Chế tạo và đánh giá hiệu quả hình thành phức hợp oxytocin PEG để làm thuốc bằng các phương pháp hóa sinh

Chế tạo và đánh giá hiệu quả hình thành phức hợp oxytocin PEG để làm thuốc bằng các phương pháp hóa sinh

CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ HÌNH THÀNH PHỨC HỢP

OXYTOCIN-PEG BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH

1 Đặt vấn đề

- Dễ bị phân hủy bởi enzym trong cơ thể

- Kém ổn định trong bảo quản

Phương pháp tăng độ bền ?

Phương pháp pegyl hóa

Pegyl hóa

Tăng độ bền phân tử

Tăng cường tác dụng

Giảm tính sinh miễn dịch của protein đối với cơ thể

Tăng thời gian bán thải

Nguyên liệu và phương pháp

Nguyên liệu

Hóa chất

Thiết bị

Oxytocin, methoxyl polyethylen glycol propion aldehyd 5kDa

Kali dihyrophosphat, ethanol, Tris(methylen, aminopersulfat, natri dodecyl

sulfat,…

Máy khuấy từ, điện di, buret, tủ lạnh, máy đo quang….

 Gắn PEG vào phân tử Oxytocin

Phương pháp nghiên cứu

- Dựa trên phản ứng khử

- Dựa trên nghiên cứu của Jenifer Collin và công sự

Đã thực hiện phản ứng liên hợp với Oxytocin với mPEG aldehyd Xác định vị trí gắn ở amin Cys 1.

Phương pháp nghiên cứu

 Xác định sự hình thành Oxytocin-PEG bằng

phương pháp điện di

Điện di trên gel polyacrylamid có Natri dodecyl sulfat (SDS)

 Phương pháp sắc ký lọc gel

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu

 Định lượng hợp chất Oxytoicn-PEG bằng phương pháp đo quang trực tiếp

- Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cchuẩn= 0,02 mg/ml

- Chuẩn bị mẫu thử: Gộp phân đoạn thể tích Ve

- Đo quang UV ở bước sóng 280 nm

3 Thực nghiệm và kết quả

3 Thực ngiệm và kết quả

3.1 Gắn PEG vào phân tử Oxytocin

Tiến hành tương tự dung dịch đệm pH 7,5

3.1 Gắn PEG vào phân tử Oxytocin

2 giai đoạn

- Giai đoạn 1: ngưng tụ

- Giai đoạn 2: khử hóa

3.1 Gắn PEG vào phân tử Oxytocin

Hai mẫu phản ứng cho kết quả tương tự

Kết quả điện di ở pH 4.5 Kết quả điện di ở pH 7.5

Như vậy, trong mẫu phản ứng có có sự xuất hiện protein mới có khối lượng phân tử khoảng 6 kDa

1 2 3 1 2 3

3.2 Xác định sự hình thành Oxytocin-PEG bằng điện di

3.3 Tách chiết và xác định khối lượng phân tử Oxytocin-PEG

Vẽ pick sắc ký của Oxytocin và sản phẩm tạo thành trong quá

Đồ thị tương quan mật độ quang và các phân đoạn

rửa giải dung dịch Oxytocin.

Oxytocin có 1 pick ở có đỉnh hấp thụ cực đại ở V =18 ml

Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của

dung dịch Oxytocin

Mẫu phản ứng xuất hiện đỉnh pick Ve=12ml là Oxytocin-PEG

Đồ thị tương quan mật độ quang và các phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin và mPEG

aldehyd ở pH 4,5.

Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của

mẫu phản ứng ở pH 4,5

Đồ thị tương quan mật độ quang các phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin và mPEG aldehyd với pH 7,5

00.05

Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của

mẫu phản ứng ở pH 7,5

6 8 10 12 14 16 18 20 0

0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

1.4 f(x) = -0.13x + 2.36

R² = 1

logMW

Ve ml

Đồ thị hồi quy tuyến tính giữa logMW và Ve

Vậy MOxytocin-PEG = 6 kDa Do đó trong phản ứng liên hợp, một phân tử mPEG aldehyd đã gắn kết với một phân

tử Oxytocin

Xây dựng đường chuẩn về khối lượng phân tử

3.4 Xác định hiệu suất thu hồi hợp chất Oxytocin-PEG sau sắc ký

Nhận xét: Hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG ở

mẫu pH 4,5 lớn hơn mẫu pH 7,5

3.5 Đánh giá ảnh hưởng lượng mPEG aldehyd tớivlượng Oxytocin-PEG

sau sắc ký lọc gel

Quá trình đánh giá được tiến hành ở 5 mức, thêm và bớt lượng mPEG aldehyd 10%, 20% so với ban đầu M0

Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và các phân đoạn

rửa giải của mẫu M1

Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của

Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và các phân đoạn rửa giải của mẫu M2.

Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của

Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và các phân đoạn

rửa giải của mẫu M3.

Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của

mẫu phản ứng M3

Ve=18 ml

Ve=12 ml Mẫu phản ứng xuất hiện

đỉnh pick Ve=12ml là Oxytocin-PEG

Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và các phân đoạn rửa giải của mẫu M4.

Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của

Về đánh giá hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG

Khối lượng phân tử protein sau phản ứng

Về đánh giá hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG

Ảnh hưởng lượng mPEG aldehyd

Thay đổi khoảng 10, 20%

lượng mPEG aldehyd

- Ảnh hưởng quá trình tách chiết

Về đánh giá hiệu suất thu hồi

Oxytocin-PEG

4 Kết luận và đề xuất

Oxytocin Oxytocin-PEG

1 Đã thực hiên gắn phân tử PEG vào Oxytocin

2 Đã tách chiết và xác định khối lượng phân tử

Cảm ơn thầy cô và các bạn đã chú ý lắng

nghe !