơ thể chống những tác dụng độc hại của những gốc tự do Những gốc tự do này được tạo thành từ những quá trình chuyển hóa bình thường hay dưới tác dụng của những nhân tố xung quanh

Vitamin E làm chậm sự lão hóa của da và đồng thời có tác dụng bảo vệ màng tế bào.Sự hiện diện của nó giúp cho mỡ trong tế bào được giữ gìn bởi vì những màng tế bào được cấu tạo từ axit béo có nhiều nối đôi, rất dễ bị oxy hóa

Sự oxy hóa của axit béo màng tế bào cho ra hàng loạt phản ứng mà kết quả cho

ra gốc Lipoperoxyd rất hoạt động vì không bền sẽ làm rối loạn chức năng sinh học của màng tế bào

Vitamin E có khả năng ngăn chặn phản ứng của các gốc tự do bằng cách nhường một hyđro (H) của gốc phenol cho gốc lipoperoxyd để biến gốc tự do này thành hyđroperoxyd không gây phản ứng vì tạo LOOH.Phản ứng như sau:

pherol bị khtrong cytoso

sự peroxy

ch, nghĩa là

iêm

ự peroxyd hiêm Nhiều

êm, vitamindùng vitamirên vitamin

min E

và quá trình

ng miễn dịc

à làm giảm s

hóa các lipidnghiên cứu

ã nhờn của của tóc

2.1.8 Nhu cầu sử dụng vitamin E

Vitamin E là một loại vitamin tan trong dầu nên nhu cầu của nó phụ thuộc vào hàm lượng axit béo chưa no có trong thực phẩm Khi PUFA (axit béo không bão hòa)

ăn vào tăng lên thì lượng vitamin E cung cấp có thể tăng lên gấp 4 lần, nghĩa là khoảng từ 5mg– 20mg một ngày

Nhu cầu bình thường cần khoảng 14 –19mg trong 24 giờ Nếu thực phẩm chứa 30g axit linoleic thì cần cung cấp thêm 30g α – tocopherol

Vitamin E được dùng như chất dinh dưỡng hỗ trợ cho việc bảo vệ cơ thể chống lại một số loại bệnh mãn tính như bệnh tim, ung thư, đái tháo đường Nếu dùng vitamin E tổng hợp thì cần phải tăng lượng cung cấp lên khoảng 1,4 lần

Bảng 2.1 Nhu cầu RRR – α – tocopherol đối với các độ tuổi

Đối tượng Độ tuổi Nam mg/ngày

(IU/ ngày)

Nữ mg/ngày (IU/ ngày) Trẻ sơ sinh 0 – 6 thánh 4 mg (6 IU) 4 mg (6 IU)

Trẻ sơ sinh 7 – 12 tháng 5 mg (7,5 IU) 5 mg (7,5 IU)

Trẻ em 1 – 3 tuổi 6 mg (9 IU) 6 mg (9 IU)

Trẻ em 4 – 8 tuổi 7 mg (10,5 IU) 7 mg (10,5 IU) Trẻ em 9 – 13 tuổi 11 mg (16,5 IU) 11 mg (16,5 IU) Thanh niên 14 – 18 tuổi 15 mg (22,5 IU) 15 mg (22,5 IU) Người trưởng thành  19 tuổi 15 mg (22,5 IU) 15 mg (22,5 IU) Phụ nữ có thai Mọi độ tuổi - 15 mg (22,5 IU) Phụ nữ sau khi sinh Mọi độ tuổi - 19 mg (28,5 IU)

(Dương Thanh Liêm, 2009)

Sự thiếu hụt và dư thừa vitamin E:Sự thiếu hụt vitamin E lâm sàng liên quan đến sự kém hấp thu và tính bất thường trong sự vận chuyển lipid.Các đối tượng có nguy cơ thiếu hụt vitamin E:

Người mắc bệnh kém hấp thu chất béo

- Bệnh tiêu chảy mỡ

- Rối loạn tụy tạng

- Trẻ sinh thiếu tháng và trẻ sơ sinh trọng lượng lúc sinh thấp

- Bệnh về máu di truyền

- Bệnh xơ hóa tạo nang

Sự dư thừa vitamin E: Vitamin E khi dùng ở liều thông thường hầu như không gây tác dụng phụ Lượng vitamin E dư thừa không được sử dụng được bài tiết ra ngoàicơ thể Khi lạm dụng vitamin E, dùng liều quá cao có thể gây buồn nôn, dạ dày

bị kích thích hoặc bị tiêu chảy, chóng mặt, nứt lưỡi, hoặc gây viêm thanh quản, những

triệu chứng này sẽ mất đi khi ngừng thuốc (http://vi.wikipedia.org/wiki/Vitamin_E)

2.1.9 Hoạt tính sinh học của vitamin E

Theo FAO, 2002 đã công bố thì chức năng chính của vitamin E trong cơ thể là tác động như là chất chống oxy hóa Nó được xem như là hàng rào phòng thủ trước tiên chống lại quá trình peroxid hóa lipid Vitamin E tác động ở mức độ tế bào để bảo

vệ màng tế bào khỏi sự tấn công của các gốc tự do làm tổn hại đến màng tế bào Với vai trò là chất thu dọn gốc tự do, vitamin E bảo vệ các acid béo không bão hòa (PUAF)

và cholesterol trong màng tế bào Vitamin E có nhiệm vụ bảo vệ các tế bào hồng cầu (có hàm lượng PUAF cao) khỏi bị tán huyết Chức năng giống như là một chất chống oxy hóa nội tế bào, vitamin E tiết kiệm Selenium, chất này chứa trong enzyme Glutathion perosidase Đây là thành phần khác của hệ thống phòng thủ chống oxy hóa của cơ thể và bảo vệ những chất tương tự chất béo khác như vitamin A khỏi bị phân hủy Bên cạnh đó, vitamin E còn có tác dụng bảo vệ những chất tạo nên tế bào như protein, acid nucleic, Vitamin E cũng có những tác động khác trong cơ thể bao gồm sự chuyển hóa nucleic và protein, chức năng phân bào và sản xuất hormone

2.2 Giới thiệu về HPLC (High pressure liquid chromatography – HPLC)

2.2.1 Lịch sử phát triển của sắc ký

Năm 1903, nhà bác học người Nga Txvet dùng cột Al2O3 tách các Picmen của

lá cây thành các vùng màu riêng biệt

Ông giải thích hiện tượng này là do lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố khác nhau Ông đặt tên phương pháp này là “sắc ký” nghĩa là “ghi lại màu sắc”

Đến năm 1931 phương pháp này mới bắt đầu được chú ý đến, từ đó đến nay phương pháp sắc ký đã không ngừng phát triển, được ứng dụng rộng rãi (Analytical

Chem vol 62, 1990)

2.2.2 Hệ thống HPLC

Theo sơ đồ hình 2.3 một hệ thống HPLC bao gồm:

1: Bình chứa dung môi pha động

Bảng 2.2 Một số dung môi và tính chất của chúng

Tên dung môi Độ nhớt ở (20oC) Sức căng bề mặt Độ phân cực

Glycerin 11,9 62,47 Phân cực Methanol 0,6 22,99 Phân cực Ethanol 1,2 22,03 Phân cực Hexan 0,31 1,11 Bán phân cực

Benzen 0,65 28,87 Không phân cực

Aceton 0,32 23,70 Không phân cực

(Trần Thị Lệ Minh, 2011)

- Bộ khử khí Degasse: loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động

- Bơm cao áp: mục đích để bơm pha động vào cột để thực hiện quá trình

chia tách sắc kí

- Bộ phận tiêm mẫu: giúp đưa mẫu cần phân tích vào cột tách của máy HPLC

để tiến hành phân tích mẫu

- Cột sắc kí: nơi diễn ra hiện tượng bắt giữ các hợp chất trong hỗn hợp cần phân tích nhờ vào tương tác giữa hợp chất với hệ thống pha tĩnh, pha động và giữa pha động

và pha tĩnh với nhau của máy HPLC Mỗi loại hợp chất khác nhau thì những lực tương tác cũng khác nhau, dẫn đến thời gian hợp chất bị giữ lại trong cột sẽ khác nhau

- Đầu dò (Detector): bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp

- Bộ phận ghi tín hiệu: ghi sắc ký đồ thể hiện được dòng chất di ra khỏi cột sau khi mẫu hân tích được bơm vào cột

- Thiết bị lưu dữ liệu: lưu trữ và trích xuất dữ liệu sắc ký đồ

- Trong nghiên cứu này, ta sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP – HPLC) vì phương pháp có thể lựa chọn nhiều loại dung môi giải ly, có thể áp dụng kỹ thuật giải ly với dung môi có độ phân cực tăng dần

2.2.3.Lựa chọn điều kiện sắc ký

2.2.3.1 Lựa chọnpha tĩnh

Có rất nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc ký lỏng Tuy nhiên, hiện nay hai loại phatĩnh phổ biến là pha thường (nomal phase) và pha đảo (revese phase) Sự khác nhau của pha thường và pha đảo được thể hiện theo bảng 2.2

Bảng 2.3 Các yếu tố cơ bản phân biệt pha thường và pha đảo

Công dụng Pha thường Pha đảo Pha tĩnh Phân cực cao Phân cực thấp

Pha động Phân cực thấp Phân cực cao Tương tác Hấp thụ (adsorption) Kỵ nước (hydrophobic)

Trình tự rửa giải Phân cực thấp đến cao Độ dài chuỗi carbon ngắn

đến dài

(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Hiện nay, đa phần các ứng dụng sắc ký dựa trên pha đảo bởi vì hệ số mâm lý thuyết lớn, khả năng phân tách tốt, sử dụng được nhiều lần, dễ sử dụng và giá cả chấp nhận được Trong pha đảo, pha tĩnh là dạng tạo nối hóa học trên giá mang silica Người ta điều chế pha tạo nối bằng cách biến đổi các nhóm silanol bề mặt thành các nhóm dẫn xuất Có các loại pha tạo nối như sau:

- Các nhóm alkyl như: octadexyl (C18H37), ngoài ra còn có những nhóm khác với dây carbon ngắn hơn: C1, C2, C8 và aryl

- Các nhóm phân cực như amino, cyanopropyl, eter, diol

- Các nhóm trao đổi ion như acid sunfonic, amino, ammonium tứ cấp

2.2.3.2 Lựa chọn pha động

Có nhiều loại dung môi được sử dụng trong sắc ký Dựa vào sự lựa chọn pha tĩnh (pha thường hay pha đảo) sẽ quyết định đến việc sử dụng dung môi Các dung môi thường sử dụng trong pha thường: hexane, methylene chloride, chloroform, methanol, acetonitrile Trong khi đó các dung môi thường sử dụng trong pha đảo như:methanol, acetonitrile, nước

2.2.3.3 Lựa chọn đầu dò

Lựa chọn đầu dò tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, mức độ phát hiện và đôi khi cả giá thành thiết bị

Bảng 2.4 So sánh các loại đầu dò sử dụng trong HPLC

Đặc tính UV Huỳnh quang Chiết xuất vi sai

Độ chọn lọc Chọn lọc Chọn lọc cao Phổ biến

Ảnh hưởng nhiệt độ Nhỏ Nhỏ Lớn

Tạo gradient Có thể Có thể Không thể

(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Xu thế hiện nay của các phòng thí nghiệm chuẩn quốc tế là phải trang bị hệ

thống sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS) vì các yêu cầu về chất lượng nông thủy sản, thức

ăn gia súc, dược phẩm ngày càng nghiêng về phân tích kiểm nghiệm điều này có nghĩa

là các phân tích này thường phức tạp và đa số ở dạng vết Do đó HPLC không đủ nhạy

nên khó có khả năng thực hiện các phân tích nói trên Ngoài ra LC/MS dễ dàng thực

hiện với các hợp chất từ tương đối phân cực đến phân cực nhiều, khó bay hơi (GC/MS

rất khó thực hiện hay không thực hiện được) và cho các nghiên cứu về cấu trúc một số

hợp chất tự nhiên

2.2.3.4 Lựa chọn điều kiện sắc ký trong phân tích Vitamin E

Phân tích Vitamin E thường được tiến hành với hệ thống sắc ký lỏng – cộtphathường – đầu dò quang phổ (NP – HPLC – FLD) Đầu dò quang phổ được ưu

tiên sử dụng hơn so với đầu dò UV trong phân tích vitamin E trong những phân tích

với nền mẫu phức tạp bởi vì độ nhạy và độ chuyên biệt của đầu dò huỳnh quang

(Piironen, 2000) Trong khi đó, một số tác giả khác sử dụng sắc ký lỏng pha đảo

(HPLC – RP), và sắc ký lỏng khối phổ cho phân tích Vitamin E trong thực phẩm

(Adibi, 2002) Các loại dung môi thường được sử dụng trong phân tích vitamin E là sự

kết hợp của nước cất với các loại dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetonitrile,

methyl alcohol nên rất đa dạng

Ví dụ hỗn hợp methanol/nước cất (96/4) (Ling Soon Ching và Suhaila Mohamded,

2001), hỗn hợp acetonitrile trong nước cất (95 – 100%) (Korchazhkina và ctv, 2006)

2.2.4 Các yếu tố để đánh giá một quy trình phân tích

Qui trình phân tích (Analytical Procedures) là sự mô tả chi tiết các bước cần

thiết để thực hiện một thử nghiệm (Analytical test) Qui trình bao gồm từ việc chuẩn bị

mẫu thử, mẫu chuẩn đối chiếu, các thuốc thử, việc sử dụng cá dụng cụ máy móc, việc

xây dựng đường cong chuẩn độ, cho đến việc sử dụng công thức để tính toán và biện

giải kết quả Để đánh giá một qui trình phân tích, các nhà nghiên cứu đưa ra rất nhiều các yếu tố như sau: tính đặc hiệu (Specificity), độ chính xác (Precision), độ lặp lại (Repeatibility), độ chính xác trung gian (Intermediate Precision), độ sao lại (Reproducibility), độ đúng (Accuracy), giới hạn phát hiện (Detection limit), giới hạn định lượng (Quantitation limit), tính tuyến tính (Linearity) và miền giá trị (Range) Tuy nhiên, theo Ashley S.Lister (2005) trong phân tích các thành phần hoạt động trong dược phẩm (Active Pharmaceutical Ingredient, API) thì không cần phải xác định LOD

và LOQ vì phương pháp HPLC trong thực tế ít khi dùng để phân tích ở mức phát hiện thấp trong các mẫu thực phẩm Vì vậy, trong điều kiện của nghiên cứu này chúng tôi tiến hành đánh giá các yếu tố quan trọng nhất như: xây dựng đường chuẩn vitamin E với độ tin cậy cao (R2>0.99), phân tích mẫu với độ lặp lại, và đánh giá hiệu suất thu hồi

2.2.5 Ứng dụng của sắc ký lỏng cao áp

- Phân tách, phân tích đặc điểm, nhận dạng các chất phản ứng và sản phẩm các

phản ứng, các cấu tử chất tan (Phạm luận, 1999)

-Dược: nghiên cứu cấu trúc của các dược phẩm Phân tích lượng kim loại (Bismuth, Arsenic, Pb) trong các loại thuốc mê, thuốc ngủ

- Công nghiệp: rút ngắn thời gian định lượng các một lượng nhỏ thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, thực phẩm dinh dưỡng: nghiên cứu sự kém chất lượng, sự phân hủy các chất trong thực phẩm

- Trong sinh học phương pháp HPLC có khả năng tách các chất đặc thù như:

- Các hợp chất cao phân tử, ion thuộc đối tượng nghiên cứu y học, sinh học

- Các hợp chất tự nhiên không bền, các chất kém bền nhiệt, các chất dễ nổ

- Tách các acid nucleic, dược phẩm, steroit, vitamin, chất bảo quản thực phẩm, chất bảo vệ thực vật, các phenol, các hydrocacbon trong dầu mỏ

2.2.6 Ưu và nhược điểm của HPLC

Ưu điểm: Ngoài những ứng dụng rộng rãi đã nêu ở trên, HPLC còn có những

ưu điểm hơn sắc ký lỏng cổ điển: tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, cột tách dùng được nhiều lần, mẫu chất thu lại dễ dàng vì hầu hết các detector không phá hủy mẫu

Nhược điểm: Xét về đầu tư trang thiết bị lẫn phí tổn vận hành, HPLC là một kỹ

thuật đắt tiền

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian, địa điểm tiến hành

3.2.1 Phương pháp thu mẫu

Các loại rau Cần tây, ớt Đà Lạt, lá dứa, rau ngót, trái khế được thu mua ở chợ Linh Trung và các Củ tỏi được thu mua ở chợ Tân Phú và mẫu được bảo quản ở nơi khô ráo tránh ánh sáng

3.2.2 Hóa chất

Ethyl acetate, khí Nitơ, Ethanol, Methanol, Butylated hydroxytoluene (BHT), Alpha – tocopherolchuẩn, acid ascorbic, KH2PO4, Na2SO4, Acetonitrile (ACN), KOH dạng khan, n – Hexan

Bình tam giác, phễu lọc thủy tinh, bình định mức, pipet, giấy lọc, màng lọc 0,2

µm, bình cầu, bình chiết quả lê, lọ thủy tinh chứa mẫu phân tích 10 ml

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nguyên tắc xác định hàm lượng vitamin E

Vitamin E trong dịch chiết có trong các loại thực phẩm được chiết tách bằng hỗn hợp n – Hexan/ethyl acetate (9/1).Dịch chiết sau đó được cô cạn, hòa tan phần cặn trong 10 ml hexan nguyên chất, đem lọc và được định lượng trên hệ thống HPLC tại

Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – TrườngĐại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.3.2 Tối ưu quy trình ly trích vitamin E

Dựa theo quy trình ly trích vitamin E của Koning (1996):

Mẫu đem rửa sạch và xay nhuyễn Cân 2,5 g mẫu đã được xay nhuyễn cho vào chai đựng mẫu rồi thêm 15 ml nước cất, sau đó bổ sung 50 ml hỗn hợp KOH hòa tan trong Ethanol.Tiếp tục cho thêm 0,625 g acid ascorbic, lắc đều hỗn hợp

Sục khí nitơ và xà phòng hóa ở 800C trong 40 phút, để nguội Chiết lấy phần lớp ở trên 3 lần bằng 150 ml nước cất và 150 ml hỗn hợp n – hexan/ethyl acetate (9/1) Loại bỏ nước bằng cách đem lọc qua Na2SO4 khan

Tiếp tục loại bỏ dung môi bằng bộ cô quay, phần cặn còn lại hòa tan trong 10

Sơ đồ 3.1 Quy trình ly trích alpha – tocopherol của Koning và ctv được cải tiến 3.3.3 Tối ưu quy trình phân tích HPLC

Điều kiện chung phân tích HPLC:

Cột sắc ký pha đảo Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 100R, 150 x 4,60 mm

Thêm 0,625 g acid ascorbic

Loại bỏ dung môi bằng

bộ cô quay

Mẫu bơm vào HPLC

Bảng 3.1 Các điều kiện phân tích HPLC

Thành phần tốc độ dòng

(ml/phút)

Thông số 0,5 0,8

1 Bước sóng

3.3.4 Dựng đường chuẩn α – tocopherol

Từ chất chuẩn α – tocopherol (Merck) ta pha ra các nồng độ khác nhau để từ đó

dựng đường chuẩn vitamin E

Sử dụng cân phân tích, cân 0,1191 g chuẩn α – tocopherol hòa tan trong 100 ml

dung môi Hexan để thu chuẩn gốc α – tocopherol 1191 µg/ml

Từ chuẩn gốc 1191 µg/ml tiến hành pha thành các chuẩn 14,89 µg/ml, 29,76

µg/ml, 59,55 µg/ml, 119,1 µg/ml, 238,2 µg/ml, 357,3 µg/ml Từ đó dựng đường chuẩn

trên hệ thống HPLC Mỗi nồng độ của vitamin E được xác định ở thời gian lưu sẽ cho

một diện tích peak Từ đó ta dựng được đường chuẩn y = ax + b

Với y: là diện tích của chuẩn x: là nồng độ các chất chuẩn α - tocopherol (14,89 µg/ml, 29,76 µg/ml, 59,55 µg/ml,

119,1 µg/ml, 238,2 µg/ml, 357,3 µg/ml)

3.3.5 Xác định hàm lượng vitamin E trong mẫu

Hàm lượng vitamin E được tính theo công thức

C =      

    ặ   (mg/kg hoặc mg/l) Trong đó : V : Thể tích định mức (ml)

m : Khối lượng hay thể tích mẫu thô ban đầu (g hay ml)

Cm : Nồng độ vitamin E suy ra từ đường chuẩn

C : Hàm lượng vitamin E có trong mẫu

3.3.6 Hiệu suất thu hồi của quy trình ly trích vitamin E

Để đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp, tiến hành phân tích 2 loại mẫu Mẫu 1: mẫu đối chứng (theo sơ đồ 3.1)

Mẫu 2: mẫu thêm chuẩn (thêm 1 ml chuẩn 119,1 µg/ml vào 2,5 g mẫu sau đó tiến hành như sơ đồ 3.1)

Hiệu suất thu hồi được xác định theo công thức sau:

H =   100%

so

m m s

C

C C

Trong đó:

H: hiệu suất thu hồi (%)

Cs+m: nồng độ vitamin E có trong mẫu sau khi phân tích (µg/ml)

Cm: nồng độ vitamin E trong mẫu trước khi thêm chuẩn (µg/ml)

Cso: nồng độ vitamin E trong chất chuẩn được thêm vào(µg/ml)