Chế tạo và đánh giá hiệu quả hình thành phức hợp oxytocin PEG để làm thuốc bằng các phương pháp hóa sinh

Chế tạo và đánh giá hiệu quả hình thành phức hợp oxytocin PEG để làm thuốc bằng các phương pháp hóa sinh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1. TỔNG QUAN VỀ PROTEIN. 2

1.2 OXYTOCIN 4

1.2.1 Đặc điểm cấu tạo của Oxytocin [5] 4

1.2.2 Tính chất hóa lý của Oxytocin [5], [6]. 5

1.2.3 Sự tổng hợp Oxytocin trong cơ thể người. 5

1.2.4 Tác dụng dược lý của oxytocin. 6

1.3 PHƯƠNG PHÁP TĂNG ĐỘ BỀN OXYTOCIN 7

1.3.1 Tạo ra các chất có cấu trúc tương tự với Oxytocin: carbetocin và desamino-oxytocin 7

1.3.2 Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfide trên oxytocin 8

1.3.3 Tạo hệ đệm chứa ion kim loại 9

1.3.4 Bột khô công thức 10

1.3.5 Các phương pháp liên hợp với Oxytocin. 10

1.4 PHƯƠNG PHÁP PEGYL HÓA. 10

1.4.1 Polyethylen glycol 11

1.4.2 Đại cương về phương pháp pegyl hóa protein dược dụng 11

1.4.3 Pegyl hóa Oxytocin 14

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU PEGYL HÓA CÁC PROTEIN VÀ OXYTOCIN. 18

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 20

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 20

2.1.1 Nguyên vật liệu 20

2.1.2 Dụng cụ máy móc 21

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 21

2.3 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 22

2.3.1 Tiến hành gắn PEG vào phân tử Oxytocin 22

2.3.2 Xác định sự có mặt của hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG bằng phương pháp điện di 23

2.3.3 Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel để sơ bộ đánh giá hiệu quả hình thành và tinh chế hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG 24

2.3.4 Phương pháp định lượng Oxytocin và hợp chất liên hợp 26

3.1 LIÊN HỢP mPEG aldehyd VỚI OXYTOCIN VÀ ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HÌNH THÀNH HỢP CHẤT LIÊN HỢP 28

3.1.1 Tổng hợp Oxytocin-PEG 28

3.1.2 Kết quả điện di 28

3.1.3 Xây dựng phương trình tương quan giữa logarit khối lượng phân tử protein và thể tích rửa giải (Ve) trong sắc ký lọc gel 29

3.1.4 Xác định khối lượng phân tử hợp chất liên hợp trong phản ứng Pegyl hóa bằng sắc ký lọc gel 33

3.1.5 Xác định hàm lượng Oxytocin-PEG trong các mẫu phản ứng ở hai pH sau sắc ký lọc gel 35

3.2 Đánh giá ảnh hưởng của lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới tỷ lệ hợp chất Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắc ký lọc gel 36

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 39

4.1.Về điều kiện của phản ứng Pegyl hóa Oxytocin 39

4.2 Xác định khối lượng của các protein sau phản ứng liên hợp 39

4.3 Về đánh giá lượng Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắc ký lọc gel 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

KIẾN NGHỊ 43

ĐẶT VẤN ĐỀ

Oxytocin là một hormone nonapeptide cyclic

(Cys-Tyr-Ile-GLN-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH 2 ) tiết ra từ thùy sau tuyến yên gây co thắt tử cung Ngày nay, người ta đã tổng hợp được nó

để làm thuốc phổ biến được sử dụng trong sản khoa Trên lâm sàng, oxytocin là thuốc lựa chọnđầu tiên để được chỉ định để khởi phát chuyển dạ và ngăn ngừa xuất huyết tử cung Tuy nhiên,Oxytocin không bền đối với các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình từ sinh tổng hợp đến sử dụnglàm giảm tác dụng điều trị của thuốc Oxytocin dễ bị tiêu hủy bởi enzym trong đường tiêu hóa,

do đó phải được bào chế dưới dạng thuốc tiêm hoặc dạng xịt mũi Một vấn đề lớn trong sử dụngcác chế phẩm dạng lỏng chứa Oxytocin kém ổn định trong bảo quản Đặc biệt phổ biến ở cácnước đang phát triển, ví dụ ở Châu Phi, Châu Á và Mỹ Latinh, nơi khí hậu nhiệt đới thường cónhiệt độ ban ngày vượt quá 40 ° C nhiệt độ cao, Oxytocin mất hoạt tính sinh học Do lợi íchtrong việc giảm tử vong mẹ liên quan đến băng huyết sau sinh, nhiều nhà khoa học trên thế giới

đã nỗ lực để phát triển ổn định công thức oxytocin

Để khắc phục nhược điểm trên , các nhà khoa học đã tìm ra các giải pháp cho vấn đề bảo vệ cấutrúc oxytocin Một trong số đó là kỹ thuật pegyl hóa: gắn polyethylen glycol (PEG) vào phân tửprotein Pegyl hóa mang lại nhiều ưu điểm cho Oxytocin như: làm tăng độ ổn định, tăng cườngtác dụng điều trị, giảm tính sinh miễn dịch của thuốc protein đối với cơ thể Hiện nay, kỹ thuậtpegyl hóa thật sự đã chứng minh được tính ưu việt của nó, thể hiện ở số lượng chế phẩm proteindược dụng được gắn PEG đang không ngừng tăng trên thị trường dược phẩm

Nhằm mục đích bào chế dạng đường uống và tăng cường độ bền phân tử trong quá trình bào chế đền bảo quản, đồng thời triển khai được kỹ thuật Pegyl hóa vào việc cải biến một số protein dược

dụng ở Việt Nam , chúng tôi tiến hành đề tài “ Chế tạo và đánh giá hiệu quả hình thành phức hợp Oxytocin-PEG để làm thuốc bằng các phương pháp hóa sinh” với các mục tiêu sau:

1 Gắn kết được Oxytocin với polyehthylen glycol tạo phực hợp Oxytocin-PEG.

2 Xác định hiệu quả hình thành phức hợp Oxytocin-PEG.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ PROTEIN.

 Khái niệm

Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axítamin Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗipolypeptide) Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấutrúc không gian khác nhau của protein.(1) (2)(3).

 Các bậc cấu trúc của protein

Người ta phân biệt ra 4 bậc cấu trúc của protein.1,2,3

Cấu trúc bậc một: Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp của cácaxit amin trên chuỗi polypeptide Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vìtrình tự các axit amin trên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trongchuỗi polypeptide, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tínhchất cũng như vai trò của protein Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các axit amin cóthể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein.1,2,3

Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không gian Chuỗipolypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp

β, được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những axit amin ở gần nhau Các protein sợi nhưkeratin, Collagen (có trong lông, tóc, móng, sừng)gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu

có nhiều nếp gấp β hơn.1,2

Cấu trúc bậc ba: là cấu dạng 3 chiều của toàn bộ chuỗi polypeptid Chỉ mối tương táckhông gian giữa các gốc acid amin ở xa nhau trong mạch polypeptid, và là dạng cuộn lại trongkhông gian của toàn mạch polypeptid Cấu trúc này được ổn định nhờ các tương tác yếu: lực Vander Walls, liên kết tĩnh điện, liên kết hydro giữa các mạch bên của các acid amin, đặc biệt làtương tác kỵ nước của các nhóm acid amin không phân cực trong trung tâm protein Mỗi proteincầu có cấu trúc bậc III khác nhau tương ứng với chức năng sinh học riêng biểu hiện ở tỷ lệ phầntrăm cấu dạng α và β 1,2

Cấu trúc bậc bốn: là chỉ mối quan hệ không gian của nhiều chuỗi polypeptid kếthợp chặt chẽ với nhau [1] Mỗi chuỗi này gọi là một “tiểu đơn vị” Chúng gắn với nhaunhờ các liên kết hydro, lực Van der Walls giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của cácchuỗi polypeptid [2] Ví dụ: hemoglobin… Phân tử protein cấu trúc bậc IV có thể phân lythuận nghịch thành các tiểu đơn vị Khi phân ly hoạt tính sinh học có thể bị thay đổi

 Phân loại protein theo chức năng sinh học.

tơ nhện, vỏ kénProtein

các phản ứng sinh hóa

Enzyme Pepsin phân giải Protein, Enzyme Lipase phân giải Lipid

Protein vận

chuyển Vận chuyển các chất

Huyết sắc tố Hemoglobin có chứa trong hồng cầu động vật

có xương sống có vai trò vận chuyển Oxy từ phổi theo máu

đi nuôi các tế bào

Thụ quan màng của tế bào thần kinh khác tiết ra (chất trung gian thần kinh) và truyền tín hiệu

Protein dự

trữ Dự trữ chất dinh dưỡng

Albumin lòng trắng trứng là nguồn cung cấp axit amin cho phôi phát triển Casein trong sữa mẹ là nguồn cung cấp AcidAmin cho con Trong hạt cây có chứa nguồn protein dự trữ cần cho hạt nảy mầm

Bảng 1.1: Phân loại protein theo chức năng

 Một số tính chất hóa lý của protein

- Sự biến tính của protein

Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ học hay tácnhân hóa học như axit, kiềm mạnh, muối kim loại nặng, gây phá hủy hoàn toàn cấu trúc khônggian (các liên kết bên trong phân tử trừ liên kết peptid) và làm giảm hay mất những tính chất banđầu của protein (tính chất lý hóa, độ tan và tính chất sinh học) Đó là hiện tượng biến tínhprotein Ví dụ: Albumin trứng bị đông vón ở nhiệt độ cao và không thể hòa tan trở lại khi làmlạnh [1]

Trong những điều kiện nhất định, protein bị biến tính có thể trở về trạng thái ban đầu tùytheo mức độ Hiện tượng đó được gọi là sự biến tính thuận nghịch [1]

- Tính lưỡng tính:

Trong phân tử protein chứa các gốc aa acid (Glu, Asp) mang điện âm và các gốc aa kiềm(Lys, Arg, His) mang điện dương Điện tích của protein phụ thuộc vào pH của môi trường Ở một

pH nào đó mà tổng điện tích âm và điện tích dương bằng không ,gọi là pI (điểm đẳng điện)protein trung hòa về điện ,dễ dàng kết tụ vào nhau và không di chuyển trong điện trường Mỗiprotein có một pI đặc trưng nên có thể tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp bằng điện di tronghuyết thanh [2].

- Tính chất hòa tan và kết tủa:

Protein có khả năng hòa tan trong dung dịch muối loãng.Protein dạng sợi tan trong

dung dịch muối đậm đặc.Albumin tan được cả trong nước Khi hòa tan, protein tạo thành cácdung dịch keo do protein có lớp áo nước bao quanh và do protein mang điện tích cùng dấu nênđẩy nhau Khi làm mất 2 yếu tố hòa tan trên, protein sẽ tích tụ lại và gây tủa [4]

Một số phản ứng hóa học của protein

1.2 OXYTOCIN

1.2.1 Đặc điểm cấu tạo của Oxytocin [5]

Oxytocin là một peptid gồm 9 aminoacid (một nonapeptide ) trong chuỗi tyrosine-isoleucine-glutamine-asparagine-cysteine-proline-leucine-glycine-amit

cysteine-, có một cầu nối disulfide nối cácphân tử cysteine có công thức phân tử C43H66N12O12S2, khối lượng phân tử là 1007,193 Da

Hình 1.2.1 Công trúc không gian của oxytocinVới cấu trúc của protein bậc I, phân tử Oxytocin có chứa các liên kết peptid củacác acid amin và một cầu nối disulfur trong phân tử Giữa các phân tử còn liên kết vớinhau bằng các liên kết hydro hay liên kết ion Cách sắp xếp của acid amin trong chuỗipolypeptid quyết định cấu trúc không gian và tính chất sinh học của Oxytocin

Một số vị trí trên cấu trúc Oxytocin dễ bị suy thoái là các acid amin Cys1, Gln4,Asn5 và Gly9 dễ bị oxy hóa, thủy phân trong môi trường acid, nhiệt độ và ánh sáng thôngqua sự hình thành các chất trung gian.Do các acid amin này có chứa N bậc một dễ thamgia phản ứng hóa học và thủy phân trong môi trường phân ly và điều kiện không phù hợp[1], [2] Ngoài ra, liên kết disulfid Cys1-Cys6 là vị trí hay gây ra sự suy thoái, đa số cácquá trình suy thoái cấu trúc xảy ra sau khi loại bỏ liên kết ở cacbon β ở Cys1, tạo raenamin N và cysteine persulfid Tạo điều kiện cho sự hình thành trisulfid và tetrasulfidOxytocin hoặc thúc đẩy sự hình thành dimer Oxytocin và các sản phẩm khác [5].

Hình 1.2.1 Sự hình thành disulfid từ Oxytocin

1.2.2 Tính chất hóa lý của Oxytocin [5], [6].

- Oxytocin là bột vô định hình trắng hoặc gần như trắng

- Dễ hút ẩm, rất dễ tan trong nước, acid acetic, butanol và ethanol

- Khi nung nóng để phân huỷ, nó phát ra hơi độc của sulfur oxid và nitric oxid

- Điểm đẳng điện của oxytocin là pI = 5,51

- Để định tính và định lượng Oxytocin dùng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng caovới detector UV ở 280 nm

- Thêm một số phản ứng màu của protein vào nhé

1.2.3 Sự tổng hợp Oxytocin trong cơ thể người.

Các oxytocin peptide được tổng hợp từ một protein tiền chất ‘precursor protein ’ khônghoạt động từ gen oxytocin [7] [8] [9] Protein tiền chất này cũng bao gồm các protein vận chuyểnoxytocin neurophysin I [10] Protein tiền chất không hoạt động được thủy phân dần thành cácmảnh nhỏ hơn (một trong số đó là neurophysin I) thông qua một loạt các enzyme Sự thủy phâncuối cùng giải phóng oxytocin nonapeptide hoạt tính được xúc tác bởi peptidylglyxin alpha-amidating monooxygenase[11] Ở vùng dưới đồi, oxytocin được tạo thành trong các tế bào thầnkinh trung và được lưu trữ trong thân Herring tại các đầu cuối sợi trục ở tuyến yên sau Sau đó

nó được đưa vào trong máu từ thùy sau của tuyến yên Bên ngoài não, các tế bào chứa oxytocinđược tìm thấy trong một số mô bao gồm ở nữ giới trong thể vàng [12] [13] và nhau thai [14]; ởnam giới trong tế bào kẽ hạch của Leydig [15]; và ở cả hai giới tính trong võng mạc, [16] tuyếnthượng thận, [17] tuyến ức (18) và tuyến tụy [19]

1.2.4 Tác dụng dược lý của oxytocin.

- Trên cơ tử cung: làm tăng co bóp cơ trơn tử cung theo nhịp, tần số và cả biên độ

co bóp sinh lý Tính cảm thụ của cơ trơn tử cung với Oxytocin tăng dần trong suốt thời

kỳ có thai, phụ thuộc nhiều vào sự có mặt của Estrogen [20] Receptor của Oxytocin trên

tử cung người đã được xác định Khi gắn với Oxytocin, các receptor sẽ hoạt hóaphospholipase C làm giải phóng Ca++ nội bào đồng thời gây khử cực kênh Ca++ nhạy cảmvới điện thế, làm tăng nhập Ca++ vào tế bào Do đó, Oxytocin thể hiện tác dụng đôi làđiều hòa sự co bóp của các tế bào cơ tử cung và kích thích tế bào nội mạc, tế bào màngrụng sản xuất prostaglandin [21] Khi oxytocin được sử dụng với liều quá mức, kích thíchquá mức tử cung, với các cơn co cứng hoặc kéo dài, có thể dẫn đến vỡ tử cung, sẹo cổ tửcung và rò rỉ âm đạo, xuất huyết sau sanh, lưu lượng máu tử cung bị suy giảm, thuyên tắcnước ối, và chấn thương bào thai bao gồm xuất huyết nội sọ,các rối loạn nhịp tim khác,tổn thương thần kinh trung ương hoặc tổn thương não, và tử vong do ngạt

Sự co lại của tử cung: Điều quan trọng đối với sự giãn nở cổ tử cung trước khi sinh, oxytocin gây

co thắt trong giai đoạn thứ hai và thứ ba của chuyển dạ Việc phóng thích Oxytocin trong thờigian cho con bú gây ra những cơn co thắt nhẹ nhưng thường đau trong vài tuần đầu của chu kỳsữa Điều này cũng giúp phục hồi tử cung với tác dụng làm cầm máu sau đẻ [22]

- Ở những bà mẹ đang cho con bú sữa mẹ, oxytocin hoạt động ở tuyến vú,Oxytocin gây co giật các tế bào niêm mạc bao quanh các tuyến dẫn sữa của vú Điều này

ép sữa từ các kênh các xoang lớn hơn, và do đó tạo điều kiện cho việc đẩy sữa.Với sựchuyển tiếp từ vùng dưới đồi qua thần kinh cột sống đến tuyến vú sẽ làm tăng bài xuấtsữa khi trẻ sơ sinh bú Sự kích thích gây ra ở nơron tạo Oxytocin từ các đầu cuối sợi thầnkinh thần kinh của tuyến yên [23]

- Do nó tương tự như vasopressin, nó có thể làm giảm bài tiết nước tiểu một chút Ởmột số loài, oxytocin có thể kích thích bài tiết natri từ thận Ở người, liều cao có thể dẫnđến nồng độ natri thấp (hạ natri máu)

- Trên hệ tim mạch: Ở mức liều gây co bóp tử cung chưa đủ ảnh hưởng đến huyết áp Ởmức liều cao gây giãn mạch rõ ràng và tạm thời làm hạ huyết áp, tăng nhịp tim do phản xạ vànóng mặt Oxytocin và thụ thể của nó cũng được tìm thấy trong tim ở một số loài gặm nhấm, và

hormon này có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển phôi của tim bằng cách thúcđẩy sự khác biệt về tế bào cơ tim [24], [25] Tuy nhiên, sự vắng mặt của Oxytocin hoặc thụ thểcủa nó ở chuột nhắt không gây ra tình trạng thiếu máu tim[26]

- Chuẩn bị các nơ-ron bào thai sinh nở: Chuyển qua nhau thai, oxytocin ở người mẹ đếnnão bào thai và kích hoạt chuyển đổi trong hoạt động của chất dẫn truyền thần kinh GABA từkích thích đến ức chế trên nơ-ron vỏ não thai nhi Điều này sẽ làm êm dịu não bộ của thai nhitrong thời gian sinh và giảm khả năng bị tổn thương do hypoxic [27]

- Điều chỉnh hoạt động của tuyến thượng thận - tuyến yên - thận: Oxytocin gián tiếp ứcchế sự giải phóng hormon adrenocorticotropic và cortisol, trong những trường hợp đó có thể coi

nó là một chất đối kháng của vasopressin [28]

1.3 PHƯƠNG PHÁP TĂNG ĐỘ BỀN OXYTOCIN.

1.3.1 Tạo ra các chất có cấu trúc tương tự với Oxytocin: carbetocin và desamino-oxytocin

Các chất này đã được đánh giá liên quan đến việc duy trì hoạt động tử cung trong khi tăng cường độ ổn định [29], [30] Các nhà khoa học đã tìm ra hai chất phổ biến là desamino-oxytocin

và carbetocin Cả hai đều có ái lực trên cùng mộ thụ thể với Oxytocin và gây ra cơn co thắt cùng một cơ chế Đặc biệt thời gian bán thải trong máu của hai chất này đều cao hơn nhiều so với Oxytocin do sự thay đổi cấu trúc [31] Desamino-oxytocin và carbetocin khác với Oxytocin là trong cấu trúc thiếu nhóm amino tự do ở cuối Phân tử carbetocin cũng thay thế một trong số các sulfur tại cầu disulfide bằng nhóm CH2

Hình : Cấu trúc của Desamino-oxytocin và Carbetocin

Cả hai chất tương tự oxytocin này đều có thời gian bán hủy kéo dài với sự duy trì một số hoạt động co bóp tử cung cho thấy nhóm amino trong oxytocin không cần thiết cho hoạt động sinh

học Đối với carbetocin, tăng thời gian bán thải là 4- 10 lần so với oxytocin, nên chỉ dùng một lần tiêm thay vì truyền kéo dài Carbetocin được chấp thuận sử dụng cho y tế và thú y ở nhiều quốc gia khác nhau [32].

1.3.2 Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfide trên oxytocin

Vì vị trí chính của sự thoái hoá trên peptide là ở liên kết disulfid nên các nghiên cứu đã tạo ra cácchất tương tự oxytocin khác nhau bằng cách được thay thế bằng một phần ở liên kết này với các nguyên tử khác Nhằm mục đích để tránh loại bỏ liên kết trong cacbon β ở Cys 1 và vì liên kết disulfid Cys1-Cys6 không phải là một trong những vị trí liên quan trực tiếp đến thụ thể và tác dụng sinh học của oxytocin [33]

Điều này đã được đánh giá vào những năm 1960 và 1970, để xác định hoạt tính có duy trì nếu một trong hai hoặc cả hai thiol trong liên kết disulfide đã được thay đổi sang thành các nhóm CH2 như trong carbetocin Người ta thấy rằng tác dụng sinh học vẫn được quan sát, mặc dù nó

đã được ức chế vừa phải, do đã thay đổi kích cỡ vòng của peptide Điều này cho thấy cầu nối disulfide không phải là một điều kiện tiên quyết cho việc duy trì hoạt động sinh học [34], [35] Các nghiên cứu gần đây của Alewood và các đồng nghiệp đã tập trung vào việc thay thế disulfidebằng các cầu thioether, selenylsulfide, diselenide và ditelluride, và sự tổng hợp của nhiều chất tương tự oxytocin có chứa các liên kết disulfid đã thay đổi (hình 3.)

Hình 1.4 Các chất tương tự oxytocin liên kết vào cầu nối disulfide của oxytocin

Kết quả nghiên cứu tác dụng trên thụ thể và sự ổn định huyết tương của các chất tương tự

Oxytocin - với sự thay thế cầu nối disulfide của Alewood cho thấy sự giảm kích thước vòng

([-S]- OT) làm giảm đáng kể ái lực với thụ thể do đó làm giảm hoat động sinh học Mặc dù việc thay thế nguyên tử S trong cysteine với một nhóm CH2 ([CH2- S] -OT) vẫn duy trì ái lực và hoạttính Việc thay thế cystein với selenocystein hoặc tellurocystein không có ảnh hưởng lớn đến hoạt động chức năng, mặc dù giảm ái lực kết hợp 10 lần đã được quan sát khi thay thế cả hai cystein Đồng thời cho thấy sự ổn định trong hyết tương của con người ở nhiệt độ cao (550C) [36], [37].

1.3.3 Tạo hệ đệm chứa ion kim loại.

Oxytocin là ổn định nhất ở pH hơi acid (pH ~ 4.5) Ở pH có tính axit cao (pH <3), peptide có thể chịu sự thủy phân, trong khi ở pH trung tính thì Oxytocin sẽ dimer hóa hoặc trimer hóa dẫn đến mất hoạt tính

Nghiên cứu của Avanti đánh giá độ ổn định của oxytocin trong nước bằng cách sử dụng hệ đệm

để lưu trữ (citrate, axetat hoặc aspartate, pH 4,5) kết hợp với các ion kim loại hóa trị I (Na+, K+ ) hoặc các in kim loại hóa trị II (Ca2+, Mg2+ và Zn2+) Kết quả cho thấy rằng khi bảo quản dung dịch có chứa Ca2+ (50 mM) và Zn2+ (2-50 mM), sự ổn định được tăng lên từ 60 % đến 100 % ở

40C, tuy nhiệt ở nhiệt đô cao không cải thiện được Sử dụng kim loại hóa trị II và dung dịch đệm citrate, aspartat thì cải thiện đáng kể ở nhiệt độ cao (550C), với nồng độ ion kim loai là 2mM [38] Người ta chứng minh rẳng ở 700C, việc phân hủy liên kết disufid giảm từ 20% - 70 % trongdung dịch chứa ion kim loại Zn và đệm aspartate Các chứng minh trên cho thấy liên kết disulfid Cys 1- Cys6 được bảo vệ ở dung dịch đệm chứa ion kim loại [39], [40], [41]

1.3.4 Bột khô công thức

Tạo ra các chế phẩm oxytocin dang bột khô với kích thước nano, bột siêu mịn để sử dụng qua đường hô hấp hoặc đường truyền tĩnh mạch thông thường bằng phương pháp phun sấy, đông khô, hoặc kỹ thuật tạo nano Việc sử dụng qua đường hô hấp giúp cho việc hấp thu tốt hơn đồng thời giải quyết sự kém bền trong dung dịch Nghiên cứu của Mc Intosh xác định thành phần chế phẩm gồm hỗn hợp glycine, leucine và manitol tạo ra các hạt kích thước từ 1 đến 5 Công thức

đã chứng minh hiệu quả tương đương dạng bột khô so với peptid tự nhiên và không gây tác dụng

co bóp ở mô khí quản Công thức này duy trì nhiệt độ thử nghiệm khá cao (500C) [42],[43]

1.3.5 Các phương pháp liên hợp với Oxytocin.

Đây là phương pháp gắn Oxytocin với các đại phân tử, nhằm mục đích tăng độ bền của phân tử, tác dụng của Oxytocin và giảm liều sử dụng oxytocin.

Cavallaro và cộng sự đã gắn kết Oxytocin vào N-succinnyl-oxytocin đã được chức năng hóa ở amin N –cuối với α, β-poly (N-2-hydroyethyl)-DL-aspartamid-poly (ethylene glycol) 2000 ( PHEA-PEG2000) kết quả tổng hợp được PHEA- PEG2000-oxytocin-succinyl Nghiên cứu thử nghiệm thủy phân trên in vitro cho thấy hợp chất trên ổn định ở pH 7,4 và trong huyết tương Đồng thời đánh giá hoạt tính sinh học trên ống nghiệm cho thấy ái lực kết hợp của oxytocin với thụ thể cải thiện đáng kể [44]

Với hướng nghiên cứu sử dụng β-cyclodextrin, olihosaccharide cyclic liên hợp với oxytocin bằng cách sử dụng cầu nố cacboxyl (kích hoạt bằng 1-hydrobenzotriazole và

dicyclohexylcarbodiimide) Kết quả cho thấy việc liên hợp có hiệu lực trên cơ tử cung tuy nhiên tác dụng giảm so với oxytocin và có tác dụng phụ gây ra cơn hen Do được sử dụng làm với các chỉ định khác [45]

Một hướng khác của Hudnut và Cook sáng chế vào năm 2004 kết hợp Oxytocin ( một số chất tương tự) vào vi nang poly ( lactic –co-glycolide) [46]

Như vậy, các phương pháp làm tăng độ bền vững và tác dụng của Oxytocin đang được quan tâm nhiều và đạt được một số thành tựu nhất định ,tuy nhiên còn gặp một số nhược điểm nên chưa được ứng dụng trong điều trị lâm sàng.

1.4 PHƯƠNG PHÁP PEGYL HÓA.

1.4.1 Polyethylen glycol.

Polyethylen glycol (PEG) là hợp chất cao phân tử có công thức cấu tạo

Hình : Công thức cấu tạo của polyethylene glycol

Bản chất là các chuỗi ehtylen glycol, có thể chất từ lỏng đến chất rắn như sáp, nhờn như dầu.Với trọng lượng phân tử thường từ 500 đến 20.000 Da PEG có đặc điểm là polymer trơ, hòa tantrong nước, không gây độc, không gây dáp ứng miễn dịch khi vào cơ thể [47], [48] Với những

đặc tính quan trong này, PEG là chất lý tưởng để sử dụng trong y học và công nghệ dược phẩmvới nhiều ứng dụng khác nhau Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng đơn thuần PEG trong cơ thể thìnhững tính chất không được ứng dụng Chỉ khi PEG được kết hợp với chất khác thì hiệu quả mớiđược bộc lộ

1.4.2 Đại cương về phương pháp pegyl hóa protein dược dụng.

Năm 1977, Frank Davies, Abraham Abuchowsky và các đồng nghiệp nghiên cứu sự kết hợpPEG với albumin huyết thanh, catalase thành công đã mở ra cho khoa học thế giới một kỷ thuậtmới để bảo vệ cấu trúc protein [49] Từ đó công nghệ Pegyl hóa được thiết lập và phát triển.Pegyl hóa là quá trình gắn các phân tử PEG với các phân tử khác như các peptid, protein vànhững đoạn kháng thể để cải thiện đặc tính và hiệu quả điều trị của thuốc [50] Bản chất của quátrình pegyl hóa là tạo liên kết đồng hóa trị của phân tử PEG với phân tử tham gia liên kết [ 51]

 Nguyên lý của phương pháp Pegyl hóa protein dược dụng

Quá trình pegyl hóa được quyết định bởi trung tâm ái điện tử của dẫn chất PEG Để gắn kết PEGvới 1 phân tử, cần thiết phải hoạt hóa PEG bằng cách tạo ra các dẫn chất có một nhóm chức năng

ở một hoặc cả 2 đầu của phân tử PEG Việc chọn nhóm chức năng dựa trên loại nhóm có khảnăng phản ứng sẵn có trên phân tử sẽ Pegyl hóa Đối với Pegyl hóa protein, các acid amin

thường có khả năng phản ứng gồm: lysin, cystein, histidin, arginin, acid aspetic, acid glutamic,serin, thronin, tyrosin, các vị trí protein dễ tham gia phản ứng là đầu N-tận (α-NH2) và đầu C-tận(-COOH), nhóm thiol (gốc Cys) và nhóm hydroxyl [52].

Tuy nhiên, cách thức phổ biến nhất tạo liên kết PEG-protein là hoạt hóa PEG với nhómchức năng thích hợp cho phản ứng với lysin (-NH2) và đầu N-tận (α-NH2) [52], [53] Trongtrường hợp này, PEG có thể được hoạt hóa bằng nhiều con đường biến đổi hóa học khác nhaunhư hình 1.6 [54]

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của những dẫn chất PEG hoạt hóa dùng cho phản ứng Pegyl hóa vào

nhóm amin(a) là PEG-dichlorotriazin, (b) PEG-tresylat, (c)PEG-aldehyd, (d) PEG-succinimidyl succinat, (e)PEG-imidazol carbonat, (f) PEG-phenyl carbonat, (g) PEG-succinimidyl carbonat, (h) PEG-benzotriazol carbonat và (i) PEG hoạt hóa kiểu ester

Dẫn chất PEG hoạt hóa phản ứng với protein trong những điều kiện xác định để tạo raliên kết protein-PEG Nguyên lý tổng quát của phản ứng này như sau:

PH C

O

C H

Trong đó: R1 là nhóm thế, R2 là nhóm chức tham gia liên kết, R3 là liên kết

 Ưu nhược điểm của protein được Pegyl hóa (protein-PEG)

Trong Pegyl hóa protein dược dụng, những đặc tính đặc biệt của PEG làm thay đổi một số đặcđiểm của phân tử protein như: sự thay đổi về hình thể, tính tan, sự đáp ứng miễn dịch, có thể gâyảnh hưởng tới ái lực liên kết của thuốc với các receptor tế bào, có thể thay đổi sự hấp thu, phân

bố thuốc trong cơ thể [54] Điều này tạo nên những ưu điểm của protein-PEG như sau:

- Các nhóm hydroxyl của PEG kéo các phân tử nước của môi trường vào hợp chất, làm tăngquá trình solvat hóa của protein Mặt khác, PEG còn có phần hữu cơ nên làm tăng khả năng hòatan của protein trong nhiều dung môi phân cực và không phân cực Như vậy, Pegyl hóa làm tăng

độ hòa tan và tính linh động của protein trong máu và các dịch sinh lý Do đó hiệu quả điều trịcủa thuốc protein-PEG cao hơn so với sử dụng protein tự nhiên với hàm lượng tương tự [54]

- PEG làm tăng kích thước phân tử protein, giúp phân tử protein-PEG khó đi qua mao quảnthận hơn Do vậy việc thải trừ thuốc khỏi thận bị giảm xuống, hợp chất được giữ lại trong cơ thểlâu hơn [54], [55]

- PEG như các “cánh tay” xung quanh phân tử protein, tạo khoảng không giữa protein vớimôi trường Do đó, protein được bảo vệ tránh khỏi hiện tượng tiêu hủy do các tác nhân hóa lý(nhiệt độ, pH…), các enzyme tiêu hóa protein, các đại thực bào và các kháng thể Đồng thời,tránh được sự nhận diện của hệ thống miễn dịch, do đó giảm tính sinh miễn dịch cảu protein[55]

- Trong môi trường lỏng, một tiểu đơn vị ethylen oxid kết hợp khá bền vững với 2-3 phân tửnước, như vậy chuỗi polymer sẽ di động và chính sự di động này làm phân tử PEG có thể tíchquét (chiếm chỗ) lớn Thể tích quét làm cho protein Pegyl hóa tác dụng gấp 5-10 lần một protein

hòa tan có trọng lượng phân tử tương tự Sự gia tăng thể tích này làm tăng cường tác dụng dượcđộng học và dược lực học của protein-PEG Hợp chất PEG-thuốc làm giảm độc tính của thuốc,giảm khả năng gây dị ứng với cơ thể, tác dụng phụ của thuốc thấp hơn Đặc tính của thuốc đượccải thiện, hiệu quả điều trị nâng cao [54], [55].

- PEG làm tăng kích thước phân tử protein, giúp phân tử protein-PEG khó lọt qua mao quảnthận hơn Do vậy việc thải trừ thuốc khỏi thận bị giảm xuống, hợp chất được giữ lại trong cơ thểlâu hơn [54]

Những ưu điểm kể trên của thuốc được Pegyl hóa làm tăng hiệu quả điều trị của thuốc, làmgiảm liều dùng, tăng khoảng liều đưa thuốc vào cơ thể thuận lợi cho bệnh nhân trong quá trìnhđiều trị

Hợp chất protein-PEG cũng có những nhược điểm PEG bảo vệ cấu trúc protein, và trongmột số trường hợp nó “che kín” cả trung tâm hoạt động và vị trí kết hợp với receptor, ngăn cảnthuốc liên kết với receptor Điều này làm giảm hoặc thậm chí mất tác dụng của thuốc Khắc phụcnhược điểm này bằng việc điều chỉnh thay đổi vị trí Pegyl hóa ra xa phần hoạt động của protein[54]

1.4.3 Pegyl hóa Oxytocin.

 Pegyl hóa vào đầu N-tận trong phân tử Oxytocin

- Sử dụng dẫn chất do alkyl hóa mPEG

Dẫn chất aldehyd của PEG là dẫn chất hay sử dụng

Sự ngưng tụ của aldehyd với N-tận của protein , ban đầu thông qua sự hình thành các sản phẩmcủa imin (Schiff base) Các bazơ Schiff có khả năng đảo ngược dễ dàng thành các amin bậc hai

ổn định trong dung dịch có một tác nhân khử như natri borohydrid (NaBH4) hoặc natricyanoborohydrid (NaCNBH3), quá trình này được gọi là amination khử NaCNBH3 thường được

sử dụng hơn do làm phản ứng xảy ra nhanh hơn và có chọn lọc làm giảm hợp chất trung gianSchiff và không làm giảm aldehyd hoặc cacbonyl ít phản ứng khác có trong dung dịch [56], [57]

Hình 1.8 Quá trình khử amin qua trung gian tạo bazơ Schiff

pH là yếu tố rất quan trọng trong quá trình tổng hợp, trong đó tác nhân khử iminthành amin (NaCNBH3) tốt nhất ở pH 6,5-8,5 Mặc dù điều chỉnh pH đến điều kiện acidnhẹ (pH 4,5) là điều kiện phản ứng thích hợp của aldehyd và amin, cho phép sự kết hợpchọn lọc của amin đầu và cuối[58], [59]

Ngoài ra, có thể dử dụng dẫn chất PEG- tresylated, và dẫn chất PEG –epoxydthực hiện pegyl hóa ở nhóm amino [60]

- Sử dụng dẫn chất do acyl hóa mPEG

Dẫn chất este của N- hydroxy succinid với các mPEG carboxylic acid (PEG-NHS)- đây là dẫnchất tiêu biểu để pegyl hóa bằng cách este hóa gốc amin của Oxytocin Các thuốc thử NHS estephản ứng với các nucleophil (như amin nucleic), với việc giải phóng N-hydroxy succinimid dẫnđến liên kết amid ổn định với peptid hoặc protein [61]

Hình 1.7 Phản ứng của NHS ester và một peptidPhản ứng được tiến hành dưới điều kiện kiềm nhẹ chẳng hạn đệm bicarbonat pH từ 8,5 đến 9,5

và ở nhiệt độ thấp (4-250C) trong thời gian ngắn 1h

Tuy nhiên, chất phản ứng NHS bị thủy phân nhanh trong nước dẫn đến khó khăntrong hình thành nhóm succinimidyl ester, với thời gian bán thải giảm đáng kể khi giatăng pH Bằng cách thêm một nhóm sulfonat, phản ứng xảy ra chậm, làm tăng khả nănghòa tan trong nước, cho phép phản ứng ghép được thực hiện trong điều kiện nước tạoSulfonat NHS este Cũng có báo cáo rằng thuốc thử succinimidyl có thể không phản ứngchọn lọc với các amin, đặc biệt phản ứng với các amin acid như tyrosin, histidin và serin[62], [63], [64]

- Sử dụng dẫn chất acid carboxylic của PEG

Sự liên kết của các nhóm carboxylat với các amin để tạo thành các liên kết amid.

Sử dụng các hợp chất carbodiimid như 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid.HCl (EDC) hoặc dicyclohexylcarbodiimid (DCC) kích hoạt các nhómcarboxyl để thay thế bằng các amin phản ứng Phản ứng xảy ra trong pH acid làm giảm

độ bền của protein nên hiệu suất thấp cũng như ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm sauphản ứng tổng hợp [65]

Hình 1.9 Liên hợp với các nhóm Cacboxylic

 Pegyl hóa vào cầu nối disulfid của Oxytocin

Việc tác động vào cầu nối disulfid không phải lúc nào cũng thuận lợi để tăng lựcliên kết disulfid trong protein hoặc peptid, vì nó là yếu tố quan trọng để duy trì cấu trúccủa protein hoặc tác dụng sinh học Gần đây đã có một số phương pháp liên hợp đượcbáo cáo cho phép bảo tồn được cầu nối disulfid với 2 hoặc 3 cầu disulfid cacbon và ít gây

ra những thay đổi trong cấu trúc của protein và peptid [66], [67]

- Sử dụng dibromo hoặc dithiomaleimid tạo cầu nối cacbon sulfidDibromomaleimid là chất để tạo phức hợp với Oxytocin tại cầu nối disulfid, bằngcách chèn thêm một cầu nối vào disulfid [68] Phức hợp này trong các điều kiện thửnghiệm invitro giải phóng ra và bảo tồn cấu trúc Oxytocin Mặt khác, phức hợp này làmtăng độ bền của phân tử Oxytocin Sử dụng Dibromomaleimid để Pegyl hóa là một chấtphản ứng thuận lợi nhưng khó khăn trong giải phóng disulfid từ phức hợp PEG với củaprotein [69] Phản ứng được tiến hành ở pH 7,5-8,5 Khi ở pH cao hơn ,bên cạnh phảnứng ở cầu nối disulfid còn xảy ra ở các amin

Hình 1.10 Gắn hợp chất dibromo và dithiomaleimid tạo cầu nối cacbon sulfid

Phương pháp tạo cầu nối disulfid của Oxytocin được mở rộng khi tạo phức vớihợp chất dithiomaleimid, phản ứng xảy ra tương tự với quá trình tạo phức hợp củadibromomaleimid với Oxytocin [70], [71]

- Phức hợp disulfid với các hợp chất asen

Phương pháp được phát triển gần đây là sử dụng các phân tử PEG có chứa asenlàm các chất kết nối với cầu disulfid Các phản ứng dựa vào ái lực của nhóm As (III) vớicác thiol tạo thành chelat khá chặt chẽ Làm tăng lực liên kết ở cầu disulfid và tăng độbền phân tử Oxytocin Đây là phương pháp thay thế cho phương pháp tạo phức với cáchợp chất cầu nối dibromo/ dithiomaleimid Các phức hợp arsenic này đã được chứngminh là có thể đảo ngược trong sự hiện diện của các dithiol khác để tạo chelat chéo, nhưgiảm lipoic acid, cho phép cơ chế giải phóng Oxytocin được dễ dàng Tuy nhiên, tácdụng của các hợp chất asen giải phóng trong cơ thể chưa được đánh giá [72]

- Liên hợp cầu nối ba nguyên tử cacbon Vinyl sulfon/ bis-sulfon

Vinyl sulfon là một nhóm các chất phản ứng ở các vị trí đặc biệt Phản ứng thôngqua bổ sung vào các nhóm sulfhydryl lần lượt ở pH kiềm, tạo ra các liên kết β-thioether

ổn định [73], [74] Năm 2006 một phương pháp chọn lọc để nhắm mục tiêu và tạo ra liênkết giữa mạch ba carbon dựa trên các phản ứng của thiols với vinyl sulfon [75], [76]

Một chất phản ứng bis-sulfon được tổng hợp có thể được sử dụng để cải tiếnpeptid tại một vị trí đặc hiệu, và đặc biệt trong trường hợp các liên kết disulfid yếu, theocách tương tự như dibromo/ dithiophenolmaleimides Sau khi giảm lực liên kết disulfidtheo quy trình, việc thêm β'-monosulfon α, β không bão hòa được thực hiện với chất thiolđầu tiên Điều này lần lượt tạo ra một liên kết đôi thứ hai mà có thể trải qua bổ sung khácvới thiol thứ hai Sự liên hợp này tạo ra một cây cầu ba cacbon qua vị trí của disulfid giữlại cấu trúc của peptid và ngăn ngừa làm mất hoạt tính của Oxytocin Đây là một kỹ thuậtliên hợp khó thực hiện do kỹ thuật phức tạp, và khó tinh chế được hợp chất tinh khiết sauphản ứng [77]

 Pegyl hóa vào đầu C-tận trong phân tử oxytocin.

Các dẫn chất của PEG phản ứng với nhóm acid carboxylic trong môi trường tác nhân kết hợpnhư DCC và EDC trong điều kiện acid tạo ra liên kết amid Hai dẫn chất thường sử dụng là dẫnchất amin và dẫn chất hydrazid của PEG.Do phản ứng có thể xảy ra liên kết chéo với các amincủa protein Để tránh liên kết chéo đó, người ta sử dụng dẫn chất PEG-hydrazid [78]

 Pegyl hóa vào nhóm hydroxyl trên phân tử Oxytocin.

PEG – epoxid phản ứng với nhóm hydroxyl ở môi trường kiềm (8,5- 9,5) Cầu nối được hìnhthành trong khoảng 14-25h tại 4-250C [79]

Ptpu

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU PEGYL HÓA CÁC PROTEIN VÀ OXYTOCIN.

Các nghiên cứu về PEG hóa protein đã được quan tâm từ rất lâu Đến hiện nay, cáctác giả ngày càng quan tâm nhiều hơn lĩnh vực này đặc biệt là các ứng dụng trong nghànhDược và sản phẩm nâng cao hiệu quả điều trị của thuốc

Ranganath năm 2015, đã nghiên cứu so sánh tác dụng của interleukin-6 và hợp chất pegylhóa interleukin-6 ( Peginterleukin -6) Kết quả cho thấy Peginterleukin-6 có tác dụng củainterleukin-6 và kéo dài thời gian bán thải của thuốc ở loài gặm nhậm và khỉ [80]

Kletzl và cộng sự đã thử nghiệm năm 2017 tác dụng Insulin tái tổ hợp bằng PEG trên 62tình nguyện viên Kết quả cho thấy thời gian bán thải của thuốc từ 14-20 giờ, không xảy ra

hạ đường huyết sau khi sử dụng [81]

Jennifer Collins và nhóm nghiên cứu năm 2016 đã thực hiện tổng hợp pegyl hóa oxytocin

và xác định độ bền của sản phẩm trong quá trình bảo quản Kết quả cho thấy lượng

Oxytocin còn lại sau 28 ngày ở 500C là 2,5 %, trong khi với hợp chất pegyl hóa thì 93,5 % cac 86,5 % tương ứng với phức hợp Oxytocin-NHS và Oxytocin-mPEG còn lại [82] Tại Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu quan tâm đến vấn đề pegyl hóa các protein làm tiền thuốc Nâng cao ổn định cũng như tác dụng điều trị của thuốc.

Thầy Nguyễn Văn Rư (2017) đã nghiên cứu tổng hợp sản phẩm pegyl hóa từ Insulin tụy lợn và mPEG-CHO với điều kiện thích hợp, xây dựng được qui trình kỹ thuật xác định hiệusuất gắn kết sản phẩm đạt 96,9 % Tinh chế và đông khô thu sản phẩm dạng bột Xác định được khối lượng phân tử sản phẩm Insulin-mPEG là 17,8 kDa, kết quả 1 phân tử mPEG aldehyde 12,0 kDa gắn kết vào vị trí –NH2 nhạy cảm ở đầu chuỗi β của Insulin Khảo sát

độ bền protein ở 3 môi trường là dịch nước bọt, dịch vị và dịch tụy nhân tạo., sau 3 giờ sự thủy phân protein trong khoảng 10-25% so với sự thủy phân Insulin tự nhiên là 100% [83].Nghiên cứu tổng hợp Oxytocin-PEG hiện chưa có nghiên cứu được thực hiện ở Việt Nam Các nghiên cứu trên thế giới đã thực hiện tổng hợp Oxytocin-PEG và thử nghiệm đặc tính,

độ bền trong bảo quản Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài này

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên vật liệu

* Nguyên liệu

- Oxytocin: dạng bột vô định hình màu trắng, độ tinh khiết trên 97%

Xuất xứ: Đức (hãng sigma aldrich) Code: O6379 CAS: 50-56-6

- Methoxy polyethylene glycol propion aldehyd 5 kDa: dạng bột màu gần nhưtrắng, độ tinh khiết 98%

Công thức: CH3O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-CHO Xuất xứ: Đức (hãng sigma aldrich) Code: JKA3039

* Hóa chất

- Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3), Acrylamid, Bis - acrylamide,Tris(hydroxymehtyl) aminomethan, Sodium dodecyl sulfat, Sephadex G50,chymotrypsin, α- amylase, pepsin, pancreatin, Alpha-lactalbumin, Chymotrypsin, Insulin,Lactoglobulin và Cytochrome C đạt TC DĐVN4 [1] (các hóa chất nhập của hãng Sigma)

- Hydroxylamin hydrochlorid, acid acetic, ethyl acetat, aceton, toluen, acidchlohydric, ethyl ether, natri hydrocarbonat, natri phosphat, dichloromethan, natri sulfat,ethyl natri sulfat, dicyclohexyl carbodiimid (DCC), kali dihydrophosphat, ammoniumpersulfat, dithiothreitol (DTT), glycerol, bromophenol blue, glycine, coomassie blue, acidacetic, methanol, natri dihydrophosphat monohydrat, tetramethylethylenediamin(TEMED), natri hydroxyd, natri carbonat được sản xuất tại Trung Quốc

- Cồn tuyệt đối sản xuất tại Việt Nam

2.1.2 Dụng cụ máy móc

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA (Đức)

- Bơm hút chân không KNF (Đức)

- Cân kỹ thuật Sartorius (Đức)

- Nồi đun cách thủy HH.11-2-II (Trung Quốc)

- Máy đo quang UV- Vis UVD 2950 (Mỹ)

- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204S (Thụy Sỹ)

- Cột sắc ký buret 25ml