So sánh trình tự gen GmDREB2 phân lập từ một số giống đậu tương trồng phổ biến ở miền bắc việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐINH THỊ HƯNG SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG TRỒNG PHỔ BIẾN Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SIN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐINH THỊ HƯNG

SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ

MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG TRỒNG PHỔ BIẾN Ở

MIỀN BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2014

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐINH THỊ HƯNG

SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB2 PHÂN LẬP

TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG TRỒNG PHỔ BIẾN

Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên – 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn là do tôitìm hiểu dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu

Các số liệu và kết quả trình bàytrong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trìnhnào Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Đinh Thị Hưng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tìnhhướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoànthành Bản luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS , ThS

các thầy cô Bộ môn Di truyền học & Sinh họchiện đại, khoa Sinh – K , Trường Đại học Sư phạm - Đạihọc Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quátrình thực hiện

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trưởng Khoa Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái NguyênTS

khoa-đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn

bè và đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tác giả

Đinh Thị Hưng

3

Trang phụ bìa

MỤC LỤC

Trang

i Lời cam đoan ii Mục

lục iii

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt .vi Danh mục các bảng vii Danh mục các hình viii MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG

3 1.1.1 Cây đậu tương 3

1.1.2 Tác động của hạn đến cây đậu tương 11

1.1.3 Đặc điểm sinh học của cây đậu tương 4

1.1.4 Giá trị kinh tế của cây đậu tương 6

1.1.5 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam 7

1.2 GEN DREB VÀ DREB2 Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 13

1.2.1 Gen DREB 13

1.2.2 DREB2 và gen GmDREB2 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 21

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 21

2.1.2 Hoá chất và thiết bị 22

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 22

Số hóa bởi Trung tâm Học http://www.lr c -tnu ed u vn/

2.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử 22

2.2.2 Phương pháp phân tích xử lý trình tự gen 30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 KẾT QUẢ 2 TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CBD và DVN5 31

3.1.1 Kết quả nhân gen DREB2 31

ả GmDREB2 32

3.2 SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN DREB2 VÀ TRÌNH TỰ 36

GmDREB2 36

3.2.2 So sánh trình tự ống đậu tương CBD, DVN5 vớ ố AAY89658 40

3.2.3 Kết quả so sánh vùng AP2 của protein DREB2 ở một số giống đậu tương nghiên cứu 41

3.3 SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO 42

3.3.1 Kết quả so sánh trình tự gen DREB2 giữa một số giống đậu tương Việ 054363 42

3.3.2 So sánh trình tự amino acid suy diễn của một số giống đậu tương Việ 89658 45

3.3.3 Kết quả so sánh vùng AP2 của protein DREB2 ở ống đậu tương CBD, DVN5, BG, 89658 46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

1 KẾT LUẬN 48

2 ĐỀ NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA Abscisis acid

bp Cặp base

Cs Cộng sự

cDNA Complementary DNA( Sợi DNA bổ sung được tổng hợp từ

RNA thông tin nhờ enzym phiên mã ngược)

DREB Dehydration- Responsive Element Binding

EDTA Ethyen Diamin Tetraacetic Acid

Số hóa bởi Trung tâm Học http://www.lr c -tnu ed u vn/

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bả , ản lượng đậ ệ

Trang

9

Bảng 2.1 Nguồn gốc của các giống đậu tương nghiên cứu 21

2.2 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 24

Bảng 2.3 Thành phần của phản ứng PCR nhân gen DREB2 25

Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen DREB2 25

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng colony – PCR 28

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR 29

Bảng 3.1 Các vị trí sai khác giữa trình tự đoạn gen GmDREB2 của hai giống đậu tương CBD và DVN5 với gen GmDREB2 có mã số DQ054363 39

Bả ữa trình tự Bả ữa trình tự Gm 89658 41

89658 42

42

Bả ữa trình tự đoạn genGmDREB2 của các giống đậu tương Việ ự có mã số DQ054363 44

Bảng 3.6 ữa trình tự amin Bảng 3.7 ữa trình tự 89658 46

tương Việ 89658 47

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Sơ đồ mô tả gen và vùng mã hóa của gen GmDREB2 ở cây đậu tương

18 Hình 1.2 Sơ đồ mô tả protein DREB2 ở đậu tương 19

Hình 1.3 Trình tự amino acid của vùng AP2 trong protein DREB2 ở đậu tương

19 Hình 2.1 Hạt của hai giống đậu tương nghiên cứu 21

ệ ản phẩ Gm i giống đậ 32

ệ ản phẩm PCR tinh sạch 33

34

Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc 35

Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen GmDREB2 36

Hình 3.6 Trình tự đoạn gen DREB2 của hai giống đậu tương nghiên cứu và giống đậu tương trên GenBank có mã số DQ054363 38

Hình 3.7 tương nghiên cứ 89658 40 Hình 3.9 Gm Hình 3.10 89658 41 054363 44

89658 45

89658 47

1

1 Đặt vấn đề

MỞ ĐẦU

Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill ) là loại cây trồng thuộc họ

đậu, một trong các loại cây công nghiệp ngắn ngày có vai trò quan trọngkhông chỉ về mặt kinh tế và dinh dưỡng mà còn trong việc cải tạo đất Hạtđậu tương có hàm lượng protein cao, từ 20-45%, dễ tan và chứa hầu hết cácloại acid amin, đặc biệt là các loại amino acid không thay thế Ngoài ra, ở rễcây đậu tương có các nốt sần, đó là kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn

Rhizobium japonicum với rễ tạo khả năng cố định nitơ trong không khí Vì

vậy, đậu tương là loại cây trồng có tác dụng cải tạo đất, làm cây trồng vụ sauphát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh, chống ô nhiễm môitrường do lạm dụng phân bón và thuốc trừ sâu [6]

Việt Nam là nước nông nghiệp nhiệt đới, cây đậu tương được trồng với

ba mục đích giải quyết vấn đề thiếu protein cho người và gia súc, xuất khẩu

và cải tạo đất Trong những năm gần đây do biến đổi khí hậu toàn cầu, hạnhán xảy ra thường xuyên làm cho đất nông nghiệp bị hoang hóa, tác động xấuđến sự sinh trưởng, phát triển, làm giảm năng suất và sản lượng cây trồng.Đặc biệt đậu tương là loại cây trồng thuộc nhóm cây chịu hạn kém Bên cạnh

kỹ thuật canh tác, ảnh hưởng của sâu bệnh và giống thì hạn hán xảy ra là mộttrong những nguyên nhân làm giảm khả năng sinh trưởng, phát triển, giảmnăng suất, chất lượng hạt, vì vậy chọn giống đậu tương theo định hướng vềtăng cường khả năng chịu hạn cao hoặc cải thiện đặc tính chịu hạn của câyđậu tương là yêu cầu thực tiễn đặt ra cho ngành nông nghiệp nói chung vàngành sản xuất đậu tương nói riêng

Đặc tính chịu hạn của là tính trạng đa gen, trong đó cónhóm gen mà sản phẩm của chúng liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện của

đặc tính chịu hạn và nhóm gen ản phẩm có chức năng điều hòa biểu hiện của nhóm gen chống chịu Protein DREB là nhân tố phiên mã

năng kích hoạt nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của thực vật nói chung

và của cây đậu tương nói riêng DREB là một họ protein được tổng hợp

hạn, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp Tuy protein DREB không trực tiếp tham gia vào quá trình kháng hạn nhưng nó giữ vai trò là nhân tố kích thích đồng thời sự biểu hiện của các gen liên quan đến khả năng chịu hạn của cây Ch nh vì vậy, phân lập và nghiên cứu đặc điểm của gen DREB sẽ cung cấp thông tin và tạo nguyên liệu phục vụ tạo cây chuyển gen nhằmcải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương là vấn đề đang được quan tâm nghiên cứu

Từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “So sánh

trình tự gen GmDREB2 phân lập từ một số giống đậu tương trồng phổ

biến ở miền Bắc Việt Nam”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được sự sai khác trong trình tự gen DREB2 và protein suydiễn phân lập từ một số giống đậu tương trồng ở miền Bắc Việt Nam

3 Nội dung nghiên cứu

(i) Nhân gen, tách dòng và xác định trình tự gen GmDREB2 từ hai mẫu đậu

tương nghiên cứu;

(ii) So sánh trình tự gen GmDREB2 đã phân lập, trình tự amino acid suy diễn

và vùng AP2 của protein DREB2 hai với các trình tựcông bố

(iii) So sánh trình tự GmDREB2 đã phân lập, trình tự amino acid suy diễn và

vùng AP2 của protein DREB2 vớ ố

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU

TƯƠNG 1.1.1 Cây đậu tương

Cây đậu tương, là loại cây trồng có lịch sử lâu đời nhất Nhiều bằngchứng về lịch sử và khảo cổ học cho thấy đậu tương có nguồn gốc từ vùngMãn Châu-Trung Quốc, được thuần hoá ở Trung Quốc từ các Triều đại Phongkiến, có thể trong triều đại Shang (1700 – 1100 B.C) Từ Trung Quốc cây đậutương đã lan rộng và được trồng trên khắp thế giới Vào khoảng 200 nămtrước Công nguyên, đậu tương được đưa sang trồng ở Triều Tiên, Nhật Bản

và mãi đến năm 1954 mới được đưa trồng ở Mĩ Ở Việt Nam đậu tương đượcbiết đến sớm, từ thời Hùng Vương “cư dân Văn Lang đã biết trồng khoai vàđậu nành” [1], [4]

Đậu tương hay còn gọi là đậu nành, tên khoa học Glycine max (L.)

Merill (2n= 40) thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae)(Hymowitz và Newell, 1981) Các giống đậu tương trồng ở Việt Nam thuộc

loài Glycine max (L.) Merill (2n= 40) trong giống phụ G.Soya, giống Glycine

thuộc họ đậu (Lengunoceace) họ phụ cánh bướm (Papilinoideae) Đối với đậutương có thể phân loại theo đặc điểm thực vật học, dựa vào thời gian sinhtrưởng, theo thời vụ Hiện nay đậu tương được trồng ở Việt Nam có hainguồn gốc, đó là các giống địa phương và các giống nhập nội

Cây đậu tương là loại cây thân thảo có giá trị kinh tế cao, quan trọngbậc nhất trong các cây họ Ðậu Để có vị trí như vậy là nhờ đậu tương có

những đặc tính ưu việt hơn những giống đậu khác, đó là: Hàm lượngprotein, lipid cao và chứa nhiều loại vitamin ….Các sản phẩm rất quen

thuộc của đậu tương như đậu phụ, tương, dầu ăn có vai trò hết sức quantrọng trong đời sống hàng ngày của con người Gần đây các nhà khoa học

đã nghiên cứu và phát hiện đậu tương có vai trò chữa và điều trị bệnh nan ynhư ung thư, tim mạch Đậu tương còn có thể giải quyết một phần vấn đềhết sức cấp thiết hiện nay trên thế giới là năng lượng từ các sản phẩm của

nó Ngoài ra đậu tương là cây họ đậu nên có tác dụng cải tạo đất thông quaviệc cố định đạm của vi khuẩn trên các nốt sần ở rễ, góp phần làm giảmlượng phân hóa học bón xuống đất, khắc phục sự thoái hóa đất và ô nhiễmmôi trường [1],[3], [9]

1.1.3 Đặc điểm sinh học của cây đậu tương

Cây đậu tương thuộc loại cây thân thảo, là loại cây trồng cạn thu hạt bao gồm các bộ phận rễ, thân, cành, lá, hoa, quả và hạt

Hệ rễ

Khác với rễ cây hoà thảo rễ cây đậu tương gồm có rễ chính và rễ phụ.Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần đó là kết quả cộng sinh của một loại

vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ cây đậu tương Nốt sần có thể dài 1cm,

đường kính 5-6mm, khi mới hình thành có màu trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nốt sần có màu hồng Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu 0-20cm, có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm từ nito không khí, vớilượng đạm cung cấp cho cây khoảng 30- 60kg/ha [9]

Đặc điểm của thân và cành

Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiềulông nhỏ Thân khi còn non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyểnsang màu nâu nhạt, màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ vớimàu sắc của hoa sau này Nếu thân lúc còn non màu xanh thì hoa màu trắng

và nếu khi còn non thân có màu tím thì hoa có màu tím đỏ

Số cành trên thân nhiều hay ít phụ thuộc vào giống và các kỹ thuật canhtác Có giống chỉ có 1 - 2 cành hoặc thậm chí không có cành Các cành mọc ra

Số hóa bởi Trung tâm Học http://www.lr c -tnu ed u vn/

từ chồi ở các nách lá Các chồi ở dưới thân chính sẽ phát triển thành các chùmquả, các chồi ở giữa và ngọn thì phát triển thành các chùm hoa Các cành mọc

ra ở đốt thứ nhất hay đốt thứ hai sẽ khỏe hơn các cành mọc ở phía trên Cáccành cùng với thân sẽ tạo thành tán cây [10]

Đặc điểm của hoa

Đậu tương là loại cây tự thụ phấn Hoa đậu tương được phát sinh từnách lá, đầu cành hoặc đầu thân, hoa lưỡng tính màu tím hay trắng Thời kỳcây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tùy thuộc vào giống và thời

vụ gieo bởi nó chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ.Hoa đậutương nhỏ và không có vị Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1 - 10hoa và thường có 3 - 5 hoa

Đặc điểm của quả và hạt

Quả đậu tương thuộc loại quả ráp, ngoài vỏ thường có lông bao phủmàu sắc vỏ quả khi chín màu vàng hay màu xám đen.Cũng giống như các cây

họ đậu khác, quả đậu tương gồm 2 nửa một lá noãn nối với nhau ở phần bụng

và lưng Trên cả hai đường nối biểu bì của quả cong vào phía trong tạo nênmột lớp nhu mô thẳng đứng, lớp nhu mô này tách mô dẫn thành 2 vùng vàgiúp quả tách ra

Hạt đậu tương có nhiều hình dạng khác nhau như: hình tròn, hình trứng,hình ô van, hình bầu dục, …Hạt đậu tương cũng đa dạng về màu sắc như

vàng nhạt,vàng đậm, xanh, nâu, đen trong đó màu vàng chiếm đa số và có giátrị thương phẩm cao Trong hạt, phôi thường chiếm 2%, lá mầm chiếm đến90% và còn lại là vỏ hạt chiếm 8% tổng khối lượng hạt Khối lượng 1000 hạttrung bình dao động từ 100 – 200 g Màu sắc rốn hạt khác nhau đặc trưng chotừng loại giống [2].

Cây đậu tương có 2 đặc tính sinh trưởng: sinh trưởng hữu hạn và sinhtrưởng vô hạn; căn cứ vào thời gian sinh trưởng có 3 loại: chín sớm (75- 85ngày), trung bình (80- 100 ngày), chín muộn (110- 120 ngày)

Đậu tương là cây trồng tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh.Trong tập đoàn giống đậu tương, có những giống chỉ trồng vào vụ hè, ngượclại có những giống chỉ trồng vào vụ đông [1], [3]

1.1.4 Giá trị kinh tế của cây đậu tương

Trong họ Đậu thì đậu tương là cây trồng có giá trị rất toàn diện về mặtdinh dưỡng, kinh tế và cải tạo đất, nó được trồng dùng làm thực phẩm chocon người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, là hàng xuấtkhẩu và là loài cây cải tạo đất trồng rất tốt

Giá trị về mặt thực phẩm: Đậu tương có hàm lượng protein cao hơn

trong gạo, thịt, cá và cao gấp hai lần các loại đậu đỗ khác Trong hạt đậutương không có thành phần cấu tạo của cholestetol Đậu tương còn được xem

là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng, lipid đậu tương chứa thành phần cácacid béo không no cao, tổng số chất béo chiếm khoảng 18% Hạt đậu tươngcòn chứa nhiều loại vitamin như: Vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin

E, … Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và các thành phần chất xơ tốtcho tiêu hóa

Giá trị về mặt công nghiệp: Hiện nay trên thế giới, đậu tương là cây

cung cấp nguyên liệu hàng đầu cho công nghiệp ép dầu, dầu đậu tương chiếm

Số hóa bởi Trung tâm Học http://www.lr c -tnu ed u vn/

khoảng 50% dầu thực vật Dầu đậu tương có chỉ số iốt cao, nhiệt độ ngưng tụtừ

-15 đến -18oC Đậu tương còn là nguyên liệu quan trọng cho các nghành côngnghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo,…

Giá trị về mặt nông nghiệp: Trong nông nghiệp đậu tương được sử

dụng làm thức ăn gia súc Ngoài ra, đậu tương còn có vai trò trong cải tạo đấttrồng đem lại hàm lượng đạm cao cung cấp cho cây trồng Vì vậy, việc luâncanh trồng cây đậu tương với các loại cây trồng khác có thể được xem là biệnpháp cải tạo đất trồng hữu hiệu [9]

1.1.5 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.5.1.Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

Trên thế giới diện tích trồng đậu tương ngày càng tăng Với những giátrị kinh tế và sử dụng của mình cây đậu tương được xem là một trong nhữngloại cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia đứngvị trí thứ tư sau lúa mỳ, lúanước và ngô [9] Đậu tương là cây lấy hạt, có dầu quan trọng bậc nhất thếgiới Đặc biệt trong những năm gần đây do nhu cầu dinh dưỡng của protein vàdầu thực vật tăng đã thúc đẩy phát triển sản xuất đậu tương trên thế giới tăngnhanh về cả diện tích, năng suất và sản lượng

Đậu tương có khả năng thích ứng khá rộng nên được trồng khắp cácchâu lục, đặc biệt là châu Mỹ (75,68%) và châu Á (21,27%)

Trong những năm gần đây, do kết quả của việc ứng dụng những tiến bộcủa công nghệ sinh học từ chọn, tạo giống đến sản xuất nên năng suất đậutương đã tăng lên đáng kể, đưa đậu tương trở thành cây trồng quan trọngtrong cơ cấu cây trồng của nhiều quốc gia

Hiện nay, đậu tương được trồng ở gần 80 quốc gia khác nhau trên thếgiới Trong đó, 4 nước có sản lượng đậu tương đứng đầu là: Mỹ, Brazil,

Argentina và Trung Quốc Đậu tương là nguồn cung cấp dầu và protein quantrọng.

Số hóa bởi Trung tâm Học http://www.lr c -tnu ed u vn/

1.1.5.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam

Ở Việt Nam, đậu tương được trồng từ rất lâu, trước cây đậu xanh và cáccây họ đậu khác Các giống đậu tương ở nước ta bao gồm các giống đậutương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến và các giống đậutương địa phương

Việt Nam là nước nông nghiệp nhiệt đới trồng đậu tương với ba mụcđích: Giải quyết vấn đề thiếu protein cho người và gia súc,xuất khẩu và cảitạo đất

Trước cách mạng tháng 8 năm 1945, diện tích gieo trồng đậu tương ởViệt Nam chỉ khoảng 32 ha, năng suất 4,1 tạ/ha Hiện nay, diện tích đó đãđược tăng lên đáng kể, cả nước có 7 vùng nông nghiệp đều trồng được đậutương với diện tích gieo trồng (năm 1997) lớn nhất là miền núi phía bắc(46,6%), tiếp đến là đồng bằng sông Hồng (19,3%), vùng Tây Nguyên (11%),miền Đông Nam Bộ (10,2%) đồng bằng sông Cửu Long (8,9%), khu Bốn(2,3%), vùng Duyên hải miền Trung (1,6%) [9] Tuy nhiên sản lượng đậutương trong nước vẫn thấp và phải nhập khẩu từ các nước khác để đáp ứngnhu cầu tiêu dùng và làm thức ăn cho gia súc

Theo Tổng cục Thống kê - Năm 2012, sản lượng đậu nành nước tagiảm 34,3% so với cùng kỳ năm trước, xuống còn 175,2 nghìn tấn do thời tiếtlạnh khác nghiệt vào cuối năm 2011 và đầu năm 2012 khiến cho năng suất vàdiện tích gieo trồng giảm mạnh (tham khảo bảng 1 ) Quy mô sản xuất vẫn còntương đối nhỏ và tiếp tục không đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ trong nước

USDA- Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ dự báo diện tích trồng đậu nành năm

2013 nước ta tăng khoảng 180 nghìn ha so với năm 2011 và sản lượng đạt ởmức 270.000 tấn

Thủ tướng Chính phủ cũng đã phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triểnsản xuất ngành nông nghiệp đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030 Theo

đó, diện

tích đất quy hoạch khoảng 100 ngàn ha, tận dụng tăng vụ trên đất lúa để năm

2020 diện tích gieo trồng khoảng 350.000 ha, sản lượng 700.000 tấn; vùng sảnxuất chính là đồng bằng sông Hồng, trung du miền núi phía Bắc, Tây Nguyên

Việt Nam

Năm Diện tích (nghìn

ha) Năng suất (tấn /ha)

Tổng sản lượng (nghìn tấn)

Nguồn: Tổng cục thống kê *số liệu dự báo của USDA

Hầu hết đậu nành được sản xuất trong nước cũng như đậu nành nhậpkhẩu đều được sử dụng nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu dùng hàng ngày cũng nhưdùng làm thức ăn chăn nuôi Các loại thực phẩm không lên men truyền thốngnhư đậu phụ, sữa đậu nành, bột đậu nành được dùng trong công nghiệp chếbiến thực phẩm; số ít được sử dụng để làm nước tương, mắm đậu nành, và sảnxuất dầu đậu tương tại các hộ gia đình Chỉ một lượng nhỏ đậu nành sản xuấttrong nước được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi Khoảng 80% lượng đậunành nguyên chất béo nhập khẩu được nghiền để làm dầu nành và bã đậunành, 5% được dùng làm thức ăn chăn nuôi và 15% được dùng làm thựcphẩm cho con người

Dựa trên số liệu về sức tiêu thụ các sản phẩm từ đậu nành, USDA dựbáo sức tiêu thụ năm 2013 tăng 6% so với năm 2012, cụ thể là 340.000 tấnniên vụ 2012/13 và 360.000 tấn niên vụ 2013/14

Số hóa bởi Trung tâm Học http://www.lr c -tnu ed u vn/

Mặc dù quy mô sản xuất còn khá nhỏ và nhu cầu tiêu thụ trong nước có

xu hướng giảm, nhưng sản lượng đậu tương nước ta năm 2010 vẫn đạt297.000 tấn, tăng 39% so với năm 2009 Nguyên nhân chính là do sự mở rộngđáng kể về diện tích cây trồng (khoảng 35%) và những nỗ lực nhằm cải thiệnnăng suất của ngành Tuy nhiên, sản lượng trên vẫn còn thấp so với mục tiêu

đề ra cho năm 2010 là 325.000 tấn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nôngthôn do chi phí sản xuất tăng và năng suất đậu tương của nước ta chưa cao

Theo số liệu thống kê chính thức của chính phủ, đậu tương được trồng ở

28 tỉnh trên khắp cả nước, trong đó 70% ở miền bắc và 30% ở miền nam.Khoảng 65% đậu tương nước ta được trồng ở vùng cao, những nơi đất khôngcần màu mỡ; và 35% được trồng ở những vùng đất thấp ở khu vực đồng bằngsông Hồng Đậu tương được trồng ở nhiều địa phương trên khắp cả nước vàotừng thời điểm khác nhau nên có cả vụ xuân, vụ hè và vụ đông

Tuy nhiên, do chưa được đầu tư cao nên năng suất đậu tương còn nhiềuhạn chế Xét về diện tích gieo trồng vẫn tăng qua các năm nhưng tỉ lệ diệntích gieo trồng đậu tương còn thấp, chỉ khoảng 1,5- 1,6% Năng suất đậutương của nước ta rất thấp, chỉ bằng 50- 70% năng suất đậu tương của toànthế giới Sản lượng đậu tương sản xuất ra chưa đủ đáp ứng nhu cầu trongnước Hàng năm, chúng ta vẫn phải nhập khẩu một số lượng đáng kể từ nướcngoài Tại Việt Nam, cây đậu tương cũng giữ vai trò rất quan trọng trong cơcấu cây trồng ở nhiều địa phương hiện nay với sản lượng trung bình từ 2001-

2009 là 239,1 nghìn tấn Theo thống kê năm 2009 cho thấy cây đậu tươngđược canh tác có hệ thống trên diện tích là 146,2 nghìn ha ở 28 tỉnh thành trảiđều từ Bắc vào Nam, nhưng tập trung chủ yếu vẫn là ở miền Bắc với sảnlượng của cả nước là 213,6 nghìn tấn [9], [38] Trong khu vực ASEAN, năngsuất đậu tương của Việt Nam đứng thứ 3 trong số 6 nước trồng đậu tương làLào, Campuchia, Myanmar, Philipines, Thái Lan và Việt Nam Khi so sánh số

liệu trên với năng suất của các trung tâm sản xuất đậu tương của thế giới làArgentina, Brazil và Hoa Kì thì khá thấp [40] Do không đáp ứng đủ nhu cầutrong nước nên Việt Nam vẫn phải nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn từcác quốc gia khác đặc biệt là Hoa Kì.

Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng trên, có thể là do dịch bệnh, kỹthuật canh tác, nhưng chủ yếu là do biến đổi khí hậu và hạn hán Vì vậy mộttrong những yêu cầu thực tiễn đặt ra là nghiên cứu tạo ra giống đậu tương cókhả năng thích nghi với những điều kiện sinh thái ở những vùng khác nhau.Trong những năm gần đây, cùng với việc nghiên cứu các công nghệ sinh học

và các loại đậu tương cao sản mới để tìm ra giống cho năng suất cao với chi phí sản xuất thấp, các nhà chọn giống Việt Nam còn quan tâm nghiên cứu cácgiống đậu tương địa phương có năng suất thấp nhưng lại có chất lượng hạtcao và có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường như:nóng, lạnh, mặn, phèn, hạn

1.2 Tác động của hạn đến cây đậu tương

Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu vềnước cao hơn các loại cây khác là do trong hạt và cây đậu tương

–

50%, trong khi đó ngô chỉ là 30%, lúa là 26% [2]

Khi nghiên cứu về các đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phươngdiện sinh l

đến đặc điểm hóa keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổichất Tính chịu hạn của cây đậu tương mang tính đa gen Chúng thể hiện ởnhiều khía cạnh khác nhau như: sự phát triển mạnh của bộ rễ, tính chín sớmtương đối, cũng như bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử dụng

Số hóa bởi Trung tâm Học http://www.lr c -tnu ed u vn/

nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Căn cứ vào đặc điểm này đậu tương chia làm 2 nhóm:

- Nhóm chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây

- Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả các giai đoạn phát triển của cây

,còn ở những giai đoạn như ra

.Đặc tính chịu hạn của cây đậu tương liên quan chặt chẽ đến đặc điểmhoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất Tính chịuhạn của cây đậu tương mang tính đa gen Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnhkhác nhau: sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tương đối, cũng nhưbản chất di truyền của từng giống trong quá trình sinh trưởng và phát triển cókhả năng sử dụng nước tiết kiệm

Hạn hán và độ mặn cao có ảnh hưởng làm giảm mạnh năng suất câytrồng trên toàn thế giới trong đó có đậu tương Để thích ứng với điều kiệnnhư vậy cơ thể thực vật đã phát triển một loạt các cơ chế đòi hỏi sự khởi độngcủa nhiều gen liên quan chống lại stress do các điều kiện bất lợi vô sinh Một

số lượng lớn các gen liên quan đến khả năng chịu hạn và chịu mặn đã đượcxác định Tuy nhiên, vẫn còn một số lượng đáng kể các gen liên quan đến tínhchống chịu của thực vật chưa được xác định Vì vậy điều quan trọng là nghiêncứu các chức năng của gen liên quan đến stress để cải thiện khả năng chốngchịu của cây trồng với hạn hán Có hai nhóm gen có liên quan chủ yếu đếntính chịu hạn của cây đậu tương:

(1) Nhóm gen mà sản phẩm của chúng có ảnh hưởng trực tiếp tới đặctính chịu hạn; (2) Nhóm gen mà sản phẩm của chúng kích hoạt quá trìnhphiên mã của nhóm gen chịu hạn

1.3 GEN DREB VÀ DREB2 Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.3.1 Gen DREB

ứ

, bông [12], [16], [19], [33], [37] Gen DREB - DREB là họ gen tổng hợp protein được tìm thấy nhiềutrong tế bào sống khi thực vật gặp các điều kiện bất lợi như hạn hán, mặn vàlạnh Nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cho rằngDREB là nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quá trình này bằng cáchkích hoạt nhanh chóng sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp chống lạicác điều kiện bất lợi của môi trường như hạn hán, mặn và lạnh Nhân tố phiên

mã DREB hoạt động không cần thông qua sự tác động của ABA

Nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa họctrên thế giới cho rằng, DREB là nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quátrình này bằng cách kích hoạt nhanh chóng sự hoạt động của các gen tham giatrực tiếp chống lại các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh

Các nhà khoa học Trung Quốc, Đức, Pháp, Mỹ… đã nghiên cứu và giảitrình tự gen DREB trên loài cúc và hướng dương, lúa mỳ…

Li và cs (2005) phân lập gen trên đối tượng cây đậu tương đã chia thành

các phân họ DREB gồm: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, ngoài ra còn có DREB1, DREB2, DREB3, DREB4, DREB5, mỗi gen có trình tự, độ dài khác

nhau nhưng đều được biểu hiện nhiều khi đậu tương gặp các điều kiện hạn

Số hóa bởi Trung tâm Học http://www.lr c -tnu ed u vn/

Wang và cs (2006) đã mô tả mối quan hệ giữa yếu tố phiên mã DREB

và DRE/CRT cis- một nhân tố chức năng liên quan đến sự biểu hiện của genDREB, nghiên cứu đặc điểm và chức năng của nhóm nhân tố phiên mãAP2/EREBP ở thực vật [35] AP2/ERF là một họ lớn bao gồm các yếu tốphiên mã quan trọng

Ở cây Arabidopsis trên cơ sở số lượng và giống nhau của các miền

DNA- binding, 145 nhân tố phiên mã được phân thành 5 nhóm: AP2 (14 gen),RAV (6 gen), DREB (còn được gọi là CBF, 56 gen), ERF (còn được gọi làEREBP, 65 gen) và nhóm gen khác (4 gen)

Ở Arabidopsis, 10 DREBs (DREB2- DREB11) được phân thành 5

nhóm, nhóm thứ nhất gồm DREB3, DREB4, DREB5; nhóm thứ hai gồmW50, DREB6, DREB7, DREB1; nhóm thứ ba gồm DREB2 và DREB8; nhómthứ tư gồm DREB9 và DREB10; nhóm thứ năm gồm DREB11, ERF1 vàERF2 (Liu và cs, 1998; Riechman và cs, 2000; Tsui- Hung Phang, 2008)

Li và cs (2005) đã phân lập ba gen DREB (GmDREBa, GmDREBb, và GmDREBc) từ cây đậu tương và cho rằng mỗi phân tử protein của các gen

này đã chứa một miền AP2 gồm 64 amino acid [23] Thực nghiệm đã chứng minh cả 3 protein này đều liên quan đến sự mất nước và đáp ứng sự mất nước

của tế bào Ở nấm men, GmDREBa và GmDREBb có khả năng kích hoạ

GmDREBc lạ Các protein GmDREBa và GmDREBb trong lá của cây giống đậu tương được tổng hợp

bởi tác động của muối, hạn hán, và lạnh

Yang và cs (2007) đã phân lập được phân họ DREB trên đối tượng Hoa

Cúc, theo đó phân họ gồm DmDREBa và DmDREBb, những gen này mã hoá

cho hai protein có 191 amino acid và 185 amino acid với trọng lượng phân tử

21,66 và 20,99 kDa, các protein của hai gen này được biểu hiện khi cây hoa cúc bị stress hạn lạnh.

Chen và cs (2007) đã nghiên cứu phân lập gen GmDREB5 từ mRNA ở

cây đậu tương với kích thước là 927 bp [14]

Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cs (2011) đã nghiên cứu phân lập gen

GmDREB5 ở giống đậu tương Vàng Ngân Sơn với kích thước 924 bp mã hóa

cho 307 amino acid [31]

Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cs (2012) đã nghiên cứu phân lập gen

DREB5 ở giống đậu tương Xanh Ba Bể đăng ký trên NCBI với mã số

HE648567, kích thước 924 bp [32]

Số hóa bởi Trung tâm Học http://www.lr c -tnu ed u vn/

644 bp [28]

DREB4 ở

Arumingtyas và cs (2011) đã nghiên cứu phân lập gen GmDREB2 từ

mRNA ở giống đậu tương với kích thước 416 bp [11]

Li và cs (2007) đã nghiên cứu phân lập gen DREB1 ở cây Địa lan vớikích thước 1265 bp được công bố trên NCBI với mã số EF654657 [25]

Lui và cs (2005) đã nghiên cứu phân lập gen DREB3 từ mRNA ở câyđậu tương với kích thước 819bp mã hóa cho 272 acid amin được công bố trênNCBI với mã số DQ055133 [26]

Chen và cs (2013) nghiên cứu phân lập gen GmDREB3 ở cây đậu

tương được công bố trên NCBI với mã số NM001250024 với kích thước 819

bp mã hóa cho 272 amino acid [15]

Hoàng Thị Xoan và cs (2014) đã nghiên cứu và phân lập gen

GmDREB2 từ 2 giống đậu tương Bắc Sơn mã số HG965101 [20] và Bắc

Giang mã số HG965100 [21] được công bố trên NCBI với kích thước 480 bp

ở

1380 bp [29]

Như vậy, có rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu phân lập về gen DREB

nói chung và gen GmDREB2 nói riêng ở cây đậu tương.

1.3.2 DREB2 và gen GmDREB2

Đậu tương là một cây trồng quan trọng trên thế giới, trong điều kiệnstress phi sinh học như hạn hán và nhiệt độ, ảnh hưởng xấu đến sự sống, phát

triển cũng như năng suất Việc mất nước được đáp ứng bởi nhóm GmDREB2

bao gồm các yếu tố phiên mã góp phần chống hạn và chống stress nhiệt bằngcách kích hoạt phiên mã thông qua các yếu tố cis đáp ứng mất nước

Gen GmDREB2 tham gia tích cực vào việc chống hạn Gen GmDREB2

được biểu hiện trong môi trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt

độ thấp

Nakashima và cs đã xác định được ở cây Arabidopsis gen DREB2 có

liên quan đến sự mất nước và độ mặn cao trong biểu hiện gen Trong cây

Arabidopsis gen biểu hiện trong điều kiện mất nước đặc trưng bởi một nhóm

gen DRE/CRT – binding protein là DREB2A và DREB2B Khi phân tích thấyrằng cả hai gen được gây ra bởi sự mất nước và độ mặn cao Mức độ biểu hiệncủa hai gen rất cao trong rễ khi nồng độ muối cao và trong thân và rễ khi cây

bị mất nước Gen DREB2A nằm trên NST số 5 và DREB2B nằm trên NST số

3, cả 2 gen bị gián đoạn bởi 1 intron duy nhất tại các vị trí giống hệt nhau

Trong cây chuyển gen Arabidopsis gen DREB2 giải phóng ra

Beta-glucuronidase (GUS) trong điều kiện cây bị mất nước và độ mặn cao [30]

Chen và cs (2009) đã phân lập gen PeDREB2 từ cây Populuseuphratica Dựa trên sự liên kết nhiều trình tự và đặc tính phát sinh loàiPeDREB2 được xếp vào phân họ A2 trong nhóm gen DREB Sự biểu hiệncủa PeDREB2 được gây ra bởi môi trường có xử lý hạn hán, lạnh và độ mặncao nhưng không có ABA PeDREB2 tăng khả năng chịu mặn trong cây

thuốc lá chuyển gen và không gây ra chậm phát triển Kết quả cho thấyPeDREB2 có chức năng như là một yếu tố phiên mã liên quan đến phản ứng

của nồng độ muối cao và có thể có ích trong việc cải thiện khả năng chịu mặn trong cây chuyển gen [13].

Liu và cs (2008) đã nghiên cứu gen DREB2 ở cây hoa cúc

Dendranthema vestitum DvDREB2A được phân lập từ hoa cúc Dendranthema vestitum nó chứa một (ORF) dài 1.471 bp mã hóa 366 amino

acid và được xếp vào phân họ DREB2 dựa trên sự liên kết nhiều trình tự.Trình tự protein điển hình chứa AP2/EREBP DNA- binding miền gần khu

vực N Trong một phân tích protein DvDREB2A đã bị ràng buộc bởi

yếu tố DRE (Trình tự lõi, AGCCGAC) và kích hoạt sự biểu hiện của HIS3

và giải phóng lacZ Các thí nghiệm cho thấy mức độ biểu hiện của

DvDREB2A đã bị ảnh hưởng đáng kể bởi nhiệt, nhiệt độ thấp, hạn hán, ABA,

độ mặn cao, những kết quả này chỉ ra rằng gen DvDREB2A là một yếu tố

mới của các yếu tố phiên mã DREB, có thể đóng một vai trò quan trọngtrong việc tăng khả năng chịu áp lực môi trường [24]

Kobayashi và cs (2008) kích hoạt gen DREB2 lúa mì (wDREB2)trong thuốc lá chuyển gen Tạo ra cây thuốc lá biến đổi gen biểu hiện

wDREB2, wDREB2 biểu hiện tăng khả năng chịu lạnh và thẩm thấu trong

cây thuốc lá [22]

Chen và cs (2007), đã phân lập gen GmDREB2 từ đậu tương và dựa trên

sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 xếp vào phân họ A5 trong nhóm gen DREB Sự biểu hiện của gen GmDREB2 trong môi trường có xử lý bởi

hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp và ABA [12] Sự biểu hiện của

GmDREB2 ở cây thuốc lá chuyển gen được tích lũy cao hơn của hàm lượng

proline [28] Đối với cây đậu tương với chức năng kích hoạt sự phiên mã của

gen GmDREB2 là cơ sở quan trọng và hữu ích cho việc cải tiến khả năng chịu

hạn của cây

Một gen DREB2 mới ở đậu tương là GmDREB2A, GmDREB2A được

đánh giá cao gây ra không chỉ bởi mất nước và nhiệt mà còn bởi nhiệt độ

Số hóa bởi Trung tâm Học http://www.lr c -tnu ed u vn/

thấp GmDREB2A còn cải thiện sốc nhiệt và cải thiện chịu hạn ở cây

Arabidopsis biến đổi gen

Trong ngân hàng gen quốc tế (GenBank) trình tự gen GmDREB2 đã được công bố, đó là trình tự gen GmDREB2 của Chen và cs công bố năm

2007 có kích thước 480 bp mã hóa 159 amino acid, mã số trên NCBI là

DQ208968 Trình tự gene GmDREB2 của Wang và cs công bố năm 2006 có

kích thước 480 bp, mã số trên NCBI là DQ054363

Thông tin về gen GmDREB2 cho thấy trình tự nucleotide của gen GmDREB2 có số lượng nucleotide 480 bp [39], từ vị trí nucleotide thứ 1 đến

480, mã hóa cho 159 amino acid, từ vị trí số 1 đến vị trí amino acid thứ 159

Sơ đồ về gen GmDREB2 được biểu diễn ở Hình 1.1.

Hình 1.1 Sơ đồ mô tả gen và vùng mã hóa của gen GmDREB2

ở cây đậu tương

Sơ đồ về protein DREB2 của cây đậu tương ở Hình 1.2 cho thấy prot ein DREB2 có vùng bảo thủ AP2 và vị trí đặc biệt bám vào DNA [39]

Hình 1.2 Sơ đồ mô tả protein GmDREB2 ở đậu tương

Protein DREB2 của cây đậu tương có chứa 159 amino acid chứa vùngAP2 có 59 amino acid, từ vị trí amino acid 34 đến 92 [39] (Hình 1.3)

1 meeaglgdc ssnttitrks ekrkqqhqqq ekpyrgirmr kwgkwvaeir epnkrsriwl

6 gsyatpvaaa raydtavfhl rgpsarlnfp ellsqdddvs tqqqgkmsad sirqkatqvg

121 arvdalqtal qqsssthsis sshvsyekpd lneypkped

Hình 1.3 Trình tự amino acid của vùng AP2 trong protein DREB2

ở đậu tương

Vùng bảo thủ AP2 hay miền gắn DNA tìm thấy trong sự điều hòa phiên

mã của thực vật như là EREBP (ethylene responsive element binding protein) Miền EREBP chứa hộp GCC có 11bp là nhân tố phản ứng đối với ethylene (ERE), đây chính là yếu tố cần thiết trong cấu trúc của promotor cho phảnứng với ethylene EREBP và yếu tố ràng buộc CBF1 có trình tự lặp lại C tham gia vào việc phản ứng chống lại các bất lợi từ môi trường AP2 như là một protein có chứa hai bản copy giữ vai trò trong sự phát triển của thực vật

Như vậy

gen GmDREB2 GmDREB2

việc

Số hóa bởi Trung tâm Học http://www.lr c -tnu ed u vn/

gen GmDREB2 là cơ sở nghiên cứu cơ chế kháng hạn

cây đậu tương nhằm tăng cường khả năng chịu hạn đậu tương

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Sử dụng 2 giống đậu tương Cao Bằng Đen và ĐVN5 do Trung tâmnghiên cứu phát triển đậu đỗ, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cungcấp làm vật liệu nghiên cứu (Bảng 2.1, Hình 2.1)

Bảng 2.1 Nguồn gốc của các giống đậu tương nghiên cứu

Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc Đặc điểm Nơi cung cấp

Cao Bằng

đen

CBD Giống địa

phương, Cao Bằng

Có khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường như khô,lạnh

Trung tâm nghiên cứu phát triển đậu

đỗ, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Giống

ĐVN5

DVN5 Giống lai giữa

giống Cúc Tuyển với giống Chaing Mai

Giống có khả năng sinh trưởng khỏe, kháng bệnh khá, chống đổ và chịu hạn rất tốt

Hình 2.1 Hạt của hai giống đậu tương nghiên cứu

Số hóa bởi Trung tâm Học http://www.lr c -tnu ed u vn/

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

Vector tách dòng pBT, chủng vi khuẩn E.coli DH5α do phòng Công

nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học &Công nghệ Việt Nam cung cấp

Hóa chất: thang DNA 1kb (GeneShun Biotech), Kit tách RNA

(GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit) (Thermo Scientific), Kit tổnghợp cDNA và RT-PCR (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit), bộ kittách dòng (Fermentas), Kit tinh sạch DNA (QIAGEN), các hóa chất thôngdụng khác (cồn, agarose, enzyme…) của các hãng GeneShun Bioteck,Fermentas

Thiết bị: Máy quang phổ UV – Vis, máy điện di DNA và bộ nguồn

PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), bể ổn nhiệt (Techne, OSI, Anh), pipetman cácloại (Gilson, Pháp), tủ sấy (Anh), cân điện tử (Thụy Sỹ), tủ lạnh sâu -30 0C(Sanyo, Nhật Bản), nồi khử trùng (Tomy, Nhật Bản), máy PCR Eppendorf(Đức), máy li tâm lạnh (Đức), máy đo pH (Metter Toledo, Thụy Sỹ), máyVortex Genius 3- IKA Genmany/ China, máy tự gen ABI 3100Genetic Analyzer (Mỹ)

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công n

Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh – KTNN, TrườngĐại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Xác định trình tự gen được thực hiện tại phòng thí nghiệm trọng điểmgen về Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học vàCông nghệ Việt Nam

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử

2.2.1.1 Phương pháp tách chiết RNA

Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Sử dụng bộ kit GeneJET Plant

RNA Purification Mini Kit (Hãng Thermo Scientific) để tách chiết RNA tổng số