Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh và cải thiện khả năng học tập nhận thức của phân đoạn n butanol chiết từ cây rau đắng biển

Hơn nữa, các thuốc đang được sử dụng để điều trị suy giảm nhận thức còn nhiều tác dụng không mong muốn và gây nhiều độc tính trên bệnh nhân.. Ngoài những bất thường hệ cholinergic, các n

NÔNG THỊ THANH PHƯƠNG

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO THẦN KINH VÀ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG HỌC TẬP NHẬN THỨC CỦA PHÂN ĐOẠN N-BUTANOL CHIẾT TỪ CÂY

RAU ĐẮNG BIỂN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NÔNG THỊ THANH PHƯƠNG

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO THẦN KINH VÀ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG HỌC TẬP NHẬN THỨC CỦA PHÂN ĐOẠN N-BUTANOL CHIẾT TỪ CÂY

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian học tập và nghiên cứu, em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới:

TS Đỗ Thị Nguyệt Quế - giảng viên bộ môn Dược lực - trường Đại học Dược

-Em xin cảm ơn toàn thể các thầy giáo, cô giáo của Trường Đại học Dược Hà Nội, đã tận tình giảng dạy cho em cũng như các bạn sinh viên của trường trong suốt năm năm học tập

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nông Thị Thanh Phương

MỤC LỤC

Danh mục các từ viết tắt iv

Danh mục bảng v

Danh mục hình, sơ đồ v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Một vài khái niệm về bệnh Alzheimer và chứng sa sút trí tuệ 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Phân loại 3

1.2 Cơ chế bệnh sinh 4

1.2.1 Giả thuyết beta Amyloid 4

1.2.2 Giả thuyết đám rối thần kinh (Neurofibrillary Tangles - NFTs) 5

1.2.3 Giả thuyết Cholinergic và những bất thường về các chất dẫn truyền thần kinh khác 5

1.2.4 Các chất gây viêm trung gian 6

1.2.5 Các cơ chế khác 7

1.3 Các thuốc điều trị Alzheimer 8

1.3.1 Các nhóm thuốc điều trị Alzheimer 8

1.3.2 Tacrin 9

1.3.3 Hạn chế của các thuốc điều trị Alzheimer 10

1.3.3.1 Về hiệu quả điều trị 10

1.3.3.2 Về tương tác thuốc, tác dụng không mong muốn 11

1.4 Nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer 12

1.4.1 Nghiên cứu thuốc nhằm làm giảm βAP 12

1.4.2 Nghiên cứu thuốc tác dụng trên các đích khác 14

1.5 Một số mô hình nghiên cứu thuốc tác động lên nhận thức và các bệnh sa sút trí tuệ 15

1.6 Vài nét về cây Rau đắng biển 17

2.1 Nguyên liệu 21

2.2 Động vật thí nghiệm 21 2.3 Hóa chất, trang thiết bị 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cắn phân đoạn n- butanol chiết từ Rau đắng biển trên tế bào vỏ não nguyên phát gây độc bằng beta-amyloid 22

2.4.1.1 Phương pháp tách và nuôi cấy tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát 22 2.4.1.2 Đánh giá độc tính của mẫu thử trên tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát 23 2.4.1.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cắn phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển trên tế bào vỏ não nguyên phát gây độc bằng

βA 25-35 24

2.4.2 Đánh giá tác dụng cải thiện khả năng học tập và ghi nhớ in vivo 26

2.4.2.1 Phương pháp gây thiếu máu não cục bộ tam thời theo mô hình 2VO + hypo 26 2.4.2.2 Thử nghiệm mê lộ nước Morris 26

2.5 Xử lý số liệu 29 3.1 Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh trên mô hình gây độc tế bào bằng

protein βA25-35 của cắn phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển 30

3.1.1 Ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu đối với khả năng sống sót của tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát 30 3.1.2 Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát khỏi tổn

thương bởi protein βA25-35 31 3.2 Tác dụng cải thiện khả năng học và nhớ in vivo bằng thử nghiệm mê lộ

nước Morris của cắn phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển 32 CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 36 4.1 Về tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của phân đoạn butanol chiết từ Rau đắng biển 36

4.2 Về tác dụng tăng khả học tập và trí nhớ in vivo của phân đoạn butanol

chiết từ cây Rau đắng biển 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

Danh mục các từ viết tắt ADAS-Cog Alzheimer's Disease Assessment Scale-cognitive

(Thang đáng giá nhận thức trong bệnh Alzheimer)

ApoE4 Apolipoprotein E4

APP Amyloid precursor protein (protein tiền chất amyloid)

GSK3b glycogen synthase kinase 3b

HDL High-density lipoprotein (lipoprotein tỷ trọng cao)

ICD 10 International Classification of Diseases 10th

(Phân loại bệnh quốc tế lần thứ 10)

LDL Low-density lipoprotein (lipoprotein tỷ trọng thấp)

NFTs Neurofibrillary Tangles (đám rối thần kinh)

NMDA N-methyl-D-aspartate

βA25-35 Amyloid β-Protein Fragment 25-35

( đoạn acid amin β-amyloid peptid chứa 11 acid amin)

βAP β-amyloid peptid

Danh mục bảng

1 Bảng 1.1 Phân loại chứng sa sút trí tuệ trong bệnh Alzheimer 4

2 Bảng 1.2 Các nhóm thuốc điều trị triệu chứng suy giảm nhận thức 9

3 Bảng 2.1 Phân nhóm thử khả năng sống sót sau gây độc tế bào

bằng βA 25-35

25

4 Bảng 2.2 Phân nhóm thí nghiệm và điều trị 27

5 Bảng 3.1 Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ của các lô thí

nghiệm ở bài tập nhìn thấy bến đỗ

32

6 Bảng 3.2 Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ của các lô thí

nghiệm ở bài tập không nhìn thấy bến đỗ

33

Danh mục hình, sơ đồ

1 Hình 1.1 Cấu trúc các thành phần Saponin chính trong bacosid A 18

2 Hình 2.1 Sơ đồ các bước đánh giá khả năng sống sót trên tế bào

gây độc bằng beta-amyloid

26

3 Hình 2.2 Sơ đồ qui trình bài tập trên mô hình mê lộ nước Morris 28

4 Hình 2.3 Mô hình thí nghiệm mê lộ nước Morris 29

5 Hình 3.1 Ảnh hưởng của phân đoạn n-butanol Rau đắng biển đối

với khả năng sống sót của tế bào thần kinh vỏ não sau 24 giờ nuôi cấy và thử thuốc

30

6 Hình 3.2 Tác dụng bảo vệ tổn thương tế bào thần kinh vỏ não

nguyên phát gây bởi βA 25-35 của cắn phân đoạn BuOH chiết từ Rau đắng biển

31

7 Hình 3.3 Tỷ lệ thời gian chuột ở cung phần tư đích 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sa sút trí tuệ là hậu quả của nhiều bệnh lý thần kinh khác nhau trong đó, bệnh Alzheimer là nguyên nhân phổ biến nhất gây nên chứng sa sút trí tuệ Chứng sa sút trí tuệ gây ra sự suy giảm năng lực nhận thức và hành vi của bệnh nhân, rút ngắn cuộc sống bệnh nhân khi bệnh tiến triển Căn bệnh này vốn được coi là bệnh tuổi già, do nguy cơ sa sút trí tuệ tăng lên theo tuổi Theo báo cáo của Tổ chức y tế thế giới (WHO) năm 2012, ở khu vực Âu – Mỹ bệnh hay gặp nhất ở độ tuổi 80-89, ở châu Á là 75-84 tuổi và ở Châu Phi hay gặp nhất trong độ tuổi 70 -79 [101] Tuy nhiên, độ tuổi mắc bệnh hiện đang giảm dần [49], [101] Các nhà nghiên cứu ước tính trên toàn thế giới có gần 7,7 triệu ca mới mắc mỗi năm Chứng sa sút trí tuệ còn tăng gánh nặng cho gia đình bệnh nhân, cho hệ thống chăm sóc sức khỏe và cho nền kinh tế của hầu hết các quốc gia [101] Theo hiệp hội Alzheimer quốc tế, Alzheimer

và chứng sa sút trí tuệ là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 6 ở Bắc Mỹ Trong năm 2012, nước Mỹ cần tới 15,4 triệu người chăm sóc dành cho các bệnh nhân, trị giá hơn 216 tỷ USD [10] Việt Nam hiện chưa có con số thống kê đầy đủ

Hiện chưa có phương pháp nào thực sự có hiệu quả trong điều trị chứng sa sút trí tuệ nói chung và bệnh Alzheimer nói riêng Các phương pháp điều trị bằng thuốc kết hợp với chăm sóc chỉ có thể làm chậm sự tiến triển của bệnh, làm chậm sự mất chức năng nhận thức, hành vi của bệnh nhân Hơn nữa, các thuốc đang được sử dụng để điều trị suy giảm nhận thức còn nhiều tác dụng không mong muốn và gây nhiều độc tính trên bệnh nhân Các thuốc mới đã và đang được nghiên cứu, tuy nhiên, cơ chế bệnh sinh phức tạp cũng khiến cho việc nghiên cứu các phương pháp điều trị khó khăn và kém toàn diện Hiện nay, xu hướng nghiên cứu thuốc điều trị suy giảm nhận thức từ dược liệu là một hướng có triển vọng Ở Việt Nam, một số nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá tác dụng tăng khả năng học tập và bảo vệ

tế bào thần kinh từ dược liệu như các saponin trong Sâm Ngọc Linh, Hương Nhu Tía, Củ bình vôi, …

Rau Đắng Biển hay còn gọi là Rau sam đắng, tên khoa học Bacopa monnieri (Linn.) Pennell họ Hoa Mõm Chó (Scofulariacea) là cây thuốc được sử dụng trong

y học cổ truyền Ấn Độ làm thuốc bổ thần kinh, tăng cường trí nhớ, trị bệnh động kinh [1], [2] Ở Việt Nam, Rau đắng biển mọc hoang dại, được sử dụng làm rau ăn

và cũng được dùng như một vị thuốc điều trị một số chứng bệnh trong y học dân gian Việc nghiên cứu tác dụng trên trí nhớ, khả năng học tập của cây Rau Đắng Biển đã được nghiên cứu trên thế giới và bước đầu được nghiên cứu ở Việt Nam [3], [4] tuy nhiên vẫn chưa được đầy đủ về cả số lượng và chất lượng kết quả nghiên cứu Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh và cải thiện khả năng học tập nhận thức của phân đoạn n-butanol chiết từ cây Rau đắng biển ” Khóa luận nằm trong đề tài cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu tác dụng cải thiện khả năng học, nhớ và bảo vệ tế bào thần kinh của cây Rau đắng biển

(Bacopa monnieri (Linn.) Wettst.) theo hướng làm thuốc điều trị Alzheimer” (Phê

duyệt QĐ số 769/QĐ-BYT, ngày 13 tháng 3 năm 2012, chủ nghiệm đề tài: TS Phạm Thị Nguyệt Hằng – Viện dược liệu trung ương.)

Mục tiêu nghiên cứu:

- Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của phân đoạn n-butanol chiết từ cây Rau đắng biển trên tế bào vỏ não nguyên phát bị gây độc bằng protein beta-amyloid

- Đánh giá tác dụng cải thiện khả năng học tập nhận thức trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm trí nhớ do thiếu máu não cục bộ tạm thời của phân đoạn n-butanol chiết từ cây Rau đắng biển

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Một vài khái niệm về bệnh Alzheimer và chứng sa sút trí tuệ 1.1.1 Khái niệm

Chứng sa sút trí tuệ (Dementia) được định nghĩa là sự suy giảm khả năng nhận thức và giảm khả năng thực hiện “thành công” các hoạt động sinh hoạt hằng ngày [24] Theo phân loại bệnh quốc tế lần thứ 10 - ICD10, “Chứng sa sút trí tuệ (F00-F03) là một hội chứng do bệnh của não bộ, thường có tính chất mạn tính hay tiến triển, trong đó có sự xáo trộn của nhiều chức năng vỏ não cao hơn, bao gồm cả trí nhớ, tư duy, định hướng, tính toán, năng lực học tập, ngôn ngữ và phán xét” Ý thức của bệnh nhân không bị mất đi Sự suy giảm nhận thức thường được đi kèm hoặc xuất hiện trước sự suy giảm khả năng kiểm soát cảm xúc, hành vi xã hội, hoặc động

cơ của bệnh nhân Hội chứng sa sút trí tuệ hay gặp ở bệnh Alzheimer, bệnh mạch máu não và trong các bệnh khác là nguyên nhân nguyên phát hoặc thứ phát ảnh hưởng tới bộ não [102] Trong đó, bệnh Alzheimer là nguyên nhân phổ biến nhất, chiếm khoảng 50% - 70% số trường hợp rối loạn chức năng nhận thức [24], [49]

1.1.2 Phân loại

a Phân loại hội chứng sa sút trí tuệ Các rối loạn tạo thành chứng sa sút trí tuệ được phân loại và xác định trên cơ sở các yếu tố gây bệnh khác nhau và những con đường sinh lý khác nhau Trong một

số tài liệu, chứng sa sút trí tuệ được phân loại thành các typ hoặc các dạng [10], [24], [29], [49] Các typ phổ biến của chứng sa sút trí tuệ gồm:

 Sa sút trí tuệ bệnh Alzheimer (Dementia in Alzheimer disease)

 Sa sút trí tuệ bệnh mạch máu (Vascular dementia)

 Sa sút trí tuệ do thể Lewy (Lewy body dementia)

 Sa sút trí tuệ thùy trán-thái dương, gồm cả bệnh Pick (Frontotemporal dementia, Pick’s disease)

 Sa sút trí tuệ do các nguyên nhân có thể đảo ngược khác như: nhiễm độc mạn tính (do rượu hoặc thuốc), thiếu vitamin, bệnh tâm thần, hormon và suy

chức năng các cơ quan (suy giáp, suy gan, suy thận…), chấn thương đầu và tổn thương não lan tỏa, nhiễm trùng mạn tính (đặc biệt là HIV), …

b Phân loại sa sút trí tuệ trong bệnh Alzeimer

Bệnh Alzheimer thường được phân loại theo thời điểm khởi phát [49], [102]

Hệ thống ICD 10 đã phân loại chứng sa sút trí tuệ trong bệnh Alzheimer như sau (bảng 1.1):

Bảng 1.1 Phân loại chứng sa sút trí tuệ trong bệnh Alzheimer

F00.0 Sa sút trí tuệ trong bệnh Alzheimer xuất hiện sớm: Mất trí nhớ trong

bệnh Alzheimer khởi phát trước tuổi 65, quá trình diễn biến xấu đi nhanh chóng với nhiều dấu hiệu rối loạn chức năng vỏ não cao hơn

F00.1 Sa sút trí tuệ trong bệnh Alzheimer xuất hiện muộn: Mất trí nhớ trong

bệnh Alzheimer khởi phát sau tuổi 65, thường từ >70 tuổi, tiến triển chậm, với sự suy giảm trí nhớ là nét đặc trưng chính

F00.2 Sa sút trí tuệ trong bệnh Alzheimer không điển hình hoặc kiểu hỗn

thần kinh và sự teo vỏ não [24], [40], [49]

1.2.1 Giả thuyết beta Amyloid

β-amyloid peptid (βAP) là những sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa bao

gồm 36-43 axit amin βA42 ít phổ biến hơn so với các βAP nhưng lại dễ bị kết tụ và hình thành mảng bám βAP có nguồn gốc từ sự phân giải protein tiền chất amyloid

(amyloid precursor protein - APP) tuần tự bởi các enzym: beta-site amyloid

precursor protein–cleaving enzyme 1 (BACE-1) - một β-secretase và γ-secretase -

một phức hợp protein với presenilin 1 Sự mất cân bằng giữa sản xuất, thanh thải

các peptid làm cho các βAP dư thừa tích lũy và kết tụ lại gây độc cho tế bào Giả

thiết này dựa trên các nghiên cứu về các hình thức di truyền của bệnh Alzheimer

(trong đó có hội chứng Down) và các bằng chứng cho thấy Aβ42 gây độc cho các tế

bào [24], [40], [49]

1.2.2 Giả thuyết đám rối thần kinh (Neurofibrillary Tangles - NFTs)

Đám rối thần kinh - NFTs thường được tìm thấy trong các tế bào của vùng hải

mã và vỏ não ở người bệnh Alzheimer NFTs được hình thành từ protein tau phosphoryl hóa bất thường Protein tau có vai trò ổn định cấu trúc vi ống, giúp hệ

thống vi ống thực hiện chức năng nâng đỡ tế bào, chức năng vận chuyển và vận

động tế bào chất Khi sợi tau bị phosphoryl hóa bất thường tại một vị trí cụ thể,

chúng không thể liên kết một cách hiệu quả với các vi ống làm chức năng của chúng bị gián đoạn dẫn tới gây chết tế bào Mật độ của các NFTs tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh mất trí nhớ bởi chúng là một dấu hiệu về sự chết đi của các tế bào thần kinh NFTs cũng được tìm thấy trong bệnh sa sút trí tuệ khác ngoài bệnh Azheimer [24], [40], [49]

1.2.3 Giả thuyết Cholinergic và những bất thường về các chất dẫn truyền thần kinh khác

Tổn thương tế bào thần kinh có thể được nhìn thấy cùng với cấu trúc mảng bám Rối loạn chức năng và thoái hóa tế bào lan tỏa dẫn đến một loạt các khiếm khuyết dẫn truyền thần kinh, trong đó các bất thường trên hệ cholinergic là nổi bật nhất Mất hoạt động của cholinergic tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh

Azheimer Vào giai đoạn muộn của bệnh Azheimer, số lượng các tế bào thần kinh cholinergic và số lượng các thụ thể nicotinic trong vùng hải mã và vỏ não giảm xuống Thụ thể nicotinic trước sinap có vai trò kiểm soát việc giải phóng của acetylcholin, cũng như các chất dẫn truyền thần kinh quan trọng khác cho bộ nhớ và tâm trạng, bao gồm glutamat, serotonin và norepinephrin Giả thuyết cholinergic lý giải việc mất tế bào cholinergic là nguyên nhân suy giảm nhận thức trong bệnh Azheimer, do đó, việc tăng chức năng hệ cholinergic có thể cải thiện triệu chứng mất trí nhớ

Ngoài những bất thường hệ cholinergic, các nghiên cứu cũng cho thấy một số rối loạn hoạt động ở nhiều con đường dẫn truyền thần kinh khác như tế bào thần kinh serotonin của hạt nhân raphe và các tế bào noradrenergic của nhân lục (ceruleus locus) bị chết, tăng hoạt động của monoamin oxidase typ B (monoamin oxidase typ

B được tìm thấy chủ yếu trong não và trong tiểu cầu và chịu trách nhiệm cho quá trình chuyển hóa dopamin), rối loạn điều hòa glutamat (được coi là một trong những quá trình trung gian chính dẫn đến suy giảm trí tuệ trong những chấn thương thần kinh sau đột quỵ hoặc sau chấn thương sọ não cấp tính) [24], [40], [49]

1.2.4 Các chất gây viêm trung gian

Giả thuyết cho rằng, khi βAP kết tụ, các thực bào tiểu thần kinh đệm (microglia)

được kích hoạt và tăng cường phản ứng của các tế bào hình sao với các mảng bám

Các thực bào tiểu thần kinh đệm làm giảm βAP qua thực bào Các tế bào hình sao đưa βAP vào tế bào chất gián tiếp qua receptor và vận chuyển βAP vào tuần hoàn chung, do đó cũng làm giảm βAP Tuy nhiên, việc kích hoạt mạn tính các tiểu thần

kinh đệm dẫn tới giải phóng các cytokin như interleukin-11), interleukin-6 6) và yếu tố hoại tử u (TNF-α), nictric oxid … làm tổn thương các tế bào thần kinh

(IL-và thúc đẩy quá trình viêm liên tục Trên thực tế, nhiều cytokin (IL-và chemokin tăng lên trong não bệnh nhân Azheimer và một số kiểu đa hình gen tiền viêm được báo cáo là có liên quan với bệnh Azheimer [24], [40], [49]

1.2.5 Các cơ chế khác

Ngày càng có nhiều bằng chứng về một mối quan hệ nhân-quả giữa các bệnh tim mạch và những yếu tố nguy cơ tim mạch với tỷ lệ mắc bệnh Azheimer Các yếu tố nguy cơ tim mạch cũng là những yếu tố nguy cơ sa sút trí tuệ bao gồm: tăng huyết

áp, tăng lipoprotein cholesterol tỉ trọng thấp (LDL- cholesterol), giảm lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao (HDL - cholesterol) và bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường có thể làm tăng nguy cơ mất trí nhớ thông qua các yếu tố liên quan đến "hội chứng chuyển hóa" (rối loạn lipid máu và tăng huyết áp) và thông qua bất thường insulin Rối loạn trong con đường tín hiệu insulin (insulin-signaling pathways), cả ở ngoại vi và ở não, có liên quan đến bệnh Azheimer Insulin cũng có

vai trò trong việc điều chỉnh sự chuyển hóa của βAP và protein tau

Bệnh mạch máu não có thể làm nặng thêm sự suy giảm nhận thức của bệnh Azheimer do các mạch máu bất thường có thể làm giảm cung cấp các chất dinh

dưỡng cho tế bào thần kinh và giảm độ thanh thải của βAP từ não bộ, làm tăng tốc

độ lắng đọng amyloid và làm tăng độc tính của amyloid cho tế bào thần kinh

Những nghiên cứu đã tìm thấy nhiều mối liên hệ giữa cholesterol và sự xuất hiện của bệnh Azheimer Apolipoprotein E là một lipoprotein có nhiệm vụ vận chuyển

cholesterol trong não ApoE4 có liên quan đến tăng lắng đọng của βAP và được cho

là đóng vai trò như một chất điều hòa thúc đẩy trong quá trình bệnh sa sút trí tuệ mạch máu Cholesterol được vận chuyển bằng LDL vào tế bào thần kinh và liên kết với NFTs Mức cholesterol cao trong tế bào thần kinh não có thể làm thay đổi chức

năng màng tế bào, dẫn đến hình thành các βAP và các mảng bám

Những giả thuyết khác được đề xuất để giải thích bệnh Azheimer bệnh bao gồm

sự oxy hóa, rối loạn chức năng ty thể và những ảnh hưởng của estrogen ở phụ nữ sau mãn kinh Rối loạn chức năng của ty thể có thể làm gián đoạn quá trình chuyển hóa năng lượng trong tế bào thần kinh, giải phóng các gốc tự do và gây mất cân bằng oxi hóa Estrogen được cho là có vai trò thúc đẩy tăng trưởng tế bào thần kinh

và ngăn chặn quá trình oxi hoá như một tác nhân chống oxi hóa, do đó sẽ có lợi cho

các tế bào tiếp xúc với βAP Estrogen có thể đóng vai trò trong việc duy trì dẫn

truyền thần kinh qua cholinergic, tăng số lượng thụ thể NMDA ở các vùng não liên quan đến việc ghi lại những ký ức mới và ngăn ngừa tổn thương tế bào Thực tế, estrogen làm tăng lưu lượng máu não, tăng sử dụng glucose, làm giảm nồng độ ApoE trong huyết tương và làm giảm căng thẳng do liên quan đến quá trình giải phóng glucocorticoid

Cho tới nay, chưa có cơ chế bệnh sinh nào được chứng minh là cơ chế chính Nhưng tất cả các giả thuyết đều dẫn đến một hậu quả: sự thoái hóa của tế bào thần kinh trong vùng não cao hơn; hình thành NFTs và mảng bám; sự suy giảm hoạt động nghiêm trọng hệ cholinergic và sự mất nhận thức tiến triển từ từ cho tới khi bệnh nhân tử vong [24], [40], [49]

1.3 Các thuốc điều trị Alzheimer

Mục tiêu chính của việc điều trị trong bệnh Azheimer là điều trị triệu chứng khó khăn về nhận thức và bảo vệ các chức năng của bệnh nhân càng lâu càng tốt Mục tiêu thứ cấp bao gồm điều trị các di chứng tâm thần và hành vi của bệnh Các biện pháp không dùng thuốc chủ yếu là cung cấp thông tin cho người chăm sóc bệnh nhân [24], [29], [49] Ngoài ra, việc phòng bệnh được thực hiện bằng cách can thiệp

vào cơ chế gây bệnh quan trọng ở giai đoạn trước khi có triệu chứng [29]

1.3.1 Các nhóm thuốc điều trị Alzheimer

 Những nhóm thuốc chủ yếu được sử dụng trong điều trị bệnh Alzheimer nhằm can thiệp vào những triệu chứng suy giảm nhận thức (cognitive symptoms)

và bảo vệ duy trì chức năng là [24], [49], [70], [8]:

 Nhóm ức chế cholinesterase : donepezil, galantamin, rivastigmin

 Nhóm ức chế glutamat: memantin

 Các thuốc sử dụng với những cách tiếp cận điều trị khác: liệu pháp estrogel, thuốc chống viêm, thuốc hạ lipid máu

Bảng 1.2 Các nhóm thuốc điều trị triệu chứng suy giảm nhận thức

(cognitive symptoms) Nhóm

1 Nhóm ức chế cholinesterase

tacrin ức chế có hồi phục acetylcholinesterase donepezil ức chế có hồi phục acetylcholinesterase rivastigmin ức chế có hồi phục acetylcholinesterase

và butyrylcholinesterase

galantamin ức chế có hồi phục acetylcholinesterase

và điều biến thụ thể nicotinic

 Nhóm thuốc chống co giật: carbamazepin, valproic acid

dung dịch methanol, ethanol, dimethylsufoxid và propylen glycol, hơi tan trong acid linoleic và polyethylen glycol 400 [95]

- Tác dụng: Tacrin là thuốc đầu tiên thuộc nhóm ức chế acetylcholinesterase được cục quản lý dược Mỹ phê duyệt điều trị bệnh Alzheimer năm 1993 Tuy nhiên,

do độc tính trên gan, cùng với sự xuất hiện của nhiều thuốc cùng nhóm có ít độc tính hơn, tacrin không còn được sử dụng hoặc với một số hướng dẫn chỉ dùng như lựa chọn thứ 2 trong điều trị bênh Alzheimer [72]

1.3.3 Hạn chế của các thuốc điều trị Alzheimer

1.3.3.1 Về hiệu quả điều trị

Chứng sa sút trí tuệ trong bệnh Alzheimer là hậu quả của những thoái hóa không hồi phục thần kinh não bộ Các phương pháp điều trị hiện tại không có hiệu quả kéo dài tuổi thọ, chữa khỏi bệnh bệnh Azheimer, hoặc tạm dừng hoặc đảo ngược quá trình sinh lý bệnh [49] Hai nhóm thuốc chính đang sử dụng là thuốc ức chế cholinesterase và thuốc tác dụng trên hệ glutamat dựa trên hai giả thuyết cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer Tuy nhiên, cơ chế bệnh sinh chính bệnh Alzheimer đến nay còn chưa được xác định rõ ràng và hai giả thuyết này chỉ là một phần trong rất nhiều con đường dẫn đến việc tế bào thần kinh bị phá hủy [49] Nhóm thuốc ức chế cholinesterase chỉ định cho trường hợp bệnh nhẹ đến trung bình, có hiệu quả ổn định nhận thức tạm thời, hoặc làm giảm rất nhỏ sự suy giảm nhận thức, 20-30% bệnh nhân đã điều trị giảm được 7 điểm trong thang điểm đáng giá nhận thức - ADAS-Cog (tương đương giảm được 1 năm suy giảm nhận thức), hay chỉ giảm 5-15% so với giả dược khi theo dõi từ 6 đến 12 tháng [44], [45], [62] Memantin được dùng cho bệnh nhân ở giai đoạn trung bình đến nặng, ở những người không dùng được thuốc ức chế cholinesterase [70] Một số thử nghiệm lâm sàng cho thấy hiệu quả của memantin khi đánh giá bằng thang ADAS-cog so với giả dược ở thời điểm

12 - 24 tuần điều trị, nhưng không cho thấy lợi ích từ 24 – 48 tuần [69]

Những nhóm thuốc điều trị triệu chứng không thuộc nhận thức: các thuốc chống loạn thần, thuốc chống trầm cảm, chống co giật chỉ được sử dụng khi những triệu chứng về tâm-thần kinh ở mức độ nghiêm trọng, gây khó khăn cho chức năng hoạt

động của bệnh nhân và các hoạt động chăm sóc cần thiết của người chăm sóc, hoặc

có thể gây nguy hiểm cho bản thân bệnh nhân hoặc người khác Việc điều trị phải dựa trên sự cân bằng giữa lợi ích và nguy cơ [49], [70], [85] Ngoài ra, thuốc hướng thần còn có tác dụng kháng cholinergic, vì vậy chúng có thể làm bệnh trầm trọng hơn hoặc tác động đến việc sử dụng thuốc ức chế cholinesterase [49]

1.3.3.2 Về tương tác thuốc, tác dụng không mong muốn

 Nhóm ức chế cholinesterase

 Tác dụng không mong muốn của nhóm ức chế cholinesterase thường do các tác dụng kích thích cholinergic quá mức và phụ thuộc vào liều như: buồn nôn, nôn, tiêu chảy, đau bụng, chóng mặt, nhức đầu, tiết nước bọt, đổ mồ hôi, nhịp chậm, chuột rút, ngất, mệt mỏi, mất ngủ, kích động, … trong đó nôn, buồn nôn, tiêu chảy được báo cáo nhiều nhất Tacrin gây nhiễm độc gan sau khoảng 3 tháng ở 30 - 40%

số bệnh nhân biểu hiện bởi tăng men gan và trở lại bình thường sau khi ngừng thuốc [44], [49], [72]

 Tương tác thuốc của các thuốc trong nhóm ức chế cholinesterase có thể gặp như: donepezil và glantamin chuyển hóa qua hệ Cytocrom P450, emzym CYP3A4, nên chúng có nguy cơ gây tương tác với các thuốc ức chế hoặc gây cảm ứng trên hệ enzym này: carbamazepin, dexamethason, phenobarbital, phenytoinand, rifampicin, erythromycin … Ngoài ra, các thuốc trong nhóm còn có thể gây tương tác thuốc với các nhóm: thuốc chống loạn thần, các azol chống nấm, nhóm ức chế thụ thể H2, chẹn kênh calci, các thuốc tác dụng lên acetylcholin khác, … [51]

1.4 Nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer

Phát triển thuốc mới chủ yếu theo hai hướng Hướng thứ nhất, tập trung vào các

thuốc làm giảm nồng độ βAP não hoặc các dạng hoạt động của nó Hướng thứ hai

bao gồm tất cả các chiến lược điều trị khác [49], [81]

1.4.1 Nghiên cứu thuốc nhằm làm giảm βAP

Để giảm nồng độ βAP trong não, thuốc có thể tác dụng vào các quá trình: giảm tổng hợp βAP, giảm lắng đọng và thúc đẩy quá trình thải trừ βAP

Để làm giảm tạo thành βAP các thuốc được nghiên cứu theo hướng tác dụng ức chế β-secretase và γ-secretase Do β-secretase 1 còn có các cơ chất khác (bao gồm

neuregulin -1 tham gia vào quá trình myelin hóa) nên việc ức chế enzym này có thể

gây độc tính Cho đến nay chưa có dữ liệu về hiệu quả của thuốc ức chế của

β-secretase trên thử nghiệm lâm sàng [49], [81]

Các thuốc ức chế γ-secretase cũng đang được chú ý nghiên cứu γ-secretase là phức hợp enzym, ngoài cơ chất là APP, γ-secretase còn tham ra phân cắt một số protein trong màng tế bào như thụ thể Notch, ErbB4, thụ thể p75NTR neurotrophin, N-cadherin, tiểu đơn vị kênh natri β4 [81] Việc ức chế γ-secretase có thể ức chế con đường tín hiệu Notch gây ra những tác dụng phụ nghiêm trọng trên đường tiêu

hóa, tuyến ức, lá lách, trên da động vật thí nghiệm và trên người Semagacestat là

chất ức chế γ-secretase đầu tiên đã qua thử nghiệm lâm sàng và được chứng minh là

làm giảm nồng độ βAP trong huyết tương và giảm sản xuất βAP ở thần kinh trung

ương Hai thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng pha 3 với semagacestat đã dừng lại sớm vì một số tác dụng bất lợi nghiêm trọng, bao gồm huyết học, tiêu hóa

và nhiễm độc da, được cho là do semagacestat ức chế của con đường tín hiệu Notch Một số thuốc khác cùng nhóm như begacestat, avagacestat đang được đánh về giá mức độ chọn lọc và an toàn so với hiệu quả trên lâm sàng [23], [39], [42], [43] Một

số loại thuốc kháng viêm không steroid (NSAIDs) có tác động lên γ-secretase

nhưng không ức chế hoàn toàn γ-secretase, chúng có tác dụng làm giảm βA40 và

βA42, trong khi làm tăng βA38 Tarenflurbil (một đồng phần quang học

flurbiprofen) đã được thử nghiệm lâm sàng pha 3 nhưng không có tác dụng làm

chậm suy giảm nhận thức [36], trong khi làm tăng chóng mặt, thiếu máu và nhiễm trùng Sự thất bại của tarenflurbil có thể do hiệu lực thấp và khả năng thâm nhập não kém [49], [81] Hơn nữa, ức chế cyclo-oxygenase trong tiểu thần kinh đệm có

thể dẫn đến sự ức chế thải trừ βAP [49] Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, các

thuốc thuộc nhóm 1,4-dihydropyridin (DHP) chẹn kênh canxi typ L có ảnh hưởng

đến quá trình sản xuất βAP [32], [33] Nilvadipin và amlodipin cũng có tác dụng ổn

định nhận thức ở một số bệnh nhân tăng huyết áp có suy giảm nhận thức nhẹ, thuốc dung nạp tốt và không gây ra tác dụng hạ huyết áp nguy hiểm [38] [52] Nilvadipin

và amlodipin đang được nghiên cứu từ những tác dụng làm giảm sản xuất βAP từ APP in vitro và làm giảm tích lũy do giảm sản xuất và tăng thải trừ βAP qua hàng

rào máu não khi điều trị thử nghiệm bằng đường uống dài hạn [33]

Các thuốc làm giảm sự lắng đọng của βAP được nghiên cứu với cơ chế ức chế các tiểu đơn vị βAP tập hợp thành các oligomer khó tan, hoặc kích hoạt thải trừ qua phản ứng miễn dịch Một số chất ức chế kết tập βAP như Tramiprosat, PBT2,

Scyllo-inositol … đang được nghiên cứu Tramiprosat cho thấy tác dụng giảm nồng

độ βAP trong dịch não tủy ở nghiên lâm sàng pha 2, tuy nhiên không có tác dụng

cải thiện trí nhớ ở thử nghiệm lâm sàng pha 3 [34], [49] PBT2 là một quinolone hydroxy, thấm tốt qua dịch não tủy khi dùng bằng đường uống, có tác dụng thúc

8-đẩy thải trừ βAP oligomer và phục hồi khả năng nhận thức trong mô hình bệnh

Azheimer trên chuột [8] [30], tuy nhiên trong thử nghiệm lâm sàng pha 2a gần đây,

PBT2 làm giảm βA42 trong dịch não tủy và cải thiện nhận thức, nhưng không thấy mối tương quan có ý nghĩa giữa sự giảm βAP trong dịch não tủy và sự thay đổi nhận thức [30] Scyllo-inositol có thể liên kết trực tiếp với βAP oligomer, thúc đẩy phân ly của βAP oligomer [11], [31] Trong thử nghiệm lâm sàng, Scyllo-inositol

làm tăng khối lượng não thất, nhưng ít cải thiện về tình trạng lâm sàng, thử nghiệm liều cao của thuốc buộc phải ngưng sớm do gây nhiều tác dụng phụ [81]

Phương pháp miễn dịch đã được nghiên cứu bao gồm vaccin AN-1792 và miễn

dịch thụ động thông qua truyền kháng thể, nhằm tăng thải trừ βAP Vaccin

AN-1792 là liệu pháp miễn dịch đầu tiên được nghiên cứu, nghiên cứu lâm sàng pha 2 trên người của AN-1792 đã phải dừng lại do một số lượng bệnh nhân bị viêm não, sau đó tiến triển thành viêm màng não vô khuẩn Những nghiên cứu dài hạn và toàn diện về bệnh học lâm sàng của các bệnh nhân điều trị AN-1792 có thể cho kết quả khả quan trong việc cải thiện suy giảm nhận thức và làm giảm mảng bám ở não; nhưng tiêm chủng AN-1792 không có nhiều lợi ích có ý nghĩa cho những bệnh nhân khởi phát muộn - là hình thức phổ biến của bệnh Azheimer [49] [81] Liệu pháp kháng thể đơn dòng bắt đầu được nghiên cứu gần đây, kết quả từ hai thử nghiệm lâm sàng pha 3 với bapineuzumab và solaneuzumab không mang lại kết quả mong

muốn Nguyên nhân có thể là các chất này chọn sai loại βAP đích hoặc do thuốc sử

dụng quá muộn trong quá trình bệnh Một số kháng thể đơn dòng mới với đích nhắm là nhiều loại amyloid-β khác nhau đang được thử nghiệm [49], [81]

1.4.2 Nghiên cứu thuốc tác dụng trên các đích khác

Giả thuyết đám rối thần kinh trong bệnh sinh của bệnh Azheimer đã khiến Tau

protein trở thành một đích tác dụng trong nghiên cứu thuốc điều trị bệnh Azheimer

Bằng chứng thực nghiệm cho thấy có tương tác giữa βAP và Tau protein phosphoryl hóa bất thường, theo đó, những mảng βAP kết tụ kích thích hoạt hóa các

kinase khác nhau như cyclin kinase, cyclin dependent kinase 5 (CDK5) và glycogen synthase kinase 3b (GSK3b) [40] Các nghiên cứu gần đây hướng tới phát triển các

thuốc ức chế protein Tau-phosphoryl hóa và các chất ngăn chặn kết tụ Tau protein

thành đám rối và/hoặc thúc đẩy tháo gỡ đám rối GSK3b là enzym chính tham gia

vào quá trình phosphoryl hóa Tau protein [16], [40] Lithium và valproat được cho

là có khả năng ức chế GSK3b và giảm Tau- phosphoryl hóa trên mô hình động vật

[41], [99] Tuy nhiên, không có đủ bằng chứng chứng minh được thuốc trầm cảm nói chung có tác dụng lên sự suy giảm nhận thức Hơn nữa, các thuốc này còn gây tác dụng phụ năng nề, đặc biệt đối với người cao tuổi [103] Một số chất khác cũng đang được nghiên cứu như một tác nhân ức chế GSK3b như: JGK-263, glucagon-like peptide-1… [21], [46], [59] Methylthioninium clorua (MTC, methylene blue),

là một hợp chất có triển vọng do có tác động lên sự khiếm khuyết chức năng của ty

thể và hoạt động trao đổi chất của tế bào, làm giảm hình thành các mảng βAP và các

đám rối thần kinh [22], [27], [47], [67] Cần có thêm nhiều thử nghiệm hơn nữa được thực hiện để kiểm chứng và phát triển thuốc theo hướng này

Gần đây, liệu pháp miễn dịch tác động lên cơ chế bệnh sinh qua con đường Tau

protein hay đám rối thần kinh được chú ý Những thử nghiệm được tiến hành cho

thấy các tác nhân miễn dịch này có tác dụng làm giảm kết tụ Tau protein, giảm tạo

thành đám rối thần kinh Những kết quả ban đầu này hi vọng sẽ mang lại một hướng

phát triển mới trong điều trị bệnh Azheimer và những bệnh sinh liên quan Tau

protein [19], [89], [104]

Các loại thuốc thiazolidinedion, rosiglitazon và pioglitazon làm giảm đề kháng insulin và cũng có thể có tác dụng kháng viêm, gần đây đã được thử nghiệm trên người bệnh Azheimer, nhưng hầu hết các thử nghiệm cho thấy không có bằng chứng về hiệu quả [49] Latrepirdine (dimebon) là một kháng histamin không chọn lọc đã được thử nghiệm trong điều trị Alzheimer như một tác nhân bảo vệ tế bào thần kinh từ những năm 2000 [15], [57], [100] Một thử nghiệm pha 2 đã cho kết quả đáng chú ý khi mang lại lợi ích trong sự tăng cường khả năng nhận thức trên bệnh nhân [28], , nhưng thử nghiệm lâm sàng pha 3 của latrepirdin đã thất bại (được

công bố trên clinicaltrials.gov), tuy nhiên các loại thuốc bảo vệ tế bào thần kinh

khác vẫn đang được nghiên cứu

1.5 Một số mô hình nghiên cứu thuốc tác động lên nhận thức và các bệnh sa sút trí tuệ

Nghiên cứu các tác dụng lên nhận thức trên động vật là phương pháp phổ biến

để nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc thuốc tác dụng lên nhận thức và các bệnh gây sa sút trí tuệ Kỹ thuật phân tích hành vi sử dụng động vật để nghiên cứu những

mô hình bệnh ở người và dự đoán các tác dụng của thuốc được sử dụng rộng rãi [80] Trên thế giới, các mô hình nghiên cứu tác dụng của thuốc trên khả năng học tập và trí nhớ được áp dụng phổ biến dựa trên khả năng nhận diện vật thể, nhận diện mùi, không gian như: mê cung nước Morris (Morris water maze test), mê cung chữ T/chữ Y ( T/Y Maze Spontaneous Alternation Test), mô hình nhận diện đối tượng

(2-object Novel Object Recognition Test, Object-Location memory task), mô hình

né tránh thụ động (passive avoidence task), … [14] [54], [63], [71], [73], [74], [75], [93], [96] Những mô hình này không giải thích được cơ chế tác dụng dược lý của thuốc thử nghiệm Tuy nhiên, những thử nghiệm phân tích hành vi vẫn là công cụ không thể thiếu, cùng với những thông tin thu được từ nghiên cứu phân tử và tế bào được đưa vào thực thành trong nghiên cứu hành vi động vật một cách đầy đủ [80] Cùng với sự phát triển công nghệ sinh học tế bào và công nghệ sinh học phân tử, việc tiến hành các mô hình nghiên cứu khác ở mức độ tế bào hay mức độ phân tử là cần thiết để xác định đích tác dụng của thuốc trong các quá trình bệnh sinh cụ thể Ở cấp độ tế bào và dưới tế bào, việc đánh giá tác dụng dược lý của thuốc trên những quá trình bệnh sinh gây sa sút trí tuệ đã được tiến hành Các mô hình chủ yếu đánh giá các yếu tố được coi là có đóng góp cho cơ chế bệnh sinh như: quá trình viêm, sự

ô xy hóa, hệ cholinergic, hệ glutamat, trên biểu hiện của các thụ thể, … trên tế bào thần kinh vỏ não của động vật thí nghiệm Quá trình viêm được đánh giá bằng mức

độ tác động đến các yếu tố gây viêm như enzym lipoxygenase (LOX), cyclooxygenase-2 (COX2), các cytokin tiền viêm TNF-α, IL-6, IL-1β… [86], [97], [93] Tác dụng trên hệ cholinergic được đánh giá chủ yếu trên khả năng ức chế enzym choliesterase trong não Tác dụng chống oxi hóa được đánh giá thông qua biểu hiện của các enzym chống oxi hóa: catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPX), superoxide dismutase (SOD),… và sự thay đổi của các yếu tố gây oxi hóa

cơ bản (nồng độ malondialdehyd, các gốc oxi hóa, nồng độ hydroperoxid và carbonyl protein) [12], [60], [76], [ 93] Đánh giá các tác động trên thụ thể MNDA, GABA, … cũng đã được tiến hành

Một số tác giả đã sử dụng mô hình nuôi cấy tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát [12], [60], [65], [93] Ưu điểm của các mô hình tế bào là khả năng đánh giá trực tiếp ảnh hưởng của thuốc tới tế bào đích và chỉ cần lượng nhỏ mẫu nghiên cứu

1.6 Vài nét về cây Rau đắng biển

Rau đắng biển có tên khoa học là Bacopa monnieri (Linn.) Pennell (tên khác

Herpetis monnieri (L.) H.B.K., Gratiola monniera L., Septas repens Lour., Bramia

indica Lamk., Bacopa monnieri (Linn.) Wettst.), họ Hoa mõm chó (Scrophulariaceae) Cây mọc hoang dại ở nhiều nơi như Ấn Độ, Sri Lanka, Đài Loan, Trung Quốc, các nước Đông Nam Á … Cây cũng được tìm thấy ở Hawaii, Florida và một số tiểu bang miền nam nước Mỹ Ở Việt Nam, cây có tên gọi Rau đắng biển, hay Rau sam trắng, Rau sam đắng, cây Ruột gà [1] Cây mọc ở ven bờ ruộng, đầm ngập nước ở nhiều vùng trung du và đồng bằng ở trên cả nước Cây Rau đắng biển được sử dụng như một loại thực phẩm có tính mát, lợi tiểu Cây cũng được dùng làm thuốc lợi tiểu, chữa ho, bổ thận, dùng ngoài đắp chữa đau nhức do tê thấp, kết hợp một số vị thuốc khác trong bài thuốc chữa rắn cắn Ở Ấn Độ, cây Rau đắng biển cũng được coi như cây thuốc truyền thống và được sử dụng như một vị thuốc bổ thần kinh, tăng cường trí nhớ, trị bệnh động kinh [1], [2]

Thành phần hóa học của cây Rau đắng biển gồm các saponin nhóm damaran là bacosid (A, B, C) và bacopasaponin (D, E, F) dựa trên phần genin bacogenin từ A1-A5, ngoài ra còn có hersaponin, monnierin; các alkaloid Brahmine, herpestin; flavonoid (luteolin-7-glucoside, glucoronyl-7-apigenin, glucoronyl-7-luteonin), phytosterol, luteonin, … Thành phần bacosid A đã được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với NMR (cộng hưởng từ hạt nhân), khối phổ Bốn thành phần chủ yếu được xác định bao gồm: bacosid A3 (1), bacopasid II (2), jujubogenin isomer của bacopasaponin C (3) và bacopasaponin C (4) [1], [2], [26], [58] Cấu trúc các thành phần Bacosia A được thể hiện ở hình 1.1 [26]

Hình 1.1 Cấu trúc các thành phần Saponin chính trong bacosid A

Cho tới nay, nhiều nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới đã được thực hiện nhằm kiểm chứng và nghiên cứu cụ thể hơn về những tác dụng dược lý từ những thành phần trong dịch chiết của cây rau đắng biển Tác dụng trên trí nhớ và nhận thức của cây rau đắng biển đã được nghiên cứu đã có một số kết quả nghiên cứu trên động vật thí nghiệm [3], [4], [54], [63], [71], [93], [96] và trên người [66], [82] [83], [90], [91], [92], [94]

Những nghiên cứu trên động vật cho thấy dịch chiết Rau đắng biển làm giảm thời gian trễ tới đích, giảm chiều dài đường đi ở thử nghiệm mê lộ Morris [54], [71], [93]; làm tăng khả năng phân biệt các đối tượng ở mô hình nhận diện đối tượng mới [74], [75]; làm tăng tỷ lệ thay đổi lựa chọn luận phiên ở mê cung chữ Y, chữ T [96]

[63]; giảm số sai lầm (bias) ở mô hình mô hình né tránh thụ động [96], … trên chuột bị gây mất trí nhớ Trên người, nhiều thử nghiệm lâm sàng (trong đó có những thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng quy mô lớn (vài trăm bệnh nhân/người tình nguyện khỏe mạnh), thời gian dài (từ 6, 8, 12 tuần) [18], [82], [83], [92], [94]), cho thấy sự cải thiện có ý nghĩa khi đánh giá bằng những bài kiểm tra như: thời gian hoàn thành đa nhiệm vụ (multitasking framework), nhận diện màu sắc, theo dõi trực quan [83], trên các thang Wechsler Memory Scale sửa đổi, Mini-Mental State Examination [82], hệ thống đánh giá trên máy tính CDR (CDR system) [90], [94] … so với nhóm chứng

Cơ chế tác dụng của các thành phần dịch chiết Rau đắng biển ở mức độ tế bào và phân tử vẫn đang được nghiên cứu Những nghiên cứu trên chuột suy giảm nhận thức cho thấy dịch chiết Rau đắng biển có tác dụng lên hệ thống glutamat và hệ cholinergic như: giảm hoạt động của các emzym acetyl cholinesterase trong tất cả các vùng não [88]; làm giảm sự thiếu hụt vesicular glutamate transporter type 1 (VGLUT1) ở hồi hải mã 1 (CA1) và 2/3 (CA2/3) ở mô hình chuột suy giảm nhận thức do tâm thần phân liệt [74], [75], tác dụng bảo vệ thần kinh trong sự thay đổi sự gắn thụ thể glutamat và làm thay đổi đáng kể biểu hiện gen của NMDA R1 và gen mgluR8 trong vùng hippocampus chuột động kinh [53], [73] Một số nghiên cứu cho thấy saponin Rau đắng biển và bacosid A ngăn ngừa sự xuất hiện của cơn động kinh do đó làm giảm sự suy yếu hoạt động của hệ GABAergic, suy giảm động cơ học tập và trí nhớ [48], [63], [64] Khi nghiên cứu về tác dụng chống oxi hóa của Rau đắng biển, kết quả cho thấy có sự suy giảm đáng kể các yếu tố oxy hóa cơ bản (nồng độ malondialdehyd, các gốc oxi hóa, hydroperoxid và carbonyls protein) trong cả tế bào chất và ty thể của tế bào tất cả các vùng não, đi kèm với tăng cường glutathion bị thiếu hụt, tăng nồng độ thiol và tăng hoạt động của các enzym chống oxy hóa (CAT, GPX, SOD) trên chuột khỏe mạnh (so với thuốc chứng) và trên chuột phơi nhiễm với nhiều tác nhân oxi hóa khác nhau (so với nhóm không phơi nhiễm) [12], [50], [76], [87], [88], [93] Cây Rau đắng biển còn được nghiên cứu tác dụng chống viêm thông qua khả năng ức chế LOX và COX-2, giảm giải phóng các

cytokin tiền viêm như IL-6, IL-1β, TNF-α và nitrit trong các tế bào đơn nhân trên

mô hình chuột bị gây viêm [86], [97], [98] Ngoài ra, nhiều thử nghiệm đã được thực hiện để đánh giá các tác dụng khác của thuốc như tác dụng chống trầm cảm thông qua ảnh hưởng lên hệ 5-HT(2C) [55], [56], tác dụng hạ đường huyết [35]…

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

- Mẫu thử: cắn phân đoạn n-butanol từ dịch chiết nước Rau đắng biển Bacopa

monieri (Linn.) Pennell thu thập ở Nghệ An, do Viện dược liệu trung ương cung

cấp

2.2 Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng cung cấp bởi Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương

+ Chuột dùng cho thí nghiệm đánh giá khả năng học tập của mẫu nghiên cứu: được nuôi ổn định ít nhất 1 tuần, đạt đến trọng lượng 23-25g trước khi tiến hành phẫu thuật

+ Chuột dùng cho thí nghiệm đánh giá tác dụng của mẫu nghiên cứu lên tế bào thần kinh nguyên phát: chuột nhắt trắng mang thai khoảng 18-19 ngày tuổi

2.3 Hóa chất, trang thiết bị

- Thuốc chuẩn: Tacrine do hãng Sigma cung cấp

- Hệ thống mê lộ nước Morris bao gồm:

+ Bể bơi: là một bể hình trụ, đường kính 1.1m và cao 30 cm Lượng nước trong

bể duy trì ở mức 15cm, nhiệt độ khoảng 200C trong suốt quá trình thí nghiệm Mê

lộ được đặt trong phòng kín, có đặt sẵn những hình ảnh định hướng không gian, những hình ảnh này không được thay đổi trong suốt quá trình thí nghiệm Một bến

đỗ hình trụ có đường kính 7,5 cm, trong suốt, đặt trong một góc ¼ của mê lộ

+ Camera được kết nối với máy tính và phần mềm phân tích kết quả dựa được thiết kế dựa trên phiên bản PanLab (Tây Ban Nha) do công ty phát triển dịch vụ công nghệ An Nhân cung cấp

- Bộ hóa chất tách và nuôi cấy tế bào (Hãng Gibco, Mỹ)

- Hóa chất khác: MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetrazolium bromide]; beta-amyloid 25-35 protein; trypan blue; dimethylsulfoxid (DMSO) đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cắn phân đoạn butanol chiết từ Rau đắng biển trên tế bào vỏ não nguyên phát gây độc bằng beta-amyloid

n-2.4.1.1 Phương pháp tách và nuôi cấy tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát

Nguyên tắc [17], [60], [61]:

Vỏ não tách từ một cơ thể sống (thường là chuột), xử lý bằng enzym và biện pháp cơ học nhằm phân cắt các mô liên kết thu được các tế bào thần kinh và một lượng nhỏ tế bào đệm riêng lẻ Bổ sung chất diệt tế bào đệm mà không làm ảnh

hưởng các tế bào thần kinh Nuôi cấy trong môi trường và điều kiện thích hợp

Quy trình tách và nuôi cấy tế bào thần kinh vỏ não phôi thai chuột nguyên phát gồm các bước cơ bản sau:

- Giết chuột mẹ mang thai khoảng 18-19 ngày tuổi

- Mổ tách vùng vỏ não, đặt vào môi trường nuôi cấy (môi trường Neuronbasal bổ sung 12% huyết thanh ngựa, 0,6% glucose, 200 mM L-glutamin và 1 µg/ml minomycin (được gọi là môi trường Glu (+))

- Bóc tách màng vỏ não và các mạch máu bám trên bề mặt

- Cắt nhỏ mô vỏ não, sau đó ủ với 2 ml trypsin 0,05 % (ở 37°C trong 15 phút) để phân tách các mô vỏ não, ly tâm thu được những hạt nhỏ

- Ủ với enzym deoxyribonuclease (100 U/ml DNase I trong 2 ml đệm phosphat)

để phân cắt acid deoxyribonucleic ngoài tế bào

- Lấy một ít huyền dịch tế bào, nhuộm bằng tripan blue và đếm trên kinh hiển vi

để xác định mật độ tế bào và khả năng sống sót của tế bào

- Tế bào được phân tán lại trong môi trường Glu (+) và chia vào 96 giếng (giếng được tráng poly-D-lysin) và nuôi cấy ở 37°C, trong môi trường không khí có chứa 10% khí CO2

- Thay môi trường Glu (+) bằng môi thường Glu (+) không có huyết thanh ngựa,

có bổ sung thêm B-27 (để hạn chế sự phát triển của tế bào thần kinh đệm) sau khi cấy 2 ngày/ lần

2.4.1.2 Đánh giá độc tính của mẫu thử trên tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát

Quy trình tiến hành:

- Cắn phân đoạn n-butanol Rau đắng biển được pha trong dimethylsulfoxid (DMSO)

- Ủ tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát đã được tách và nuôi cấy (ở trên) với

mẫu thử sao cho nồng độ mẫu thử cuối cùng trong các giếng nuôi cấy tế bào lần lượt là 50, 100, 200, 300, 400 μg/ml, tiếp tục nuôi cấy tế bào ở 37°C, trong môi trường không khí có chứa 10% CO2 Mỗi nồng độ mẫu thử được đánh giá trong 3 giếng, thí nghiệm được làm lặp lại 2 lần

- Sau 24 giờ, định lượng số lượng tế bào sống sót bằng kỹ thuật định lượng MTT

Nguyên tắc kỹ thuật định lượng MTT [60]: MTT là một muối tetrazolium hòa

tan trong nước có màu vàng nhạt Trong tế bào sống, enzym hydrogenase ở ty thể sẽ phân giải vòng tetratropium của MTT thành tinh thể formazal màu tím Hòa tan tinh thể bằng dung môi thích hợp Định lượng lượng chất phản ứng bằng đo độ hấp thụ

ánh sáng ở bước sóng 540nm Độ hấp thụ của dung dịch là một hàm chuyển đổi tỷ

lệ thuận với lượng tế bào sống

Tiến hành định lượng MTT trên các giếng tế bào thử độc tính của cắn phân đoạn n-butanol Rau đắng biển:

+ Bổ sung 20 µl MTT (nồng độ 5mg/ml, trong đệm muối natri phosphate) vào mỗi giếng tế bào

+ Tiếp tục ủ trong tủ nuôi cấy duy trì nhiệt độ 37°C, không khí có chứa 10% CO2 + Sau 2 giờ, hút loại bỏ môi trường, thêm vào 50µl DMSO vào mỗi giếng để hòa tan tinh thể Đo độ hấp thụ ánh sang ở bước sóng 550nm bằng máy ELISA

Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ tế bào sống sót sau nuôi cấy 24 giờ

- Dựa vào kết quả định lượng tế bào sống sót, chọn nồng độ mẫu thử thích hợp để tiếp tục đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gây độc bằng beta-amyloid

2.4.1.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cắn phân đoạn n-butanol

chiết từ Rau đắng biển trên tế bào vỏ não nguyên phát gây độc bằng βA 25-35

Nguyên tắc chung: Bổ sung mẫu thử ở nồng độ khác nhau vào môi trường

nuôi cấy tế bào thần kinh nguyên phát trước khi gây độc bằng beta amyloid (βA

25-35) Sau đó, tiến hành định lượng số lượng tế bào sống sót bằng kỹ thuật định lượng MTT

Quy trình tiến hành:

- Thí nghiệm được tiến hành trên tế bào vỏ não nguyên phát sau khi tách và nuôi

cấy 7 ngày Các giếng tế bào được chia thành 3 nhóm, mỗi nhóm 3 giếng (bảng 2.1):

Bảng 2.1 Phân nhóm thử khả năng sống sót sau gây độc tế bào bởi βA25-35

Chứng sinh lý DMSO 0.01%

Chứng bệnh lý DMSO 0.01% + βA 25-35

Thử Cắn BuOH Rau đắng biển 100µg/ml+ βA 25-35

- Chuẩn bị beta amiloid 25-35 (βA 25-35) kết tập: chuẩn bị dung dịch βA 25-35

trong nước vô khuẩn ở nồng độ 1mM và bảo quản ở - 200C Trước khi gây độc tế

bào, βA 25-35 được ủ ở 37°C trong 48 giờ để tạo βAP kết tập

- Cắn phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển được hòa tan trong DMSO và

bổ sung vào các giếng nuôi cấy tế bào đến nồng độ đã được chọn sau khi đánh giá độc tính (mục 2.4.1.2)

- Sau 15 phút, bổ sung βA 25-35 trực tiếp vào môi trường nuôi cấy của lô chứng

bệnh lý và lô thử thuốc để đạt được nồng độ cuối cùng là 10 µM và ủ trong tủ nuôi cấy đảm bảo nhiệt độ 37°C và không khí có chứa 10% CO2

- 48 giờ sau khi thêm βA 25-35, tiến hành định lượng tế bào sống sót ở các lô thí

nghiệm bằng định lượng MTT

+ Bổ sung 20 µl MTT (nồng độ 5mg/ml, trong đệm muối natri phosphate) vào

mỗi giếng tế bào

+ Tiếp tục ủ trong tủ nuôi cấy duy trì nhiệt độ 37°C, không khí có chứa 10% CO2trong 2 giờ

+ Hút loại bỏ môi trường, thêm vào 50µl DMSO vào mỗi giếng để hòa tan tinh thể Đo độ hấp thụ bằng đo quang ở bước sóng 550nm bằng máy ELISA

Thí nghiệm lặp lại 3 lần trong cùng điều kiện nghiên cứu

Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ tế bào sống sót của nhóm thử so với nhóm chứng