Thiết kế vector mang cấu trúc gen gmdreb2 nhằm phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen chịu hạn

Đặc tính chịu hạn ở đậu tương là tính trạng đa gen mà sản phẩmcủa các gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện tính chịu hạn hoặc cóchức năng điều hoà nhóm gen chịu hạn.. phiên mã đó

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HOÀNG THỊ THU HOÀN

THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2

NHẰM PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG

CHUYỂN GEN CHỊU HẠN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái nguyên, 2014

HOÀNG THỊ THU HOÀN

THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2

NHẰM PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG

CHUYỂN GEN CHỊU HẠN

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên, 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn là do tôi tìmhiểu, nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu và sự cộngtác giúp đỡ của các cộng sự trong nhóm nghiên cứu Các số liệu, kết quảtrình bày trong luận văn đã được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhómnghiên cứu Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Thu Hoàn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tìnhhướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Đào Xuân Tân và các thầy cô Bộ môn

Di truyền học & Sinh học hiện đại, khoa Sinh – Kỹ thuật nông nghiệp,Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiệnthuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện các thí nghiệm của đề tài

Tôi xin cảm ơn TS Lê Văn Sơn và các cán bộ Phòng Công nghệ DNAứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinhhọc đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Tân Trào, TuyênQuang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và hoànthành khoá học

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn đã động viênkhuyến khích giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn

Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và caohọc của Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trường Đạihọc Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Thu Hoàn

Trang bìa phụ

i Lời cảm ơn .ii Mục lục .iii Danh

mục bảng .iv

Danh mục hình

v Những chữ viết tắt .vi MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề

1 2 Mục tiêu nghiên cứu

2 3 Nội dung nghiên cứu

2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 3

1.1.1 Cây đậu tương 3

1.1.2 Đặc tính chịu hạn của thực vật và cây đậu tương 8

1.2 DREB VÀ GEN DREB2 13

1.2.1 Gen DREB 13

1.2.2 DREB2 và gen GmDREB2 15

1.3 CHUYỂN GEN VÀ VECTOR CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 17

1.3.1 Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp và gián tiếp ở thực vật

17 1.3.2 Hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium 19

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 22

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Phân lập gen 24

2.2.1.1 Phương pháp tách chiết RNA 24

2.2.1.2 Phương pháp tổng hợp cDNA 25

2.2.1.3 Phương pháp PCR 26

2.2.1.4 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) 27

2.2.1.5 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 27

2.2.1.6 Phương pháp ghép nối gen đích vào plasmid 27

2.2.1.7 Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp 28

2.2.1.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotide của gen 29

2.2.2 Phương pháp thiết kế vector 29

2.2.3 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào A tumefaciens

30 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 PHÂN LẬP GEN GmDREB2 TỪ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN DT2008 31

3.1.1 Nhân bản gen GmDREB2 từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR 31

3.1.2 Tách dòng đoạn mã hoá (cDNA) của gen GmDREB2 32

3.1.3 Kết quả đọc trình tự đoạn mã hoá của gen GmDREB2 35

3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GmDREB2 38

3.2.1 Kết quả cắt plasmid pBT mang gen GmDREB2 bằng XbaI và SacI 38

3.2.2 Kết quả cắt plasmid pBI121 bằng XbaI và SacI 39

3.2.3 Tạo vector chuyển gen pBI121 mang cấu trúc GmDREB2 40

3.3 KẾT QUẢ TẠO DÒNG VI KHUẨN A tumefaciens MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

1 Kết luận 43

2 Đề nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013 7

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

23 Bảng 2.2 Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 25

Bảng 2.3 Thành phần của phản ứng PCR 26

Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 26

Bảng 2.5 Thành phần gắn gen GmDREB2 vào vector tách dòng pBT 27

Bảng 2.6 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid

28 Bảng 3.1 Sự sai khác giữa trình tự đoạn gen GmDREB2 của giống đậu tương DT2008 và trình tự có mã số DQ054363 36

Bảng 3.2 Sự sai khác giữa trình tự amino acid của protein DREB2 (DT2008) và trình tự có mã số AAY89658 37

Hình 2.1 Ảnh hạt của giống đậu tương DT2008 22Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu 23Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen 30Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hoá gen GmDREB2; 31

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch đoạn mã hoá của gen

GmDREB2 32Hình 3.3 Ảnh đĩa khuẩn lạc 33Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc mang plasmid

tái tổ hợp chứa đoạn cDNA của GmDREB2 34Hình 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid pBT/GmDREB2 tái tổ hợp; 34Hình 3.6 Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hoá gen GmDREB2 của giống đậu

tương DT2008 và DQ054363 35Hình 3.7 Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein DREB2 giữa giống

DT2008 và AAY89658 37Hình 3.8 Ảnh điện di sản phẩm plasmid pBT/GmDREB2 được cắt bằng XbaI

và SacI 38Hình 3.9 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pBI121 được cắt bằng

XbaI và SacI 39Hình 3.10 Hình điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc mang plasmid

pBI121/GmDREB2 tái tổ hợp 41Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ vi khuẩn A tumefaciens

mang plasmid pBI121/GmDREB2 42

ABA Axit absisic

bp Cặp base

cs Cộng sự

C:I Chloroform : Isoamyl

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DNA Deoxyribonucleic Acid

DREB Dehydration – Responsive Element Binding dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate

EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid

E coli Escherichia coli

TAE Tris - Acetate - EDTA

Taq Thermus aquaticus

v/p vòng / phút

X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside

Cây đậu tương đang trở thành một trong những cây trồng quan trọngkhông chỉ đối với Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới Sản phẩmcủa nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu quantrọng cho nhiều ngành công nghiệp.

Trong những năm gần đây hạn hán xảy ra thường xuyên đã tácđộng xấu đến sự sinh trưởng, phát triển, làm giảm năng suất và sản lượngcây trồng trong đó có đậu tương Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm vớiđiều kiện ngoại cảnh và thuộc vào nhóm cây chịu hạn kém, khi thiếu nước ởcác thời kì khác đều có tác động xấu, làm giảm năng suất cây đậu tương

Đặc tính chịu hạn ở đậu tương là tính trạng đa gen mà sản phẩmcủa các gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện tính chịu hạn hoặc cóchức năng điều hoà nhóm gen chịu hạn DREB là một loại protein điều hòa

có chức năng kích thích hoạt động phiên mã của nhóm gen chịu hạn,đây nhân tố

phiên mã đóng vai trò quan trọng trong sự biểu hiện của nhóm gen chịu hạnkhi cây đậu tương ở điều kiện cực đoan.

Vì vậy cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương trong định hướngchọn giống chịu hạn bằng công nghệ gen đang được các nhà chọn giốngquan tâm ứng dụng Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành

đề tài: “Thiết kế vector mang cấu trúc gen GmDREB2 nhằm phục vụ tạocây đậu tương chuyển gen chịu hạn”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc gen GmDREB2 phân lập từcây đậu tương chịu hạn và biến nạp được vào vi khuẩn Agrobacteriumtumefacien

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA Nhân gen GmDREB2 bằng PCR vớicặp mồi đặc hiệu từ các giống đậu tương chịu hạn tốt DT2008 Tách dòng vàxác định trình tự đoạn mã hóa của gen GmDREB2;

3.2 Tạo vector chuyển gen mang gen GmDREB2 Kiểm tra vector tái tổ hợpbằng enzym cắt giới hạn;

3.3 Tạo vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ

hợp

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG1.1.1 Cây đậu tương

Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sửdụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớmđược xác minh Cây đậu tương có nguồn gốc từ Trung quốc và nó sớm đượcngười dân thuần hóa và trồng làm cây lương thực vào khoảng thế kỉ 17trước công nguyên Sau đó, nó được đưa đến Triều Tiên, Nhật Bản, Nga,sang Nam Á và Đông Nam Á qua con đường tơ lụa Đậu tương truyền básang Châu Âu vào khoảng thế kỉ thứ 17, sang Hoa Kì thế kỉ thứ 18 và ngàynay Hoa Kì là quốc gia sản xuất đậu tương hàng đầu trên thế giới, chiếm 50%sản lượng trên toàn thế giới, tiếp theo là các nước Trung Quốc, Ấn Độ,… Ởtrung du Việt Nam đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnhthuộc khu vực trung du, miền núi phía Bắc và miền đông Nam Bộ [3], [5]

Cây đậu tương hay đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.)Merrill, thuộc chi Glycine, họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm(Papilionoideae), bộ Phaseoleae và có bộ NST 2n = 40 Đối với đậu tương cóthể phân loại theo đặc điểm thực vật học, dựa vào thời gian sinh trưởng,theo thời vụ Theo cách phân loại của Hymowit và Newell (1984) dựa trênđặc điểm về hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể thì ngoàichi Glycine còn có thêm chi phụ Soja Chi Glycine được chia ra thành 7 loàihoang dại lâu năm, và chi phụ Soja được chia ra làm 2 loài: loài đậu tươngtrồng Gtycine (L) Merr và loài hoang dại hàng năm G Soja Sieb và Zucc [3],[5], [9]

Cây đậu tương gồm các bộ phận chính: rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt.

Rễ đậu tương là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ có nhiều nốt sầnchứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định đạm của khôngkhí tạo thành đạm dễ tiêu Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốtsần ít hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, khí hậu và kĩ thuật trồng.Trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, sinh trưởng của rễ nhanh hơnthân, nên khi vào thời kì ra hoa rộ, lúc đó độ sâu của rễ thường dài gấp đôichiều cao của thân cây, và rễ vẫn tiếp tục phát triển cho đến khi quả vàomẩy và hạt bước vào giai đoạn chín sinh lý mới ngừng lại [3], [5], [14]

Thân cây đậu tương là thân thảo, ít phân cành dạng bụi, thân hìnhtròn, nhiều lông nhỏ, mang nhiều đốt Thân khi còn non thường có màuxanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu nâu nhạt, chiều cao trungbình từ 0,5 –

1,2 m, thay đổi tùy theo giống, thời vụ, mật độ cây, đất đai, phânbón… Giống đậu tương dại cao 2 - 3 m Những giống thân nhỏ lóng dài dễ bị

đổ hay mọc bò thường làm thức ăn cho gia súc Những giống thân tothường là thân đứng và có nhiều hạt và chống được gió bão [5] Số cànhtrên thân nhiều hay ít phụ thuộc vào giống và các kỹ thuật canh tác Cógiống chỉ có 1 - 2 cành hoặc thậm chí không có cành Các cành mọc ra từchồi ở các nách lá Các chồi ở dưới thân chính sẽ phát triển thành các chùmquả, các chồi ở giữa và ngọn thì phát triển thành các chùm hoa Các cànhmọc ra ở đốt thứ nhất hay đốt thứ hai sẽ khỏe hơn các cành mọc ở phíatrên Các cành cùng với thân sẽ tạo thành tán cây [14]

Cây đậu tương có 3 loại lá chính là: lá mầm, cặp lá đơn, lá chét vàngoài ra còn có thêm lá gốc Lá đậu tương có hình dạng khác nhau: tròn,hẹp, bầu dục, lưỡi mác hoặc hình thoi… nhưng thường quy thành hai loại

là lá rộng và lá hẹp Cặp lá mầm là 2 lá đầu tiên, khi mới mọc thường có màu

vàng hay xanh lục nhưng khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màuxanh Hạt

giống to thì cho lá mầm to thì chứa nhiều chất dinh dưỡng để nuôi cây,khi hết chất dinh dưỡng thì khô và rụng đi Cặp lá đơn xuất hiện khi câymọc được 2 - 3 ngày và mọc trên lá mầm Lá có màu xanh đậm và có phiến láhình ô van Lá đơn mọc đối xứng nhau Lá đơn to màu xanh bóng là biểuhiện cây sinh trưởng tốt Lá đơn to xanh đậm biểu hiện của một giống cókhả năng chịu rét Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh trưởng khôngbình thường Đậu tương thường có 3 lá chét sau cặp lá đơn và được xếpxen kẽ thành 2 hàng đối diện Phiến lá chét có hình ô van rộng tới hẹp tùythuộc vào từng loại giống Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ Những giống

có lá nhỏ và dài chịu hạn khỏe nhưng cho năng suất thấp Còn những giống

có lá to chống chịu hạn kém nhưng lại cho năng suất cao Lá gốc xuất hiện ởcuống của mỗi cành, là một lá đơn rất nhỏ Lá gốc không có cuống và lá gối[3], [5]

Đậu tương là cây tự thụ phấn, có hoa dạng cánh bướm đặc trưng, hoađậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt hoặc trắng, hoa mọc

từ nách lá hoặc ngọn Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1 - 10hoa và thường có 3 - 5 hoa Hoa đậu tương nhiều nhưng tỉ lệ đậu quả thấp

do chịu nhiều ảnh hưởng từ môi trường [9], [14]

Quả đậu tương thuộc loại quả ráp, thẳng hoặc hơi cong, có nhiềulông khi chín có màu vàng hoặc xám Quả đậu tương có số lượng biến động

từ 2 đến 20 quả trên một chùm hoa và có thể có 400 quả trên một cây Mộtquả thường có từ 1 đến 5 hạt, nhưng chủ yếu là 2 đến 3 hạt Hạt đậu tươngkhông có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn Hạt có hìnhtròn hoặc bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan vỏ hạt thường nhẵn và có màuvàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa số là hạt màu vàng Trong hạt,phôi thường chiếm 2%, lá mầm chiếm đến 90% và còn lại là vỏ hạt chiếm 8%tổng khối lượng hạt [3], [5]

Đậu tương là cây trồng có giá trị kinh tế cao, nó được dùng làm thựcphẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, làhàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt Đậu tương có hàm lượng proteincao hơn trong gạo, thịt, cá và cao gấp hai lần các loại đậu đỗ khác Trong hạtđậu tương không có thành phần cấu tạo của cholesteron Đậu tương cònđược xem là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng, lipid đậu tương chứathành phần các acid béo không no cao, tổng số chất béo chiếm khoảng 18%.Hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin như: Vitamin nhóm B như: B1,B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và các thànhphần chất xơ tốt cho tiêu hóa Đậu tương là cây cung cấp nguyên liệu hàngđầu cho công nghiệp ép dầu và một số ngành công nghiệp khác như chếbiến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo… Đối với nông nghiệpđậu tương được sử dụng làm thức ăn gia súc và đóng vai trò quan trọngtrong việc cải tạo đất trồng [5], [12], [14].

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trênthế giới, đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô Do khả năng thíchứng rộng nên nó đã được trồng ở khắp năm châu lục, nhưng tập trung nhiềunhất ở châu Mỹ trên 70%, tiếp đến là Châu Á 21,27% và một số nước kháctrên thế giới Hiện nay, đậu tương được trồng ở gần 80 quốc gia khác nhautrên thế giới Trong đó, 4 nước có sản lượng đậu tương đứng đầu là Mỹ,Brazil, Argentina và Trung Quốc Hiện nay đậu tương được trồng ở Việt Nam

có hai nguồn gốc, đó là các giống địa phương và giống nhập nội Trước cáchmạng tháng 8 năm 1945, diện tích gieo trồng đậu tương ở Việt Nam chỉkhoảng 32 ha, năng suất 4,1 tạ/ha, cho đến nay diện tích đó tăng lên đáng kể[5], [18]

Ở Việt Nam, đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp,trong đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng

đồng

bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền Trung1,6%, diện tích gieo trồng đậu tương tính đến tháng 4/2010 là 123,9 nghìn

ha Cây đậu tương chiếm một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp củanước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưaphát triển [5], [7], [12], [18]

Trong những năm gần đây do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu toàncầu cũng như hạn hán đã làm ảnh hưởng tới tình hình phát triển cây đậutương ở Việt Nam Từ năm 2007 đến nay, diện tích trồng đậu tương có sựbiến động và có xu hướng tăng vào năm 2012, 2013, nhưng năng suất vàsản lượng đậu tương gần như không tăng đáng kể (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013

và các loại đậu

tương cao sản mới để tìm ra giống cho năng suất cao với chi phí sảnxuất thấp, các nhà chọn giống Việt Nam còn quan tâm nghiên cứu các giốngđậu tương có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trườngnhư: nóng, lạnh, hạn, mặn, phèn… [4], [7], [9].

1.1.2 Đặc tính chịu hạn của thực vật và cây đậu

của môi trường và nó điều hòa hoạt động bởi ABA (Umezawa và cs,2004; Hiroaki Fujii và cs, 2009) [25] Một số nghiên

cứu cũng đã chứng minh được rằng SnRK2.8 (SRK2C) có liên quan đếnphản ứng điều kiện khô hạn của cây trồng (Umezawa và cs, 2004) [36].Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tươngđối ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn Khả năng củathực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ragọi là tính chịu hạn [15], [17].

Khô hạn có thể phân ra làm các trường hợp sau:

(i) Hiện tượng khô xảy ra khi mất một phần nước trong các cơ quan ởgiai đoạn nhất định trong chu kì sống ở thực vật (hạt, hạt phấn, bào tử).Hiện tượng này không làm ảnh hưởng đến tế bào, mô của cây Đây làquá trình biến đổi trạng thái trong tế bào có sự điều khiển của hệ thốngthông tin di truyền Trong giai đoạn hình thành hạt nếu tế bào mất nước khảnăng chịu hạn tăng lên Khả năng này đạt cực đại ở thời kì hạt chín và cóchiều hướng giảm dần khi hạt nảy mầm Hạt khô còn có khả năng chốngchịu với hàng loạt điều kiện ngoại cảnh bất lợi khác như nhiệt độ, gió

(ii) Hạn do tác động của môi trường chịu tác động bên ngoài rấtlớn, gây ảnh hưởng đến đời sống của cây, có thể gây hủy hoại cây cối và gâymất mùa Hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đất và không khí thiếunước đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấynước vào tế bào Những yếu tố bất lợi chính là các thành phần như thổnhưỡng, nhiệt độ, gió nóng hay thời tiết, khí hậu Có hai loại hạn do môitrường tác động là hạn đất và hạn không khí

(iii) Hạn đất thường xảy ra ở những vùng có khí hậu hay thổnhưỡng đặc thù, hạn tác động mạnh mẽ lên bộ rễ của cây Sự tác độngnày được biểu hiện qua sự điều tiết các hoocmon giúp cho cây chống chịuvới điều kiện cực đoan

(iv) Hạn nhiệt độ không khí thường xảy ra ở những vùng có gió nóng,nhiệt độ cao Hạn không khí thường tác động lên các bộ phận trên mặtđất như lá, hoa Hạn do tác động của môi trường dẫn đến hiện tượng mấtnước trong cây ở các bộ phận mô, tế bào khác nhau [8], [13].

Cây đậu tương là cây có nhu cầu về nước cao hơn các loại cây khác và

là cây chịu hạn kém Trong suốt thời gian sinh trưởng, nhu cầu nước của câykhông đồng đều qua các giai đoạn Hạn thường làm giảm 40% năng suấtđậu tương và tác động đến tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển, từnảy mầm, ra hoa, tạo hạt cũng như chất lượng hạt được tạo thành Nóichung hạn hán ảnh hưởng đến mọi giai đoạn sinh trưởng của cây, đặc biệtvới cây đậu tương thì giai đoạn tạo hạt đặc biệt cần nước vì giai đoạn nàyquá trình tổng hợp protein diễn ra mạnh do đó nước cung cấp cho cây lúcnày có ý nghĩa lớn quyết định năng suất Ở cây đậu tương, để tổng hợp 1kgchất khô cần 500-530 kg nước Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu vềnước của đậu tương cũng khá cao 50%, trong khi ở ngô chỉ là 30%, lúa là26%

Khi nghiên cứu về đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phươngdiện sinh lý và di truyền đã cho thấy, các đặc tính này liên quan chặt chẽđến đặc điểm hóa keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổichất Khi gặp hạn, axit absisic (ABA) được sinh ra chủ yếu ở phần rễ rồichuyển hoá lên lá, gây hiện tượng héo lá, đóng khí khổng và đẩy nhanh tốc

độ già hoá bộ lá Khi hàm lượng ABA được chuyển hoá tới hạt, làm hạt bịlép trong quá trình đẫy hạt Theo Paroda thì khả năng chịu hạn ở thực vậtliên quan đến một số đặc trưng về hình thái như chín sớm, mầu lá, diện tích

lá, khả năng phát triển của hệ rễ, số lượng lông hút, mầu sắc thân, độ phủlông trên thân lá Ngoài ra, khả năng chịu hạn còn liên quan đến một sốyếu tố sinh lý như khả năng đóng mở của khí khổng, quá trình quang hợp, hôhấp, điều chỉnh áp suất thẩm thấu, nhiệt độ tán cây

Tính chịu hạn của cây đậu tương mang tính đa gen, chúng thể hiện ởnhiều khía cạnh khác nhau: như sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chínsớm tương đối cũng như bản chất di truyền của từng giống có khả năng sửdụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Căn

cứ vào đặc điểm này, đậu tương được chia thành hai nhóm:

- Nhóm chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây

mà gặp hạn thì sẽ dẫn đến năng suất giảm đáng kể.

Signh và Sarkar (1991) chia cơ chế chịu hạn ở thực vật làm 3 loại:

- Tránh hạn: là khả năng của cây có thể hoàn thành chu kỳ sống của

nó trước khi sự thiếu hụt nước xuất hiện

- Chịu hạn: là khả năng của cây có thể sống, phát triển và cho năngsuất trong điều kiện cung cấp nước hạn chế hoặc thụ động trải qua các giaiđoạn thiếu nước và tiếp tục phát triển khi điều kiện trở lại bình thường

- Chống hạn: là khả năng của cây trồng chống lại sự thiếu hụt nướcbằng cách duy trì nước trong mô tế bào cao [6], [9], [13]

Đã có rất nhiều công trình khoa học trên thế giới nghiên cứu về tínhchịu hạn của cây đậu tương nhằm góp phần quan trọng trong công tác chọngiống

Năm 2004, nhóm nghiên cứu gồm Huang và cs của trường Đại học Tựnhiên và Kỹ thuật Pingtung - Taiwan đã phân lập được gen P5CS ở đậu tương

từ mRNA với kích thước 2148 bp Gen P5CS là nhân tố giới hạn cho nhịp độtổng hợp proline ở thực vật trong điều kiện bất lợi do hạn và do mặn gây nên[6]

rễ thứ cấp, gen này hoạt động mạnh hơn so với các rễ chính Rất có thể, sựbiểu hiện của gen Sb-HRGP3 liên quan đến việc chấm dứt sự kéo dài của rễ[19].

Khi nghiên cứu về gen TCS (gen hai thành phần hệ thống có chức năngchống hạn) ở đậu tương các tác giả Dung Tien Le, Rie Nishiyama, YasukoWatanabe và cs (2011) nhận thấy, cơ chế kháng hạn là một trong hai cơ chếliên quan đến rễ và chồi Khảo sát hình thái của 29 hệ rễ cây đậu tươngcác tác giả đã có nhận xét là sự phát triển của bộ rễ có sự tương quan mậtthiết với các cơ chế kháng hạn Sự thích nghi linh hoạt của hệ rễ là một yếu

tố quan trọng để duy trì sự sống trong điều kiện hạn hán

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu phân lập các gen liênquan đến tính chịu hạn, chịu nóng của cây đậu tương Trần Thị Phương Liên

và cs (2003) phân lập gen chaperonin CCTδ từ giống đậu tương địa phươngchịu hạn Cúc Vàng, gen này gồm 1602 nucleotide mã hoá cho 533 axit amin[8] Nguyễn Thu Hiền và cs (2005) phân lập gen dehydrin với kích thước 751

bp liên quan đến khả năng chịu hạn từ hai giống đậu tương vàng MườngKhương và Cao Bằng 4 Nguyễn Thị Thuý Hường và cs (2011) đã phân lập,tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệmchuyển vào cây đậu tương Việt Nam [6]

1.2.1 Gen DREB

Các protein điều hoà phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chếbiểu hiện của các gen chức năng thông qua việc bám vào trật tự DNA điềukhiển trên vùng khởi động gen và tương tác với RNA polymerase tạo thànhphức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chức năng Nhóm gen mãhóa các nhân tố phiên mã chiếm khoảng 8-10% trong hệ gen mỗi loài vàđóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động sống như quá trình sinhtrưởng phát triển và chống chịu với bất lợi môi trường Ở đậu tương, hơn

2000 yếu tố phiên mã từ các mô cơ quan chính đã được xác định, khoảngtrên 180 yếu tố phiên mã ở rễ liên quan đến tính chịu hạn Các nhà khoa học

đã xác định các nhân tố tham gia vào quá trình phiên mã của nhóm gen chịuhạn là DREB, ADREB, NAC, bZIP, ZFHD…

DREB là họ gen tổng hợp protein được tìm thấy nhiều trong tế bàosống khi thực vật gặp các điều kiện bất lợi như hạn hán, mặn và lạnh Nhiềucông trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cho rằng DREB lànhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quá trình này bằng cách kích hoạtnhanh chóng sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp chống lại các điềukiện bất lợi của môi trường như hạn hán, mặn và lạnh Khi nghiên cứucấu trúc protein họ DREB đã cho thấy rằng chúng có chứa vùng bảo thủ duynhất để gắn với trình tự DNA đặc hiệu là AP2/ERF, cho phép chúng tươngtác với một loạt các gen phía sau theo hình thức không phụ thuộc ABA Cácmiền AP2/ERF khá bảo thủ và có khoảng 60 amino acid [21], [24], [27]

Shahrokhabadi và cs (2008) đã xác định được các gen trong họ genDREB ở đậu tương

Trình tự đặc hiệu của nhóm nhân tố DREB1/CRT có trình tự lõi làA/GCCGAC lần đầu tiên được phát hiện nằm trong vùng điều khiển gen rd29

Dubouzet và cs (2003) cho rằng gen OsDREB1A, OsDREB1B,OsDREB1C, OsDREB1D, gặp lạnh, OsDREB2A được biểu hiện khi mấtnước và nồng độ muối cao; các OsDREB1A và OsDREB2A tạo protein liênquan đến yếu tố DRE và kích hoạt yếu tố phiên mã của GUS tham gia vàoquá trình chống chịu hạn

Theo Li và cộng sự (2005) phân lập gen trên đối tượng cây đậu tương

và đã chia thành các phân họ DREB gồm: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc,ngoài ra còn có DREB1, DREB2, DREB3, DREB4, DREB5 mỗi gen có trình tự,

độ dài khác nhau nhưng đều được biểu hiện nhiều khi đậu tương gặp cácđiều kiện hạn [29]

Ở Arabidopsis, 10 DREBs (DREB2 – DREB11) được phân thành 5 nhóm,nhóm thứ nhất gồm DREB3, DREB4, DREB5; nhóm thứ hai gồm W50,DREB6, DREB7, DREB1; nhóm thứ ba gồm DREB2 và DREB8; nhóm thứ tưgồm DREB9 và DREB10; nhóm thứ năm gồm DREB11, ERF1 và ERF2 (Liu và

cs, 1998; Riechman và cs, 2000; Tsui – Hung Phang, 2008)

Các nhà khoa học Trung Quốc, Đức, Pháp, Mỹ… đã nghiên cứu và giảitrình tự gen DREB trên loài cúc và hướng dương, lúa mỳ…

Chen và cs (2007) đã nghiên cứu phân lập gen DREB5 từ mRNA ở câyđậu tương với kích thước là 927 bp [23]

Liu và Feng (2008) đã phân lập gen DREB4 từ mRNA ở cây thuốc lá

có kích thước là 644 bp [31]

Lucas và cs (2009) nghiên cứu gen DREB11 từ mRNA ở cây hướngdương có kích thước 1380 bp [32]

hạn của đậu tương Gen DREB2 được biểu hiện trong môi trường có xử lýbởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp.

1.2.2 DREB2 và gen GmDREB2

Việc mất nước được đáp ứng bởi nhóm DREB2 bao gồm các yếu tốphiên mã góp phần chống hạn và chống stress nhiệt bằng cách kích hoạtphiên mã thông qua các yếu tố cis đáp ứng mất nước

Gen DREB2 tham gia tích cực vào việc chống hạn Gen DREB2 đượcbiểu hiện trong môi trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độthấp

Nakashima và cs đã xác định được ở cây Arabidopsis gen DREB2 có liênquan đến sự mất nước và độ mặn cao trong biểu hiện gen Trong câyArabidopsis gen biểu hiện trong điều kiện mất nước đặc trưng bởi một nhómgen DRE/CRT – binding protein là DREB2A và DREB2B Khi phân tích thấy rằng

cả hai gen được gây ra bởi sự mất nước và độ mặn cao Mức độ biểu hiệncủa hai gen rất cao trong rễ khi nồng độ muối cao và trong thân và rễ khi cây

bị mất nước Gen DREB2A nằm trên NST số 5 và DREB2B nằm trên NST số 3,

cả 2 gen bị gián đoạn bởi 1 intron duy nhất tại các vị trí giống hệt nhau [33]

Trong cây chuyển gen Arabidopsis gen DREB2 giải phóng ra glucuronidase (GUS) trong điều kiện cây bị mất nước và độ mặn cao [33]

Beta-Chen và cs (2007), đã phân lập gen GmDREB2 từ đậu tương và dựatrên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 xếp vào phân họ A5 tronggen GmDREB2 nhóm gen DREB Sự biểu hiện của gen GmDREB2 trongmôi trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp và AB[23] Sự biểu hiện của GmDREB2 ở cây thuốc lá chuyển gen được tích lũy caohơn của hàm lượng proline [31] Đối với cây đậu tương với chức năng kíchhoạt sự phiên mã của là cơ sở quan trọng và hữu ích cho việc cải tiến khảnăng chịu hạn của cây

Dendranthema vestitum nó chứa một (ORF) dài 1.471 bp mã hóa 366amino acid và được xếp vào phân họ DREB2 dựa trên sự liên kết nhiềutrình tự Trình tự protein điển hình chứa AP2/EREBP DNA - binding miềngần khu vực N Trong một phân tích protein DvDREB2A đã bị ràng buộc bởiyếu tố DRE (Trình tự lõi, AGCCGAC) và kích hoạt sự biểu hiện của HIS3 vàgiải phóng lacZ Các thí nghiệm cho thấy mức độ biểu hiện của DvDREB2A đã

bị ảnh hưởng đáng kể bởi nhiệt, nhiệt độ thấp, hạn hán, ABA, độ mặncao, những kết quả này chỉ ra rằng gen DvDREB2A là một yếu tố mới của cácyếu tố phiên mã DREB, có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc tăngkhả năng chịu áp lực môi trường [30]

Kobayashi và cs (2008) kích hoạt gen DREB2 lúa mì (wDREB2) trongthuốc lá chuyển gen Tạo ra cây thuốc lá biến đổi gen biểu hiện wDREB2,wDREB2 biểu hiện tăng khả năng chịu lạnh và thẩm thấu trong câythuốc lá [28]

Chen và cs (2009) đã phân lập gen PeDREB2 từ cây populuseuphratica Dựa trên sự liên kết nhiều trình tự và đặc tính phát sinh loàiPeDREB2 được xếp vào phân họ A2 trong nhóm gen DREB Sự biểu hiệncủa PeDREB2 được gây ra bởi môi trường có xử lý hạn hán, lạnh và độ mặncao nhưng không có ABA PeDREB2 tăng khả năng chịu mặn trong câythuốc lá chuyển gen và không gây ra chậm phát triển Kết quả cho thấyPeDREB2 có chức năng như là một yếu tố phiên mã liên quan đến phản ứngcủa nồng độ muối cao và có thể có ích trong việc cải thiện khả năng chịumặn trong cây chuyển gen [22]

một nhóm đậu tương hoang dã được tìm thấy dọc theo dãy núi Andes ởNam Mĩ và khu vực Trung Mĩ, Cortes và cs (2012) cho rằng mức độ đa dạngnucleotide khi gặp điều kiện khô hạn của DREB2A cao hơn DREB2B [20].

Xiaoshuang Li và cs (2014) đã nghiên cứu EsDREB2B trong nhóm genDREB2 ở một nhóm cây họ đậu và thấy rằng EsDREB2B mã hóa cho cácpolypeptide DREB2 Sự biến đổi gen quá mức của EsDREB2B làm tăng khảnăng chịu nhiều stress phi sinh học trong cây EsDREB2B là một gen chứcnăng trong DREB2 có thể ảnh hưởng đến phản ứng sinh lý và sinh hóa củathực vật khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi [37]

Một gen DREB2 mới ở đậu tương là GmDREB2A, GmDREB2A đượcđánh giá cao gây ra không chỉ bởi mất nước và nhiệt mà còn bởi nhiệt

độ thấp GmDREB2A còn cải thiện sốc nhiệt và cải thiện chịu hạn ởcây Arabidopsis biến đổi gen

Trong Ngân hàng gen quốc tế (Genbank) trình tự gen GmDREB2 đãđược công bố, đó là trình tự gen GmDREB2 của Chen và cs công bố năm

2007 có kích thước 480 bp mã hóa 159 amino acid, mã số trên NCBI làDQ208968 Trình tự gen GmDREB2 của Wang và cs công bố năm 2006 cókích thước 480 bp, mã số trên NCBI là DQ054363

Thông tin về gen GmDREB2 cho thấy trình tự nucleotide của genGmDREB2 có số lượng nucleotide 480 bp, từ vị trí nucleotide thứ 1 đến 480,

mã hóa cho 159 amino acid, từ vị trí số 1 đến vị trí amino acid thứ 159

1.3 CHUYỂN GEN VÀ VECTOR CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

1.3.1 Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp và gián tiếp ở thực

vật

Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ

đã được thiết kế dạng plasmid tái tổ hợp, hoặc được gắn vào hệ gen của

tế bào