BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM Salmonella TRÊN THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ CHỢ VÀ SIÊU
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM Salmonella TRÊN THỊT TƯƠI
TẠI MỘT SỐ CHỢ VÀ SIÊU THỊ THUỘC ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ KIM THUẬN Niên khóa : 2009 – 2013
Tháng 6/2013
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM Salmonella TRÊN THỊT TƯƠI
TẠI MỘT SỐ CHỢ VÀ SIÊU THỊ THUỘC ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Tháng 6/2013
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố
Hồ Chí Minh, Quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt
cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu ở trường
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải, Cử nhân Võ
Tấn Hùng đã hết lòng dạy bảo, giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành tốt khóa luận
Bên cạnh đó tôi cũng chân thành cảm ơn chị Đặng Thị Thu Hường cùng các cô,
chú, anh chị đang công tác tại Trạm Chẩn Đoán, Xét Nghiệm và Điều Trị - Chi Cục
Thú Y Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian
tiến hành đề tài
Cảm ơn các bạn bè đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong những năm tháng học tập
dưới mái trường mến yêu này
Xin cảm ơn Hội đồng giám khảo đã dành thời gian đọc và xem xét đề tài tốt
nghiệp này
Mãi mãi ghi nhớ công ơn sinh thành, dưỡng dục của Ba Mẹ - Người đã cho con
cả cuộc đời và sự nghiệp
Nguyễn Thị Kim Thuận
Trang 4TÓM TẮT
Đề tài “Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại một số chợ và siêu thị
thuộc địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh” được tiến hành từ ngày 15/12/2012 đến 15/06/2013 tại Phòng Kiểm nghiệm Vi sinh - Trạm Chẩn Đoán, Xét Nghiệm và Điều Trị - Chi Cục Thú Y Tp HCM và Phòng Xét nghiệm Chẩn đoán Thú y Hàn – Việt, trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM Mục đích là khảo sát tình trạng vấy nhiễm
Salmonella trên thịt tươi (heo, bò, gà) tại một số chợ và siêu thị thuộc địa bàn Tp
HCM, sử dụng phương pháp PCR để khẳng định Salmonella
Bằng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên, chúng tôi thu thập được 80 mẫu thịt tươi trong đó có 45 mẫu tại chợ và 35 mẫu tại siêu thị Qua khảo sát, ghi nhận: tỷ lệ
nhiễm Salmonella trung bình trên các mẫu thịt tươi là 58,8% và tỷ lệ nhiễm
Salmonella tại chợ (64,4%) cao hơn tại siêu thị (51,4%) Trong các loại thịt được lấy
tại chợ và siêu thị, thịt heo có tỷ lệ nhiễm Salmonella cao nhất (65,1%), kế đến là thịt
gà (52,9%) và thấp nhất là thịt bò (50,0%) Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt heo tại siêu thị cao hơn so với chợ (80,0% so với 60,6%); tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt bò,
thịt gà tại chợ cao hơn so với siêu thị (66,7% và 100% so với 36,4 và 42,9% )
Vậy tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi khá cao so với tiêu chuẩn Việt Nam là không được phép có Salmonella trên quầy thịt Cần phải có những chiến lược để giảm
tỷ lệ này nhằm cung cấp nguồn thịt tươi an toàn cũng như bảo vệ người tiêu dùng
Trang 5SUMMARY
Study “Prevalence of Salmonella on fresh meat from markets and supermarkets
in Ho Chi Minh city” was carried out from December 15th, 2012 to June 15th , 2013 in the laboratory of Diagnostic, Tests and Treatment Station – Veterinary Department,
Ho Chi Minh city and Diagnostic laboratory VietNam – Korea, Agriculture University, Ho Chi Minh city This study was aimed at determining and comparing the
prevalence of Salmonella on fresh meat (pork, beef, chicken) from markets and supermarkets in Ho Chi Minh city, using PCR to confirm Salmonella
A total of 80 fresh meat samples (45 samples from markets and 35 samples from
supermarkets), overall Salmonella prevalence was 58.8% The higher contaminated
frequence was in the products from market (64.4%) as compared to which from supermarket (51.4%) The most contaminated was pork samples (65.1%), fewer with chicken (52.9%) and beef (50.0%) samples The contaminated frequency was different between the samples from the supermarket and market by espece sample For the pork,
80.0% samples of supermarket was positive with Salmonella as compared to the which
of market (60.6%); however, the higher frequency of contamination (66.7% and 100%)
in the beef and chicken was found with products from market as compared to that from supermarkets (36.4% and 42.9%)
This study demonstrated that a high proportion of fresh meat was contaminated
with Salmonella Strategies to reduce Salmonella levels on fresh meat in Vietnam
should be undertaken to improve the safety of meat products and reduce the incidence
of human Salmonellosis from meat consumption
Key word: beef, chicken, market, Salmonella, supermarket, PCR, pork, prevalence
Trang 6MỤC LỤC
Lời cảm ơn i
Tóm tắt ii
Summary iii
Mục lục iv
Danh sách các chữ viết tắt vii
Danh sách các hình viii
Danh sách các bảng ix
Chương 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Yêu cầu của đề tài 2
1.3 Nội dung thực hiện 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Vi sinh thịt 3
2.2. Đại cương về Salmonella 4
2.2.1 Lịch sử nghiên cứu 4
2.2.2 Hệ thống phân loại 4
2.2.3.Đặc điểm chung 5
2.2.3.1 Đặc điểm hình thái 5
2.2.3.2 Đặc điểm nuôi cấy 5
2.2.3.3 Đặc điểm sinh hóa 6
2.2.4 Cấu tạo kháng nguyên 6
2.2.5 Độc tố của Salmonella 6
2.2.6 Sức đề kháng của Salmonella 7
2.2.7 Tính biến dị của Salmonella 7
2.2.8. Ngộ độc do Salmonella 8
2.2.8.1 Các công đoạn dễ cảm nhiễm Salmonella trong hệ thống HACCP 8
2.2.8.2 Điều kiện và cơ chế gây ngộ độc 8
2.2.8.3 Triệu chứng ngộ độc 8
Trang 72.2.8.4 Tình hình ngộ độc do Salmonella 9
2.3. Kỹ thuật PCR 9
2.3.1 Giới thiệu 9
2.3.2 Nguyên lý 9
2.3.3 Các thành phần trong phản ứng PCR 11
2.4 Ứng dụng PCR trong phát hiện Salmonella 11
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14
3.2. Vật liệu 14
3.2.1 Đối tượng khảo sát 14
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 14
3.2.3 Môi trường và hóa chất 14
3.3. Phương pháp nghiên cứu 15
3.3.1 Cách bố trí mẫu 15
3.3.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu thịt 16
3.3.3 Qui trình định tính Salmonella 16
3.3.4 Phương pháp PCR khẳng định Salmonella 18
Xác nhận quy trình 18
Phương pháp ly trích DNA 18
Các thông số chạy PCR 19
Điện di kiểm tra sản phẩm DNA 19
3.4 Chỉ tiêu theo dõi 20
3.5 Xử lý số liệu 20
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21
4.1. Kết quả PCR 21
4.1.1 Xác định Salmonella 21
4.1.2 Xét nghiệm Salmonella trong mẫu 23
4.2 Tình trạng nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại chợ và siêu thị 23
4.3 Tình trạng nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại các chợ 26
4.4 Tình trạng nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại các siêu thị 27
4.5 Tình trạng nhiễm Salmonella trên thịt heo, bò, gà tại các chợ và siêu thị 29
Trang 8Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32
5.1 Kết luận 32
5.2 Đề nghị 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
Trang 9DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ctv Cộng tác viên
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
E coli Escherichia coli
g/l gam/lít
HACCP Hazard Analysis and Critical Control Point
NXB Nhà Xuất Bản
PCR Polymerase Chain Reaction
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
Tm Temperature Melting
Tp HCM Thành phố Hồ Chí Minh
UV UltraViolet radiation
Trang 10DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella 5
Hình 2.2 HACCP trong chăn nuôi và giết mổ lưu hành súc sản 8
Hình 2.3 Nguyên lý kỹ thuật PCR 10
Hình 2.4 Chu trình nhiệt PCR 10
Hình 2.5 Cụm gen gây bệnh SPI - I 12
Hình 3.1 Salmonella trên môi trường tăng sinh chọn lọc 17
Hình 3.2 Qui trình định tính Salmonella 17
Hình 3.3 Salmonella trên môi trường phân lập XLD 18
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR chạy thử với cặp mồi S139 và S141 22
Hình 4.2 Kết quả Blast và so sánh trình tự trên NCBI 23
Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi S139 và S141 24
Hình 4.4 Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại chợ và siêu thị 25
Hình 4.5 Bảo quản thịt tại chợ 26
Hình 4.6 Bảo quản thịt tại siêu thị 26
Hình 4.7 Điều kiện bày bán thịt tại chợ 28
Hình 4.8 Vissan – nguồn cung cấp thịt cho siêu thị có quy trình giết mổ công nghiệp 29
Hình 4.9 Tỷ lệ nhiễm Salmonella giữa các loại thịt heo, bò và gà 30
Trang 11DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Một số serotyp Salmonella được tìm thấy từ thực phẩm 3
Bảng 2.2 Nồng độ và thể tích các thành phần cho 50 μl PCR 11
Bảng 3.1 Số lượng mẫu thịt heo, bò, gà lấy tại chợ và siêu thị 14
Bảng 3.2 Trình tự primer S139 và S141 15
Bảng 3.3 Nguồn gốc các mẫu thịt tươi lấy tại chợ 15
Bảng 3.4 Nguồn gốc các mẫu thịt tươi lấy tại siêu thị 16
Bảng 3.5 Thành phần hóa chất PCR 19
Bảng 3.6 Chu trình nhiệt PCR với cặp primer S139 và S141 19
Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại chợ và siêu thị 23
Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại các chợ 26
Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại các siêu thị 27
Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm Salmonella giữa các loại thịt heo, bò và gà 29
Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt heo, bò, gà giữa chợ và siêu thị 30
Trang 12Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
An toàn thực phẩm là vấn đề có tầm quan trọng đặc biệt, được tiếp cận với thực phẩm an toàn đang trở thành quyền cơ bản đối với mỗi con người Thực phẩm an toàn đóng góp to lớn trong việc cải thiện sức khoẻ con người, chất lượng cuộc sống và chất lượng giống nòi Tuy nhiên, công tác bảo đảm ATTP ở nước ta còn nhiều khó khăn, thách thức Tình trạng ngộ độc thực phẩm có xu hướng tăng và ảnh hưởng không nhỏ tới sức khoẻ cộng đồng
Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới, mỗi năm Việt Nam có 8 triệu người (chiếm xấp xỉ 1/10 tổng dân số) bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc do liên quan đến thực phẩm Trong tổng số vụ ngộ độc thực phẩm thì ngộ độc do vi sinh vật chiếm 51%
và vi khuẩn Salmonella là nguyên nhân của 70% vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật gây ra (Cục an toàn vệ sinh thực phẩm - Bộ Y tế) Salmonella phát triển trong cơ thể
người gây bệnh thương hàn và phó thương hàn Một lượng lớn tế bào sinh nội độc tố
và khi chết sẽ giải phóng ra gây ngộ độc Ngộ độc do Salmonella có thể gây tiêu chảy
kèm theo sốt, suy nhược, mệt mỏi, một số ca nặng dẫn đến tử vong Mầm bệnh còn lưu lại trên cơ thể người bệnh một thời gian dài, phát tán vào môi trường xung quanh và lây nhiễm sang những đối tượng khác
Mặc dù đã có quy định về điều kiện sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo đảm ATTP, quy chế điều tra ngộ độc thực phẩm nhưng việc tuân thủ các quy định này còn chưa nghiêm túc Ý thức trách nhiệm của người sản xuất, kinh doanh thực phẩm đối với sức khỏe cộng đồng còn chưa cao
Xuất phát từ thực tế và các yêu cầu nói trên, được sự đồng ý của Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM, khoa Công Nghệ Sinh Học, với sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải và các anh chị trong Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị, tiến
hành đề tài “Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt tươi tại một số chợ và siêu thị
thuộc địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh”
Trang 132
1.2 Yêu cầu của đề tài
Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella trên các mẫu thịt tươi tại một số chợ và siêu thị
thuộc địa bàn Tp HCM nhằm đánh giá chất lượng nguồn thịt tươi cung cấp cho người tiêu dùng và cảnh báo thực trạng vệ sinh thịt tươi tại Tp HCM
1.3 Nội dung thực hiện
Lấy mẫu thịt tươi tại một số chợ và siêu thị trên địa bàn Tp HCM Xác định tỷ
lệ mẫu thịt tươi nhiễm Salmonella, sử dụng phương pháp PCR để khẳng định
Salmonella
Trang 14Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Vi sinh thịt
Thịt là một trong những nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có chứa nhiều acid amin cần thiết, các chất béo, chất khoáng, vitamin và một số các chất thơm hay còn gọi là chất chiết xuất Theo thành phần hóa học của các loại thịt, chúng ta thấy rằng thịt không những là thức ăn tốt cho người mà còn là môi trường thích hợp cho vi sinh vật có hại phát triển Các vi sinh vật này thường nhiễm vào thịt theo hai con đường: nội sinh và ngoại sinh
Vi sinh vật thường nhiễm nhiều trên bề mặt thịt và phát triển làm cho số lượng tăng lên, đặc biệt khi thịt giữ trong điều kiện nóng khiến vi sinh vật tăng nhanh và thịt chóng hư hỏng Khi ăn phải các loại thực phẩm mang vi sinh vật gây bệnh hoặc độc tố của chúng sẽ gây ra nhiều bệnh cho cơ thể người và động vật, có thể để lại hậu quả nghiêm trọng thậm chí dẫn đến tử vong Các bệnh thường gặp là thương hàn do vi
khuẩn Salmonella, tả do Shigella, lao do Micobacterium, Ngoài ra còn có thể dẫn
đến các triệu chứng ngộ độc nghiêm trọng nếu chúng ta ăn phải độc tố của vi khuẩn
như độc tố botulin của vi khuẩn độc thịt Clostridium botulinum, độc tố của vi khuẩn tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
Trong đó ngộ độc do Salmonella là trường hợp ngộ độc thức ăn do vi khuẩn
thường hay gặp nhất trên người và động vật Vi khuẩn gây ngộ độc chủ yếu là do
Salmonella typhimurium, Salmonella cholerae, Salmonella enteritidis
Bảng 2.1 Một số serotyp Salmonella được tìm thấy từ thực phẩm có nguồn gốc động
Trang 154
Tại Việt Nam, bệnh thương hàn do Salmonella typhi và Salmonella paratyphi
A, B, C gây ra Bệnh rất nguy hiểm, có thể gây ra biến chứng xuất huyết đường tiêu
hóa, khiến ruột trở nên mỏng và có thể bị thủng Salmonella thường vào cơ thể người
qua đường ăn uống Độc tố vi khuẩn tiết ra có thể làm tổn thương hay làm chết các tế
bào lót bên trong ruột làm ruột bị mất nước dẫn đến tiêu chảy Một số Salmonella có
thể sống sót trong các tế bào của hệ miễn dịch và có thể vào máu gây bệnh nhiễm
khuẩn huyết Những Salmonella khác có thể vào túi mật khiến bệnh nhân mang mầm bệnh mãn tính Trong trường hợp sau này, Salmonella theo mật truyền từ gan vào phân
rồi theo phân thải ra ngoài gây bệnh cho người khác (ytehagiang.org.vn/old/index.php
?option = article &id = 408 hong-ng-c-do-nhim-salmonella&catid=94:y-t-d-phong&itemid=185)
2.2 Đại cương về Salmonella
2.2.1 Lịch sử nghiên cứu
Giống Salmonella gồm trên 600 chủng vi khuẩn, chủng đại diện của giống này
là Salmonella cholerae suis, trực khuẩn phó thương hàn lợn, do Salmon và Smith phân
lập ra vào năm 1885 trên lợn mắc bệnh dịch tả
Theo đề nghị của Hội nghị vi sinh vật học Quốc tế năm 1934, để kỷ niệm người
đầu tiên tìm ra vi khuẩn, người ta đặt tên cho vi khuẩn này là Salmonella
Năm 1888, Gaertner phân lập được Salmonella enteritidis từ thịt của bò bị mắc bệnh Năm 1889, Klein phân lập được Salmonella gallinarum từ gà mắc bệnh thương hàn Năm 1909, Rettger phân lập được Salmonella pullorum từ gà con mắc bệnh bạch
lỵ (Nguyễn Quang Tuyên, 2010)
2.2.2 Hệ thống phân loại
Salmonella thuộc:
Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Tộc: Salmonelleae
Salmonella có 2 loài là Salmonella enterica và Salmonella bongori Theo hệ
thống phân loại của Kauffmann –White:
Salmonella enterica chia thành 6 loài phụ:
I Salmonella enterica
II Salmonella salamae
IIIa Salmonella arizona
Trang 16IIIb Salmonella diarizona
IV Salmonella houtenae
VI Salmonella indica Salmonella bongori chỉ có một loài phụ V (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)
2.2.3 Đặc điểm chung
2.2.3.1 Đặc điểm hình thái
Salmonella là một loại vi khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4 -
0,6 x 1 - 3 μ, không hình thành giáp mô và nha bào, phần lớn vi khuẩn thuộc giống
Salmonella có thể di động, trên thân có lông (7 đến 12 lông chung quanh thân), trừ S
pullorum và S gallinarum không có lông, gram âm, dễ nhuộm với các thứ thuốc
nhuộm thông thường (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)
Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella
(futurity.org/health-medicine/sensors-turn-salmonella-into-a-killer)
2.2.3.2 Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn Salmonella vừa hiếu khí vừa yếm khí, dễ nuôi cấy, nhiệt độ thích hợp
37oC, pH 7,2 - 7,6 Salmonella của gia súc sinh trưởng tốt trong điều kiện hiếu khí,
kém hơn ở điều kiện yếm khí
Trên môi trường nước thịt, Salmonella làm canh trùng đục đều, nếu nuôi lâu dài
thì ở đáy ống có cặn, trên môi trường có màng mỏng
Trên môi trường thạch, xuất hiện những khuẩn lạc tròn, trong sáng, ẩm ướt,
nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa, nhỏ hơn và trắng hơn khuẩn lạc của E coli Thỉnh
thoảng có thể thấy khuẩn lạc dạng R, nhám, mặt trong mờ (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)
Trang 176
2.2.3.3 Đặc điểm sinh hóa
Trực khuẩn Salmonella phần lớn lên men và sinh hơi đường glucoza, mannit, mantoza, galactoza, levuloza, arabizona Phần lớn các loài Salmonella không lên men
lactoza và saccaroza
Đa số Salmonella không làm tan chảy gelatin, không thủy hóa ure, không sản
sinh indol, sinh H2S, phản ứng VP âm tính, phản ứng MR dương tính (Nguyễn Quang Tuyên, 2010)
2.2.4 Cấu tạo kháng nguyên
Salmonella có ba lọai kháng nguyên O, H và K:
Kháng nguyên O: Về mặt cấu trúc kháng nguyên O, những nghiên cứu mới đây
cho biết kháng nguyên O không phải là một đơn chất mà gồm nhiều phân tử kháng nguyên cấu tạo thành, gồm 40 thành phần khác nhau được đánh số la mã hay số Ả
Rập Do sự khác nhau giữa các loài Salmonella về phương diện cấu tạo kháng nguyên
O nên người ta đã chia Salmonella ra làm 34 nhóm: A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2,
E3, E4, F, G1, G2, H, I, J, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z, 49, 50
Kháng nguyên H: Cấu tạo của kháng nguyên H cũng rất phức tạp, chỉ ở các
Salmonella có lông Kháng nguyên H chia làm hai pha:
Pha 1: có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông biểu thị bằng chữ mẫu la tinh thường như a, b, c, d, e, f, g, h,…z
Pha 2: không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với các loại khác
và có khi với trực khuẩn E coli, gồm có hơn 6 loại biểu thị bằng số Ả Rập: 1, 2, 3, 4,
5, 6, hay chữ la tinh thường: e, n, x…
Kháng nguyên K: Kháng nguyên K (Kapsel - vỏ) của vi khuẩn Salmonella
không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ đã biết là kháng nguyên Vi (Virulence - độc
tính) có ở hai typ huyết thanh Salmonella typhi và Salmonella paratyphi (Nguyễn
Quang Tuyên, 2010)
2.2.5 Độc tố của Salmonella
Nội độc tố
Nội độc tố của Salmonella rất mạnh và chỉ giải phóng ra ngoài khi tế bào vi
khuẩn bị phân hủy Tiêm nội độc tố với liều thích hợp cho chuột lang, có khả năng gây ngộ độc thần kinh, gây hôn mê, co giật và chết chuột lang trong vòng
Trang 1848 giờ Nội độc tố của Salmonella gồm có hai loại là độc tố ruột gây sung
huyết, mụn loét trên ruột và độc tố thần kinh gây triệu chứng thần kinh
Ngoại độc tố
Ngoại độc tố của Salmonella chỉ hình thành trong điều kiện invivo và trong
nuôi cấy kị khí Ngoại độc tố có tác động vào hệ thần kinh và ruột, có tính kháng nguyên bền vững Có thể chế thành giải độc tố bằng cách trộn thêm 5% formol vào ngoại độc tố, để ở 37oC trong 20 ngày Giải độc tố tiêm cho thỏ sẽ tạo ra kháng thể ngưng kết, kháng thể kết tủa và thỏ có khả năng trung hòa độc
tố và vi khuẩn (Nguyễn Quang Tuyên, 2010)
2.2.6 Sức đề kháng của Salmonella
Salmonella bị diệt ở 70oC trong 20 phút, 75oC trong 5 phút, có thể sinh trưởng trong môi trường thạch ở nhiệt độ 10oC trong 116 ngày Ánh sáng mặt trời chiếu trực
tiếp diệt Salmonella ở nước trong sau 6 giờ, ở nước đục sau 9 giờ Các chất sát trùng
như formol 1/50, acid phenic 3% diệt vi khuẩn trong 15 - 20 phút
Trong xác động vật chết Salmonella có thể sống 100 ngày, trong đất bùn có thể sống 3 tháng Salmonella có thể sống từ 4 - 8 tháng trong thịt ướp muối có tỷ lệ muối
29%, nhiệt độ 6 - 12oC Xử lý bằng cách hơ lửa hay nướng miếng thịt nhiễm trùng ít
có tác dụng diệt Salmonella ở bên trong (Nguyễn Quang Tuyên, 2010)
2.2.7 Tính biến dị của Salmonella
Trong khi nuôi cấy Salmonella có thể biến dị về khuẩn lạc và kháng nguyên
Biến dị S – R
Vi khuẩn mới phân lập có khuẩn lạc S dạng trơn, bóng láng, có kháng nguyên
O đặc hiệu của chủng Qua một thời gian nuôi cấy, vi khuẩn phát sinh biến dị, khuẩn lạc có thể trở thành dạng nhám, xù xì, có dạng R, khi biến thành dạng R
thì kháng nguyên O không đặc hiệu nữa
Biến dị O – H
Trong khi nuôi cấy, dưới ảnh hưởng của một số chất như acid fenic vi khuẩn sẽ
mất lông, sinh biến dị, không di động chỉ còn kháng nguyên O
Biến dị của kháng nguyên H
Vi khuẩn có lông có thể biến dị từ pha 1 sang pha 2 có cấu tạo kháng nguyên khác pha 1 (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)
Trang 198
2.2.8 Ngộ độc do Salmonella
2.2.8.1 Các công đoạn dễ cảm nhiễm Salmonella trong hệ thống kiểm tra HACCP
Hình 2.2 HACCP trong chăn nuôi và giết mổ lưu hành súc sản
(Dương Thanh Liêm, 2010)
2.2.8.2 Điều kiện và cơ chế gây ngộ độc
Điều kiện cần thiết để ngộ độc do Salmonella bộc phát là: (1) thực phẩm phải
chứa hoặc nhiễm vi khuẩn, (2) số lượng vi khuẩn phải đủ cao trong lúc vấy nhiễm hoặc chúng phát triển mạnh mẽ, nghĩa là thực phẩm đó phải là môi trường tốt cho vi khuẩn phát triển, nhiệt độ thích hợp và thời gian đủ dài để sinh sôi nảy nở, (3) vi khuẩn phải được đưa vào ống tiêu hóa
Vi khuẩn vào ruột rồi phát triển tại đó, theo hệ thống bạch huyết vào tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng huyết Vi khuẩn gây viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm mạc ruột, tiết ra độc tố Độc tố này thấm qua thành ruột vào máu Ngoài ra vi khuẩn trong hệ tuần hoàn cũng tiết ra nội độc tố Nội độc tố chủ yếu tác động trên hệ thần kinh vận động của huyết quản, làm giảm độ bền của thành mao quản và giảm chức
năng điều tiết thân nhiệt của cơ thể Như vậy, Salmonella gây bệnh là do độc tố ruột
(enterotoxin) và có lẽ còn do cytotoxin và neurotoxin (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002)
2.2.8.3 Triệu chứng ngộ độc
Thời gian ủ bệnh trung bình từ 12 - 24 giờ Đối với cơ thể yếu và nhiễm nhiều
có khi chỉ vài giờ sau xuất hiện triệu chứng, ngược lại cũng có khi kéo dài đến vài ngày Trước khi phát bệnh thường có hiện tượng nhức đầu, biếng ăn, mặt tái nhợt, ra nhiều mồ hôi Sau đó là nôn mửa, tiêu chảy… có khi nhiệt độ tăng đến 38 - 40oC Tùy
Xí nghiệp chăn nuôi công nghiệp, quy mô lớn, vệ sinh kém
Lò giết mổ gia súc tập trung vấy nhiễm giữa thú khỏe và bệnh
Kho trữ lạnh nhiễm lẫn nhau giữa các quầy thịt
Thịt bày bán ngoài chợ và các siêu thị
nhiễm Salmonella
Thức ăn nhiễm
Salmonella từ
phân chuồng
Trang 20theo từng trường hợp mà sốt có thể kéo dài đến 3 hoặc 7 ngày Bệnh nặng có thể viêm
dạ dày, ruột (Dương Thanh Liêm, 2010)
2.2.8.4 Tình hình ngộ độc do Salmonella
Năm 1940, Salmonella typhi và Salmonella paratyphi được coi là nguyên nhân chủ yếu của các bệnh ở người do Salmonella phát sinh từ thực phẩm và nước trên
phạm vi toàn thế giới Giữa những năm 1969 và 1976, số vụ dịch phát sinh từ thực
phẩm do Salmonella gây ra khoảng 37 trong một năm ở Mỹ (Kiều Hữu Ảnh, 2010)
Ở Đan Mạch năm 1995 có 2.911 trường hợp nhiễm Salmonella, trong đó có
19% gây bệnh thương hàn do ăn thức ăn là trứng và các sản phẩm của trứng bị nhiễm
vi khuẩn này Năm 1999 ở Hàn Quốc nghiên cứu cho thấy 25,9% mẫu thịt gà tươi
sống bị nhiễm Salmonella Ở Netherland 23% thịt heo nhiễm Salmonella spp Năm
2001 nghiên cứu của Swanen Burg và ctv cho thấy 26% thịt heo nhiễm Salmonella
(http://www.pasteur-hcm.org.vn/ng_cuu/nuoc_thucpham/phathien_salmonella_bang_PCR.htm)
Giữa năm 1981 và 1991, số lượng các bệnh nhiễm khuẩn Salmonella đã tăng 170% ở Anh, chủ yếu là do một dịch Salmonella enteritidis, dịch này đã đạt đỉnh vào
năm 1993 (http://www.agroviet.gov.vn/pages/news_detail.aspx?newsid=27673)
Năm 2012, Viện Pasteur Tp HCM cho biết trong hơn 1.100 mẫu thịt tươi sống
lấy tại các chợ trên thị trường Tp HCM có hơn 32% mẫu nhiễm khuẩn Salmonella
Trong đó, thịt lợn chiếm gần 40%, kế đến là thịt gà và thịt bò mau-thit-tuoi-nhiem-khuan-salmonella/55500457/88)
(vietbao.vn/kinh-te/385-2.3 Kỹ thuật PCR
2.3.1 Giới thiệu
Kỹ thuật PCR được nhà khoa học người Mỹ - Kary Mullis và cs phát minh năm
1985 tại công ty Cetus
Phương pháp PCR là một phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này (Trần Linh Thước, 2009)
2.3.2 Nguyên lý
Phản ứng PCR được thực hiện dựa trên cơ sở đặc điểm của sự hồi tính, biến tính và kéo dài của chuỗi DNA trong điều kiện nhiệt độ và chất xúc tác thích hợp (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)
Trang 2140 - 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây
Bước tổng hợp (elongation): Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase (vốn là polymerase chịu nhiệt) hoạt động tốt nhất Thời gian của bước này tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút (Trần Linh Thước, 2009)
Hình 2.3 Nguyên lý kỹ thuật PCR
( http://enfo.agt.bme.hu/drupal/en/node/8912)
Hình 2.4 Chu trình nhiệt PCR
( mun.ca/biologv/scarr/PCRsimplified.html)
Trang 225 μl
unit/50 μl
Enzyme bền nhiệt gắn dNTP vào khuôn DNA Thay đổi
6 Mồi xuôi và mồi
ngược 0,1 - 1 μM
Đoạn DNA ngắn (20 - 30 base) liên kết với khuôn DNA cho phép Taq pol khởi động phản ứng gắn dNTP Cả mồi đặc hiệu lẫn mồi chung có thể được sử
(Quyền Đình Thi và Nông Văn Hải, 2003)
2.4 Ứng dụng PCR trong phát hiện Salmonella
Nuôi cấy định danh vẫn còn là phương pháp truyền thống được áp dụng trong
tất cả các phòng kiểm nghiệm vi sinh để phát hiện Salmonella spp trong thực phẩm và
bệnh phẩm Hạn chế của phương pháp này là mất nhiều thời gian từ 5 – 7 ngày Ngày nay với sự tiến bộ của khoa học, công nghệ sinh học được ứng dụng rộng rãi, kỹ thuật
Trang 2312
PCR cũng được áp dụng để chẩn đoán nhanh Salmonella spp trong thực phẩm có kết
quả trong vòng 24 giờ
Một số lượng lớn các gen tham gia vào quá trình gây bệnh bởi Salmonella Các
gen này tập trung thành từng cụm trên nhiễm sắc thể gọi là cụm gen gây bệnh
(Salmonella Pathogenicity Island – SPI)
Hình 2.5 Cụm gen gây bệnh SPI-I
mô ruột, Salmonella cư trú bên dưới lớp màng nhầy Ở đây chúng thích nghi dần để
tránh sự tấn công của các thực bào và sau đó chúng xâm nhiễm vào các thực bào và
tồn tại bên trong các thực bào này Các locus giúp cho Salmonella chống lại sự tấn công của các thực bào là phoP/Q, pag, prg Locus spv được mang bởi plasmid ở các
kiểu huyết thanh gây bệnh có vai trò làm tăng tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn sau pha
xâm nhiễm Gen hilA (hyper invasion locus) hay còn gọi là iagA nằm trên SPI-I, có vai trò điều hòa sự biểu hiện của operon inv Sự biểu hiện của gen hilA được hoạt hóa bởi