KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG in vitro ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL TRONG CÂY BẠC HÀ (Mentha arvensis L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG in vitro ĐẾN SỰ SINH TRƯ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG

in vitro ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN

VÀ HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL

TRONG CÂY BẠC HÀ

(Mentha arvensis L.)

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : LƯƠNG THIỆN KHÁNH Niên khóa : 2009 – 2013

Tháng 06/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG

in vitro ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN

VÀ HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL

TRONG CÂY BẠC HÀ

(Mentha arvensis L.)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS TRẦN THỊ LỆ MINH LƯƠNG THIỆN KHÁNH

KS TÔ THỊ NHÃ TRẦM

Tháng 06/2013

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Nhà Trường và Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh cùng toàn thể quý thầy cô đã chân thành giảng dạy và truyền đạt những kiến thức

bổ ích trong suốt những năm học tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Trần Thị Lệ Minh, Tô Thị Nhã Trầm là người trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi để thực hiện tốt việc nghiên cứu đề tài khóa luận này

Chân thành cảm ơn đến chị Đỗ Ngọc Thanh Mai, Bùi Thị Hồng Gấm và Nguyễn Thị Thúy Kiều đã giúp đỡ tận tình khi tôi gặp khó khăn trong việc thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn của tôi, cùng tập thể lớp DH09SH đã luôn ủng

hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng con xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người thân trong gia đình đã luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong suốt quá trình học tập và trưởng thành

Lương Thiện Khánh

TÓM TẮT

Hiện nay nhu cầu sử dụng tinh dầu bạc hà ngày càng gia tăng, song lượng tinh dầu tự nhiên vẫn chưa đủ đáp ứng, dẫn đến việc sản xuất tổng hợp tinh dầu bằng phương pháp hóa học và điều này đã phần nào ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Nguyên nhân chính xuất phát từ việc thiếu hụt nguồn cung cấp cây giống Chính

vì thế, yêu cầu đặt ra là phải xây dựng một quy trình sản xuất cây giống bạc hà để cung ứng cho thị trường số lượng cây giống tốt và có hiệu quả kinh tế Do đó, việc xây dựng

quy trình nhân giống in vitro sản xuất cây giống bạc hà, không những đảm bảo khả

năng thích nghi cao khi cây được trồng trên đồng ruộng mà còn tăng hàm lượng tinh dầu, menthol mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhà sản xuất là rất cần thiết

Trong đề tài, tiến hành thử nghiệm nhân giống cây bạc hà gồm vào mẫu, tạo callus, tái sinh chồi và tạo rễ trong ba điều kiện nuôi cấy: ánh sáng đèn neon, nhiệt độ

26 ± 20C; ánh sáng đèn neon, nhiệt độ phòng 29 ± 50C; ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ 28 ±

60C Sau giai đoạn nhân giống in vitro tiến hành thử nghiệm trồng cây bạc hà trên đồng

ruộng và ly trích tinh dầu, đánh giá hàm lượng menthol

Kết quả đạt được sau khi tiến hành thí nghiệm cho thấy giai đoạn vào mẫu, tạo callus và tái sinh chồi cho kết quả tốt nhất khi cây bạc hà được nuôi cấy trong điều kiện

sử dụng ánh sáng đèn neon, nhiệt độ 26 ± 20C Giai đoạn tạo rễ, tái sinh cây hoàn chỉnh thì điều kiện nuôi cấy tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C là tốt nhất Cây bạc hà được nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C có sự sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với cây bạc hà được nuôi cấy trong hai điều kiện phòng lạnh và phòng nóng Hàm lượng tinh dầu (4,36%) và menthol (73,32%) trong cây bạc hà được nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C cho kết quả cao nhất

mint cseedlings in vitro propagated process, not only highly adaptive when growing in

the field but also increased concentrations of synthetic oil and menthol, bring high economic efficiency for producers is necessary

The research focussed on: testing on the sample of mint, creating callus, regenerating shoot and rooting of three culture conditions: neon light, temperature 26 ±

20C and neon light, room temperature 29 ± 50C and natural light, temperature 28 ± 60C

After a period of in vitro propagation, mint is planted on the field, extracted oil,

evaluated menthol content

The result showed that neon lights, temperature 26 ± 200C is optimal condition

to creating callus, regenerating shoot Optimal temperature for Rooting phase, complete regeneration is 28 ± 600C on natural culture conditions Mint was grown in natural conditions with temperature 28 ± 600C, had the growth and development of better than peppermint was cultured in two conditions cold rooms and heat room Mint was grown

in natural conditions, temperature 28 ± 600C had the best results with oil content (4.36%) and menthol (73.32%)

Keywords: propagation condition, mint, menthol

MỤC LỤC

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iii

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng x

Danh sách các hình xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây bạc hà châu Á (bạc hà Á) 3

2.1.1 Phân loại cây bạc hà 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái cây bạc hà Á 3

2.1.3 Đặc điểm sinh vật học cây bạc hà 4

2.1.3.1 Các thời kì sinh trưởng của cây bạc hà 4

2.1.3.2 Điều kiện sinh thái 4

2.1.4 Kỹ thuật trồng, chăm sóc và thu hoạch cây bạc hà 5

2.1.4.1 Kỹ thuật trồng cây bạc hà 5

2.1.4.2 Chăm sóc cây bạc hà 6

2.1.4.3 Thu hoạch cây bạc hà 7

2.2 Tinh dầu cây bạc hà 7

2.2.1 Giới thiệu về tinh dầu bạc hà 7

2.2.2 Công dụng tinh dầu bạc hà 7

2.2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ tinh dầu 8

2.3 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

2.3.1Nhân giống vô tính in vitro 8

2.3.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

2.3.1.2 Ý nghĩa và ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô 8

2.3.2 Một số phương pháp nhân giống vô tính in vitro 9

2.3.3 Quá trình thực hiện nhân giống vô tính in vitro 9

2.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy trong nhân giống in vitr 10

2.3.4.1 Cường độ và chất lượng ánh sáng 10

2.3.4.2 Sự thoáng khí và nồng độ khí CO2 và O2 lên sự sinh trưởng

và phát triển của cây cấy mô 12

2.3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của cây cấy mô 15

2.3.4.4 Sự tương tác giữa nhiệt độ và ánh sáng 15

2.3.4.5 Độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy 16

2.3.4.6 Thành phần và thể tích môi trường nuôi cấy 17

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Thời gian và địa điểm làm đề tài 18

3.2 Vật liệu nghiên cứu 18

3.3 Phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Tạo cây bạc hà in vitro 18

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành callus   18

3.3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tái sinh chồi từ callus 19

3.3.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy trong giai tạo rễ 19

3.3.5 Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây bạc hà ex vivo 19

3.3.6 Đánh giá hàm lượng tinh dầu từ cây bạc hà trong 3 điều kiện nuôi cấy 20

3.3.7 Đánh giá hàm lượng menthol bằng phương pháp đo OD 21

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 21

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Tạo cây bạc hà in vitro 22

4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành callus 23

4.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tái sinh chồi từ callus 25

4.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy trong giai đoạn tạo rễ 27

4.5 Trồng thử nghiệm cây bạc hà in vitro 28

4.5.1 Thuần hóa cây con ngoài vườn ươm 28

4.5.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng và phát triển

của cây bạc hà in vitro khi trồng ở ngoài đồng ruộng 28

4.6 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy in vitro đến hàm lượng tinh dầu,

menthol của cây bạc hà 33

4.6.1 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy in vitro đến hàm lượng tinh dầu 33

4.6.2 Xác định hàm lượng menthol bằng phương pháp đo OD 34

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

Tài liệu tham khảo 37

Phụ lục

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Kết quả mẫu bạc hà sau 3 tuần tái sinh mẫu 22

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng hình thành callus 24

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi 26

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy trong giai đoạn tạo rễ 27

Bảng 4.5 Tỉ lệ sống, chiều cao cây bạc hà trong giai đoạn vườn ươm 29

Bảng 4.6 Kết quả thống kê về chiều cao, số cành, trọng lượng tươi 30

Bảng 4.7 Hàm lượng tinh dầu và trọng lượng khô cây bạc hà 33

Bảng 4.8 Hàm lượng menthol có trong tinh dầu 34

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến năng suất bạc hà 35

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cây bạc hà 40 ngày tuổi 3

Hình 4.1 Mẫu bạc hà phát triển từ đốt thân mang chồi ngủ sau 3 tuần………23

Hình 4.2 Mẫu callus được hình thành sau 30 ngày nuôi cấy……….25

Hình 4.3 Tái sinh chồi từ callus……….26

Hình 4.4 Rễ cây bạc hà in vitro sau 30 ngày……….28

Hình 4.5 Cây bạc hà in vitro sau 2 tuần trồng ở vườn ươm……… 29

Hình 4.6 Cây bạc hà sau 20 và 40 ngày trồng……… 31

Hình 4.7 Đồng ruộng bạc hà sau 1 và 60 ngày trồng………32

Hình 4.8 Quy trình nhân giống in vitro cây bạc hà……… 35

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

phẩm có xu hướng phát triển mạnh mẽ nên nhu cầu sử dụng tinh dầu, hương liệu tăng cao Một số loại tinh dầu được ứng dụng rộng rãi hiện nay như là: tinh dầu cam, chanh, sả, hồi, lài, hoa hồng, nổi bật nhất phải kể đến tinh dầu bạc hà Tinh dầu từ cây bạc hà rất được quan tâm do có công dụng chữa cảm sốt, nhức đầu, sổ mũi, đau họng, khản tiếng, kích thích tiêu hóa, chữa các bệnh đường ruột, sát trùng, giảm đau và những ứng dụng khác trong các ngành kỹ nghệ, thực phẩm và mỹ phẩm (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

Ở nước ta, Hưng Yên là tỉnh trồng và chưng cất tinh dầu bạc hà lớn nhất nước nhưng chỉ đạt khoảng 1.500 lít/tháng Với sản lượng này thì chỉ đáp ứng rất nhỏ nhu cầu sử dụng tinh dầu bạc hà trong nước Chính vì thế, cần phải có những vùng chuyên canh trồng cây bạc hà nhằm đáp ứng được nhu cầu trong nước và xuất khẩu Với dự án

mở rộng vùng chuyên canh trồng cây bạc hà thì việc thiếu hụt cây giống là điều đáng quan tâm Chính vì thế, để có thể cung cấp một sản lượng cây giống bạc hà đáp ứng đủ

nhu cầu thực tế thì phương pháp nhân giống in vitro được xem là có hiệu quả nhất

Tuy nhiên một thực tế là cây bạc hà in vitro được nhân giống trong điều kiện ổn

định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm,… khi trồng trên đồng ruộng, với điều kiện tự nhiên có dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước mau héo và chết hàng loạt gây thiệt hại rất lớn Theo công bố của Nguyễn Trường Giang (2012) tỷ lệ chết này lên đến 32,1% Do

đó, trên nhiều bài báo gần đây đã có nhiều nghiên cứu nhằm mục đích “ rèn luyện” cây

in vitro khi trồng ra vườn ươm có tỷ lệ sống cao, phát triển tốt khi chuyển từ môi

trường nhân tạo ổn định trong bình cấy mô ra ngoài đồng ruộng

Xuất phát từ nhu cầu thực tế, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhân

giống in vitro đến sinh trưởng, phát triển và hàm lượng tinh dầu, menthol trong cây bạc hà (Metha arvensis L.)” được thực hiện nhằm đưa ra quy trình nhân giống cây bạc

hà có hiệu quả kinh tế cao nhất

1.2 Yêu cầu đề tài

 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhân giống in vitro đến sự sinh trưởng, phát

triển và hàm lượng tinh dầu, menthol trong cây bạc hà

 Đưa ra quy trình nhân giống cây bạc hà có hiệu quả kinh tế cao nhất

1.3 Nội dung

trưởng, phát triển của cây bạc hà in vitro trong những điều kiện nuôi cấy được bố trí Sau đó tiến hành trồng cây bạc hà in vitro từ những nghiệm thức được bố trí để khảo

sát sự sinh trưởng, phát triển của cây bạc hà khi trồng ngoài đồng ruộng Cuối cùng là tiến hành ly tích, xác định hàm lượng tinh dầu và mentholtrong cây bạc hà

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây bạc hà Châu Á (bạc hà Á)

2.1.1 Phân loại cây bạc hà Á

Tên khoa học: Mentha arvensis L

Tên khác: Bạc hà nam - Nhân đơn thảo

(Trung Quốc) - Mentha (Pháp) - Peppermint (Anh)

2.1.2 Đặc điểm hình thái cây bạc hà Á

Cây bạc hà là cây thân thảo, sống lâu năm, cao 10 - 60 cm, thân vuông, mọc đứng hay hơi bò, có khi phân nhánh, trên thân và lá có nhiều lông Lá mọc đối, chéo chữ thập, cuống dài, rộng 2 - 3 cm, dài 3 - 5 cm, mép có răng cưa, mặt trên và mặt dưới đều có lông che chở và lông bài tiết Hoa mọc vòng ở kẽ lá, màu tím hay hồng nhạt, có khi màu trắng Mùa hoa tháng 7 - 10, tất cả thân, cây, lá, hoa đều có mùi thơm (Savithri Bhat, 2000)

Rễ bạc hà: Cấu tạo từ thân ngầm dưới đất, phân bố lớp đất từ 30 - 40 cm phân nhánh như rễ phụ Thân ngầm không chứa tinh dầu

Thân bạc hà: Rỗng ruột khi già, trên thân có đốt, mỗi đốt mọc hai mầm đối xứng nhau và các rễ bất định Giữa hai đốt là các lóng, độ dài ngắn phụ thuộc vào các giống và điều kiện trồng trọt, chứa hàm lượng tinh dầu tương đối thấp khoảng 0,3% tỷ

lệ tinh dầu

Lá bạc hà: Lá là cơ quan dinh dưỡng quan trọng nhất có nhiệm vụ quang hợp,

hô hấp, thoát hơi nước và mang tinh dầu, chiếm khoảng 2,4 - 2,7% tỷ lệ tinh dầu

Hoa bạc hà: Cụm hoa bồng hình chóp, trên hoa có cuốn ngắn, 5 đài cánh hợp thành hình chuông Mặt ngoài đài hoa có lông bao phủ Chiếm khoảng 4 - 6% tỷ lệ tinh dầu (Đỗ Tất Lợi, 1987)

Hình 2.1 Cây bạc hà 40 ngày tuổi

2.1.3 Đặc điểm sinh vật học cây bạc hà

2.1.3.1 Các thời kì sinh trưởng của cây bạc hà

Thời kì mọc: thời kì mọc được xác định từ lúc trồng đến khi cây mọc lên định

rõ hàng, điều kiện bình thường thời kì này kéo dài từ 10 - 15 ngày, sau khi trồng một thời gian các đốt thân ngầm mọc rễ, phát triển mầm trong điều kiện nhiệt độ < 100C,

ẩm độ < 60%

Thời kì phân cành: sau khi mọc từ 45 - 55 ngày, bộ rễ đã phát triển đầy đủ, các cây con phát triển mạnh về chiều cao, các cành hai bên nách lá phát triển ra các cành mới Sự phân cành theo thứ tự từ các đốt thân chính xuất hiện mầm từ dưới gốc lên, các đốt trên cao sẽ ngắn lại tạo cho dáng cây có dạng hình chóp Trong thời kỳ này tốc

độ sinh trưởng và khối lượng chất xanh tăng mạnh, quyết định đến năng xuất cây bạc

hà sau này

Thời kì ra nụ: thời kì này kéo dài 10 - 15 ngày, biểu hiện tốc độ ra lá của cây chậm lại, tuy nhiên cây vẫn phát triển kích thước thân lá, tại đỉnh sinh trưởng thân chính xuất hiện mầm hoa, ở thời kì này khối lượng chất xanh vẫn tăng và sự tích lũy tinh dầu vẫn diễn ra Trong thời kì này phải chú ý về dinh dưỡng, phải giảm hàm lượng đạm, tăng lượng phân lân và các yêu cầu về ánh sáng, nhiệt độ trong giai đoạn này đòi hỏi cao nhất

Thời kì nở hoa: đây là giai đoạn khối lượng chất xanh và hàm lượng tinh dầu bạc hà cao nhất (trong một ngày có thể tạo ra 280 kg chất xanh/ha) Vào thời kì hoa nở 50% trên đồng ruộng là lúc hàm lượng tinh dầu trong cây đạt cao nhất, đây là thời điểm thu hoạch tốt nhất Nếu hoa nở 100% thì năng xuất tinh dầu giảm do lá rụng bớt

đi Trong thời kì này chú ý đến các điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ cao, gió mạnh, khô hạn, úng sẽ làm cho hàm lượng tinh dầu giảm (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

2.1.3.2 Điều kiện sinh thái

Ánh sáng: bạc hà là cây ngày dài, ưa ánh sáng Điều kiện ngày dài từ 14 - 16 giờ, cây sẽ chuyển từ sinh trưởng sinh dưỡng sang sinh thực và ra hoa Thời gian chiếu sáng từ 8 - 10 giờ cây sẽ không chuyển giai đoạn được, năng suất chất xanh giảm, tỷ lệ thân ngầm tăng Cây bạc hà là cây ưa sáng và phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng trực xạ Trong quá trình trồng bạc hà phải chú ý đến thời vụ trồng mật độ trồng, không

trồng xen kẽ để dảm bảo ánh sáng hợp lí cho chúng sinh trưởng và phát triển tốt

Nhiệt độ: cây bạc hà sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ mát mẻ từ 18 -

270C, còn thời kì ra hoa nhiệt độ thích hợp nhất là từ 25 - 270C Tuy nhiên trong điều kiện nhiệt độ > 100C cây vẫn có thể sinh trưởng được Trong thời kì tiềm sinh, cây bạc

hà có thể chịu đựng được nhiệt độ rất thấp dưới -10C Như vậy tùy theo nhiệt độ trong vùng trồng mà người ta bố trí thời vụ cho thích hợp Thời gian sinh trưởng của cây bạc

hà từ 80 - 90 ngày khi nhiệt độ trung bình từ 18 - 190C và 90 - 100 ngày khi nhiệt độ trung bình từ 15 - 160C Vì vậy để có sinh khối về tỉ lệ tinh dầu cao cần bố trí thời vụ thích hợp Nhiệt độ trung bình ngày đêm càng cao, cây nở hoa càng nhanh Nếu nhiệt

độ trung bình trong ngày thấp, kết hợp với điều kiện ngày ngắn thì cây sẽ không ra hoa

Độ ẩm: cây bạc hà có lượng bộ phận khí sinh tương đối lớn, bộ rễ kém phát triển, lại phân bố trên lớp đất nông là những lý do làm cây bạc hà cần nước (cả độ ẩm trong đất và độ ẩm trong không khí) Nhìn chung trong thời gian sinh trưởng, nước càng đầy đủ bao nhiêu, khối lượng và chất lượng thu hoạch càng cao bấy nhiêu Ngược lại hạn hán xảy ra, khối lượng và chất lượng thu được đều kém Độ ẩm trong đất thích hợp nhất với bạc hà là 80% (độ ẩm tương đối) Bộ rễ của cây bạc hà phân bố nông và kém phát triển nên sức hút và giữ nước kém, mẫn cảm với hạn Trong thời kì sinh trưởng, nếu độ ẩm cao, bạc hà sẽ đạt được năng suất chất xanh cực đại nhưng hàm lượng tinh dầu sẽ giảm

Đất đai và dinh dưỡng: cây bạc hà ưa đất tơi xốp, có thành phần cơ giới nhẹ, giàu dinh dưỡng, giữ nước và thoát nước tốt Các loại đất phù sa ven sông suối, các loại đất đen có tầng canh tác tương đối dày, mực nước ngầm thấp thích hợp cho cây bạc hà Độ pH thích hợp cho cây bạc hà là 6 - 7,5 trên các loại đất trồng liên tục từ 2 -

3 năm nên phá đi để trồng lại, nên tiến hành luân canh với các loại cây trồng khác để giảm tỉ lệ sâu bệnh hại, không ảnh hưởng đến năng suất Trong từng giai đoạn sinh trưởng bạc hà cần lượng dinh dưỡng khác nhau Chú ý bón phân vào các thời kì: khi cây cao 10 cm, khi phân cành và khi nụ hoa bắt đầu phát sinh Nguyên tố kali cần bón kết thúc sớm (vào lúc cây phân cành) để không ảnh hưởng đến quá trình tích lũy tinh dầu (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

2.1.4 Kỹ thuật trồng, chăm sóc và thu hoạch bạc hà

2.1.4.1 Kỹ thuật trồng bạc hà

Theo Nguyễn Thị Thanh Bình (2004), kỹ thuật trồng gồm có: trồng bằng hạt, bằng thân ngầm, trồng bằng thân bò trên mặt đất, trồng bằng cành, trồng bằng cây con,

trồng bằng cây nuôi cấy mô Trồng bằng hạt: có thể gieo thẳng hay ươm rồi nhổ cây đi trồng Trồng bằng thân ngầm: có thể trồng vào mùa đông và mùa xuân; ở miền Nam khí hậu ấm áp nên phần lớn là trồng vào mùa xuân (tháng 3 - 4) Trước khi trồng nên chọn những đoạn thân ngầm tốt, cắt thành đoạn từ 7 - 10 cm, cứ cách 23 - 33 cm thì đánh một rãnh, nếu trồng theo từng lỗ (hốc) cứ cách 23 - 27 cm đào một lỗ sâu 7 cm, mỗi lỗ trồng 2 - 3 hom Trồng bằng thân, cành: bạc hà thường được trồng vào tháng 6,

7 Người ta cắt những đoạn thân, cành bánh tẻ để trồng Thân bạc hà được cắt thành đoạn dài 10 cm và được đặt sâu xuống 2/3, khoảng cách trồng từ 5 - 7 cm, trồng xong phải che phủ để giữ ẩm Sau khi trồng được 2 - 3 tuần thì cây mọc mầm và khi mọc cao được 10 - 13 cm thì có thể nhổ để trồng chỗ khác

2.1.4.2 Chăm sóc bạc hà

Làm cỏ và vun xới: trồng bằng thân ngầm và bằng hạt khi cây đã mọc cao 7 -

10 cm, hoặc bằng những đoạn thân cành, nếu vườn có cỏ, cần làm cỏ và phá váng Khi cây đã cao 17 - 20 cm thì xới đất lần thứ hai Khi cây đã mọc cao 27 - 33 cm, thì vun xới lần thứ ba Sau khi đã thu hoạch lần thứ nhất, cần phải vun xới kết hợp nhổ những cây có nhiều cành đâm rễ xuống đất Ngoài ra trên những ruộng bạc hà trồng để hai năm thường có rất nhiều cây con mọc lên trong năm thứ hai, lúc làm cỏ và vun xới lần thứ nhất cần phải nhổ bỏ đi, làm cho khoảng cách các cây có cự ly thích hợp, không nên để quá dày, nếu để dày thì sẽ thiếu ánh sáng, ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng của bạc hà

Bón phân: bộ phận thu hoạch là thân và lá cho nên bón phân chủ yếu là dùng phân đạm và phân kali Loại phân dùng bón lót chủ yếu là phân chuồng, phân rác, bùn

ao Phân dùng bón thúc thì dùng sulfat đạm, phân chuồng ủ hoai hay khô đầu trâu Lúc làm đất ngoài việc bón phân lót ra, sau khi cây đã mọc thì phải bón phân thúc nhiều lần, có như thế mới đảm bảo tăng thu hoạch

Tưới nước và tháo nước: bạc hà ưa đất ẩm vừa phải, nếu gặp phải đất quá khô hay sau khi bón phân thúc đều cần phải tưới nước Nhưng gặp phải trời mưa quá nhiều, không tháo nước được, thì bất lợi cho cây bạc hà sinh trưởng Việc tháo nước

và tưới nước cần phải đặc biệt chú ý làm kịp thời và đúng mức Sau khi thu hoạch lần thứ nhất, nếu đất quá khô, cần kết hợp với bón phân có tưới nước, như vậy cây sẽ đâm chồi rất mạnh và cho sản lượng/năng suất thu hoạch lần thứ hai cao hơn (Nguyễn Thị Thanh Bình, 2004)

2.1.4.3 Thu hoạch bạc hà

Bạc hà trồng 2 - 3 tháng có thể thu hoạch Dùng liềm cắt sát gốc, thu hoạch toàn

bộ thân lá để cất lấy tinh dầu Cây thu hoạch xong cần chuyển ngay đến nơi cất tinh dầu Nếu chưa kịp cất tinh dầu ngay thì cần trãi mỏng ở những nơi râm mát, tuyệt đối không đánh đống hoặc bó chặt cây sẽ làm tăng độ ẩm nóng, cây dễ bị thối hỏng, tinh dầu giảm sút nghiêm trọng Phơi nắng hàm lượng tinh dầu cũng bị giảm sút

Để có năng suất cao và phẩm chất tinh dầu tốt thì phải thu hoạch đúng thời vụ, chưng cất kịp thời Để thu hoạch bạc hà đúng lúc người ta dựa vào căn cứ sau: giống

và thời điểm thu hoạch, thời tiết, tuổi cây (Nguyễn Thị Thanh Bình, 2004)

2.2 Tinh dầu bạc hà

2.2.1 Giới thiệu về tinh dầu bạc hà

Hàm lượng tinh dầu trong cây bạc hà thường từ 1,5 - 4% Sự biến động này tùy

thuộc vào giống và điều kiện ngoại cảnh Tinh dầu là chất lỏng không màu hay vàng

nhạt, có mùi thơm đặc biệt, vị cay, rất dễ tan trong dung môi ethanol 900, tan trong 2 -

3 thể tích ethanol 700

Tính chất vật lý: lỏng ở nhiệt độ thường, có mùi thơm không màu hoặc màu

nhạt Chỉ số khúc xạ cao, có năng suất quay cực Ít tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ, este, cồn, có tính sát trùng mạnh Dễ bay hơi, khuếch tán mạnh ở nhiệt độ bình

thường, nhẹ hơn nước Tinh dầu dễ bị biến mùi khi có tác động của ánh sáng, nhiệt độ

Thành phần hoá học: tinh dầu bạc hà bao gồm menthol (51,8%); menthone (19,8%); neomentol (7,65%); β-pinen (1,1%); limonen (2,87%); acetat mentil (2,53%) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2009)

2.2.2 Công dụng tinh dầu bạc hà

Tinh dầu bạc hà được sử dụng khá rộng rãi trong tất cả các loại hương liệu cho bánh kẹo, thực phẩm, nước giải khát, thuốc lá, xà phòng, kem đánh răng,… có tác dụng sát khuẩn, gây tê tại chỗ, trị viêm thần kinh, trị các bệnh tai mũi họng, các bệnh cảm cúm, nhức đầu, đầy bụng,…

Dùng chiết xuất menthol được dùng nhiều trong nhiều ngành kỹ nghệ: kỹ nghệ dược phẩm (1.550 tấn/năm), kỹ nghệ bánh kẹo (570 tấn/năm), kỹ nghệ sản xuất thuốc

lá (1.350 tấn/năm), sản xuất thuốc đánh răng (1.800 tấn/năm), sản phẩm cạo râu (250 tấn/năm),… (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2009)

2.2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ tinh dầu

Theo Lawrence (2006), trong năm 1961, thế giới đã sản xuất và sử dụng 1.500 -

1.600 tấn tinh dầu bạc hà từ loài M piperita Hud., 3000 tấn lấy từ loài M arvensis L

và 700 tấn từ loài M spicata L., Ngày nay, số lượng tinh dầu Bạc hà sản xuất hàng

năm là hơn 23.000 tấn với trị giá hơn 400 triệu USD Ấn Độ là nước sản xuất tinh dầu bạc hà lớn nhất thế giới chiếm khoảng 80 - 85%, các nước còn lại là: Trung Quốc, Brazil, Mỹ và Nhật Bản Menthol là thành phần chính trong tinh dầu bạc hà và được tiêu thụ mạnh trong các ngành công nghiệp Ấn Độ đã được ước tính khoảng 10.000 - 15.000 tấn, Trung Quốc 3.500 tấn và Châu Âu 1.900 tấn

2.3 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.1 Nhân giống vô tính in vitro

2.3.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật không bị nhiễm vi sinh vật, được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống (Murashige, 1977)

2.3.1.2 Ý nghĩa và ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô

Ý nghĩa: nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày nay có ý nghĩa cực kì quan trọng trong phát triển công nghệ sinh học Khi tiến hành các kĩ thuật chuyển gen tạo ra các loại giống cây trồng mới cũng như tìm cách nhân nhanh các giống mới đó, chúng ta đều cần đến kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Sự phát triển kĩ thuật này đến nay đã góp phần quyết định vào sự thành công của công nghệ sinh học thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1996)

 Một số ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật:

+ Không phụ thuộc vào thời tiết, thời vụ, không chiếm nhiều diện tích trong quá trình tiến hành, có thể tiến hành ở bất kì thời điểm nào Phục tráng được các giống cây

đã bị nhiễm, thoái hóa Hệ số nhân cao, nhân nhanh Có thể đáp ứng nhu cầu số lượng lớn trong thời gian ngắn

+ Bảo quản giống dễ dàng Tiết kiệm chi phí vận chuyển giống từ nơi này đến nơi khác Vật liệu để nhân giống dồi dào, phong phú mà tiết kiệm chi phí, hiệu quả kinh tế cao cho người sản xuất Góp phần tích cực cho công tác giống cây trồng Dễ dàng trao đổi công nghệ với các nước

Ứng dụng: tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, sản xuất cây đơn bội, lai xa, bảo quản nguồn gen (Dương Công Kiên, 2002)

2.3.2 Một số phương pháp nhân giống vô tính in vitro

Nhân giống thông qua giai đoạn callus: callus là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự tái biệt hóa của tế bào đã phân hóa Callus sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin Khối callus có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo Cây tái sinh từ callus có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào callus có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma cao hơn

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: sau khi vô trùng mẫu và được nuôi cấy trên môi trường thích hợp Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Sau đó chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và

rễ trở thành cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất có điều kiện sinh trưởng phát triển bình thường Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức

nhân giống thông thường được thực hiện bằng kỹ thuật nhân giống vô tính (in vitro)

thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (Dương Công Kiên, 2002)

2.3.3 Quá trình thực hiện nhân giống vô tính in vitro

Thiết lập sự nuôi cấy vô trùng: các mẫu chọn được khử trùng và cấy vào trong môi trường thích hợp Thời gian nuôi cấy khác nhau tùy loại cây, thường là 4 - 6 tuần Khi đó mẫu cấy mọc thành cây con cao khoảng 1cm

Nhân vô tính in vitro: mẫu cấy được chia ra và được cấy chuyền vào môi

trường mới Tại môi trường mới các mẫu cấy sẽ phát triển thành những chồi nách và chồi bất định, môi trường nhân chồi thường có sự hiện diện của cytokinin Giai đoạn này kéo dài từ 2 - 4 tuần

Tạo rễ: cây in vitro tái tạo hoàn chỉnh được đưa từ ống nghiệm ra môi trường

bên ngoài thường khá yếu nên cần thiết lập môi trường bên ngoài để cho cây làm quen

và thuần hóa cây in vitro Giai đoạn này nếu không có sự nhân giống liên tục thì kéo

dài khoảng 30 - 45 ngày Sau đó có thể đem trồng ra đồng ruộng sản xuất Nếu ở giai đoạn vườn ươm dùng để sản xuất giống thương mại thì có thể kéo dài giai đoạn này 5 -

7 năm (Dương Công Kiên, 2002)

2.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy trong nhân giống in vitro

2.3.4.1 Cường độ và chất lượng ánh sáng

Mẫu cấy được đặt trên môi trường chứa nguồn năng lượng có sẵn là đường nên mẫu ít tùy thuộc vào quá trình quang tổng hợp Tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng hấp thụ có vai trò quan trọng trong phản ứng phát sinh hình thái cây nuôi cấy

mô, đặc biệt ánh sáng là nhân tố quan trọng tham gia trực tiếp vào quá trình quang hợp

và có vai trò quyết định đến quá trình quang hợp, đặc biệt ánh sáng đỏ và xanh của

quang phổ trông thấy ảnh hưởng đến việc nuôi cấy in vitro (Dương Tấn Nhựt, 2007)

Ánh sáng tác động lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật do ảnh hưởng của quang kỳ, sự quang hợp và phát sinh hình thái Quang kỳ đã cho thấy tác động

mạnh mẽ lên sự sinh trưởng của mẫu cấy in vitro (Debergh và Maene, 1977; Hughes,

1981; Economou và Read, 1987) Quang kỳ tác động lên những loài cây khác nhau theo những cách rất khác nhau, một số cây đáp ứng rất tốt trong điều kiện tối, một số trong ánh sáng liên tục và những cây khác dưới điều kiện trung gian Thông thường, điều kiện tốt nhất cho sự sinh trưởng của hầu hết cây là từ 16 - 18 giờ sáng hay ít hơn

1 chút (Morini và ctv, 1987) Đối với đỉnh chồi của cây khô (Azalea) thuộc họ đỗ quyên (Economou và Read, 1986) và nhiều giống táo (Yae và ctv, 1987) sự kéo dài thời gian chiếu sáng là từ 16 – 24 giờ đã giảm tỉ lệ nảy chồi Ở những loài khác cho thấy có sụ khác nhau về sự sinh trưởng để đáp ứng với sự thay đổi của quang kỳ Sự nảy chồi của cây mận sau 45 ngày sinh trưởng không có gì khác nhau về mặt thống kê giữa hai chu kỳ 12 và 16 giờ sáng, trong khi đó chu kỳ 8 giờ sáng cho tỉ lệ hình thành chồi thấp hơn rất nhiều (Morini và ctv, 1991)

Cournac và ctv (1992), đã nhận thấy được sự gia tăng hàm lượng protein và hoạt động của enzyme Rubisco khi cây con khoai tây được nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng cao và sự sinh trưởng của cây đáp lại tương đồng với sự phát triển của quang

hợp biến dưỡng carbon Mặc dù đòi hỏi về ánh sáng của cây in vitro thì thấp hơn trong điều kiện in vivo, nhưng thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng và chất lượng

quang phổ rất quan trọng cho sự điều hòa của quá trình quang phát sinh hình thái mẫu nuôi mô nuôi cấy ( Ziv, 1991) Hasegawa và ctv (1973) đã thu được số lượng cây măng tây cao nhất dưới điều kiện 1000 lux lại hạn chế sự hình thành cơ quan Hunter

và ctv (1983) ghi nhận sự sống sót và sinh trưởng tối ưu của mẫu cây dâu tây tại điều kiện chiếu sáng 4.000 lux, đạt được sự sinh trưởng và phát triển tối đa trong điều kiện

6000 lux và hình thành rễ và phát triển tốt nhất trong điều kiện 7.000 lux Cường độ ánh sáng thấp (1.000 đến 3.000 lux) cần thiết cho việc nhân chồi và gia tăng sự ra rễ ở cây Zzalea (Economou và Read, 1986) và cường độ cao hơn (7.000 đến 10.000 lux) được đề nghị cho việc ra rễ (Murashige, 1977)

Điều khiển sự kéo dài chồi in vitro là một nhiệm vụ quan trọng trong vi nhân

giống để đạt được những chồi hay cây con mong muốn Độ dài lóng cần được điều khiển khác nhau tại những pha sinh trưởng và phát triển khác nhau Chồi với thân ngắn, to khỏe và lá to là những cây thích hợp cho việc chuyển ra vườn và bước thích nghi sau nuôi cấy Mặt khác, chồi với lóng thân dài thường được dùng trong pha nhân chồi để dễ dàng thu nhận các đốt cắt Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của cây được miêu tả bởi Hart (1988) Sự phân bố quang phổ của ánh sáng từ những nguồn sáng khác nhau thì không giống nhau, cũng như cung cấp những dòng bức xạ khác nhau

Chất lượng ánh sáng được điều khiển bằng cách bổ sung thêm nguồn sáng như đèn huỳnh quang đơn sắc kết hợp với bộ lọc ánh sáng Đèn đi-ốt phát sáng đơn sắc (LEDs) có tiềm năng trong việc cung cấp một nguồn sáng với chất lượng mong muốn

mà không có tác động rõ ràng lên sự quang hợp bởi vì chúng đóng góp một phần khá nhỏ vào tổng năng lượng bức xạ Mỗi đèn LEDs là một nguồn sáng hình thành bán cầu nhỏ (đường kính 2 mm) có khả năng cung cấp chỉ một lượng bức xạ đơn sắc nhỏ Để điều khiển sự quang phát sinh hình thái thực vật, sử dụng những loại LEDs khác nhau

có thể phát ra ánh sáng màu đỏ, đỏ xa và xanh với chi phí thấp Ứng dụng đèn LEDs cho sự sinh trưởng thực vật đã được nghiên cứu và có thể ứng dụng vào thực tế (Bula

và ctv, 1991; Iwanami và ctv, 1992; Dương Tấn Nhựt, 2007)

Đối với các mô nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là hoạt động cần thiết, vì năng lượng được cung cấp dưới dạng glucid (đường) có trong môi trường nuôi cấy Theo một vài quan sát, sự quang tổng hợp dường như không bị hủy bỏ, nhưng lại bị giảm mạnh, có thể là do sự hiện diện của đường trong môi trường Trái lại ánh sáng lại cần thiết để điều hòa vài quá trình phát sinh hình thái cây như người ta đã chứng minh

ở nhiều nghiên cứu khác nhau (Dương Công Kiên, 2002)

Ảnh hưởng của ánh sáng đến quang hợp vừa phụ thuộc vào cường độ ánh sáng

vừa phụ thuộc chất lượng ánh sáng Ánh sáng sử dụng trong nuôi cấy in vitro có

cường độ thay đổi từ 100 đến 5.000 lux, và phổ biến nhất là 1.000 đến 3.000 lux

Trong giai đoạn chuẩn bị cây in vitro trước khi đem trồng ngoài vườn ươm, cần cường

độ ánh sáng tăng khoảng 3.000 lux đến 10.000 lux.Cườngđộ ánh sáng tác động đến quang hợp khá rộng, quang hợp có thể tiến hành ngay ở điều kiện ánh sáng có cường

độ thấp như ánh sáng trắng, ánh sáng đèn dầu, tuy nhiên, ở điều kiện ánh sáng yếu thì sản phẩm tạo ra sẽ không đủ bù cho lượng chất hữu cơ bị hô hấp phân hủy Ngược lại, nếu cường độ ánh sáng quá cao thì lại ức chế quá trình quang hợp, đặc biệt là cây ở

giai đoạn in vitro cây có sức sống kém, do đó cần phải bố trí cho cây một cường độ

chiếu sáng thích hợp (Dương Tấn Nhựt, 2007)

Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong quang hợp có bước sóng từ 400 -

700 nm với đỉnh từ 660 - 680 nm Sự phát sinh hình thái do ánh sáng (sự nảy mầm, sự kéo dài đốt thân) xảy ra ở những bước sóng từ 400 - 500 nm (xanh lục), 600 - 700 nm (đỏ) và 700 - 800 nm (siêu đỏ) Các công trình nghiên cứu đáng lưu ý của (Seibert, 1975), chứng tỏ là trên mô sẹo thuốc lá ánh sáng xanh (giải phổ giữa khoảng 467 nm) hoặc tím (giải phổ giữa 419 nm) kích thích việc tạo chồi và ánh sáng đỏ (giải phổ 660 nm) cảm ứng việc tạo rễ Sự phân phối phổ của ánh sáng (spectral distribution of light), thời gian chiếu sáng (photoperiod) và hướng chiếu sáng cũng đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng của thực vật nuôi cấy mô Thời gian chiếu sáng dường như không ảnh hưởng đến việc tạo hình dạng của mô mà chính cường độ ánh sáng nhận được là quan trọng Trong thực tế, phần lớn các phòng nuôi cấy có thời gian chiếu sáng từ 16 đến 18 giờ/ngày Có thể để ánh sáng liên tục, điều này sẽ cho phép gia tăng

sự tăng trưởng của mô

Các loại tia sáng khác nhau có tác dụng lên quang hợp không giống nhau, ánh

sáng đỏ và xanh của quang phổ trông thấy ảnh hưởng đến việc nuôi cấy in vitro Hầu

hết các cây trồng nuôi cấy, xử lý ánh sáng 660 nm kích thích chồi trong khi ánh sáng

740 nm kích thích rễ (Seibert, 1975)

2.3.4.2 Sự thoáng khí và nồng độ khí CO 2 và O 2 lên sự sinh trưởng

và phát triển của cây cấy mô

Nồng độ CO2 cao sẽ tác động có lợi trên sự kéo dài chồi và sự phát triển của lá

trên sự tháo gỡ sự ngủ của chồi ngủ và đốt đơn cây Theobroma cacao, một loài rất khó

nhân giống bằng hệ thống vi nhân giống truyền thống Figucira và Janick (1994) nhận thấy tính gia tăng của việc kéo dài chồi, số lá, diện tích lá, trọng lượng khô và tươi của

chồi cây Theobroma cacao khi nồng độ CO2 xung quanh lên đến 24.000 pm

Quang hô hấp thường hạn chế năng suất của cây C3, gia tăng nồng độ CO2 (500 đến 2.000 μmol.s-1.m-2) tạo ra một sự suy giảm đều đặn và sự hạn chế của O2 lên quang hợp của thực vật đã hoàn toàn bị loại bỏ bởi CO2 Tuy nhiên, quang hô hấp hầu như bị cản dưới điều kiện O2 2%, trong khi đó tỷ lệ quang hợp thực (NPR) tăng gấp đôi nếu so với điều kiện 21% O2 trong môi trường ex vivo (Zelitch, 1975) Shimada và

ctv (1988) đã nghiên cứu ảnh hưởng của ba loại nồng độ O2 trong bình nuôi cấy hai loại cây C3 Primula malacoides và Chrysanthemum morifolium được nuôi cấy dưới

điều kiện PPF bằng 110 μmol.s-1.m-2 và nhận thấy rằng tỉ lệ quang hợp thực (NPR) của những loại này đã được gia tăng gấp 3 lần (ở nồng độ 1% O2) và gấp 1,5 lần (ở nồng

độ 10% O2 nếu so với nghiệm thức đối chứng ở nồng độ 21% O2) Thêm vào đó sự cản hô hấp và gia tăng NPR, giảm nồng độ O2 trong bình nuôi cấy sẽ có ích trong việc ngăn ngừa sự sinh trưởng của vi khuẩn và nấm Những đặc điểm vừa nêu trên cho thấy

sự phát triển và tăng trưởng của mô cấy không chỉ phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng mà còn phụ thuộc vào thành phần không khí bên trong các bình nuôi cấy (Ziv, 1991) Fujiwara và ctv (1988) cho rằng tốc độ quang hợp thấp và sự kém phát triển

của cây in vitro là do nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy thấp nhất trong quá trình quang hợp Nói cách khác, nồng độ CO2 thấp trong bình nuôi cấy trong gần hết quang kỳ sẽ

ức chế khả năng quang hợp của cây, từ đó buộc cây phải sinh trưởng theo phương thức

dị dưỡng hay dị - tự dưỡng nhờ vào sự thu đường từ môi trường như là nguồn carbon

chủ yếu của cây (Kozai, 1991) Khi cường độ quang hợp của cây in vitro được gia tăng

sẽ làm tăng tỷ lệ sống sót của cây in vitro khi đưa ra vườn ươm Các nhà nghiên cứu

gần đây cho rằng cây trồng chứa diệp lục có khả năng quang hợp tăng khi nuôi cấy trên môi trường chứa CO2 (Kozai, 1991)

Bình nuôi cấy được thiết kế ngăn chặn vi khuẩn nhưng hạn chế sự trao đổi không khí giữa bên trong và bên ngoài bình nuôi cấy, từ đó dẫn tới sự ảnh hưởng đến thành phần các khí trong bình nuôi cấy Thông thường, việc đậy kín bình nuôi cấy ngăn ngừa sự xâm nhiễm của các vi sinh vật và sự thoát hơi nước quá mức từ môi trường và mẫu cấy Dạng bình nuôi cấy kín làm ảnh hưởng đến thành phần các khí (Lentini và ctv, 1988) cũng như ánh sáng, vì vậy sự tích lũy nước quá mức và sự sinh trưởng của mô cấy như sự kéo dài chồi, sự nảy chồi và trọng lượng tươi gia tăng nhận thấy rằng kích cỡ của bình nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng của cây

dâu tây và tái sinh chồi của cây Vitis vinifera Blazkova và ctv (1989) đã quan sát sự

khác nhau về sinh trưởng và phát triển của cây Chenpodium rubrum nuôi cấy in vitro

trong những bình nuôi cấy khác nhau và lý do cho sự khác nhau này là sự thay đổi

lượng ethylene gia tăng (De Proft và ctv, 1985)

Những đặc điểm trao đổi khí trong bình có thể được diễn ra tốt nhất bởi số lần trao đổi khí trên một giờ Số lần trao đổi khí trong một giờ (N) là tính chất vật lý của bình nuôi cấy và không thay đổi N có thể gia tăng từ 3 đến 6 lần bằng cách sử dụng màng film polypropylen có khả năng cho khí thấm qua (Kozai và Sekimoto, 1988)

Một hệ thống bình nuôi cấy kín nhưng được làm thông thoáng để giảm hiện

tượng thủy tinh thể ở hoa cây bi bi (Gypsophyla paniculata) (Dillen và Buysens, 1989)

và cây hoa cẩm chướng (Hakkaart và Versluijs, 1983) và để nâng cao sự sinh trưởng của cây dâu tây (Kozai và Sckimoto, 1988) Cuối cùng, việc tăng cường trao đổi không khí giữa bình nuôi cấy và môi trường bên ngoài nhằm:

 Tăng hàm lượng CO2 ở mức tối ưu trong bình nuôi cấy nhằm tăng cường khả

năng quang hợp của cây in vitro (Tanaka và ctv, 1991) Giảm hàm lượng ethylene và

độc tố (De Proft và ctv, 1985) Giảm hàm lượng O2 trong bình nuôi cấy xuống khoảng 10% (Tanaka và ctv, 1991)

 Giải quyết vấn đề thủy tinh thể của cây do độ ẩm trong bình nuôi cấy cao (Ohki và ctv, 1991) Dương Tấn Nhựt và ctv (2007) đã chứng minh rằng trong điều kiện nuôi cấy thoáng khí cây có khả năng hình thành hệ rễ thứ cấp ngay trong giai

đoạn in vitro, điều này sẽ cải thiện tỷ lệ sống sót của cây khi đưa ra vườn ươm

Việc cải thiện chế độ không khí trong bình nuôi cấy có thể đạt được thông qua việc sử dụng màng lọc thoáng khí được gắn lên các lỗ của mỗi bình để ngăn bụi, vi khuẩn và nhờ sự khuếch tán mà CO2 từ bên ngoài sẽ di chuyển vào bên trong các hệ thống nuôi cấy, thành phần khí trong bình sẽ dần dần thay đổi bằng với thành phần khí bên ngoài bình Nồng độ CO2 còn có thể gia tăng nhờ việc bơm trực tiếp khí CO2 vào bình hoặc bình nuôi cấy được chế tạo bằng vật liệu thoáng khí kết hợp với tăng áp lực khí CO2 trong phòng nuôi Ngoài ra, các bình nuôi cấy có dung tích lớn nhằm làm gia tăng lượng không khí trong bình cũng đã được sử dụng Việc sử dụng các bình lớn sẽ đạt hiệu quả cao khi áp dụng phương pháp bơm không khí vào thẳng bình nuôi cấy để cây trong bình không thiếu CO2 trong suốt quá trình tăng trưởng

2.3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của cây cấy mô

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quang hợp chủ yếu vào pha tối thông qua hoạt tính các enzyme pha tối quang hợp và phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường Nhiệt độ trong bình nuôi thường cao hơn nhiệt độ bên ngoài bình một vài độ và phần đáy thường sẽ

ấm hơn phần nắp bình Thông thường, người ta điều chỉnh nhiệt độ phòng nuôi cấy thấp hơn 20C đối với nhiệt độ mong muốn Nhiệt độ trung bình của buồng nuôi được điều chỉnh ổn định từ 220C đến 250C Các loại cây sống ở khí hậu ôn đới thường quen với nhiệt độ thấp hơn là cây nhiệt đới, chính vì vậy mà sẽ có lợi hơn khi có những phòng nuôi cấy có nhiệt độ 200C ± 10C dành cho cây ôn đới, và nhiệt độ 250C ± 10C dành cho cây nhiệt đới Sự chênh lệch nhiệt độ giữa ban ngày (khi chiếu sáng) và ban đêm (không có chiếu sáng) thường được duy trì từ 4 - 80C Ví dụ nhiệt độ ban ngày là

280C nhiệt độ ban đêm là 240C… sự chênh lệch nhiệt độ như vậy hỗ trợ sự trao đổi khí của bình nuôi và cải thiện sự sinh trưởng của cây nuôi cấy Với mỗi loại cây khác nhau

có khoảng nhiệt độ thích hợp riêng Ví dụ cây khoai tây sinh trưởng rất nhanh ở nhiệt

độ ngày đêm là 220C/180C, khi nhiệt độ ngày đêm là 270C/220C cây sinh trưởng chậm hẳn Tốc độ sinh trưởng của mẫu cấy thường giảm hẳn dần khi nhiệt độ buồng nuôi thấp hơn nhiệt độ tối thích nhưng giảm xuống rất nhanh khi nhiệt độ buồng nuôi cao hơn nhiệt độ tối thích

2.3.4.4 Sự tương tác giữa nhiệt độ và ánh sáng

Sự kéo dài chồi là một trong những đặc điểm phát triển không mong muốn trong hệ thống vi nhân giống truyền thống Việc điều khiển chiều cao thích hợp của

chồi in vitro là yêu cầu cực kỳ quan trọng quyết định sự thành công của một hệ thống

vi nhân giống Những nhà nghiên cứu hiện nay đã sử dụng DIF (Moe và ctv, 1991) và nhiều thao tác trên những biến số môi trường khác để điều khiển chiều cao của cây và cho thấy tương lai rất hứa hẹn trong việc ứng dụng kỹ thuật này vào vi nhân giống

Watanabe và ctv (1992) đã nuôi cấy chồi cây Mentha rotundifolia với hai lá

trong 60 ml môi trường MS không đường có bổ sung 8 g/l agar và được chứa trong hộp Magenta với ba loại quang kỳ tối khác nhau lần lượt là 16 giờ/8 giờ, 12 giờ/12 giờ, 8 giờ/16 giờ PPF tổng hợp được cố định trong ba nghiệm thức Hàm lượng PPF, quang kỳ tối, DIF và tương tác của chúng đã tác động một cách mạnh mẽ lên sự sinh

trưởng và phát triển của cây khoai tây và cây bạc hà in vitro (Watanabe và ctv, 1992)

lượng 70 μmol.s-1.m-2 dưới cùng một quang kỳ tối 16 giờ/8 giờ Dưới quang kỳ tối 8 giờ/16 giờ sự khác nhau về chiều cao của chồi trong hai nghiệm thức này ít hơn DIF <

0 làm chồi ngắn hơn so với chồi được tạo ra trong hai nghiệm thức DIF ≥ 0

2.3.4.5 Độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy

Đây là yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến mối quan hệ giữa nước và

cây in vitro Nếu độ ẩm trong bình quá cao sẽ dẫn đến sự chậm phát triển cây in vitro hoặc cây in vitro phát triển không bình thường về sinh lý và hình thái chẳng hạn hiện

tượng thủy tinh thể Hạ thấp độ ẩm trong bình nuôi cấy sẽ tăng tính chống chịu của mô

thực vật đối với hiện tượng mất nước và giúp tăng tỉ lệ sống của cây in vitro trong giai đoạn ex vivo Tanaka và ctv (1992) đã thấy rằng có sự liên hệ tích cực giữa việc giảm

độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy với việc gia tăng sự kháng của lá đối với sự thoát

hơi nước của cây khoai tây nuôi cấy in vitro Họ cũng quan sát được rằng sự gia tăng tỉ

lệ quang hợp thực (NPR) trên một đơn vị diện tích lá khi gia tăng ẩm độ tương đối trong bình nuôi cấy và dưới nồng độ CO2 trong khoảng từ 100 - 200 μmol/mol Sự điều khiển độ ẩm tương đối thích hợp có thể góp phần vào việc cải thiện chất lượng và

năng suất của cây được nuôi cấy in vitro Độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy phụ

thuộc rất nhiều vào số lần trao đổi khí trong một giờ và độ ẩm tương đối của phòng nuôi cấy (Tanaka và ctv, 1992)

Việc thay đổi độ ẩm trong bình nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

và phát triển bình thường của cây trước khi chuyển ra vườn ươm dẫn đến sự thay đổi hình thái giải phẫu và chức năng lá Nhiều phương pháp giảm độ ẩm trong bình đã được đưa ra bao gồm bỏ nắp bình, phủ màng bán thấm lên bình nuôi cấy, làm mát đáy bình, sử dụng dung dịch muối bão hòa và sử dụng một tấm phủ trên môi trường Forney và Brandl (1992) đã đưa ra một cách đơn giản và không tốn kém nhiều để điều kiện độ ẩm trong bình nuôi cấy bằng dung dịch glycerol Wardle và ctv (1983) sử dụng một lớp mỡ cừu phủ trên bề mặt môi trường và một túi chứa silica gel để giảm

độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy và quan sát rõ ràng lỗ khí khổng của cây hoa cúc

Chrysanthemum và Morifolium hẹp hơn và có nhiều lông sừng hơn trên bề mặt cùng

với tỷ lệ mất nước thấp ở cây Brassica oleracea

Một phương pháp cơ bản để tạo ra những cây cứng cáp hơn bằng cách biến đổi qui trình ở giai đoạn thứ ba trong nuôi cấy và vì vậy không cần phải qua bước thích nghi nên tiết kiệm được chi phí sản xuất Phương pháp này được ứng dụng thành công

trên cây hoa cúc và cây nho Đối với cây nho, cả paclobutrazol và việc giảm mạnh độ

ẩm tương đối cải thiện được khả năng chống chịu của cây đối với sự héo rũ sau khi chuyển ra vườn ươm Cây được xử lý với paclobutazol và giảm độ ẩm tương đối có lỗ khí khổng nhỏ hơn, thân ngắn hơn và rễ mập mạp hơn, trong khi đó paclobutazol cảm ứng sự giảm diện tích lá trên cây và gia tăng số rễ (Smith và ctv, 1992)

2.3.4.6 Thành phần và thể tích môi trường nuôi cấy

nuôi cấy mô và vi nhân giống Khi nuôi cấy mô, môi trường thường được sử dụng với diện tích khá nhỏ nếu so với môi trường sử dụng trong thủy canh và những hệ thống sản xuất cây khác Thêm vào đó, môi trường nuôi cấy không được bổ sung trong một thời gian dài do đó việc pha chế thành phần môi trường ban đầu là rất quan trọng Một môi trường lý tưởng cho sự sinh trưởng tốt nhất là môi trường có thể cung cấp cho mô với một lượng đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết (bao gồm đường là nguồn carbon

và năng lượng trong nuôi cấy dị dưỡng và quang dị dưỡng) cho đến khi kết thúc thời gian nuôi cấy, vì vậy sự tiêu hao những chất dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy không ảnh hưởng gì đến sự sinh trưởng của cây Mặt khác, môi trường nên chứa một lượng dinh dưỡng tối thiểu để hạ thấp chi phí sản xuất đồng thời làm giảm những bất lợi về nước và khoáng chất của cây đến mức tối thiểu, đặc biệt ở những giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy Vì thế, sự thay đổi hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường là một trong những con đường để điều hòa sự sinh trưởng của nuôi cấy mô

hấp thu ion giữa những cách xử lý khác nhau, tốc độ tiêu hao ion trong một khoảng

thời gian sẽ lớn hơn khi thể tích nuôi cấy nhỏ hơn Khi cây con Solanum tuberosum được nuôi cấy in vitro trong điều kiện quang tự dưỡng trong 23 ngày trên 16 và 32

ml/bình môi trường lỏng MS đầy đủ, ½ và ¼ trong bình thủy tinh, trọng lượng tươi và khô, chiều dài chồi, số lá, diện tích lá, NPR/đơn vị trọng lượng khô của lá và tốc độ tăng trưởng tương đối trong một ngày của cây đã được nâng cao trong khi đó sự gia tăng phần trăm chất khô bị ngăn cản bởi sự gia tăng thể tích và nồng độ của môi trường ban đầu (Dương Tấn Nhựt, 2007)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm làm đề tài

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 12/2012 đến tháng 06/2013 tại Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: cây bạc hà châu Á (Mentha arvensis L.) Thiết bị: nồi hấp Autoclave, tủ cấy, đĩa cấy, kẹp, dao, kéo, bông thấm, bình tam giác, nhiệt kế,

Hóa chất: môi trường MS, chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA, Kn, cồn 960, 700

Điều kiện thí nghiệm:

 Phòng lạnh: Ánh sáng đèn neon, nhiệt độ 26 ± 20C

 Phòng nóng: Ánh sáng đèn neon, nhiệt độ phòng 29 ± 50C

 Tự nhiên: Ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Tạo cây bạc hà in vitro

Cách tiến hành:

 Thao tác ngoài phòng thí nghiệm: rửa mẫu bằng xà phòng loãng 15 phút Sau

đó rửa mẫu dưới vòi nước sạch trong 20 phút

 Thao tác trong phòng thí nghiệm: lắc mẫu với nước Javen nồng độ 1:2 (javen:nước) trong vòng 10 phút Rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần Sau đó cắt bỏ phần bị hoại tử, cấy vào môi trường MS

Bố trí thí nghiệm: mẫu thí nghiệm được bố trí trong điều kiện ánh sáng đèn neon, nhiệt độ 26 ± 20C; ánh sáng đèn neon, nhiệt độ phòng 29 ± 50C và ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu đạt: tỷ lệ mẫu không bị nhiễm vi sinh vật/tổng số mẫu khảo sát Tỷ lệ mẫu sống: tỷ lệ mẫu phát triển bình thường/tổng số mẫu đạt

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành callus

Vật liệu: mẫu thân từ cây bạc hà in vitro 4 tuần tuổi

Cách tiến hành: cắt lấy mẫu thân từ cây bạc hà in vitro 4 tuần tuổi và được đặt

trên môi trường MS bổ sung NAA 2 mg/l và BA 10 mg/l (Bùi Thị Hồng Gấm, 2012)

Bố trí thí nghiệm: mẫu thí nghiệm được bố trí trong điều kiện ánh sáng đèn neon, nhiệt độ 26 ± 20C; ánh sáng đèn neon, nhiệt độ phòng 29 ± 50C và ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C

Chỉ tiêu theo dõi: Phần trăm (%) mẫu tạo callus: tổng số mẫu tạo callus/tổng số mẫu khảo sát Thời gian cảm ứng tạo callus (ngày) Khối lượng callus (g) Màu sắc và đặt điểm của callus

3.3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sự tái sinh chồi từ callus

Cách tiến hành: cấy chuyền callus hình thành từ ba điều kiện nuôi cấy vào môi trường MS bổ sung 1 mg/l BA + 1 mg/l Kn + 0,5 mg/l NAA (Bùi Thị Thúy Liễu, 2011)

Bố trí thí nghiệm: đặt các mẫu thí nghiệm trong điều kiện ánh sáng đèn neon, nhiệt độ 26 ± 20C; ánh sáng đèn neon, nhiệt độ phòng 29 ± 50C và ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C

Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mẫu tạo chồi: tổng số callus tạo chồi/tổng số callus khảo

sát Số chồi/mẫu: số chồi trung bình/callus Chiều cao chồi: đo từ gốc đến ngọn trên

mặt thạch

3.3.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành rễ

Cách tiến hành: chồi hình thành từ callus trong ba điều kiện nuôi cấy sẽ cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung 0,4 mg/l NAA (Trần Lệ Trúc Hà, 2010) Quan sát sự hình thành rễ đến khi tạo cây hoàn chỉnh trước khi tiến hành đưa ra vườn ươm

Bố trí thí nghiệm: đặt các mẫu thí nghiệm trong điều kiện ánh sáng đèn neon, nhiệt độ 26 ± 20C; ánh sáng đèn neon, nhiệt độ phòng 29 ± 50C và ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C

Chỉ tiêu theo dõi: số rễ/chồi: số rễ được hình thành từ chồi Chiều dài rễ: được

đo từ gốc đến hết chóp rễ

3.3.5 Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây bạc hà ex vivo

 Giai đoạn vườn ươm

Cách tiến hành: sau thời gian 4 tuần cấy vào môi trường tạo rễ cây bạc hà in

vitro đạt kích thước từ 4 - 6 cm ta tiến hành chọn ngẫu nhiên khoảng 200 cây tương

ứng với mỗi điều kiện thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm: chọn 12 khay xốp, sử dụng đất sạch để ươm cây, mỗi khay xốp trồng 50 và sẽ được tưới ngày hai lần Cây mô bạc hà sẽ được bố trí trong vườn ươm Bộ môn Công nghệ Sinh học

Chỉ tiêu theo dõi: sau 2 tuần trồng cây ra vườn ươm, tiến hành khảo sát tỷ lệ chết, chiều cao cây bạc hà

 Giai đoạn trồng trên đồng ruộng

Cách tiến hành: cây con trồng từ vườn ươm sau 2 tuần có độ cao trung bình 8

-11 cm được trồng ra ngoài đồng ruộng Cây được tưới nước 2 lần/1 ngày trong tuần đầu tiên, giai đoạn sau đó tưới 1 lần/ngày Bón phân urê sau 7, 14, 21 và 28 ngày trồng, sau đó bón phân N - P - K sau 40 ngày và 50 ngày trồng Liều lượng phân bón 5 g/m2 Tùy vào tình hình dịch bệnh xuất hiện mà tiến hành phun thuốc ngăn ngừa, một số loại thuốc thường dùng là COC, Kasumin Làm cỏ xới đất sau 15, 30, 45 ngày trồng

Bố trí thí nghiệm: bố trí ba luống đất thí nghiệm tương ứng với ba nghiệm thức

được khảo sát trong giai đoạn in vitro, tiến hành trồng trên mỗi luống 108 cây, với

khoảng cách 15 cm x 20 cm Sau đó tiến hành theo dõi khả năng sinh trưởng, phát

triển của cây bạc hà in vitro được nuôi cấy ở các điều kiện phòng lạnh, phòng nóng và

ngoài tự nhiên qua ba giai đoạn 20, 40, 60 ngày kể từ khi trồng

Chỉ tiêu theo dõi: tiến hành khảo sát tỉ lệ sống, đo chiều cao và đếm số cành sau

20, 40 và 60 ngày trồng Theo dõi tình hình sâu bệnh trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây bạc hà

3.3.6 Đánh giá hàm lượng tinh dầu từ cây bạc hà trong 3 điều kiện nuôi cấy

Cách tiến hành: thu hoạch riêng cây bạc hà từ 3 điều kiện thí nghiệm nuôi cấy sau khi trồng ngoài đồng Tiến hành cân 100 g bạc hà khô cắt nhỏ cho vào nồi với 1 lượng nước cất vừa đủ, đun trong khoảng 2 giờ ở nhiệt độ 1500C Khi đun hơi nước bốc lên đi ngang qua mẫu và mang theo tinh dầu, hơi nước và tinh dầu bốc hơi gặp hệ thống làm lạnh ở trên, khi đó nước và tinh dầu ngưng tụ trong bình hứng Khi tinh dầu tách ta khỏi lớp tế bào, ngưng đun thu lượng tinh dầu trong bình hứng Làm khô bằng

Na2SO4 và bảo quản (Bùi Thị Hồng Gấm, 2010)

Khối lượng mẫu khô

Bố trí thí nghiệm: cây bạc hà được trồng từ mỗi điều kiện nuôi cấy khác nhau

sẽ tiến hành ly trích bằng phương pháp cuốn hơi nước lặp lại ba lần Mỗi lần lặp lại cân 100 g bạc hà khô

Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng trung bình tinh dầu thu được từ những cây bạc hà được trồng từ mỗi điều kiện nuôi cấy