Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hợp chất steroid từ dịch chiết ethyl acetate cây thạch vĩ họ Dương xỉ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHAN THÚY HẰNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT STEROID TỪ DỊCH CHIẾT ETHYL ACETATE CÂY THẠCH VĨ Pyrrhosia lingua T

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHAN THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

HỢP CHẤT STEROID TỪ DỊCH CHIẾT

ETHYL ACETATE CÂY THẠCH VĨ (Pyrrhosia lingua

(Thunb.)Farwell) HỌ DƯƠNG XỈ (Polypodiaceae)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Ngành: Sư phạm Hóa học

Phú Thọ, 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHAN THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

HỢP CHẤT STEROID TỪ DỊCH CHIẾT

ETHYL ACETATE CÂY THẠCH VĨ (Pyrrhosia lingua

(Thunb.)Farwell) HỌ DƯƠNG XỈ (Polypodiaceae)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Ngành: Sư phạm Hóa học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS Triệu Quý Hùng

Trường Đại học Hùng Vương

Phú Thọ, 2017

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô bộ môn Hóa học, cùng các thầy

cô Khoa Khoa học Tự nhiên Trường Đại học Hùng Vương đã tận tình giúp

đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi về thời gian và tài liệu có liên quan trong suốt quá trình nghiên cứu giúp em hoàn thành khóa luận nhanh nhất và sớm nhất Nhân dịp này em xin bày tỏ sự cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo Trường Đại học Hùng Vương đã tạo cho em một môi trường học tập khoa học, nghiêm túc

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và các bạn sinh viên lớp K11 ĐHSP Hóa học - Trường Đại học Hùng Vương đã

hỗ trợ, động viên em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này!

Phú Thọ, ngày 12 tháng 05 năm 2017

Sinh viên

Phan Thúy Hằng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do lựa chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 3

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về chi Pyrrhosia 4

1.2 Đặc điểm thực vật loài Thạch vĩ 7

1.3 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Pyrrhosia 8

1.4 Sơ lược về lớp chất steroid 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị 13

2.2.1 Nguyên vật liệu 13

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp ngâm chiết 17

2.3.2 Phương pháp sắc ký 18

2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 18

2.3.2.2 Phương pháp sắc ký cột 20

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc 21

2.3.3.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 21

2.3.3.2 Phương pháp phổ hồng ngoại 23

2.3.3.3 Phương pháp phổ khối lượng 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết EtOAc cây Thạch vĩ 25

3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết EtOAc cây Thạch vĩ 26

3.2.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung môi 26

3.2.2 Quá trình phân lập các chất 28

3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

1 Kết luận 43

2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng

hưởng từ hạt nhân proton

13

C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng

hưởng từ hạt nhân carbon 13 DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer: Phổ DEPT

IS Infrared spectroscopy: Phổ hồng ngoại

ESI-MS ElectroSpray lonization Mass Spectrometry: Phổ khối lượng

m: multiplet dd: double doublet ddt: double double triplet

 Tên của các hợp chất được viết theo nguyên bản Tiếng Anh

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cây Thạch vĩ 7

Hình 1.2 Cấu tạo khung steroid 10

Hình 1.3 Quá trình sinh tổng hợp cholesterol 11

Hình 2.1 Cây Thạch vĩ (tại Lâm Thao) 13

Hình 2.2 Các dung môi thông dụng được sử dụng phân lập các hợp chất thiên nhiên 14

Hình 2.3 Máy cất quay chân không 14

Hình 2.4 Cột sắc ký với kích thước khác nhau 15

Hình 2.5 Bình sắc ký lớp mỏng Camag 15

Hình 2.6 Bộ chưng cất dung môi 16

Hình 2.7 Máy soi UV 16

Hình 2.8 Minh họa sắc ký lớp mỏng 19

Hình 2.9 Minh họa sắc ký cột 20

Hình 2.10 Độ chuyển dịch hóa học của proton và carbon 21

Hình 2.11 Sự tách vạch phổ 22

Hình 2.12 Ví dụ minh họa về phổ 13C-NMR của propane-1-ol 23

Hình 2.13 Đỉnh hấp thụ một số nhóm nguyên tử 24

Hình 2.14 Phổ ESI-MS của saccopetrin A 24

Hình 3.1 Ngâm mẫu Thạch vĩ 25

Hình 3.2 Cặn EtOAc Thạch vĩ 26

Hình 3.3 Kết quả khảo sát TLC cặn chiết EtOAc Thạch vĩ 27

Hình 3.4 TLC cặn EtOAc Thạch vĩ với hệ dung môi (III) 27

Hình 3.5 Cột tổng silica gel cặn EtOAc 29

Hình 3.6 Hình ảnh TLC các phân đoạn F1÷F7 31

Hình 3.7 Cột phân đoạn F2 32

Hình 3.8 Hình ảnh TLC các phân đoạn F2.1÷F2.9 34

Hình 3.9 Cột phân đoạn F2.9 35

Hình 3.10 Hình ảnh TLC các phân đoạn F2.9.1÷F2.9.8 36

Hình 3.11 Hình ảnh TLC điều chế phân đoạn 2.9.1 37

Hình 3.12 Hình ảnh TLC hiện màu bằng đèn tử ngoại 37

Hình 3.13 Sơ đồ phân lập dịch chiết EtOAc cây Thạch vĩ 38

Hình 3.14 Hình ảnh chất PLEA5 và sắc ký TLC 38

Hình 3.15 Cấu trúc của hợp chất PLEA5 39

Hình 3.16 Phổ ESI-MS của PLEA5 39

Hình 3.17 Phổ IR của PLEA5 40

Hình 3.18 Phổ 1H-NMR của hợp chất PLEA5 41

Hình 3.19 Phổ 13C-NMR của PLEA5 42

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Giá trị Rf và màu sắc các vệt chất trên bản mỏng 28

Bảng 3.2 Kết quả các phân đoạn thu được từ cột tổng EtOAc 29

Bảng 3.3 Kết quả các phân đoạn thu được từ phân đoạn F2 33

Bảng 3.4 Kết quả các phân đoạn thu được từ phân đoạn F2.9 36

MỞ ĐẦU

1 Lý do lựa chọn đề tài

Các hợp chất thiên nhiên là nguồn cung cấp các phân tử có sự đa dạng rất lớn về cấu trúc và hoạt tính sinh học Các cấu trúc khung phân tử do thiên nhiên sinh tổng hợp và sắp xếp các nhóm chức trong các cấu trúc này cho phép chúng ta dự đoán về sự phát triển và hình thành của các cấu trúc phân tử trong quá trình tiến hoá của thực vật, động vật và vi sinh vật để tạo ra một hiệu quả tối ưu trong sự điều chỉnh các chức năng sinh học.Hơn nữa, các hợp chất có hoạt tính sinh học được tìm thấy từ thiên nhiên có thể dùng trực tiếp trong y học, nhiều hợp chất khác được dùng như chất dẫn đường(lead compound)hoặc phân tử hiện đại cho tổng hợp và bán tổng hợp thuốc Việc

sử dụng sản phẩm thiên nhiên đóng vai trò là nguồn hợp chất dẫn đường làm phong phú, đa dạng về cấu trúc của hợp chất tổng hợp và bán tổng hợp thuốc Hiện nay, các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên đóng góp 30% số lượng thuốc trên thị trường thế giới và đó cũng là tỷ lệ đối với các hợp chất đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng Theo thống kê thì ít nhất có 119 hợp chất bắt nguồn từ 90 loài cây có thể được xem là các thuốc quan trọng được

sử dụng ở một hay nhiều nước Các thuốc chống ung thư có nguồn gốc từ thiên nhiên đang được sử dụng trong điều trị như vincristin (Oncovin®), một vinca alkaloit từ Catharanthus roseus G Don (Apocynaceae), etoposit một dẫn xuất bán tổng hợp của podophyllotoxin có trong thành phần của cây Podophyllum peltatum L (Berberidaceae), paclitaxel (Taxol®), hợp chất taxan diterpenoit từ Taxus brevifolia L (Taxaceae), và các dẫn xuất irinotecan, topotecan của camptothecin, alkaloit được phân lập

từ Camptotheca accuminata Decne (Nyssaceae), hay thuốc chống sốt rét artemisinin từ Artemisia annua L (Asteraceae) là những hợp chất minh họa điển hình Nhu cầu điều trị các loại bệnh khác nhau, cùng với hiện tượng

kháng thuốc trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, ung thư, thúc đẩy các nhà nghiên cứu phát hiện các tác nhân điều trị mới với cơ chế tác dụng mới

Nguồn sinh vật, đặc biệt là các cây thuốc cổ truyền, vẫn tiếp tục là mối quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, vì tính đa dạng của chúng thường hứa hẹn sự phong phú của các chất hóa học với cấu trúc mới lạ Tiềm năng của thực vật bậc cao là nguồn cung cấp dược phẩm mới nhưng chỉ được khảo sát bước đầu Trong số các sinh vật thì chỉ một tỷ lệ phần trăm nhỏ đã được nghiên cứu về mặt hóa học thực vật, và chỉ một phần nhỏ hơn nữa được đưa vào các nghiên cứu sàng lọc sinh học và dược lý học

Việt Nam nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có một hệ thực vật vô cùng phong phú, đa dạng và là một nguồn tài nguyên thiên nhiên

vô cùng quý giá có gần 10.000 loài thực vật bậc cao, 800 loài rêu, 600 loài nấm và hơn 2.000 loài tảo Trong đó có trên 3.200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian Do tầm quan trọng của chúng nên trong những năm gần đây việc nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên thiên nhiên được đẩy mạnh; hiệu quả của các nghiên cứu cũng được nâng cao, nhờ cách tiếp cận đa ngành (hoá học, sinh học, dược lý học, và y học lâm sàng) cùng với việc phát triển các phương pháp chính xác cao trong phân tích, phân tách và phân lập nhanh, các phương pháp hiện đại xác định cấu trúc các hợp chất thiên nhiên và các phương pháp thử nghiệm sinh học cho phép sàng lọc nhanh với số lượng lớn các mẫu Việc áp dụng rộng rãi quy trình phân tách các hỗn hợp chất được định hướng thông qua việc sàng lọc hoạt tính sinh học, cũng như việc có được chiến lược tốt trong việc lựa chọn các loài sinh vật cho nghiên cứu nhằm phát hiện tác nhân có hoạt tính mới cũng đóng vai trò quan trọng [9]

Chi Pyrrhosia ở Việt Nam có 17 loài và các loài này đã được sử dụng

trong y học cổ truyền mở ra tiềm năng nghiên cứu hóa thực vật về các loài này [1]

Dựa trên các tài liệu tham khảo cho thấy đến nay vẫn chưa có nhiều công trình khoa học trong và ngoài nước công bố chi tiết về thành phần hóa học của cây Thạch vĩ Nhằm mục tiêu kế thừa và tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên từ các loài thực vật của Việt Nam, chúng tôi lựa chọn đề tài khóa luận

tốt nghiệp“Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hợp chất steroid từ

dịch chiết ethyl acetate cây Thạch vĩ (Pyrrhosia lingua (Thunb.) Farwell)

họ Dương xỉ (Polypodiaceae)”

2 Mục tiêu của đề tài

- Điều chế cặn dịch chiết EtOAc (ethyl acetate) của cây Thạch vĩ

- Phân lập chất sạch từ các phân đoạn của dịch chiết EtOAc cây Thạch

+ Cho biết thành phần hóa học của cây Thạch vĩ

+ Cung cấp dữ liệu về phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng của một số hợp chất thiên nhiên được phân lập từ cây Thạch vĩ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về chi Pyrrhosia

Về thực vật, chi Pyrrhosia thuộc họ Dương xỉ (Polypodiaceae) ở dạng ổ

túi bào tử tròn hoặc thuôn và xếp thành nhiều hàng, chéo gốc với gân giữa và gần sát vào nhau, phủ kín gần mặt dưới của phiến lá Có hai loại lông hình sao, đều có cuống dài

Chi Pyrrhosia gồm khoảng 100 loài, chủ yếu ở vùng ôn đới và nhiệt đới,

một số ít loài mọc ở châu Phi và Australia Ở Việt Nam có 17 loài, một số loài được sử dụng làm thuốc trong y học dân gian [1]

Pyrrhosia clavata (Baker) Ching – Ráng tai chuột Cây cao 25-60 cm;

thân rễ to và ngắn, nằm ngang và hướng lên, phủ vẩy hình tam giác Lá đồng hình, gốc cuống lá có nhiều vẩy màu vàng nâu Ổ túi bào tử phủ kín mặt dưới

lá Lông hình sao, màu nâu nhạt Loài của Trung Quốc, Lào và Việt Nam Cây mọc bám trên đá dưới tán rừng, hoặc bám trên cây gỗ, trên vách đá trong rừng và ven rừng, thường ở độ cao 400-1750 m Toàn cây được dùng ở Vân Nam (Trung Quốc), làm thuốc trị cảm nhiễm đường tiết niệu, sỏi niệu đạo, viêm thận thủy thũng, ho thổ huyết, viêm hạch limphô, ngoại thương xuất huyết và bỏng lửa

Pyrrhosia lanceolata (L.) Farw [P Adnascens(Sw.) Ching] – Ráng tai

chuột thường, Lưỡi mèo tai chuột Dương xỉ phụ sinh, có thân rễ nhỏ mọc bò, dài, mang vẩy màu nâu nhạt hay hơi trắng Có hai loại lá, lá không sinh sản màu lục, hình dạng như tai chuột và lá sinh sản mang các túi bào tử màu nâu

ở mặt dưới lá, hình dải dài nom như lưỡi mèo Phân bố ở Nam Trung Quốc và các nước nhiệt đới châu Á Ở nước ta, cây mọc phổ biến ở các miền núi, trung

du và đồng bằng Thường bám trên các cây gỗ, trên vách đá dưới tán rừng ở

độ cao 100-1700 m Có khi gặp cả ở bờ tường, mái nhà Dân gian dùng toàn cây đem về phơi trong râm, sau đó sao lên sắc nước uống chữa trẻ em suy dinh dưỡng, bụng ỏng, lưng eo, thường đi ỉa ra phân xanh, đầu ngón tay mòng mọng nước

Pyrrhosia lingua (Thunb.) Farw – Thạch vĩ, Ráng tai chuột lưỡi dao

Cây thảo sống nhiều năm, cao 10-30 cm, có thân rễ bò dài mang vẩy thon, mép gợn sóng Cuống 2-10 cm, mảnh, có đốt ở gốc, phiến hơi đa dạng, tròn dài, nhỏ hay hẹp thon, dài 8-18 cm, rộng 2-5 cm, dai, gân phụ rõ, mặt trên cây gần như không lông, mặt dưới có lông hình sao vàng hoe Ổ túi bào tử phủ kín mặt dưới, màu đỏ đậm; bào tử xoan, nâu nhạt Phân bố ở Nhật Bản, Đài Loan, Nam Trung Quốc và Việt Nam Ở nước ta, gặp nhiều nơi từ Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Phú Thọ, Hà Tây, đến Thừa Thiên-Huế và Lâm Đồng Cây phụ sinh trên thân cây và bám trên đá trong rừng ở độ cao 100-1800m

Có nơi cây mọc thành những đám rất lớn Người ta đã biết trong lá có phytosterol, tanin pyrocatechic, những đường khử ôxy, các chất béo và các chất vô cơ; còn có diplopten, β-sitosterol Dân gian dùng cây, lá làm thuốc lợi tiểu chữa bệnh đái buốt, đái dắt, viêm niệu đạo, đái ra máu, đái ra sỏi nhưng khi dùng phải bỏ những lông trên lá Thân rễ còn được dùng chữa bệnh than, ung nhọt, lở loét, ngộ độc do lưu huỳnh hoặc dùng khô tán bột trộn với dầu vừng bôi lên đầu cho tóc đen và làm cho tóc mọc nhanh Ở Trung Quốc, toàn cây và lá được dùng trị viêm thận thủy lũng, viêm nhiễm đường niệu, viêm phế quản, viêm bàng quan, suyễn khan, phổi có mủ, khạc ra máu, đái ra máu, đại tiện ra máu, băng lậu và bế kinh Thường dùng dạng thuốc sắc Còn dùng ngoài chữa ngoại thương xuất huyết

Pyrrhosia mollis (G Kunze) Ching – Ráng tai chuột mềm, Thạch vĩ

lông mềm Cây cao 15-30 cm, thân rễ bò dài, phủ vẩy hình khiên, hai màu (giữa nâu thẫm, mép vàng nhạt) Lá xanh thẫm và mỏng, mặt lá phủ lông mềm hình sao Ổ túi bào tử phân bố khắp mặt dưới phiến lá; bào tử khá lớn,

bề mặt có hạt nhỏ Phân bố ở Trung Quốc và nhiều nước nhiệt đới châu Á: Ấn

Độ, Mianma, Lào, Việt Nam, Inđônêxia, Philippin Ở nước ta, có gặp tại Lào Cai (Sa Pa), Lâm Đồng ( Đà Lạt) Cây mọc chủ yếu trong rừng ẩm và bóng ở

độ cao 200-2300 m trên mặt biển Toàn cây được dùng làm thuốc Ở Vân Nam (Trung Quốc), cây được dùng trị viêm bể thận, viêm bàng quang, sỏi

niệu đạo gây bí tiện, mắt quáng gà, đòn ngã tổn thương xuất huyết và thủy thũng

Pyrrhosia petiolosa (Christ) Ching – Ráng tai chuột cống, Thạch vĩ lá có

cuống Cây sao 5-10 cm; thân rễ phủ vẩy một màu Là có cuống, thường dài 15-17 cm; mặt trên lá không có lỗ thoát nước, lông trên lá tồn tại rất lâu Ổ túi bào tử ở dưới phiến lá, thường ở 1/3 về phía đỉnh Loài của Trung Quốc và Việt Nam Ở nước ta, có gặp tại rừng Vĩnh Phúc (Tam Đảo) Cây thường mọc bám trên đá, trên các cây thân gỗ trong rừng vùng núi từ 250–2200 m Toàn cây được dùng làm thuốc Ở Vân Nam (Trung Quốc), được dùng trị bệnh đường tiểu tiện, đi tiểu ra máu, sỏi niệu, viêm thận, băng lậu, lỵ, ho do phổi nóng, viêm khí quản mãn tính, vết thương do dao kiếm, mụn nhọt

Pyrrhosia piloselloides (L.) M G Price [Drymoglossum piloselloides

(L.) C Presl]- Ráng tai chuột vẩy ốc Dương xỉ nhỏ phụ sinh có thân rễ bò dài, to cỡ 1mm, có vẩy nâu; vẩy hình mũi mác rất nhọn, hẹp và dài Lá hơi cách nhau, dị hình: lá không sinh sản bầu dục hay thuôn, dày, cuống có đốt ở gốc; lá sinh sản hẹp, mang ổ bao tử thành hai dải dài, có sợi bên hình sao Phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam, Inđônêxia , Philippin và Irian Ở nước ta, có gặp từ Lạng Sơn, Lào Cai, Quảng Bình, Quảng Nam, Bình Định tới Khánh Hòa và Lâm Đông Cây mọc trên vỏ cây gỗ trong rừng vùng núi Ở Trung Quốc, toàn cây được dùng làm thuốc chữa hoàng đản, phong thấp tê đau, viêm tuyến mang tai, viêm hạch limphô, ghẻ lở, đòn ngã tổn thương và ngoại thương xuất huyết

Pyrrhosia porosa (C Presl) Hovenkamp var tonkinensis (Giesenh.)

Hovenkamp [P tonkinensis (Giesenh.) Ching] – Ráng tai chuột Bắc, Thạch vĩ

Bắc Bộ Thân rễ bò; vẩy màu nâu nhạt, hình ngọn giáo, gốc hình lọng, đầu ngọn hẹp lại thành sợi, sẫm hơn ở trung tâm Lá xếp khá sít nhau, hình dải, dài tới 30 cm, rộng 0,5-1 cm, hơi thắt dọc cuống lá; cuống lá có cánh tới thân rễ; phiến lá cuộn lại, dai, mặt trên phiến gần trần, mang vài lông hình sao, mặt dưới mang một lớp lông dày màu hơi xám, những lông hình sao có cánh cứng

và dày Ổ túi bào tử phủ nhận phần cuối cùng của phiến, tạo thành những

nhóm xiên gồm 2-3 hàng ổ túi Bào tử hình trái xoan, màu vàng Loài của Bắc Việt Nam và Nam Trung Quốc Ở nước ta, có gặp tại Hà Tây (Ba Vì), Lào Cai (Sa Pa) và Ninh Bình (Cúc Phương) Cây mọc bám trên cây to, trên đá trong rừng núi đá ở nới khô ráo Ở Trung Quốc, lá cây được dùng làm thuốc trị bệnh lậu và ho do phổi nóng

Pyrrhosia sheareri (Baker) Ching – Ráng tai chuột Shearer, Thạch vĩ

cụt Cây thảo sống nhiều năm cao 30- 36 cm, có thân rễ mọc bò, ngắn, mang nhiều rễ và vẩy thon Lá đính gần nhau; cuống dài đến 20 cm, trần, nhẵn, có đốt ở gốc; phiến dài 15- 30 cm, rộng 3-7 cm; gốc lõm một bên, mặt trên có các lỗ nước (thủy khổng) và vài lông hình sao, mặt dưới đầy lông hình sao màu gạch Các ổ túi khít nhau, sau hòa vào nhau Loài của Nam Trung Quốc

và Bắc Việt Nam Ở nước ta có gặp tại Lai Châu, Lào Cai, Ninh Bình Cây thường mọc trên đá và trên thân cây gỗ trong rừng ẩm vùng núi ở độ cao 500-

2290 m Toàn cây được dùng làm thuốc thanh nhiệt, lợi niệu, thông lâm; cũng dùng như Thạch vĩ để trị bệnh lậu, đái ra máu, sỏi niệu, viêm thận, băng lậu,

lỵ, ho do phổi nóng, viêm khí quản mạn tính, nhọt có mủ vàng …

1.2 Đặc điểm thực vật loài Thạch vĩ

Cây Thạch vĩ (Pyrrhosia lingua (Thunb.) Farwell.) có dạng cây thảo

sống nhiều năm, cao 10–30 cm, có thân rễ bò dài mang vẩy thon, mép gợn sóng Cuống 2–10 cm, mảnh, có đốt ở gốc; phiến hơi đa dạng, tròn dài, nhỏ hay hẹp thon, dài 8–18 cm, rộng 2–5 cm, dai, gân phụ rõ, mặt trên gần như không lông, mặt dưới có lông hình sao vàng hoe

Hình 1.1 Hình ảnh cây Thạch vĩ

Ổ bào tử phủ kín mặt dưới, màu đỏ đậm; bào tử xoan, nâu nhạt

Cây phụ sinh trên thân cây và bám trên đá trong rừng ở độ cao 100 – 1800m Có nơi cây mọc thành những đám rất lớn

Người ta đã biết trong lá có phytosterol, tanin pyrocatechic, những đường khử oxy, các chất béo và các chất vô cơ, còn có diplopten, β-sitosterol Dân gian dùng cây, lá làm thuốc lợi tiểu chữa bệnh đái buốt, đái dắt, viêm niệu đạo, đái ra máu, đái ra sỏi, nhưng khi dùng phải bỏ những lông trên lá

Thân rễ còn được dùng chữa bệnh than, ung nhọt, lở loét, ngộ độc do lưu huỳnh hoặc dùng khô tán bột trộn với dầu vừng bôi lên đầu cho tóc đen và làm cho tóc mọc nhanh

Ở Trung Quốc, toàn cây và lá được dùng trị viêm thận thủy thũng, viêm nhiễm đường niệu, viêm phế quản, viêm bàng quang, suyễn khan, phổi có mủ, khạc ra máu, nôn ra máu, đái ra máu, đại tiện ra máu, băng lậu và bế kinh Loài thực vật này thường dùng dạng thuốc sắc Còn dùng ngoài chữa ngoại thương xuất huyết [1]

1.3 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Pyrrhosia

Dựa trên các tài liệu tham khảo cho thấy đến nay vẫn chưa có nhiều công trình khoa học trong và ngoài nước công bố chi tiết về thành phần hóa học của cây Thạch vĩ

Theo Từ điển thực vật thông dụng của tác giả Võ Văn Chi chỉ ra cho

thấy cây Thạch vĩ có chứa triterpenoid diploptene (1), steroid β–sitosterol (2)

[1]

Năm 1997, tác giả Kazuo Masuda và cộng sự đã phân lập từ thân và rễ cây Thạch vĩ Pyrrosia lingua năm hợp chất triterpenoids: 22,28-epoxyhopane

(3); 22,28-epoxyhopan-30-ol (4); hopane-22,30-diol (5); hop-22(29)-en-30-ol (6); hop-22(29)-en-28-ol (7) [12]

Gần đây, năm 2016 nhóm tác giả Bùi Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Sang

đã bước đầu công bố thành phần hóa học cây Thạch vĩ của Việt Nam Trong

đó từ các dịch chiết EtOAc, n-Hexane đã phân lập được hỗn hợp β–sitosterol

và stigmasterol (8) [2]; hopane-22-ol (9) [5]

1.4 Sơ lược về lớp chất steroid

Steroid có cấu tạo gồm 3 vòng 6 cạnh và 1 vòng 5 cạnh tiếp giáp với nhau Nhiều steroid có 2 nhóm methyl góc ở vị trí hai vòng tiếp giáp với nhau [14]

Hình 1.2 Cấu tạo khung steroid

Hai vòng tiếp giáp với nhau theo kiểu của cis-Decalin và trans-Decalin

Một trong các steroid được biết đến sớm nhất là cholesterol (10) Hợp

chất này được phân lập lần đầu tiên vào năm 1770 nhưng mãi đến tận những năm 1920 mới xác định được cấu trúc của nó [14]

Quá trình sinh tổng hợp cholesterol đã được xác định đi từ chất đầu là một triterpene squalene

Hình 1.3 Quá trình sinh tổng hợp cholesterol

Nhiều hợp chất steroid trong thiên nhiên là các hormone như hormone

giới tính nam testosterone (11), androsterone (12); hormone giới tính nữ estradiol (13), estrone (14) [13], [14]

Các hợp chất steroid có chứa thêm một số nhóm chức như OH, C=O,

ester, gắn vào hệ 5 vòng nên ít phân cực do vậy dễ tan trong n-hexane,

dichloromethane, ethyl acetate [4]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây Thạch vĩ được thu hái tại Thị trấn Lâm Thao – Huyện Lâm Thao – Tỉnh Phú Thọ vào tháng 6/2015 Tên cây được xác định bởi nhà thực vật học

Đỗ Văn Hài Mẫu tiêu bản kí hiệu QHT-02 được lưu giữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hình 2.1 Cây Thạch vĩ (tại Lâm Thao)

2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.2.1 Nguyên vật liệu

Dung môi được sử dụng như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH, acetone đều là các hóa chất kỹ thuật của Việt Nam, Trung Quốc được chưng cất lại trước khi sử dụng

Hình 2.2 Các dung môi thông dụng được sử dụng phân lập các hợp chất

thiên nhiên

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

Quá trình ngâm chiết được thực hiện trong các bình thủy tinh có dung tích 5 lít Sau quá trình ngâm chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cất quay chân không IKA®RV 10 của Anh

Hình 2.3 Máy cất quay chân không

Việc tinh chế các hỗn hợp sản phẩm được thực hiện bằng sắc ký cột siica gel và sắc ký lớp mỏng Với sắc ký cột silica gel thì tùy vào lượng mẫu chất ta

sử dụng các cột sắc ký có kích cỡ khác nhau: 1; 2; 2,5; 4; 10 Chất nhồi cột sắc ký là silica gel 60 (0,063–0,200 mm) (70–230 mesh astm) đều là của Merck còn sắc ký lớp mỏng sử dụng bình sắc ký lớp mỏng Camag của Đức và bản mỏng sắc ký tráng silicagel 60 F254 trên tấm nhôm 20 × 20 cm của Đức

Hình 2.4 Cột sắc ký với kích thước khác nhau

Hình 2.5 Bình sắc ký lớp mỏng Camag

Dung môi được chưng cất trước khi sử dụng bằng bộ chưng cất dung môi của hãng IKA

Hình 2.6 Bộ chưng cất dung môi

Hiện màu dưới bước sóng UV 254, 366 nm được thực hiện trên hệ thống đèn UV CAMAG

Hình 2.7 Máy soi UV

Ngoài ra còn có bếp điện, cân phân tích, máy siêu âm, máy sấy, các bình cầu đáy tròn, bình cầu đáy quả nhót, bình nón, cốc thủy tinh, bát sứ, giấy lọc, phễu lọc, các ống đong chia độ lần lượt theo các thể tích V = 5ml, 10ml,100ml, 200ml; pipet Pasteur,…

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp ngâm chiết

Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp có độ

phân cực tăng dần (n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH, …) ngâm mẫu rồi lọc Dung dịch qua lọc được chưng cất dưới áp suất giảm ở nhiệt độ khoảng 30-

45oC [4]

Kĩ thuật chiết ngâm dầm: Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy

tinh hoặc bằng thép không gỉ, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa

vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó

có chứa trong cây

Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xỉ bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau

đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ

có được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình

bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài)

Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi

cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa,

không thể hòa tan thêm được nhiều hơn; có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian

Nhắc lại quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi

Dung môi sau khi được thu hồi, được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau [4]

2.3.2 Phương pháp sắc ký

Sự sắc kí là một phương pháp vật lí để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh)

- Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumi hoặc silicagel đã được xử lý, nó

có thể được nạp nén vào trong một cột, hoặc được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên trên bề mặt một tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm nhựa

- Pha tĩnh là chất lỏng: Có thể là một chất lỏng tẩm lên trên bề mặt một chất mang rắn hoặc một chuỗi dây carbon dài được gắn lên trên chất mang rắn [4]

2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ,

ví dụ như: silicagel hoặc oxid alumin Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic [4]