THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘT BIẾN NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE NGỪA BỆNH NHIỄM TRÙNG HUYẾT CHO CÁ TRA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌ C KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘT BIẾN NHẰM ỨNG D

  BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌ C

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC CHỦNG Aeromonas hydrophila

ĐỘT BIẾN NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

SẢN XUẤT VACCINE NGỪA BỆNH

NHIỄM TRÙNG HUYẾT

CHO CÁ TRA

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : CHAU PHI RINNE

Niên khóa : 2009– 2013

Tháng 06/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌ C

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM ĐỘC LỰC CHỦNG Aeromonas hydrophila

ĐỘTBIẾNNHẰM ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

SẢN XUẤT VACCINE NGỪABỆNH

NHIỄM TRÙNGHUYẾT

CHO CÁ TRA

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS VŨ THỊ THANH HƯƠNG CHAU PHI RINNE

Tháng 06/2013

LỜI CÁM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường

Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ

Sinh Học đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cảm ơn các thầy cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, đặc biệt là cô Tô Thị

Nhã Trầm, các thầy cô trong và ngoài trường đã tận tình giảng dạy truyền đạt mọi kiến

thức và kinh nghiệm quý báo cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

Xin gửi lời tri ân sâu sắc đến cô Vũ Thị Thanh Hương đã tận tình hướng dẫn,

giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận

Xin cảm ơn các anh, chị công tác tại Phòng Công Nghệ Sinh Học Thủy Sản,

Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là anhLê Văn

Hậu,chị Trương Ngọc Thùy Liên đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tại

Trung Tâm

Cảm ơn các anh, chị và các bạn cùng thực tập tại Phòng Công Nghệ Sinh Học

Thủy Sản, Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh đã khuyến

khích, ủng hộ, giúp đỡ tôi thực hiện tốt khóa luận này

Gửi lời cảm ơn đến các bạn bè thân yêu lớp DH09SH và những người bạn thân

yêu khác của tôi, các bạn đã luôn ở bên cạnh, động viên, ủng hộ, giúp đỡ, chia sẽ

những vui buồn cùng tôi suốt thời gian qua

Con xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ và các thành viên trong gia đình đã

quan tâm, chăm sóc, luôn làm chỗ dựa vững chắc cho con vượt qua mọi khó khăn

Sinh viên thực hiện

CHAU PHI RINNE

TÓM TẮT

Vi khuẩn Aeromonas hydrophila được xác định là nguyên nhân chính gây bệnh

nhiễm trùng huyết trên cá Tra, hàng năm gây thiệt hại lớn về sản lượng nuôi trồng thủy sản nói chung Sản xuất vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết (bệnh đốm đỏ)là một biện pháp được đánh giá cao vì những lợi ích về kinh tế và môi trường Đáp ứng nhu

cầu trên đề tài “Thử nghiệm độc lực chủng Aeromonas hydrophila đột biến nhằm ứng

dụng trong nghiên cứu sản xuất vaccinengừa bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra” đã

được đề ra phục vụ cho nghiên cứu “Tạo chủng Aeromonas hydrophila nhược độc có

tiềm năng làm vaccine ngừa bệnh nhiễm trùng huyết trên cá Tra” của Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh

Cá Tra thử nghiệm được tiêm chủng A hydrophilađột biếnvà chủng A hydrophilahoang dại với nồng độ từ 103 – 107 cfu/ml.Sau đó, đánh giá hiệu quả bảo vệ

của chủng A hydrophilađột biến, nhược độc thông qua hệ số RPS

Kết quả: chủng A hydrophila hoang dại có độc lực cao, ở nồng độ 103 cfu/ml gây chết 60% cá, ở nồng độ 107 gây chết 100% cá.Chủng A hydrophila đột biến bị

giảm độc lực ở nồng độ 105, 106 cfu/ml không gây chết cá (so với chủng A hydrophila

hoang dại gây chết lần lượt 91%, 93% cá), 107 cfu/ml gây chết 40% cá (so với chủng

A hydrophila hoang dại gây chết 100% cá).

SUMMARY

Thesis “Experimental Aeromonas hydrophila strains virulent mutants to study

applications in vaccine production for septicemia of catfish”

BacteriaAeromonas hydrophila were identified as the main cause of septicemia

of catfish, causing major damage each year in aquaculture productionl Vaccine production sepsis is a measure of appreciation for the economic benefits and

environmentalbenefits Meeting the needs of the project "Experimental Aeromonas hydrophila strains virulent mutants to study applications in vaccine production for septicemia of catfish" has been proposed for the study "Creating Aeromonas hydrophila strain disadvantages toxic potential vaccine septicemia of catfish "of the

Biotechnology Center of Ho Chi Minh city

Catfish immunized test A hydrophila mutant and strains of A hydrophilawild

with a concentration of 103-107 cfu/ml Then evaluate the protective effect of strain A hydrophila mutant, attenuated through the RPS

The strains of A hydrophila virulent wild high concentration of 103 cfu/ml caused 60% of the fish died, at a concentration of 107 100% lethal fish Strains of A hydrophila mutant was attenuated in a concentration 105, 106 cfu/ml did not cause fish

kills (compared with wild-type strains of A hydrophila lethal 91%, respectively, 93%),

107 cfu/ml 40% lethal fish (compared with wild-type strains of A hydrophila caused

100% mortality of fish)

Key word: virulent strains A hydrophila mutant, virulent strains A hydrophilawild

MỤC LỤC

Trang

Lời cám ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu đề tài 2

1.3Nội dung thực hiện 2

2.1 Tổng quan về Aeromonas hydrophila 3

2.1.1 Vị trí phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm chung 3

2.1.3 Môi trường phân lập 4

2.1.4 Tình hình nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết ở cá Tra 4

2.1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới 4

2.1.4.2 Nghiên cứu trong nước 6

2.2 Sơ lược về bệnh xuất huyết trên cá do vi khuẩn A hydrophila 6

2.2.1 Đối tượng lây nhiễm 6

2.2.2 Triệu chứng lâm sàng khi xâm nhiễm 7

2.2.3 Điều kiện phát sinh bệnh 8

2.2.4 Chẩn đoán 8

2.2.5 Điều trị và khống chế bệnh 9

2.3 Các hình thức cấp vaccine trong nuôi trồng thủy sản 10

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1Thời gian và địa điểm nghiên cứu 13

3.2 Vật liệu 13

3.2.1Đối tượng thí nghiệm 13

3.2.2Thiết bị, dụng cụ 13

3.2.3Hóa chất 13

3.2.4Môi trường 15

3.3.Phương pháp nghiên cứu 15

3.3.1Phương pháp kiểm tra cá nhiễm A hydrophilatrước khi thí nghiệm 16

3.3.2Phương pháp tiêm cá 17

3.3.3Phương pháp phân lập A hydrophila từ các mẫu bệnh phẩm 18

3.3.4Phương pháp nhuộm Gram 18

3.3.5Phương pháp PCR khuẩn lạc 19

3.3.6Phương pháp chuẩn bị chủng A hydrophila 20

3.3.7Phương pháp thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila hoang dại, đột biến 22

3.3.8Đánh giá tỉ lệ sống của cá sau khi tiêm chủng A hydrophila đột biến 22

3.3.9Xử lý số liệu 23

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 24

4.1 Kiểm tra cá nhiễm vi khuẩn A hydrophila trước khi thử nghiệm 24

4.2 Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophilahoang dại 26

4.2.1 Chuẩn bị chủng A hydrophila hoang dại 26

4.2.2 Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila hoang dại bằng phương pháp tiêm 27

4.3 Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila đột biến 31

4.3.1 Chuẩn bị chủng A hydrophila đột biến 32

4.3.2 Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila đột biến bằng phương pháp tiêm 32

4.4 Đánh giá tỉ lệ sống của cá sau khi tiêm chủng A hydrophila đột biến 33

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BHIA :Môi trường Brain heart infusion agar

CFU : Colony Forming Unit

DNA : Deoxyribo NucleicAcid

ĐC (-) : Đối chứng âm

ĐC (+) : Đối chứng dương

LB : Môi trường Luria Bertani

LD50 : Medium Letalisdosis

NA : Môi trường Nutrient Agar

NMSL 0,65% : Nước muối sinh lý, nồng độ 0,65%

OD : Optical Density

PBG : Môi trường Peptone beef - extract glycogen

PCR : Polymerase Chain Reaction

RPS : Relative Percentage Survival

RS : Môi trường Rimler Shotts

TAE : Tris – Acetate – EDTA

TBE : Tris – Borate – EDTA

TSA : Môi trường Trypticase soy agar

UV : Ultraviolet radiation

VASEP : Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers  

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 12

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt cho cập mồi aroA_F4/aroA_R4 21

Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR 22

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát độc lưc bằng phương pháp tiêm cá 25

Bảng 4.1 Kết quả ương cá Tra giống từ cá bột 27

Bảng 4.2Số cá chết sau 7 ngày khi tiêm chủng A hydrophila hoang dại 32

Bảng 4.3 Kết quả xử lý trắc nghiệm phân hạng số liệu cá chết qua 6 ngày theo dõi 33

Bảng 4.4Tỷ lệ cá chết sau 72 giờ tiêm chủng A hydrophilađột biến 35

Bảng 4.5 Tỉ lệ cá chết sau khi tiêm A hydrophila hoang dại, đột biến 38

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1Vi khuẩn A hydrophilaquan sát dưới kính hiển vi 3

Hình 2.2 Cá Tra có biểu hiện bệnh nhiễm trùng huyết 5

Hình 3.1 Thang DNA dùng trong điện di 12

Hình 3.3 Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophilahoang dại và đột biến 14

Hình 3.4 Đánh giá tỷ lệ sống của cá thông qua hệ số RPS 15

Hình 3.5 Kỹ thuật tiêm cá thí nghiệm 19

Hình 3.6Phương pháp pha loãng dịch vi khuẩn 23

Hình 3.7 Đánh giá tỷ lệ sống của cá sau khi tiêm chủng A hydrophilaWT,M25 26

Hình 4.1Mẫu máu cá cấy trên môi trường RS 28

Hình 4.2Khuẩn lạc phân lập được từ mẫu nước trước và sau khi thay nước 29

Hình 4.3 Kết quả điện di trên gel agarose 1,2% sản phẩm PCR khuẩn lạc 30

Hình 4.4 Cá chết sau khi tiêmchủng A hydrophilahoang dại 33

Hình 4.6 Vi khuẩn A.hydrophila mọc trên môi trường RS 34

Hình 4.8Hình thái khuẩn lạc dưới vật kính x100 34

Hình 4.9 Cá chết sau khi tiêm chủng A hydrophilahoang dại 38

Hình 4.10 Các dạng khuẩn lạc mọc trên môi trường RS 38

Cá Tra là loài cá được nuôi trồng nhiều ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long với diện tích nuôi cá lớn, tính đến tháng 6 năm 2011 vào khoảng 3,980 ha, tăng 385

ha so với cùng kỳ năm 2010 và năng suất bình quân 309 tấn/hecta (Lê Đình Minh Phương, 2011) Việc nuôi cá Tra thường gặp rất nhiều khó khăn trong việc kiểm soát dịch bệnh do diễn biến thời tiết phức tạp, dịch bệnh thường xảy ra ở quy mô lớn khó kiểm soát, ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng dẫn đến sụt giảm kim ngạch xuất khẩu Bệnh nhiễm trùng huyết, bệnh gan mủ thận, bệnh trắng gan, trắng mang là những bệnh khá phổ biến ở cá Tra hiện nay Trong đó, tỷ lệ chết do bệnh nhiễm trùng huyết gây ra hơn 80%, tỷ lệ chết do bệnh gan thận mủ gây ra từ 60 – 80%, tỷ lệ chết

do bệnh trắng gan, trắng mang gây ra là 70 – 80% (Trần Anh Dũng, 2005)

Hiện nay, các biện pháp điều trị bệnh nhiễm trùng huyết trên cá Tra do vi

khuẩn Aeromonas hydrophila chủ yếu là dựa vào kháng sinh Tuy nhiên, việc dùng

kháng sinh để điều trị sẽ tác động đến nhiều yếu tố gây bất lợi như: phải dùng một lượng lớn kháng sinh, ô nhiễm môi trường nước, dư lượng kháng sinh có trong sản phẩm sau khi thu hoạch Vì vậy, sản xuất vaccine phòng bệnh xuất huyết do vi khuẩn

Aeromonas hydrophilađược xem là một giải pháp hiệu quả và kinh tế nhất

Đáp ứng nhu cầu trên, Trung tâm Công nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh đã

nghiên cứu, tạo thành công chủngAeromonas hydrophilađột biến.Tuy nhiên, cần phải

nghiên cứu con đường xâm nhập của vi khuẩn vào cá hiệu quả và ít ảnh hưởng đến cá

Tra Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu phương pháp lây nhiễm chủngAeromonas hydrophila nhược độc có tiềm năng làm vaccine ngừa bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra” được tiến hành phục vụ cho đề tài“Tạo chủng Aeromonas hydrophila nhược độc

có tiềm năng làm vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết trên cá Tra” của Trung tâm Tuy nhiên, trong quá trình thực hiện đề tài gặp rất nhiều khó khăn, đăc biệt là tốn rất nhiều thời gian để nuôi cá Tra bột thành cá Tra giống (3 tháng) và kiểm tra sự sạch bệnh của cá trước thí nghiệm, với thời gian thực tập 6 tháng không đủ để làm các công việc trên Vì vậy, chúng tôi quyết định đổi tên đề tài thành “Thử nghiệm độc lực

chủng Aeromonas hydrophila đột biến nhằm ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất

vaccinengừa bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra” so với dự kiến đề tài có tên “Nghiên

cứu phương pháp lây nhiễm chủngAeromonas hydrophila nhược độc có tiềm năng

làm vaccine ngừa bệnh nhiễm trùng huyết vào cá Tra”

1.2 Yêu cầu đề tài

Thử nghiệm độc lực chủng Aeromonas hydrophila đột biến trên cá Tragiống

1.3 Nội dung thực hiện

1 Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila hoang dại trên cá Tra giống Các bước thực hiện bao gồm: Ương nuôi cá bột-cá hương-cá giống, chuẩn bị chủng A hydrophila hoang dại, thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila hoang dại bằng

phương pháp tiêm vào cá, theo dõi tỷ lệ cá chết (%) cá Tra thử nghiệm sau 7 ngày

2 Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila đột biến trên cá Tra giống Các bước thực hiện bao gồm: Ương nuôi cá bột-cá hương-cá giống, chuẩn bị chủng A hydrophilađột biến, thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila đột biến bằng phương

pháp tiêm vào cá,theo dõi tỷ lệ cá chết (%) cá Tra thử nghiệm sau 7 ngày

3 Đánh giá hiệu quả bảo vệ của chủng A hydrophila nhược độc đột biến

trên cá Tra giống thông qua hệ số RPS

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 

2.1 Tổng quan về Aeromonas hydrophila

A hydrophilalà một vi khuẩn hiếu khí khá phổ biến ở các ao hồ nước ngọt, đặc

biệt là khi có sự hiện diện của nồng độ muối cao của các chất hữu cơ Ngoài ra, nó

còn là một vi khuẩn phổ biến của đường tiêu hóa của cá Sự hiện diện của A hydrophila trong đường ruột của cá Rô phi nuôi và trong tự nhiên lần lượt là 10% và 2,5% Còn đối với cá Karmout (Claries lazera) tỷ lệ này lần lượt là 18,75% và 6,25% (Huizinga và ctv, 1979)

Oxidase và catalase dương tính, có khả năng lên men hiếu khí và kị khí Tất cả đều cho phản ứng arginin dihydrolase và lysine decarboxylase dương tính nhưng ornithine decarboxylase âm tính Không sinh ureaza nhưng sinh gelatinaza và indol,

sử dụng đường glucose và manitol (có hoặc không sinh hơi) nhưng không sử dụng đường inositol, sorbitol, rhamnose và arabinose, kháng với hợp chất vibriostastic

Hình 2.1 Vi khuẩn Aeromonas

hydrophilaquan sát dưới kính hiển

vi https://vi.wikipedia.org. 

agent 0/129 (2,4-diamino,6,7-di-isopropyl pteridine), có khả năng chuyển nitrate thành nitrite (Bùi Quang Tề, 2006)

Hiện tại trên Wedsite của National Center for Biotechnology Information

(NCBI), cung cấp2 chủngA hydrophilađã được giải trình tự toàn bộ bộ gen đó là chủng A hydrophila subsp Hydrophila ATCC 7966 và chủng Aeromonas hydrophila ML09 – 119 Trung tâm Công nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh đang sử dụng chủng A hydrophila subsp Hydrophila ATCC 7966 vàgây đột biến gen aroA để tạo chủng A hydrophilanhược độc trong nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết do A hydrophilagây ra

2.1.3 Môi trường phân lập

A hydrophila có thể được phân lập trên môi trường không chọn lọc như môi

trường dinh dưỡng NA hoặc TSA hay phân lập trên môi trường có chọn lọc như RS hoặc PBG và ủ trong 20 – 30oC trong 18 – 36 giờ Khuẩn lạc A hydrophila có thể

mọc trong môi trường TSA ở 28oC trong 18 – 24 giờ, khuẩn lạc thường có hình tròn, màu sắc từ vàng kem đến vàng sáng, lồi, kích thước khuẩn lạc từ 2 – 3 mm Khuẩn lạc

phát triển trên môi trường RS có màu vàng Khuẩn lạc A hydrophila có thể phát triển

trên môi trường BHIA cho khuẩn lạc tròn, nhẵn, lồi, có màu vàng Hầu hết tất cả các môi trường chọn lọc đều sử dụng ampicilin, carbohydrat, peniciline, kanamycin như

là tác nhân chọn lọc (Palumbo và ctv, 1985)

Hiện tại, tại Trung tâm công nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh đang sử dung môi

trường RS để phân lậpvàLuria Bertani (LB) để tăng sinh chủng A hydrophila Đối với chủng A hydrophila hoang dại có bổ sung thêm kháng sinh Ampicilin với liều lượng 50µg/ml, đối với chủng A hydrophila đột biến sử dụng thêm kháng sinh Ampicilin và

Kanamycin với liều lượng mỗi kháng sinh là 50µg/ml

2.1.4 Tình hình nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra

do vi khuẩn A hydrophila gây ra

2.1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới về vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra

Nhiều công trình nghiên cứu đã được thực hiện để phát triển một vaccine hiệu

quả chống lại A hydrophila (Huizinga và ctv, 1979;Rahmanvà ctv, 2000; Leung và ctv, 1997;Lamers và ctv, 1985; Baba và ctv 1988).Tác dụng của vaccine bất hoạt toàn

tế bào đã được báo cáo, ví dụ: Như sự gia tăng hàm lượng kháng thể trong huyết

thanh chống lại A hydrophilađối với cá chép ngâm trong dung dịch vaccine A hydrophila được bất hoạt.

Sự gia tăng nồng độ protein huyết thanh khi cá chép được chủng ngừa bằng A hydrophilabất hoạt bằng formol (Kusuda và ctv, 1987) Cá Hồi vân được chủng ngừa bằng cách tiêm, ngâm, cho ăn bằng chủng A hydrophila bất hoạt, đã tạo được kháng thể trong huyết thanh, da, mật, dịch nhầy, ruột và cơ (Loghothetis và ctv, 1994) Vaccine đa giá kết hợp giữa mầm bệnh A hydrophila bị giết bằng nhiệt và các sản phẩm ngoại bào của A hydrophila bất hoạt bằng formol được thử nghiệm trên cá trôi

Ấn Độ và cá Trôi mrigal, nhưng nó không cho được kết quả bảo vệ cá chống lại vi

khuẩn công cường độc thực nghiệm (Chandran và ctv, 2002) Các tác giả này nhận

định tuy hàm lượng kháng thể trong máu của nhóm được chủng ngừa cao nhưng tỷ lệ bảo hộ thấp có thể là do tác động của các yếu tố stress hoặc các kháng thể tao ra không có tác dụng bảo vệ cá chống lại mầm bệnh

Lớp mỏng chitin dùng để bọc bên ngoài kháng nguyên có nguồn gốc từ vi

khuẩnA hydrophila đã được sử dụng như một loại vaccine cho ăn để tránh sự tác động của môi trường acid trong dạ dày (Azad và ctv, 1999) Cá Trê (Clarias batrachus),cho ăn với vaccine màng sinh học như vậy cho thấy hàm lượng kháng thể

trong huyết thanh và hiệu quả bảo hộ miễn dịch cao hơn so với chỉ dùng vaccine bất

hoạt thông thường khi công cường độc với A hydrophila(Nayak và ctv, 2004)

Các protein màng ngoài của A hydrophila đã làm tăng sự bảo vệ chống lại A hydrophila và cho rằng vaccine dựa trên việc lựa chọn kháng nguyên protein lớp màng có thể có tác dụng (Rahman và ctv, 2000) Hướng phát triển vaccine nhược độc phòng bệnh do A hydrophila gây ra cũng được nghiên cứu Chủng A hydrophila gây đột biến gen aroA đã cho hiệu quả bảo hộ trên cá Hồi vân (Moral và ctv, 1998)

Mặc dù tất cả các vaccine được báo cáo đã cho thấy mức độ khác nhau của sự gia tăng miễn dịch và hiệu quả bảo vệ Tuy nhiên, vaccine thương mại không có sẵn

cho A hydrophila(Loghothetis và ctv, 1996; Rahman và ctv, 2000; Fang và ctv,

2004) Do sự không đồng nhất kiểu huyết thanh và kiểu hình của vi khuẩn Trong thực

tế, người ta phát hiện được gần 100 kiểu huyết thanh trong nhóm Aeromonas di động (Janda và ctv, 1996; Nielsen và ctv, 2001) Các biện pháp phòng ngừa như vệ sinh tốt,

tránh tình trạng nuôi với mật độ quá dày và giảm tối đa các thao tác bằng tay dễ gây stress và các biện pháp phòng ngừa tốt nhất

2.1.4.2 Nghiên cứu trong nước về vaccine phòng bệnh nhiễm trùng huyết cho cá Tra

Đối với nước ta, vaccine cho cá vẫn chưa đượcsử dụng, đây là một vấn đề khá mới Cho tới thời điểm hiện nay vẫn chưa có một loài vaccine nào được cấp phép lưu hành và sử dung cho cá nuôi Việt Nam

Tuy nhiên trong những năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu và phát triển vaccine cho thủy sản ở Việt Nam: Năm 2000, tập đoàn Intervet Nobio – Hà Lan phối hợp với Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đánh giá khảo nghiệm 4

sản phẩm vaccine phòng bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm sú nhưng kết quả cho thấy

vacinne này không hiệu quả

Năm 2006, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã kết hợp với Công ty Thuốc Thú y Trung Ương II (NAVETCO) nghiên cứu phòng bệnh vaccine gan thận

mủ cho cá Tra Kết quả hiệu quả bảo hộ tốt của vaccine phòng bệnh gan thận mủ trên

cá Tra có thể kéo dài trong 2 tháng Sự hợp tác nghiên cứu giữa công ty Pharmaq – Na

Uy và Bayer Việt Nam trong nghiên cứu vaccine phòng bệnh gan thận mủ do E Ictaluri trên cá Tra Kết quả Vaccine ALPHAJECT® Panga1 tiêm vào xoang bụng cá Tra đã kích thích hình thành miễn dịch đặc hiệu chống lại vi khuẩn E.ictaluri và bảo

hộ được cá khi bệnh xảy ra trong thời gian thí nghiệm Gần đây nhất công trình

nghiên cứu tạo chủng E ictaluriđột biến bằng phương pháp tái tổ hợp gen nhằm sử

dụng làm vaccinephòng bệnh gan thận mủ cho cá Tra của Trung tâm Công nghệ sinh

học Tp Hồ Chí Minh đã thực hiện Kết quả chủng E.ictaluri đột biến gen wzz có tiềm

năng sử dụng trong nghiên cứu sản suất vaccine phòng bệnh mủ gan đã được đăng ký patent vào năm 2011 Đây là một thành công lớn của các nhà khoa học tại Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo liên quan đến gây đột biến bằng phương pháp tái tổ hợp gen

2.2 Sơ lược về bệnh xuất huyết trên cá do vi khuẩn A hydrophila

2.2.1 Đối tượng lây nhiễm

Các căn bệnh do vi khuẩn này chủ yếu ảnh hưởng đến loài cá nước ngọt như cá Chép, cá Rô phi, cá da trơn và nhiều loại cá nhiệt đới hoặc cá cảnh Bên cạnh đó nó

cũng có thể ảnh hưởng đến loài cá nước lạnh Phân lập được A hydrophila từ vết

thương của 4 loài cá nước lợ bao gồm: Cá Ngát (Platosus anguillaris), cá Chẽm (lates calcarifer), cá Mú (Epinephelus megachir), cá Rohu (Labeo ruhita).A hydrophila

không chỉ phân lập được từ cá biển tươi hoặc đã chế biến mà còn phân lập được từ các vùng đánh bắt cá (Bùi Quang Tề, 2006)

2.2.2 Triệu chứng lâm sàng khi xâm nhiễm

Karunasagar (1989) phân chia dấu hiệu lâm sàng của bệnh gây ra bởi A hydrophila thành 4 nhóm: cấp, nhiễm khuẫn nhanh chóng, với những triệu chứng

sưng rõ rệt; dạng nhiễm bệnh cấp với triệu chứng phù, phồng giộp, áp xe và tróc vẩy; dạng loét mạn tính với sự nổi nhọt và áp xe và dạng tiềm ẩn không triệu chứng

Các dấu hiệu lâm sàng của sự xâm nhiễm A hydrophila được phân chia thành

3 nhóm khi gây nhiễm nhân tạo trên cá nheo: MAS (sự xâm nhiễm toàn thân, có dấu hiệu của bệnh), da (nhiễm bệnh được giới hạn trên da và các lớp cơ bên dưới da), tiềm

ẩn (nhiễm bệnh toàn thân mà không biểu hiện bệnh ra ngoài) (Grizzle và ctv, 1993)

Nhìn chung các dấu hiệu gây bệnh lâm sàng cơ bản khi nhiễm A hydrophila là

sự hiện diện của những tổn thương nhỏ trên bề mặt (dẫn đến sự bỏng tróc vẩy), xuất huyết cục bộ ở mang, các vết loét, áp xe, lồi mắt, bụng phình to và thường xuất hiện phù nể ở bụng Jeney (1995) quan sát thấy các dấu hiệu bên ngoài hoài tử và phủ nề

cá Rô phi ở sông Nil bị nhiễm A hydrophila

Cũng như các dấu hiệu đã được mô tả, nhiều dấu bệnh khác cũng được nhận thấy ở nội tạng của các loài cá khác, ví dụ: Gan và thận cũng bị phá hủy hoàn toàn ở

cá hồi bị nhiễm A hydrophila (Jeney và ctv, 1995) Hoại tử lan rộng trong một vài cơ

Hình 2.2 Cá Tra có biểu hiện nhiễm trùng huyết

quan nội tạng và sự hiện diện của các đại thực bào chứa melanin trong máu cũng được

quan sát thấy khi A hydrophilanhiễm vào cá Nheo Mỹ(Ictalurus punctatus)(Vivekanandhan và ctv, 2002)

2.2.3 Điều kiện phát sinh bệnh

Các nhân tố môi trường như nhiệt độ nuôi cấy thời gian ủ (Ko và ctv, 2003)và môi trường sống (Vivas và ctv, 2005) có thể làm biến đổi sự biểu hiện của các yếu tố

gây bệnh của A hydrophila, ví dụ: sự hiện diện của heamagglutin bề mặt xuất hiện tùy thuộc môi trường các dòng A hydrophila sống trong môi trường lỏng cho thấy sự

tăng cường hoạt động heamagglutination so với các dòng sống trên môi trường rắn

(Dixon và ctv, 1993).Sự tăng hoặc giảm nhiệt độ của nước cũng tăng khả năng gây bệnh của vi khuẩn trên cá nuôi (Ventura và ctv, 1987) Các tác giả này nhận thấy rằng

sự thay đổi nhiệt độ của nước cùng với sự gia tăng của mật độ chất tan là một nhân tố

chính trong sự diễn tiến của sự bùng phát bệnh do A hydrophila trên cá Tra Các tác

nhân khác bao gồm cho ăn quá mức và sục giảm nồng độ muối (Eissa và ctv,

1994).Chất mang A hydrophila cũng đóng vai trò trong sự lây nhiễm, sự nhiễm trên

cá được quan sát khi cho ăn với luân trùng mang vi khuẩn Thêm vào đó, các vi khuẩn

A hydrophila bị thiếu chất dinh dưỡng (nuôi cấy trên môi trường nước khử trùng

chứa 0,60 % NaCl, 0,50 % KCl, 0,10% CaCl2.2H2O và 0,20% MgCl2.6H2O) cũng cho thấy tính độc cao trên họ cá Chép so với khi nuôi trên môi trường LB (Ventura và ctv, 1987)

Một vài nghiên cứu cũng cho thấy khả năng gây bệnh của A hydrophila phụ

thuộc nó là tác nhân sơ cấp, thứ cấp hay cơ hội do tổn thương hay stress của vật chủ

(Khalil và ctv, 1997) Sự xâm nhiễm sơ cấp bởi một tác nhân gây bệnh khác và A hydrophilatham gia gây bệnh như một tác nhân thứ cấp, ví dụ: các chấn thương gây ra bởi bệnh đốm trắng Ichthyophthirius multifiliis sẽ là cổng xâm nhập của A hydrophilatrong nước, và theo cách đó giúp cho sự xâm nhập thuận lợi hơn (Mitchell

và ctv, 1980) Tương tự ở cá Nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), Edwardsiella Ictaluri là tác nhân sơ cấp, còn A hydrophila là tác nhân thứ cấp (Nusbaum và ctv, 2002)

2.2.4 Chẩn đoán

Nếu như các biện pháp quan sát hình thái khuẩn lạc không chính xác, phân tích sinh hóa và miễn dịch mất nhiều thời gian thì phương pháp phân tử với ưu điểm

nhanh, chính xác được khuyến cáo dùng để nhận biết A hydrophila

Sugita (1994) đưa ra phương pháp lai DNA để nhận biết A hydrophila, trong

khi khuyếch đại một gen cụ thểbằng PCR được khuyên dùng để phát hiện vi khuẩn Thêm vào đó, phương pháp xác định nhanh được phát triển bằng cách giải trình tự

DNA 16S ribosomal của A hydrophila(khuyếch đại đoạn gen 16S rDNA và gen earolysin để phát hiện các dòng gây bệnh của A hydrophila) Một phương pháp nữa

kết hợp miễn dịch và kỹ thuật sinh học phân tử cũng được phát triển cung cấp một

cách thức nhanh chóng, nhạy để phát hiện A hydrophila(Zervosen và ctv, 2001)

Trong nghiên cứu này, đoạn gen DNA 16S ribosomal được khuyếch đại bằng

phương pháp PCR dùng để định danh A hydrophila(Rahman và ctv, 2001)

2.2.5 Điều trị và khống chế bệnh

Kháng sinh là tác nhân chính để điều trị A hydrophila(Huizinga và ctv, 1979)

Các chất được nhận thấy có tác dụng gồm furan (Nusbaum và ctv,2002), sunfonamide (Del Corral và ctv, 1990), chloraphenical, neomycin, sulfamethoxazole – trimethoprim, treptomycin, naladixic acid, oxolinic acid, neomycin, xarafloxacin (Landre và ctv, 2000), rifampicin(Ansary và ctv, 1992), cephamycins và moxalactam (Zervosen và ctv, 2001), ciprofloxacin (Krovacek và ctv, 1989), amoxycilin và

enrofloxacin penicillin G, erythromycin and gentamicin (Dixon và ctv, 1993) A hydrophila cũng nhạy cảm với các Hydroxamate của amino acid (Walter và ctv, 1999)

và hydrogen peroxide (H2O) (Liu và ctv, 2004)

Mặc dù điều trị bằng kháng sinh là phương pháp chính, nhưng thực tế cho thấy các vi khuẩn gây bệnh trở nên kháng với các chất hóa học khi dùng một thời gian kéo dài (Nusbaum và ctv, 2002;Vivekanandhan và ctv, 2002) Một số dòng A hydrophila

được nhận thấy kháng với các chất kháng sinh sau: ampicillin, carbenicillin, erythromycin, gentamicin, penicillin, tetracycline, nitrofuradantoin, ormetoprim-sulfadimethoxine, sulfamethoxazole-trimethoprim vàtriple sulfa (Nusbaum và ctv,

2002;Vivekanandhan và ctv, 2002;Ansary và ctv, 1992;Dixon và ctv, 1993; Yamashita

và ctv, 1990)

Do những tác hại của việc sự dụng kháng sinh như: phải dùng một lượng lớn kháng sinh, dư lượng kháng sinh có trong sản phẩm sau khi thu hoạch ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm thủy sản, ô nhiễm môi trường nước, tác hại xấu đến hệ sinh thái, việc sử dụng kháng sinh ồ ạt không kiểm soát dễ xảy ra hiện tượng kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất vaccine để phòng

bệnh xuất huyết gây ra bởi A hydrophilalà hết sức cần thiết

2.3 Các hình thức cấp vaccine trong nuôi trồng thủy sản

Năm 1976 vacxin ngâm cho cá Hồi để phòng bệnh do Vibriosis và Yersiniosis

mới được sản xuất thành công Sau đó 5 năm ra đời vaccine đơn và đa giá dạng tiêm (dung môi nước) phòng bệnh lở loét Năm 1990 xuất hiện vaccine ngâm và tiêm cho

cá Vược và cá Tráp biển Địa Trung Hải Đến tận năm 1998, vaccine dạng trộn vào thức ăn cho cá mới được giới thiệu ở Nhật Bản Năm 2005, lần đầu tiên vaccine DNA cho cá Hồi được áp dụng tại Canađa

Trong thủy sản để cấp vaccine cho cá người ta thường áp dụng các hình thức sau:

o Tiêm: Vaccine được tiêm trực tiếp vào cơ thể cá, có thể tiêm ở dưới gốc vẩy

lưng hoặc có thể tiêm vào xoang bụng của cá Ở các nước phát triển người ta đã chế tạo ra những máy tiêm tự động để bơm thuốc theo một hệ thống dẫn truyền, với công suất khoảng 1000 cá/giờ, dùng để tiêm vaccine cho cá giống trước khi thả nuôi Ưu điểm: Đây là phương pháp hiệu quả nhất, có thể kích thích sản xuất kháng thể toàn thân cũng như cho hiệu quả bảo hộ tối ưu, đồng thời nó cho phép kết hợp được nhiều kháng nguyên trong một loài vaccine đơn lẻ Hiện nay, đã có vaccine bảo vệ chống lại

6 loại mầm bệnh cùng lúc (5 bệnh do vi khuẩn và 1 bệnh do virus) được tiêm vào cá Nhược điểm: Phương pháp tiêm khó thực hiện khi cá còn nhỏ và phải cần nhiều nhân công lao động vì số lượng cá thả nuôi nhiều, đòi hỏi kĩ thuật tiêm tốt, việc gây mê và bắt giữ đối tượng thủy sản khi tiêm vaccine dễ dàng gây sốc và tổn thương cho đối tượng thủy sản, có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ chết, vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể không giống với ngoài tự nhiên

 Ngâm: Dùng vaccine hòa tan trong nước có thể tích nhỏ, ngâm trực tiếp cá

trong khoảng một thời gian ngắn từ 30 – 60 giây Đối với phương pháp này vaccine sẽ đươc hấp thụ qua da, mang, đường bên, và một ít qua miệng Cơ chế hấp thụ kháng nguyên chưa biết được chắt chắn, nhưng người ta thấy răng mang là con đường chính

để hấp thụ kháng nguyên Bên cạnh đó thì da và các cơ quan đường bên cũng tham gia vào qua trình hấp thu đường bên.Ưu điểm: Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá giống tự nhiên, ít gây stress cho cá, cảm nhiễm được số lượng lớn cá trong một lúc, dễ dàng áp dụng với cá nhỏ, thời gian thực hiện ngắn.Nhược điểm: Phải phá vỡ các rào cản vật lý bên ngoài của cá để vi khuẩn xâm nhập vào cá

 Tắm: Nhằm hạn chế làm gây sốc cho cá theo phương pháp ngâm, người ta sử

dụng phương pháp tắm vaccine cho cá bằng cách cho vaccine vào bể cá Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn vaccine và thơi gian tắm là khoảng 1 giờ.Ưu điểm: Ít gây sốc cho cá nhất, dễ dàng áp dụng với cá nhỏ, thời gian thực hiện ngắn.Nhược điểm: Tốn một lượng kháng sinh khá lớn, dễ gây hại cho môi trường sinh thái

 Phun: Đây là phương pháp được phát triển đồng thời với phương pháp ngâm

Vaccine được phun hoặc được dẫn vào hệ thống bán tự động thông qua băng chuyên chảy dưới vòi phun vaccine Phun vaccine có thể gây sốc cá và kết quả có thể rất thay đổi.Ưu điểm: Dễ áp dụng đối với cá nhỏ, thời gian ngắn, có thể áp dụng cho số lượng

cá nhiều.Nhược điểm: Gây stress cho cá, mặc khác hiệu quả đáp ứng miễn dịch và bảo hộ miễn dịch thường không cao

 Cho ăn: Đây là phương pháp dễ làm nhất, vaccine được trộn vào thức ăn và

cho cá ăn Phương pháp này đơn giản dễ thực hiện ít tốn kém do không cần phải sử dụng nhân công lao động, ít gây stress cho cá Tuy nhiên, hiêu quả đáp ứng miễn dịch thường kém và thường không đồng điều vì có cá thể ăn ít có cá thể ăn nhiều Do thức

ăn qua đường miệng vào đường tiêu hóa nên kháng nguyên dễ bị pH của dạ dày hoặc các men tiêu hóa làm hư hại Hiện nay, đối với các kháng nguyên nhạy cảm các phương pháp đóng gói sinh học đang được thử nghiệm, trong trường hợp này các loại thức ăn sống như ấu trùng Artemia, giáp xác chân chéo hoặc luân trùng sẽ được nuôi trong một môi trường chứa huyền dịch vaccine, sau đó chúng được sử dụng làm thức

ăn cho tôm cá, vì đây là các loài sinh vật không ăn chon lọc nên chúng sẽ tích lũy các kháng nguyên trong đường tiêu hóa của chúng và chúng trở thành các viên nang siêu nhỏ để đưa vaccine vào cơ thể tôm cá.Ưu điểm: Áp dụng đối với mỗi lứa tuổi của cá,

ít tốn kém, dễ làm.Nhược điểm: Phụ thuộc sức ăn cũng như hệ tiêu hóa của cá khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn vào mỗi con cá là khác nhau

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện trong 6 tháng từ tháng ngày 15 tháng 12 năm 2012 đến ngày 15 tháng 06 năm 2013 Tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử 1, 2và trại thực nghiệm, Phòng Công nghệ sinh học Thủy sản thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá Tra giống và cá Tra bột (Pangasius hypophthalmus) do Phòng Công nghệ

sinh học Thủy sản, Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

Chủng Aeromonas hydrophilahoang dại và chủng Aeromonas hydrophilađột

biến do Phòng Công nghệ sinh học Thủy sản, Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu

Tủ lắc 28oC, tủ ủ 28 oC, tủ cấy vi sinh, tủ âm 80oC, máy ly tâm lạnh Centrifuge 5810R (Eppendorf),máy PCR (MasterCycler gradient) (Eppendorf), bộ điện di DNA Power Pac200 (Biorad), cân điện tử, ống nghiệm, kim tiêm, đĩa petri, que cấy vòng, que cấy thẳng, đèn cồn, lame, eppendorf 1,5 ml, 0,2 ml, cuvette 2 ml, bể composite 2 đến 3 m3 và thùng composite100 lít, kính hiển vi quang học, bộ dùng cụ giải phẩu cá, vortex, hệ thống sục khí Oxy và một số các dụng cụ liên quan khác

3.2.3 Hóa chấtdùng trong nghiên cứu

Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Thành phần cần thiết cho phản ứng PCR của nhà sản xuất Fementasđược cung cấp bởi Trung tâm Công nghệ sinh học gồm:

Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, Taq buffer 10X Thành phần phản ứng PCR

được liệt kê trong bảng 3.1

 Hóa chất dùng cho điện di DNA: Agarose (BioLab_Việt Nam), Tris base (Promega_China), Acid acetic (Merck_Việt Nam), Bromophenol blue (Merck_Việt Nam), Ethidium Bromide (Merck_Việt Nam)

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR

Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng

Buffer 10X 1X 2,5 µl Dntp 25mM 0,2mM 0,2 µl MgCl2 25mM 1mM 1,0 µl

Taq Polymerase 5 U/µl 0,04U/µl 0,2 µl

 Thang DNA: được sử dụng trong thí nghiệm của nhà sản xuất Fermentas, cung

cấp bởi Trung tâm Công nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh

- Primers

Primer đặc hiệu cho chủng A hydrophila hoang dại là aroA_F4/R4, cho sản phẩm

khuếch đại 683 bp Trình tự primer aroA_F4/R4:

aroA_F4: 5’- GGAGCCGGTCAATCTGTTCC- 3’

aroA_R4: 5’- CGGGGATGTGGTTCATGTCC- 3’

Hình 3.1 Thang DNA dùng trong điện di.(a) Thang DNA 100 bp; (b)

Thang DNA 1 kb; (c) Thang DNA 1 kb plus. 

3.2.4 Môi trường dùng trong nghiên cứu

Môi trường Luria Bertani (LB) gồm các thành phần sau:Trypton 10g, Yeast extract 5 g, NaCl 10 g,nước cất vừa đủ1.000 ml

Môi trường tăng sinh cho chủng A hydrophilahoang dại: môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicilin 50 µl/ml.Môi trường tăng sinh cho chủng A hydrophila

đột biến là môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicilin 50 µl/mlvà Kanamycin

50 µl/ml

Môi trường Rimler Shott (RS) là môi trường đặc hiệu, phân lập vi khuẩn A hydrophila Thành phần bao gồm:Agar 13,5g,Na2S2O3.5H2O 6,8g,L-Ornithine HCl 6,5g,NaCl 5,0g,L-Lysine·HCl 5,0g,maltose3,5g,yeast extract 3,0g,sodium deoxycholate 1,0g,ferric ammonium citrate 0,8g;L-Cysteine·HCl 0,3g,bromthymol

Blue 0,03g,novobiocin solution 10,0 ml, điều chỉnh pH 7,0 ± 0,2 ở 25°C

Novobiocin Solution:Composition per 10,0 ml,Novobiocin 5,0mg

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Ương nuôi cá bột-cá hương-cá giống (2,5 – 3tháng tuổi)

Xác định tỉ lệ chết của cá, kiểm tra

sự hiện diện của A

hydrophilahoang dại bằng PCR

Xác định LD50

Xác định tỉ lệ chết của cá, kiểm tra

sự hiện diện của A hydrophila đột

biến bằng phản ứng PCR

Theo dõi tỉ lệ cá chết trong 1 tuần

Hình 3.2.Thử nghiệm độc lực chủng A hydrophilahoang dại, đột biến

Hình 3.3Đánh giá tỉ lệ sống của cá thông qua hệ số RPS

3.4 Phương pháp kiểm tra cá nhiễm vi khuẩnA.hydrophila trước khi thí nghiệm

Cá Tra dùng trong thí nghiệm được mua về từ trại giống cá huyện Củ Chi và được ương nuôi từ cá Tra bột: Cá được thuần dưỡng và ương nuôi trong các bể composite có dung tích từ 1200 – 1500 cm3 Trước khi thả cá vào nuôi thuần, bể composite được xử lý diệt khuẩn bằng cách lau formol với nồng độ 200 ppm để khô trong 5 phút Nguồn nước dùng để nuôi cá được lấy từ giếng của Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Nước trong bể được sục khí liên tục Thức ăn

sử dụng cho cá ăn là thức ăn công nghiệp ở dạng viên đường kính 1,5 mm, mỗi ngày cho ăn 2 lần

tra sự hiện diện của A

hydrophila, hoang dại, nhược độc

Theo dõi tỉ lệ cá chết trong 2 tuần

Điều kiện chọn mua cá dùng thử nghiệm: Cá phải sạch bệnh, chưa từng sử dụng bất kỳ kháng sinh nào, không lở loét, kích thước đồng đều từ 10 cm đến 12 cm Trước khi đưa vào thí nghiệm cần có thời gian nuôi thuần dưỡng để cá phục hồi sức khỏe trong quá trình vận chuyển từ nơi cung cấp giống đến trại thí nghiệm và dần dần thích nghi với điều kiện sống của trại Hàng ngày nước trong bể nuôi được thay 70 – 90% thể tích bể bằng phương pháp cho nước chảy ra 60% thể tích bể, thay nước tuần hoàn trong 30 phút và cung cấp nước mới vào bể nuôi đến khi bằng thể tích nước trước khi thay Mật độ nuôi thuần dưỡng là 450 con/m3 Khi cá hồi phục sức khoẻ và thích nghi với điều kiện nuôi thuần thì tắm cá bằng nước muối trong vòng 5 – 10 phút để phòng bệnh trước khi chuyển sang các lô thí nghiệm Thông thường thời gian thuần dưỡng cá thí nghiệm khoảng 15 – 25 ngày tùy theo tình trạng cá khi mua về

Phương pháp kiểm tra cá sạch bệnh: Tiến hành hút 10 mẫu máu cá và 5 mẫu nước trong bể nuôi thuần dưỡng khác nhau, mỗi mẫu hút 100 µl pha với 400 µl NaCl 0,65 %trong các eppendorf Để tránh mẫu máu cá bị đông cục ảnh hưởng đến kết quả kiểm tra thì thao tác lấy máu cá phải nhanh, sau khi hút bỏ máu vào eppendorf, phải hòa trộn mẫu đều với NaCl 0,65% và giữ lạnh trong đá Hút 100 µl từ các eppendorf trải lên môi trường phân lập RS, ủ ở 28oC trong 16 giờ Các khuẩn lạc mọc trên môi trường RS được kiểm tra bằng cách quan sát hình thái và PCR khuẩn lạc với căp mồi

aroA_F4/aroA_R4

3.3.2 Phương pháp tiêm cá

Dịch vi khuẩn được tiêm vào dưới lớp da, vị trí tiêm ở khoảng giữa từ vây ngực đến vây bụng của xoang bụng cá Trước khi tiêm, cá được bất hoạt bằng cách ngâm với nước lạnh từ 15 – 20oC cho đến khi cá lờ đờ, không còn vùng vẫy nữa thì tiến hành bắt cá tiêm Khi tiêm, kim tiêm được đặt nằm nghiêng hướng từ đuôi đến đầu cá, để hạn chế gây tổn thương đến nội tạng của cá, khi kim tiêm được đâm vừa qua lớp da thì bắt đầu tiêm từ từ dịch vi khuẩn với liều lượng 50 – 100 µl/cá Sau khi tiêm, cá được

bỏ vào thùng trung gian chứa nước lấy từ các thùng nuôi, sau đó bỏ nhẹ nhàng vào các

lô thí nghiệm

3.3.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn A hydrophila từ các mẫu bệnh phẩm

Sau khi quan sát và chọn ra những cá có biểu hiện bệnh tích ra bên ngoài như đốm đỏ ở vẩy ngực, thân, đuôi, mang, miệng, mắt lồi tiến hành sát trùng kỹ toàn bộ thân cá đặc biệt là vùng lấy mẫu bằng cồn 70o, mổ cá bằng kéo bắt đầu từ gốc vây ngực của xoang bụng đến lớp cơ trên vây lưng cá, lột lớp da bỏ tiến hành lấy lớp cơ, mỗi mẫu lấy khoảng 0,147 cm3 (0,7 x 0,7 x 0,3cm) trên lưng cá đem nghiền nhuyễn điều trong eppendorf 1,5 ml với 500µl NaCl 0,65%, hút 100µl dung dịch đem trải trên môi trường phân lập RS ủ 28oC trong 16 giờ

3.3.4 Phương pháp nhuộm Gram

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng lưu giữ phẩm màu của Crystal Violet trên thành

tế bào vi khuẩn sau khi rửa bằng cồn Sự khác biệt trong thành phần lớp vỏ tế bào của

vi khuẩn Gram dương và Gram âm: Vi khuẩn Gram dương có lớp vỏ tế bào dày phần lớn được tạo bởi peptidoglycan, nhờ đó phẩm màu Crystal Violet được lưu giữ nhiều hơn sau khi nhuộm, thêm 1 ít Iodine để cho phẩm màu Crystal Violet gắn chặt với peptidoglycan và không bị khử khi rửa cồn, do đó vẫn giữ được màu thuốc nhuộm ban đầu Vi khuẩn Gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn do có ít pepdoglycan hơn, nhưng lại có nồng độ lipid cao hơn, khi rửa bằng cồn lớp chất béo này sẽ bị hòa tan kéo theo màu của thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt màu hồng đỏ của thuốc

Hình 3.3Kỹ thuật tiêm cá thử nghiệm

nhuộm Fuschin Như vậy, sau khi nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram âm có màu hồng đỏ,

vi khuân Gram dương có màu tím

Phương pháp thực hiện: Cố định tiêu bản bằng cách dùng que cấy vô trùng bắt

một ít khuẩn lạc vi khuẩn A hydrophila phân lập từ cá chết trên môi trường phân lập

RS (được lấy trong tủ 4oC sau khi ủ 16 giờ, 28oC) hòa với 1 giọt nước cất ở giữa phiên

kính, để khô, sau đó hơ nhanh 2 – 3 lần trên ngọn lửa đèn cồn Nhuộm mẫu bằng dung

dịch phẩm màu tím tinh thể Crystal Violet trong 2 phút, rửa lại bằng nước Nhuộm lại

bằng dung dịch iodine trong 1 phút, rửa lại bằng nước, thấm khô Rửa bằng cồn 70oC

trong 30 giây để tẩy màu rửa lại bằng nước Nhuộm tiếp mẫu bằng dung dịch Fuschin

trong 30 – 60 giây rửa lại bằng nước Để khô quan sát sự bắt màu của vi khuẩn dưới

kính hiển vidùng vật kính dầu với độ phóng đại X100 (Vũ Thị Minh Đức, 2001)

3.3.5 Phương pháp PCR trực tiếp

Chương trình phản ứng PCR trực tiếp:

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt cho cặp mồi aroA_F4/aroA _R4

Bước Hoạt động Nhiệt độ (0C) Thời gian

1 Tiền biến tính 95 5 phút

2 Biến tính 95 30 giây

3 Bắt cặp 55 30 giây

4 Kéo dài 72 30 giây

6 Lặp lại từ bước 2  4 trong 30 chu kỳ

7 Kéo dài cuối 72 7 phút

8 Giữ sản phẩm 4 Vô cùng

Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di:

Hút 7µl sản phẩm PCR và thang DNA đem trộn với loading dye Điện di trên

đồng thời trên gel agarose 1,2% trong TAE 0,5X Thời gian điện di từ 30 đến 35 phút

ở 100V, 250mA

Sau khi điện di gel được ngâm trong dung dịch ethidium bromide 1 mg/ml TAE

với thời gian 30 phút Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UV bằng

máy chụp gel với phần mềm Quality One 2000, Biorad Các băng của các mẫu xuất

hiện được xác định bằng cách so sánh với các băng đối chứng dương và ladder

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR

Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng

Buffer 10X 1X 2,5 µl Dntp 25mM 0,2 mM 0,2 µl

Tổng thể tích 25,0 µl

3.3.6Phương pháp chuẩn bị chủngA hydrophila

- Tăng sinh cấp 1: Cấy 1 khuẩn lạc A hydrophilavào 5 ml LB lỏng, nuôi cấy qua

đêm ở điều kiện lắc 250 vòng/phút ở 28oC, trong 16 giờ Tăng sinh cấp 2: Cấy truyền

tiếp 2% đến 3% dịch nuôi cấy vào 100 ml LB lỏng Nuôi cấy lắc qua đêm 250

vòng/phút ở 28oC trong 4 đến 5 giờ, đến khi đạt OD600 1,45 nồng độ vi khuẩn đạt

109cfu/ml.Sinh khối vi khuẩn được pha loãng trong NaCl 0,65% theo các nồng độ 10-2,

10-3,10-4,10-5,10-6,10-7

Dùng micropipette hút 100 µl từ các ống nghiệm có hệ số pha loãng từ 10-6, 10-7

cho vàođĩa petri chứa môi trường LB (có bổ sung kháng sinh Ampicilin (50 µg/ml) đối

với chủng A hydrophilahoang dại và kháng sinh Kanamycin + Ampicilin (50 µg/ml)

đối với chủng A hydrophilađột biến) pha loãng trải 2 đĩa cho mỗi nồng độ Dùng que

trang thủy tinh trang đều vi khuẩn trên khắp mặt thạch cho đến khi mặt thạch khô, ủ ở

28oC trong 16 giờ

Đọc kết quả

Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường đĩa thạch, khuẩn lạc phải tách rời nhau

không dính chùm, có hình dạng và màu sắc đặc trưng (mỗi đĩa có số khuẩn lạc trong

khoảng 25 – 250)

Công thức tính mật độ vi khuẩn bằng cách đếm khuẩn lạc là:

A = N/(K*V)