ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VIÊM GAN DO VIRUS HBV TẠI BỆNH VIỆN 175

Trong quá trình này, một số HBV-DNA mới được hình thành ở trong bào tương sẽ quay trở lại nhân tế bào, rồi tổng hợp thành cccDNA , một số tiếp tục gây nhiễm vào tế bào gan khác tiếp tục

TRƯỜNG ÐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VIÊM GAN DO VIRUS HBV

TẠI BỆNH VIỆN 175

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NGUYỄN NGỌC NHI Niên khóa : 2009 - 2013

Tháng 6/2013

TRƯỜNG ÐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VIÊM GAN DO VIRUS HBV

TẠI BỆNH VIỆN 175

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS.BS VŨ BẢO CHÂU NGUYỄN NGỌC NHI

CN CHU THỊ THU HÀ

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến:

Thầy Vũ Bảo Châu và Cô Chu Thị Thu Hà đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt

những kiến thức, kinh nghiệm, luôn giúp đỡ và động viên em trong suốt quá trình thực

hiện khóa luận

Ban chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm Thành

Phố Hồ Chí Minh cùng tất cả quý thầy cô đã dạy dỗ và truyền đạt những kiến thức

chuyên môn cũng như kinh nghiệm sống cho em trong suốt 4 năm học tập tại trường

Cố vấn học tập Tô Thị Nhã Trầm đã luôn luôn đồng hành cùng lớp DH09SH

trong quá trình học tập suốt 4 năm

Con xin gửi lòng biết ơn đến mẹ cùng các anh chị trong gia đình đã luôn luôn tạo

mọi điều kiện tốt và là nguồn động viên về tinh thần lớn nhất cho con trong suốt

những năm tháng vừa qua và mãi sau này

Tập thể lớp DH09SH và đặc biệt là những người bạn đã luôn luôn cùng mình

vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian học tập tại trường

Nguyễn Ngọc Nhi

TÓM TẮT

Viêm gan do virus HBV gây ra là bệnh truyền nhiễm rất nguy hiểm và phổ biển

ở hầu hết các nước trên thế giới Ở nhiều nước Châu Á, Châu Phi, 80% nguyên nhân gây ung thư gan là do nhiễm virus HBV Hiện nay, trên thế giới có khoảng 300 - 350 triệu người mang HBV mạn tính Đồng thời, hàng năm, khoảng 1 triệu người mang HBV mạn tính chết do xơ gan, ung thư gan nguyên phát

Việc chẩn đoán phát hiện và định lượng nồng độ virus HBV trong máu bệnh nhân có HBsAg dương tính không chỉ giúp đưa ra phác đồ điều trị thích hợp và cần thiết mà còn là cơ sở cho những nghiên cứu về dịch tễ virus HBV

Nghiên cứu này ứng dụng kỹ thuật Real-Time PCR để định lượng nồng độ HBV trong huyết thanh của bệnh nhân Đồng thời, thống kê số liệu để khảo sát tình hình nhiễm DNA-HBV tại bệnh viện 175 qua sự phân bố của bệnh theo độ tuổi và giới tính…

DNA-Kết quả nghiên cứu trên 164 mẫu bệnh phẩm đã phát hiện 98 trường hợp dương tính chiếm tỷ lệ 59,8% Về phân bố độ tuổi : từ 20 - 39 tuổi và ≥ 60 tuổi chiếm tỷ lệ 70%, 40 - 59 tuổi chiếm tỷ lệ 60% Tỷ lệ nhiễm DNA-HBV ở nam và nữ là như nhau (60%) Trong đó, kết quả định lượng cho thấy số mẫu dương tính ở nồng độ > 105copies/ml chiếm tỷ lệ cao nhất 38,4%

350 millions people are in state of chronic HBV infection Every year, about one

million people are dead by cirrhosis, liver cancer Therefore, the diagnosis and quantity of DNA-HBV concentration in serum of the patients who are positive for HBsAg help to predict and treat effectively This is necessary and is the basis for research epidemiology

This research applied Real-Time PCR technology to quantity of DNA-HBV concentration in serum of the patients Statistic data help to investigate the state of HBV infection at hospital 175, distribution of disease by age and gender…

Having studied 164 patient detected 98 cases to be positive with HBV (59,8 %) For age of distribution, age of 20 - 39 and age of more than 60 years old were 70 %, age of 40-59 years old was 60% The HBV positive rate of males and females were equal (60%) For samples, which had concentration of more 105 copies/ml were the highest (38,4%)

Key word: HBV, cirrhosis, liver cancer, quantitation, status of HBV infection

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt v

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về bệnh viêm gan do virus HBV 3

2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan siêu vi B 3

2.1.2 Dịch tễ học bệnh viêm gan B 4

2.2 Virus HBV 6

2.2.1 Cấu trúc của virus HBV 6

2.2.2 Quá trình nhân lên của HBV 9

2.3 Chẩn đoán viêm gan siêu vi B 10

2.3.1 Phương pháp định tính 10

2.3.2 Phương pháp định lượng DNA-HBV 12

2.4 Phương pháp Real-Time PCR 13

2.4.1 Khái niệm 13

2.4.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp Real-Time PCR 16

2.4.3 Một số khái niệm dùng trong phản ứng Real-Time PCR 17

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

3.2 Vật liệu 18

3.2.2 Vật liệu và hóa chất dùng để tách chiết DNA 18

3.2.3 Hóa chất dùng cho xây dựng đường chuẩn định lượng 18

3.2.4 Vật liệu và hóa chất dùng cho phản ứng Real-Time PCR 19

3.2.5 Thiết bị và dụng cụ 19

3.3 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật nghiên cứu 19

3.3.1 Phương pháp nghiên cứu 19

3.3.2 Kỹ thuật nghiên cứu 20

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Phân tích kết quả Real-Time PCR 25

4.1.1 Mẫu dương tính 25

4.1.2 Mẫu dương tính dưới ngưỡng 29

4.1.3 Mẫu âm tính 29

4.2 Tình hình nhiễm DNA-HBV tại 175 30

4.2.1 Tình hình nhiễm DNA-HBV 30

4.2.2 Tình hình nhiễm DNA-HBV theo độ tuổi 31

4.2.3 Tình hình nhiễm DNA-HBV theo giới tính 32

4.3 Phân loại nhóm nồng độ DNA-HBV 33

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

5.1 Kết luận 34

5.2 Kiến nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

cccDNA covalently closed circular DNA

HBcAg Hepatitis B core Antigen

HBeAg Hepatitis B eliminate Antigen

HBsAg Hepatitis B surface Antigen

HBcAb Hepatitis B core Antibody

HBeAb Hepatitis B eliminate Antibody

HBsAb Hepatitis B surface Antibody

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Tình hình nhiễm HBV theo các lớp tuổi tại TP Hồ Chí Minh năm 2000 6

Bảng 3.1 Thành phần bộ kít tách chiết DNA từ các bệnh phẩm 18

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt định lượng HBV cài đặt cho máy Real-Time PCR 22

Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm HBV tại bệnh viện 175 30

Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm DNA-HBV theo độ tuổi 32

Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm DNA-HBV theo giới tính 32

Bảng 4.4 Phân loại nhóm nồng độ DNA-HBV 33

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Tình hình bệnh viêm gan B mạn tính trên thế giới 5

Hình 2.2 Ba dạng cấu trúc của HBV trong huyết thanh dưới kính hiển vi điện tử 6

Hình 2.3 Cấu trúc tiểu thể Dane 7

Hình 2.4 Tổ chức bộ gen của HBV 7

Hình 2.5 Mô hình chu trình nhân lên của HBV 10 

Hình 2.6 Nguyên tắc hoạt động của molecular beacon 15 

Hình 2.7 Nguyên tắc hoạt động của Taqman probe 16

Hình 4.1 Kết quả chạy Real-Time PCR mẫu dương tính cao dạng linear 26

Hình 4.2 Mối tương quan giữa chu kỳ và nồng độ DNA-HBV 26 

Hình 4.3 Kết quả chạy real-time PCR mẫu dương tính phân tích dạng log 27 

Hình 4.4 Kết quả chạy Real-Time PCR mẫu dương tính trung bình dạng linear 27

Hình 4.5 Kết quả chạy Real-Time PCR mẫu dương tính yếu dạng linear 28

Hình 4.6 Kết quả chạy Real-Time PCR mẫu dương tính dưới ngưỡng dạng linear 29

Hình 4.7 Kết quả chạy Real-Time PCR mẫu âm tính dạng linear 30

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Theo thông báo của Tổ chức y tế thế giới (WHO, 2008), hiện nay có khoảng 2 tỷ người nhiễm virus viêm gan B, trong đó 6% nhiễm cấp tính và 5-10% trong số này sẽ chuyển sang mạn tính ở người lớn và riêng đối với trẻ em tỷ lệ này lên đến 90% Viêm gan B cấp dẫn tới viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nguyên phát Mỗi năm, trên thế giới có 1 triệu người chết vì viêm gan B (Alter MJ, 2003; Garson JA và ctv, 2005) Tại Việt Nam, hiện nay có khoảng 15 - 20% dân số nhiễm HBV, đồng thời có khoảng

80 - 90% bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát có liên quan đến nhiễm HBV (Trần Hữu Bích và ctv, 2010)

Do tỷ lệ nhiễm HBV khá cao nên vấn đề điều trị hay theo dõi khả năng hoạt động của virus trong máu cũng đang rất được quan tâm Nhưng để có thể có được những hiểu biết về các vấn đề trên thì cần phải xác định được một người đang mang HBsAg (+) có thật sự đang nhiễm HBV hay không? Ngoài ra, để có được chỉ định điều trị đặc hiệu cũng như theo dõi được hiệu quả điều trị thì phải phát hiện cũng như định lượng HBV trong máu

Vì vậy, việc phát hiện và theo dõi hiệu quả điều trị viêm gan B là một trong những vấn đề quan trọng hiện nay Có nhiều phương pháp cho phép xác định nồng độ DNA-HBV trong máu nhưng phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay là Real-Time PCR vì độ nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian cho ra kết quả nhanh chóng Trước yêu cầu đó, khóa luận “ Ứng dụng kỹ thuật Real-Time PCR trong chẩn đoán viêm gan do virút HBV tại bệnh viện 175” được thực hiện với mục đích:

- Tìm hiểu phương pháp định lượng DNA-HBV bằng kỹ thuật Real-Time PCR sử dụng bộ kít do công ty Việt Á sản xuất

- Phân tích kết quả định lượng DNA-HBV từ phản ứng Real-Time PCR sử dụng Tapman probe được đánh dấu màu FAM và màu HEX

- Khảo sát tỷ lệ DNA-HBV dương tính

1.2 Yêu cầu đề tài

 Nắm vững, hiểu rõ và ứng dụng quy trình định lượng DNA-HBV

 Tìm hiểu tình hình nhiễm DNA-HBV tại bệnh viện 175 từ 15/12/2012 đến 25/5/2013

1.3 Nội dung thực hiện

 Ứng dụng kỹ thuật Real-Time PCR để định lượng DNA-HBV trong huyết thanh

 Khảo sát tình hình nhiễm HBV, tìm hiểu sự phân bố theo độ tuổi, giới tính và

nhóm nồng độ của người nhiễm HBV

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về bệnh viêm gan do vi rút HBV

2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan siêu vi B

Vào thế kỷ thứ 5 trước Công Nguyên khi quan sát bệnh vàng da, Hippocrates đã khẳng định tác nhân gây ra bệnh dịch vàng da ở người có khả năng liên quan đến bệnh

lý gan Năm 1937, người ta ghi nhận có sự liên quan giữa tình trạng vàng da với việc chủng ngừa bệnh sốt vàng Trận dịch viêm gan huyết thanh lớn nhất xảy ra vào năm

1942, 28.585 chiến binh Mỹ được chủng ngừa vaccine bệnh sốt vàng đã bị vàng da và

62 người bị tử vong Sự kiện này đã cung cấp một bằng chứng quan trọng là bệnh viêm gan có thể được gây ra bởi một tác nhân hiện diện trong huyết thanh người được đưa vào môi trường cấy siêu vi dùng để pha chế vaccine phòng ngừa bệnh sốt vàng Sau đó, hiện tượng vàng da cũng được phát hiện sau khi truyền máu toàn phần hoặc các chế phẩm từ máu

Năm 1947, MacCallum và Bauer là người đưa ra khái niệm viêm gan A và viêm gan B Viêm gan A được gọi cho các “viêm gan nhiễm trùng” lan truyền chủ yếu qua đường tiêu hóa với thời gian ủ bệnh là 2 - 6 tuần Trong khi đó viêm gan B được gọi cho “viêm gan huyết thanh” lây truyền do sự tiếp xúc của da với các sản phẩm có nguồn gốc từ máu với thời gian ủ bệnh từ 2 - 6 tháng Năm 1963, trong khi nghiên cứu

sự đa hình của các protein trong huyết thanh, Blumberg đã phát hiện một protein lạ trong máu của một người thổ dân châu Úc Protein này đã được đặt tên là kháng nguyên Australia (Au), đây là một dạng hình thái đặc trưng của viêm gan siêu vi B Năm 1968, Prince và ctv đã chứng minh rằng kháng nguyên Au (và ngày nay được gọi là kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B, HBsAg) chỉ hiện diện duy nhất trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B Năm 1973, Dane đã tìm thấy các hạt tương tự như virus hiện diện trong huyết thanh của các bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B Những hạt này hay còn gọi là hạt Dane được xem như là virus viêm gan B, yếu tố bề mặt của virus được gọi là kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (HBsAg), phần lõi chứa DNA nội bào và kháng nguyên lõi (HBcAg) Cùng thời gian này, Magnius và Espmark phát hiện kháng nguyên thứ ba đó là kháng

nguyên e của virus (HBeAg) Sau đó, các virus viêm gan khác cũng được phát hiện nhưng khái niệm virus viêm gan B vẫn được dùng cho các hạt có cấu trúc kể trên Cho đến nay khoa học đã phát hiện được 7 loại virus gây viêm gan, trong đó virus HBV chiếm tỷ lệ nhiễm cao nhất Tại Việt Nam 15% dân số nhiễm HBV và đây

là virus gây viêm gan duy nhất có vaccine để phòng ngừa

2.1.2 Dịch tễ học bệnh viêm gan B

2.1.2.1 Sự phân bố HBV trên thế giới

Sự phân bố HBV trên thế giới không đồng đều, được phân thành ba vùng dịch tễ theo 3 mức dịch lưu hành địa phương

 Vùng lưu hành dịch cao

Là những vùng có số người mang HBsAg mạn tính từ 7 - 20% Đó là những nước châu Á (trừ Nhật Bản và Ấn Độ) và Châu Phi, hầu hết các nước vùng Trung Cận Đông, vùng lưu vực sông Amazon (Nam Mỹ), các nước thuộc khu vực Tây Thái Bình Dương, một số dân tộc vùng Bắc Cực Ở vùng này nhiễm sớm rất cao ngay sau khi mới ra đời, ở lứa tuổi nhỏ và đạt đỉnh điểm ở tuổi vị thành niên Phương thức lây truyền ở đây là lây truyền dọc từ mẹ sang con

Hình 2.1 Tình hình bệnh viêm gan B mạn tính trên thế giới 

(www.impe-qn.org.vn)

2.1.2.2 Tình hình nhiễm HBV tại Việt Nam

 Tỷ lệ mang HBsAg trung bình ở người Việt Nam

Việt Nam nằm trong vùng lưu hành dịch viêm gan B cao và là một trong những nước có tỉ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới Cả nước có khoảng 12 - 16 triệu người mang HBV Tỷ lệ dao động 15 - 20% Ở những nhóm có nguy cơ cao tỷ lệ nhiễm HBV còn cao hơn nhiều

Đến nay, chưa có các công trình nghiên cứu thực sự quy mô về dịch tễ học của viêm gan siêu vi B ở Việt Nam Tại Hà Nội, tỷ lệ người mang HBsAg được ghi nhận vào khoảng 15 - 20% (Hoàng Thủy Nguyên, 1991) Tại TP.HCM có 2 nghiên cứu có

số lượng khảo sát tương đối lớn như ở Trung tâm Truyền máu và Huyết học TP.HCM (n=32.300, 1992 - 1996), tỷ lệ này là 11,4% và ở bệnh viện Chợ Rẫy (n=22.427, 1996-1997), tỷ lệ HBsAg (+) là 5,14% Tại Tiền Giang, vào khoảng 21,28%

 Tình hình nhiễm HBV theo các lớp tuổi

Theo nghiên cứu thực hiện tại phòng tiêm chủng vaccine ở trường Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh, khảo sát trên 9.078 đối tượng từ 1 tuổi trở lên đã cho thấy tỷ lệ mang HBsAg thay đổi theo tuổi như sau:

Bảng 2.1 Tình hình nhiễm HBV theo các lớp tuổi tại TP Hồ Chí Minh năm 2000

2.2.1 Cấu trúc của virus HBV

2.2.1.1 Cấu trúc của virus HBV

Virus viêm gan B (HBV) thuộc họ Hepadnaviridae là một loại virus hướng gan,

có cấu trúc nhân là DNA Trong huyết thanh của bệnh nhân ở giai đoạn siêu vi đang nhân đôi, có 3 loại tiểu thể: hình cầu hoặc bầu dục (đường kính 20 nm), hình trụ ( dài

200 - 400 nm, đường kính 20 nm) và hình cầu lớn (đường kính 42 nm), được gọi là tiểu thể Dane hay virion hoàn chỉnh Tiểu thể Dane có 2 lớp bao gồm lớp vỏ bọc bên ngoài là kháng nguyên bề mặt (HBsAg) và phần lõi bên trong là một nucleocapside được cấu tạo từ kháng nguyên lõi (HBcAg) Bên trong lõi có chứa DNA và DNA - polymerase

2.2.1.2 Cấu trúc bộ gene (genome) của HBV

mã hóa cho các thông tin di truyền của siêu vi và chuỗi ngắn nằm trong (mang điện tích dương) có chiều dài thay đổi từ 50 - 100% chiều dài của chuỗi dài

 Tổ chức bộ gene HBV

Chuỗi DNA mã hóa cho protein HBV (chuỗi âm) có tính không liên tục có một phần dư nhỏ 9 - 10 base tại đầu 5’, đầu 5’ cũng có sự gắn kết với một protein primase cần thiết cho quá trình tổng hợp chuỗi âm Chuỗi dương giữ chuỗi âm trong cấu trúc vòng vì tính không liên tục của chuỗi âm Đầu 3’ của chuỗi dương không ở vị trí cố định mà còn nối với DNA polymerase của HBV

Chuỗi âm có 4 vùng mã hay 4 khung đọc mở (open reading frames, ORFs) đã được xác định: gene S, gene C, gene P và gene X Các khung đọc mở này gối chồng lên nhau, chính đặc tính này làm cho virus viêm gan B với kích thước bộ gene nhỏ nhưng có khả năng tổng hợp ra nhiều loại protein khác nhau Gene S mã hóa cho các kháng nguyên bề mặt HBsAg gồm 3 vùng (pre-S1, pre-S2, S) mã hóa 3 loại protein của HBsAg (protein L, M và S)

Gene C có 2 codon khởi đầu cho quá trình dịch mã ở đầu 5’, trình tự nucleotide nằm giữa 2 codon này được gọi là vùng pre-C (pre-Core) Nếu quá trình dịch mã bắt đầu từ codon AUG thứ nhất ở vị trí 1814 sẽ tổng hợp nên HBeAg Các nucleotide đầu tiên của vùng pre-C sẽ mã hóa cho một đoạn peptide gồm 19 axit amin gọi là peptide tín hiệu Peptide này giúp cho HBeAg được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào tương của tế bào gan, đồng thời cũng giúp cho kháng nguyên này hòa tan được trong huyết thanh Vì vậy HBeAg được gọi là kháng nguyên hòa tan Đây là một loại protein không tham dự vào cấu trúc của virion và chức năng chưa được biết rõ Tuy nhiên, sự hiện diện của HBeAg có liên quan đến tính lây nhiễm và phản ánh tình trạng đang nhân lên của virus Nếu quá trình đọc mã bắt đầu từ codon AUG thứ hai ở vị trí 1910

sẽ tổng hợp nên kháng nguyên lõi hay HBcAg, đây là kháng nguyên cấu trúc của phần nuclecapside Bởi vì HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu cho nên nó không được bài tiết ra khỏi tế bào gan Vì vậy, HBcAg không bao giờ hiện diện trong huyết thanh Một số trường hợp xảy ra đột biến ở đoạn pre-C tại vị trí 1896, Guanosine được thay thế bằng Adenine, tạo nên một trình tự TAG là codon kết thúc Chính codon kết thúc này đã chấm dứt quá trình dịch mã của vùng pre-C, cho nên sự tổng hợp HBeAg không thực hiện được mặc dù quá trình nhân lên của virus vẫn thực hiện được

Gene P chiếm 80% chiều dài của bộ gene Sản phẩm của gene này là một enzyme vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc RNA lại vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc DNA DNA polymerase được dùng để tổng hợp một DNA mới

từ RNA tiền genome mà sợi RNA tiền genome này lại được tạo ra từ khuôn mẫu là DNA của HBV dưới tác dụng của RNA polymerase của tế bào gan Sản phẩm của gene P không chỉ liên quan đến cơ chế sao chép ngược mà còn tham gia vào việc tạo

ra phần capside bao bọc bên ngoài cấu trúc RNA tiền genome Gien X có kích thước

đôi của siêu vi Protein X còn có liên quan đến sự điều hòa quá trình tăng trưởng của tế bào, cho nên có thể nó có vai trò trong cơ chế sinh ung thư của tế bào gan bị nhiễm

2.2.2 Quá trình nhân lên của HBV

Sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ, vượt qua hàng rào bảo vệ của hệ thống miễn dịch, HBV sẽ di chuyển tới tổ chức gan theo hệ thống tuần hoàn Cơ chế xâm nhập của HBV vào trong tế bào gan cho tới hiện nay vẫn chưa được biết rõ, mặc dù hình thức gắn kết của đoạn Pre-S1 của vỏ HBV với một số các thụ cảm thể trên bề mặt

tế bào gan cũng đã được đề cập đến (Tong và ctv, 1999) Đầu tiên, HBV thâm nhập vào tế bào gan qua sự gắn kết của HBV vào các thụ cảm thể trên bề mặt của tế bào gan Từ đó HBV được chuyển vào trong tế bào gan theo một cơ chế chưa được biết rõ Sau khi hòa màng, HBV bỏ vỏ protein bao bọc bên ngoài và giải phóng lõi DNA vào trong nhân tế bào Tại đây, bộ gen của HBV biến đổi tạo thành ccc-DNA hoạt động như một khuôn phiên mã tạo các RNA thông tin của virus Các RNA thông tin này được vận chuyển qua màng nhân ra bào tương của tế bào và dịch mã tạo ra các protein

vỏ (HBsAg), lõi (HBcAg), HBe protein (HBeAg), polymerase, HBx protein và một số protein chưa xác định khác Tại đó, sẽ thực hiện quá trình “lắp ghép” các protein mới được mã hóa với genomic RNA của virus, tiếp theo các RNA này sẽ được phiên mã ngược để tạo thành 2 chuỗi đơn DNA để tạo thành HBV hoàn chỉnh rồi đi qua hệ thống lưới nội chất bằng hình thức “nảy chồi” thoát khỏi tế bào gan vào hệ thống tuần hoàn

Trong quá trình này, một số HBV-DNA mới được hình thành ở trong bào tương

sẽ quay trở lại nhân tế bào, rồi tổng hợp thành cccDNA , một số tiếp tục gây nhiễm vào tế bào gan khác tiếp tục chu trình nhân lên mới của virus ( Chisari, 2000 và Ganem và Prince, 2004) Quá trình đó cứ tái diễn nhiều lần trong suốt thời gian tồn tại của của HBV trong cơ thể vật chủ Người ta ước tính ở mỗi cá thể mang HBV mạn tính mỗi ngày có khoảng 1011 hạt virus được tạo thành (Nowak MA và ctv, 1993 và Lewin SR và ctv, 2001; Desmond và ctv, 2008) Trong quá trình nhân lên của HBV do

sự thiếu hụt cơ chế sữa sai nên tần suất đột biến xuất hiện cao

Hình 2.3 Mô hình chu trình nhân lên của HBV (Ganem và Pricne,

là kháng thể duy nhất được hình thành.Trong thực tiễn, không dựa vào kháng thể này

HBcAg không hiện diện trong máu, chỉ có trong tế bào gan HBcAb có 2 lớp: HBcAb type IgM và HBcAb type IgG Trong giai đoạn viêm gan cấp chủ yếu là HBcAb type IgM sau đó giảm dần và mất hẳn khi bệnh phục hồi, thay vào đó là HBcAb type IgG tăng dần và tồn tại suốt đời Như vậy, HBcAb type IgM là chỉ điểm của viêm gan B cấp, còn HBcAb type IgG là chỉ điểm của viêm gan B cấp giai đoạn hồi phục hoặc viêm gan B mạn

HBeAg có giá trị tiên lượng lâu dài, cho phép xác định nguy cơ mạn tính, khả năng lây nhiễm cũng như giúp phân biệt người lành mang khuẩn hay người mắc viêm gạn mạn tiến triển Trong viêm gan cấp, hiếm gặp kháng nguyên e, song nếu dương tính có khả năng bệnh chuyển sang giai đoạn mạn tính Kháng thể e xuất hiện khi kháng nguyên e biến mất và bệnh đã khỏi HBeAg phản ánh tính lây nhiễm của bệnh Trong sản khoa, mẹ có HBeAg (+) thì nguy cơ lây truyền cho con là 90-100%, trong khi đó những bà mẹ có HBeAb(-) thì nguy cơ lây truyền cho con là 5-20% HBeAg (+) chứng tỏ virus đang nhân lên mạnh và bệnh tiến triển xấu, khi HBeAb (+) chứng tỏ bệnh đang khỏi Sự chuyển đảo huyết thanh từ HBeAg thành HBeAb là dấu hiệu tiên lượng tốt nói lên sự đáp ứng miễn dịch và bệnh không trở thành mạn tính Tuy nhiên, khi có đột biến pre-core hoặc core, HBeAg sẽ (-), nguyên nhân do quá trình chọn lọc hoặc do áp lực thuốc Viêm gan B mạn mà HBeAg (-) thì bệnh nặng hơn và khó điều trị hơn Trong quá trình điều trị, mặc dù có chuyển đảo huyết thanh nhưng men gan và DNA-HBV vẫn tăng ta phải nghĩ đến tình huống biến dị dưới áp lực thuốc do đó phải thay đổi liệu pháp điều trị

Để tầm soát xem một bệnh nhân có bị nhiễm HBV hay không, người ta không cần phải làm tất cả các dấu ấn huyết thanh mà chỉ cần tìm HBsAg và antiHBc HBsAg (+) là tiêu chuẩn chính yếu để chẩn đoán nhưng nếu HBsAg (-) thì HBcAb (+) cũng đủ chứng minh bệnh nhân đã từng nhiễm HBV Do đó khi cả HBsAg và HBcAb đều (-), chúng ta ít nghĩ đến viêm gan siêu vi B Sau khi đã xác định bị nhiễm HBV, nếu muốn biết bệnh nhân đang ở giai đoạn nào của bệnh thì mới cần thêm các dấu ấn còn lại DNA-HBV: chỉ hiện diện trong các con HBV hoàn chỉnh Hiện nay, với những kỹ thuật sinh học phân tử có thể phát hiện được DNA-HBV và DNA-polymerase Hai dấu

ấn này là những chỉ thị cho sự hoạt động và nhân lên của virus DNA-HBV giúp chúng

ta khẳng định sự hiện diện và nhân đôi của siêu vi cũng như tính lây nhiễm Ngoài ra,

nó còn có giá trị trong chẩn đoán những trường hợp đặc biệt như: có biến chủng

precore khi HBeAg (-) và HBeAb (+) hoặc khi bệnh cảnh lâm sàng rất gợi ý đến viêm gan siêu vi mà tất cả các dấu ấn huyết thanh còn lại đều âm tính, đặc biệt HBsAg Do

đó, trong các trường hợp khó chẩn đoán, người ta thường yêu cầu làm thêm xét nghiệm tìm DNA-HBV Ngoài ra, trước khi quyết định điều trị, người ta cũng dựa trên kết quả dương tính của DNA-HBV

2.3.2 Phương pháp định lượng DNA-HBV

Có nhiều phương pháp cho phép định lượng DNA-HBV như: phương pháp lai ghép trên màng lọc hoặc trong môi trường lỏng (dot blot hydridation test), phương pháp DNA phân nhánh (branched DNA), phương pháp PCR Phương pháp PCR nhạy cảm gấp 10.000 lần so với phương pháp dot blot và DNA phân nhánh, có thể phát hiện ở nồng độ 10 copies/ml

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ Polymerase) do Kary Mullis và ctv phát minh năm 1985 được sử dụng rộng rãi nhất, đây là phương pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào Về nguyên tắc, tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới

từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là 94 - 95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút

Bắt cặp (hybridization): Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng

40oC - 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút Kéo dài (elongation): Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân, theo

sản phẩm khuếch đại đúng kích thước mong muốn hay không, cũng có thể thực hiện thí nghiệm lai với các đoạn dò đặc hiệu (trên màng, trên giếng hay phiếng nhựa,…) để xem sản phẩm khuếch đại có trình tự mong muốn hay không

2.4 Phương pháp Real-Time PCR

2.4.1 Khái niệm

Real-Time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đặc điểm này nên với Real - Time PCR người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng của phản ứng khuyếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng khuếch đại Máy Real-Time PCR cũng có một buồng ủ nhiệt chạy được chương trình luân nhiệt như máy PCR bình thường nhưng có thêm thiết bị Real - Time, thiết bị này có 2 chức năng: có các nguồn sáng phát ra được các tia sáng kích thích có bước sóng xác định lên các tube phản ứng Real-Time PCR và có được camera hay cảm biến quang ghi nhận được ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các tube phản ứng Real – Time PCR khi các tube này được chiếu các tia sáng kích thích

Chất phát huỳnh quang giữ vai trò quan trong trong phản ứng Real-Time PCR Chất phát huỳnh quang phải phát được huỳnh quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích khi trong phản ứng có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại từ DNA đích, và sẽ không thể phát được huỳnh quang nếu không có sản phẩm khuếch đại trong ống Chất phát huỳnh quang được chia thành 2 nhóm: màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA (SYBR Green I) và phương pháp sử dụng mẫu dò (Probe) Màu huỳnh quang này có ái lực rất cao khi có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại và ái lực này là do khả năng chèn của màu vào giữa sợi đôi DNA và làm cho sợi đôi DNA phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Khi không có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại của PCR, chất huỳnh quang bị phân tán trong dung dịch PCR mix, do vậy

mà tube phản ứng sẽ không bị phát huỳnh quang hay chỉ phát huỳnh quang không đáng kể khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích Nhưng khi có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại của PCR thì màu huỳnh quang sẽ bị chèn vào và tập trung trên các sợi đôi DNA của sản phẩm khuếch đại và sẽ làm cho tube phản ứng bị phát huỳnh quang khi

bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích Ban đầu người ta sử dụng ethidium bromide trong phản ứng Real-Time PCR nhưng sau này chuyển sang sử dụng SYBR I vì các ưu điểm

vượt trội hơn như màu huỳnh quang nền rất thấp, khả năng chèn vào sợi đôi cao nhưng không làm cho sợi đôi bị gắn chặt vào nhau khi bị biến tính nhờ vậy mà ảnh hưởng ít lên hiệu quả PCR

Probe là những đoạn olionucleotide sợi đơn có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích gồm Taqman Probe, Molecular Beacon Molecular Beacon có trình tự dài khoảng 25 - 40 base, đầu 5’ gắn với reporter và đầu

3’ gắn với quencher, có trình tự 15 - 39 base ở giữa là bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên một sợi của DNA đích còn 2 đầu của probe thì mỗi đầu có một trình tự 5-6 base bổ sung với nhau làm cho probe tạo thành cấu trúc hình kẹp tóc do trình tự của 2 đầu bắt cặp nhau Ở giai đoạn nhiệt độ biến tính, cấu trúc kẹp tóc của Molecular Beacon không còn nên nếu ở giai đoạn này reporter nhận nguồn sáng kích thích thì nó

sẽ phát huỳnh quang Ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, nếu chưa có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Molecular Beacon sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích vì cấu trúc kẹp tóc của hai đầu đã làm cho reporter gần với quencher khiến tất cả huỳnh quang phát từ reporter đều bị quecher hấp thu Nhưng nếu

có mặt của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Molecular Beacon sẽ bắt cặp vào trình tự đặc hiệu trên sợi đích của sản phẩm khuếch đại, nhờ vậy reporter cách xa quencher trên reporter phát được huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích Trong giai đoạn nhiệt độ kéo dài, enzyme Taq polymerase không thủy giải Molecular Beacon mà chỉ làm tách sợi đích ra khỏi Molecular Beacon khi sợi bổ sung được tổng hợp kéo dài đến trình tự mà probe bắt cặp vào Cuối giai đoạn kéo dài, Molecular Beacon tách khỏi sợi đích và trở lại cấu trúc kẹp tóc nên không cho reporter phát được huỳnh quang nếu nhận được nguồn sáng kích thích

Molecular Beacon rất đặc hiệu vì chỉ cần trình tự sợi khuôn khác biệt là sẽ không có bắt cặp và như vậy là sẽ không có huỳnh quang - chính nhờ vậy Beacon rất ưu việt để phát hiện SNP, thực hiện Mutiplex phát hiện cùng lúc nhiều tác nhân đích rất tốt Tuy nhiên, Molecular Beacon tương đối khó thiết kế, nhất là khi thiết kế trình tự ở hai đầu

5’ và 3’ phải chú ý để có sự bắt cặp đủ mạnh làm cho probe có cấu trúc kẹp tóc mà không làm cho cấu trúc của probe tự gấp lại thành cấu hình không kẹp tóc, vì như vậy

sẽ làm cho huỳnh quang của reporter phát ra tự do không mong muốn

Hình 2.6 Nguyên tắc hoạt động của Molecular beacon (Phạm Hùng Vân, 2008)

Đối với Taqman probe, ngoài các thành phần cơ bản của PCR mix còn có hai thành phần quan trọng để probe có thể phát huỳnh quang được khi có sự hiện diện của sản phẩm khuyếch đại đặc hiệu từ DNA đích, đó là: Taqman probe và enzyme Taq polymerase Taqman probe là những oligonucleotide có trình tự bổ sung với một trình

tự đặc hiệu trên DNA đích, và trình tự này dài khoảng 24 đến 30 base với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang (gọi là reporter) còn đầu 3’ có gắn chất hấp thụ tương ứng (gọi là quencher) để hấp thụ được ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ reporter Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease để có khả năng thủy giải cắt bỏ probe khi probe này bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung

Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra được từ reporter ở đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ của probe hấp thụ, ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuyếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter của Tapman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích