Thiết lập quy trình phát hiện một số đột biến trên gen FLT3, NPM1 và CEBPA gây bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy ở bệnh nhân việt nam

Tuy nhiên, bên cạnh các tổn thương ở cấp độ NST có thể phát hiện được áp dụngxét nghiệm này, xấp xỉ một nửa số bệnh nhân AML mang các đột biến gen và có kiểu hình nhân bình thường normal

TR ÊN GEN FLT3, NPM1 VÀ CEBPA G ÂY BỆNH UNG T H Ư

Chủ trì đề tái: TS Phạm Bảo Yêu

Phòng I hỉ nghiệm trọng đicm Công nghộ Fnzym và Prolein

ỉ rường Dại học Khoa học Tự nhicn

H à N ội, 2014

&

PHẦN I THÔ N G TIN CHU NG

1.1 Tên đề tài/d ự án:

Thiết lập quy trình phát hiện một số đột biến trên gen FLT3, NPM1 và CEBPA gây

bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy ở bệnh nhân Việt Nam

1.2 M ã số: KLEPT.12.02

1.3 Danh sách chủ nhiệm , th àn h viên tham gia thự c hiện đề tài/d ự án

TT Chức danh, học vị, họ và tên Đon vị công tác C hức danh thực hiện

đề tài/d ự án

Truyền máu Trung ương

Uy viên

1.4 Đơn vị chủ trì: Đại học Khoa học T ự Nhiên

1.5 T hòi gian thực hiện:

1.5.1 Theo họp đồng: từ tháng 8 năm 2012 đến tháng 8 năm 2014

1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng 2 năm 2015

1.5.3 Thực hiện thực tể: từ tháng 8 năm 2012 đến tháng 11 năm 2014

1.6 N hững th ay đổi so vói th u y ết m inh ban đầu (nếu có):

(Ve mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và to chức thực hiện; Nguyên nhắn; Y kiên của Cơ quan quản lý)

Thay đổi thời gian nghiên cứu:

Thời gian theo hợp đồng: Từ tháng 8 năm 2012 đến hết tháng 8 năm 2014

Thời gian thay đổi: Từ tháng 8 năm 2012 đến hết tháng 2 năm 2015

1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 500 triệu đồng

PHẦN II TỌNG QUAN KÉT QUẢ NG HIÊN c ử u

1 Đ ặt vấn đề

Các tế bào máu là thành phần thiết yếu của hệ tuần hoàn, trong đó hồng cầu (ethryocyte) chịu trách nhiệm đảm bảo cho cơ thể có đầy đủ oxy để tạo ra năng lượng, còn bạch câu (leukocyte) đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể tránh khỏi sự xâm nhập cua các yểu tố gây bệnh Ưng thư máu, cụ thể là ung thư bạch cầu,xuất hiện ở cả đối tượng người lớn và trẻ em, là một rối loạn huyết học xuất phát từ những đột biến ở tế bào gốc máu, những tế bào đầu tiên trong quá trình sản sinh bạch cầu, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng miễn dịch của người mắc bệnh thông qua việc tạo ra những bạch cầu bất thường Tùy theo tính chất cấp (acute) hay mạn (chronic) và phân loại tế bào dòng tủy (myeloid) hay dòng lympho mà bệnh được chia làm 4 loại phụ, trong đó, ung thư bạch cầu cấp tính dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia - AML) là dạng đặc biệt nguy hiểm do tốc độ tiến triển nhanh và và rối loạn diễn ra ở tất cả các loại bạch cầu, trừ bạch cầu lympho [Giles, 2002; Gunz, 1990]

Thống kê cho thấy, mỗi năm, số bệnh nhân ung thư máu nhập Viện Huyết học Truyền máu Trung ương đều gia tăng, và trong tổng số bệnh nhân có tới 2/3 mẳc ung thư bạch cầu cấp dòng tủy [Trần Thị Minh Hương, 2002].Bệnh nhân nếu không được chẩn đoán, điều trị kịp thời và hiệu quả sẽ sớm tử vong do các biến chứng nhiễm trùng, chảy máu, thiếu máu Kỹ thuật karyotyping kiểm tra kiểu hình nhân tế bào là một phương pháp xác định tổn thương NST ở bệnh nhân AML được sử dụng phổ biến ở Việt Nam cũng như trên thế giới [Khalidi, 1998] Tuy nhiên, bên cạnh các tổn thương ở cấp độ NST có thể phát hiện được áp dụngxét nghiệm này, xấp xỉ một nửa số bệnh nhân AML mang các đột biến gen và có kiểu hình nhân bình thường (normal karyotype, AML-NK) sẽ bị bỏ qua [Bene, 1999] Đáng lưu ý là, theo các nghiên cứu trên thế giới, loại gen, sổ lượng và kiểu đột biến

là những yểu tố quan trọng ảnh hưởng đến tiên lượng bệnh, từ đó bác sỹ có thể đưa ra phác

đồ điều trị họp lý, làm tăng khả năng sống sót của người bệnh [Naoe, 1999] Chính vì vậy, việc phát triểncác quy trình phù hợp để phát hiện những đột biển gen thường gặpcó ý nghĩa tiên lượng bệnh là một nhu cầu cấp thiết, đặc biệt là ở Việt Nam, nơi các bệnh viện chưa sử dụng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử.Trong số các gen liên quan đến AML, đột biến trên ba

gen Nucleophosmin 1 (NPM1), Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3), và CAAT enhancer

binding protein alpha (CEBPA) có tần suất xuất hiện cao nhất, chiếm tỉ lệ lần lượt là 40-

45%, 20-25%, và 10-15% số ca mắc bệnh[Ammatuna, 2005; Calvo, 2009; Dốhner, 2005; Yamamoto, 2001; Lin, 2005]

Gen NPM1 nằm ở nhiễm sắc thể số 5, bao gồm 12 exon, mã hóa cho một

phosphoprotein tham gia vào quá trình lắp ráp và vận chuyển các tiểu phần ribosome qua

màng nhân [Lim, 2006] Có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng đột biến gen NPM1 có đáp ứng tốt với hóa trị liệu [Dõhner, 2005] Hai loại đột biến phổ biến trên genNPM l được công bố là

đột biến chèn thêm bốn nucleotide tại vị trí 959, và đột biến kép gồm mất trình tự GGAGG tại vị trí 965-969 và thêm chín nucleotide [Falini, 2005] Cả hai loại đột biển này đều làm

tăng chiều dài gen NPM1 thêm bốn nucleotide, đẫn đến việc mất một hoặc hai phân tử

trytophan cần thiết cho quá trình vận chuyển vào nhân của protein [Falini, 2005] Đe phát

hiện đột biến tăng thêm 4 nucleotide trên gen NPM1, chúng tôi triển khai sử dụng phương

pháp khuếch đại đoạn gen (PCR) kết họp với điện di phát hiện đa hình cấu trúc mạch đơn (PCR/SSCP) Phương pháp này dựa vào sự di chuyển theo cấu trúc không gian của mạch ADN sau khi biến tính, và lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1989 để phát hiện những sai khác một vài nucleotide trên gen [Orita, 1989]

Gen FLT3 nằm ở nhiễm sắc thể 13 (13q 12.2), bao gồm 24 exon, mã hóa cho protein

FLT3, thuộc thụ thể tyrosine kinase (receptor tyrosine kinase-RTK) lớp III [Agnes F, 1994]

Hai kiểu đột biến thường gặp nhất trên sen FLT3 là lặp đoạn ITD (intemal tandem duplicaíion) và đột biến điểm TKD (tyrosine kinase domain) Đột biến FLT3-ITD có kích thước từ 3-400 bp ở exon 14-15 mã hóa cho vùng cận màng của FLT3 [Meshinchi, 2008] Đột biến FLT3-TKD thường xảy ra ở vị trí D835 và 1836 tương đồng với đột biến điểm được tìm thấy ởcác RTK khác như đột biến D816 ở C-KIT và C969 ở gen FM S [Yamamoto, 2001; Kim, 2010] Các phương pháp thường được sử dụng để phát hiện đột biến FLT3 là PCR kết họp với điện di và PCR-RFLP Sự xuất hiện đột biến trên gen FLT3 làm tăng khả

năng tự bảo vệ củatế bào ung thư chúng, gây ra những phản ứng kháng thuốc, làm giảm hiệu quả của việc điều trị [Gilliland, 2002; Bagrintseva, 2005 ; Kiyoi, 1998] Vì vậy, những

hiểu biết về các loại đột biến trên gen FLT3 sẽ giúp xây dựng phác đồ điều trị phù hợp và

tìm ra thuốc ức chế thụ thể FLT3 cho bệnh AML [Bagrintseva, 2005]

CEBPA là một protein thuộc họ Leucine Zipper, là một trong những yếu tố phiên mã tham gia quá trình biệt hóa của bạch cầu hạt, bạch cầu đơn nhân, tế bào tạo mỡ, tế bào gan

[Darling, 1998] Protein này được mã hóa bởi gen CEBPA không có intron, bao gồm 2783

b p v à nằm ở NST số 19 [Hendricks-Taylor, 1992] Hai loại đột biến gen CEBPA thường gặp

nhất là đột biến mất đoạn ở đầu 5’ và đột biến làm tăng kích thước ở đầu 3’ Những trình tự

ngắn được chèn thêm hoặc lặp lại ở vùng bZIP thuộc đầu c làm mất khả năng bám vào

ADN của protein; trong khi, đột biến thay đổi khung đọc mở ở đầu N làm mã kết thúc xuất hiện sớm hơn, thay vì tạo ra phân tử nguyên vẹn (42 kDa), những protein không hoàn thiện được hình thành (với kích thước xấp xỉ 30 kDa) [Fuchs, 2010] Những nghiên cứu gần đây

cho thấy có một số kĩ thuật khác nhau nhằm phát hiện đột biến CEBPA/bZIP như điện di và

giải trình tự trực tiếp [Fuster, 2012]

Các nghiên cứu về bệnh ở trong nước dựa trên các phương pháp chẩn đoán ung thư máu truyền thống như kiểm tra lâm sàng, quan sát hình thái, hóa tể bào hay xác định dấu ấn miễn dịch không thể chỉ ra những thay đổi ở cấp độ phân tử Đây là một hạn chế đối với việc tiên lượng và xây dựng phác đồ điều trị Bệnh nhân AML mang các đột biển khác nhau

sẽ phản ứng khác nhau với các phương pháp trị liệu (phóng xạ hay hóa chất, loại thuốc sử dụng) Tóm lại, đối với cả ba gen nêu trên, ở Việt Nam, việc pháttriển và chuẩn hóa các quy trình phát hiệnvẫn chưa được đầu tư đúng mức để đưa ra ứng dụng rộng rãi ở các cơ sở y tế

2 M ục tiêụ

Thiết lập được quy trình phát hiện chính xác một số đột biến trên ba gen: FLT3,

NPM1, CEBPAhay gặp trongung thư bạch cầu cấp dòng tủy cho bệnh nhân tại Việt Nam

Bước đầu so sánh tỉ lệ cũng như tần suất xuất hiện của các đột biến gen FLT3, NPM Ỉ,

CEBPA ở bệnh nhân Việt Nam so với trên thế giới, từ đó giúp ích cho việc tiên lượng và áp

dụngphác đồ điều trị phù họp sau khi chuyến giao quy trình đến cơ sở y tế

Chuyển giao được quỵ trình phát hiện một số đột biến trên ba gen: FLT3, NPM1,

CEBPA cho một cơ sở y tế để có thể bước đầu ứng dụng trong tiên lượngbệnh ung thư bạch

cầu cấp dòng tủy tại Việt Nam

3 P hư ơng p h áp nghiên cứu

Tinh sạch A D N từ mẫu m áu

156 mẫu máu của người bệnh AM L được thu thập từ Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương.Các mẫu này được chia nhỏ vào các ống eppendorf, mỗi ống chứa 200 í-il mẫu máu tổng số Hồng cầu được loại bỏ bằng dung dịch ly giải RBC (Gồm 155 mM NH4C1, 10

mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) Sau đó, ADN được tinh sạch sử dụng bộ kít QIAamp DNA blood mini (Qiagen) Nồng độ và độ tinh sạch của ADN được xác định bằng cách điện

di Irên gel agarose 1% kết hợp với đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng A260

-3

Khuếch đại vùng gen chứa các đột biến nghiên cứu

Phản ứng khuếch đại đoạn gen NPM lcỏ kích thước 197 bp đối với mẫu thường và 201

NPM1 Jbrw ard(5’ ACCACATTTCTTTTTTTTTTTTTCCAGGCT 3') và NPM1 reverse

(5,_CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA_3’) (AITbiotech) Phản ứng trong tổng thể tích 25 Ịil gồm có 20 ng ADN tổng số; 10 pmol mỗi mồi; 0,2 mM mỗi loại dNTP; 1 unit enzyme Dream Taq ADN polymerase (Thermo Scientiíic) và 2,5 |al đệm Dream Taq 10X Chu trinh nhiệt của phản ứng khuếch đại như sau: 94°c trong 4 phút; 35 chu kỳ gồm 94°c trong 30 giây, 67 ° c trong 30 giây, 72°c trong 30 giây; và 72°c trong 4 giây

Đe phát hiện đột biến FLT3-ITD, cặp mồi đặc hiệu được thiết kế cho phản ứng PCR

nhằm khuếch đại đoạn gen có kích thước 329 bp với trình tự như sau: 11F: 5’- GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’; 12R: 5’-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC- 3’ [Yamamoto, 2001] Phản ứng chuỗi polymerase PCR được thực hiện với mỗi phản ứng (25 1^1) gồm 40 - 50 ng ADN tổng số; 10 pmol mỗi mồi; 0,2 mM mồi loại dNTP; 1 unit Dream Taq ADN polymerase, 2,5 |il đệm Dream Taq 10X Chu trình của phản ứng PCR như sau: 94°c trong 4 phút; 35 chu kì của 9 4 °c trong 45 giây, 56°c trong 45 giây, 72°c trong 1 phút; và 7 2 °c trong 5 phút

Trình tự mồi được sử dụng để nhân đoạn ADN 114 bp thuộc vùng TKD từ exon 17

vầFLT3_reverse (17R: 5’-GCAGCCTCACATTGCCCC-3’) [Yamamoto, 2001] (IDT)

Phản ứng chuỗi polymerase PCR được thực hiện với mỗi phản ứng (25 |il) gồm 40 - 50 ng ADN tổng số; 2 pmol mỗi mồi; 0,2 mM mỗi loại dNTP; 1 unit Dream Taq ADN polymerase, 2,5 ^1 đệm Dream Taq 10X Chu trình của phản ứng PCR như sau: 94°c trong

4 phút: 30 chu kì của 9 4 °c trong 30 giây, 58°c trong 30 giây, 7 2 °c trong 30 giây; và 72°c trong 10 phút

Nhằm phát hiện đột biến CEBPA-bZIP, một đoạn ADN 143 bp thuộc vùng này được khuếch đại sử dụng cặp mồi CEBPA-forward: 5'-TCGGTGGACAAGÃACAGC-S’; và

CEBPÁ-reverse: 5’-AGGCGGTCATT GTCAC TGG-3’ Các thành phần của phản ứng

PCR (25 jnl) bao gồm 2,5 nl đệm Dream Taq 10X; 0,2 mM cho mỗi loại dNTP; 10 pmol mỗi mồi; 1 unit Dream Taq ADN polymerase (Thermo Scientific); 5% DMSO và 20 ng ADN Hỗn hợp phản ứng PCR được trộn đều và thực hiện theo chu trình nhiệt như sau: 94°c ứong 5 phút; 35 chu kì của 9 4 °c trong 1 phút, 58 ° c trong 45 giây, 72°c trong 1 phút; cuối cùng 7 2 °c trong 15 phút

Điện di và phân tích p h ổ băng

Điện di agarose (A G E)

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose 2% trong đệm TAE lx (40mM Tris-base, 20mM acetic acid, lm M EDTA), hiệu điện thế 100V trong thời gian 40 phút đối với hệ thống SUB-CELL GT, và hiệu điện thế 90V trong khoảng 30 phút đối với hệ thống MINI-SƯB-CELL GT (Bio-rad), sử dụng marker 100 bp (Fermentas) Sau khi điện di xong, bản ge! được nhuộm với dung dịch ethidium bromide 0,5 ng/ml trong 5-10 phút và soi dưới đèn u v của hộ thống GelDoc (Bio-rađ)

Điện di polyacrylam ide (PA GE)

Nhàm phân tách nhũng đoạn ADN có chênh lệch về kích thước nhỏ hơn, sản phẩm PCR điợc điện di trên gel polyacrylamide 12,5 % trong đệm TBE IX ( 89mM Tris base, 2mM EDTA, 89mM axit boric), hiệu điện thế 120V trong thời gian 60 phút, sử dụng marker Lowrange (Permentas) Bản gel sau khi chạy xong được nhuộm bằng ethidium bromide 0,5

^g/ml và soi dưới đèn u v của hệ thống GelDoc (Bio-rad)

4

Đa hình cấu trú c m ạch đon (SSC P)

Một lượna 5 Ịil sản phẩm PCR được trộn với đệm íbrm am ide có 9,3 % íbrmamide, 5

%0 bromophenol blue, 5 %0 xylene cyanol, 2 mM EDTA, 1 mM NaOII and 12,5 % glycerol Đun nóng hỗn hợp trên ở 95°c trong 10 phút để biến tính ADN, rồi để trên đá ngay trong 10 phút Sau khi xử lý, mẫu PCR được điện di phân tích trên gel 10% polyacrylamide (29:1) có chứa 5% glycerol với MOV trong 45 phút Sau khi điện di, bản gel được nhuộm trong dung dịch 0,5 ng/ml ethidium bromide và quan sát dưới ƯV trong hệ thống GelDoc (Bio-Rad).Điện di trên gel U ltra p h o r

Một lượng 10 |ul sản phẩm PCR trộn 2 ^1 đệm mẫu 6X rồi tra trên gel 3% Ưltraphor agarose Điện di trong đệm TBE ở nhiệt độ khoảng 20-30°c với 400V trong 45 phút Bản gel được nhuộm trong dung dịch 0,5 Ịig/ml ethidium bromide và quan sát dưới ƯV trong hệ thống GelDoc (Bio-Rad)

F ragm ent A nalyzer

Một lượng 2 |il sản phẩm PCR được phân tích trong hệ thống điện di mao quản của Advanced Analytical Fragment Analyzer Ket quả được phân tích bằng phần mềm ProSize

2.0và xuất ra hình ảnh sổ của điện di

Đoạn gen FLT3-TKD 114 bp và đoạn gen CEBPA-bZIP 143 bp bình thường được

nhân dòng vào plasmid pGEM T easy Nhằm khuếch đại toàn bộ plasmid trên, hai cặp mồi phosphoryl hóa được thiêt kê chứa trình tự đột biên mong m uôn, gôm: cặp môi nhân đoạn

gen CEBPA là: CEBPA1407 forw ard (5’-CAACGTGGAGA A G A CG CAG C AỌ -3’ có chèn AAG) và CEBPA1407 reverse (5 ’-CG CTG CTTGG CCTTGTCG-3’); và cặp mồi nhân đoạn

ATCCAAAGTCACATATCTTCACCACTTTCC-3 ).Plasmid dạng mạch thẳng được nối

lại và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli D H 5a, sau đó,tế bào được nuôi trên môi

trườngLB-ampicillin và chọn ra những khuẩn lạc mang plasmid đột biến bằng PCR và/hoặc cắt enzyme giới hạn

PCR kết hợp với đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (PCR-RFLP)

Phản ứng PCR được thực hiện nhằm nhân đoạn gen FLT3-TK D 114 bp như mô tả ở

trên Sau đó, 6-8 ng sản phẩm PCR được trộn với 0,1 |il (20u/|il) enzyme giới hạn £coR V (New England Biolabs), 1 đệm và nước cho đủ 10 |il, đem ủ ở 3 7 °c trong 30 phút, bất hoạt ở 80°c trong 20 phút Ket quả quan sát được nhờ điện di trên gel polyacrylamide 12,5

Nhân dòng và đọc trình tự đoạn gen mang đột biến

Băng ADN mang đột biến đưực cắt ra khỏi gel agarose và được tinh sạch băng bộ kitWizard® s v Gel and PCR Clean-Ưp System (Promega) ADN tinh sạch được gắn vector pGEM T easy bàng enzyme T4 ligase Vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến

E cớ//DH5a theo phương pháp sốc nhiệt Te bào khả biến này được nuôi cấy trên đĩa thạch

môi trường LB (Luria-Bertani Broth) được trải 100 |ig/ml ampicillin, 20 mg/ml X-Gal and

20 mg/mỉ isopropyl thio-beta-D-galactoside (IPTG) Qua một đêm nuôi ở 3 7 °c, khuẩn lạc trăng từ đĩa được chọn và kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp bàng PCR với cặp mồi

5

pGEM-T easy forward (5’-GCTCiCAAGGCGATTAAGTTG-3*) và pGEM-T easy reverse (5’-GTTGTGTGGAATTGTCACG-3’) N hững khuẩn lạc có chứa vector tái tổ hợp được nuôi irong 1 ml môi trường LB, và tách plasmid bàng kít QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) Plasmid đã tinh sạch được gửi đi đọc trình tự ở Macrogen (Hàn Quốc).

4 Tổng kết kết q uả nghiên cứu

4.1 Tinh sạch và định lưọug ADN tổng số

ADN tổng số tinh sạch từ các mẫu máu của người thường và bệnh nhân AML sử dụng bộ kit Qiagen Ket quả điện di của AD N tổng số trên gel agarose 1% cho một băng duy nhất, không có vệt do ADN bị đứt gẫy Ket quả đo quang phổ chothấy nồng độ ADN tổng số vào khoảng 20-400 ng/nl, và chỉ số A26o/A28o là 1.8 đến 2, chứng tỏ mẫu ADN tinh sạch không bị lẫn ARN hay protein Ket luận, độ tinh sạch và lượng ADN tổng số là đủ để

sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR

4.2 Gen NPM1

Thiết lập quy trìn h p h át hiện đ ộ t biến NPM1

Đột biến tăng bổn nucleotide trên gen N P M Ỉ được phát hiện theo quy trìnhgồmhai bước chính: 1-Khuếch đại đoạn gen NPM1 với cặp mồi đặc hiệu, 2-Phân tích phổ băng của

sản phẩm PCR được điện di theo phương pháp SSCP hoặctrên gel Ultraphor agarose.Chi tiết từng bước được trình bày dưới đây

Khuếch đại đoạn gen NPM1 với cặp m ồi đặc hiệu

Theo tính toán lý thuyết, phản ứng khuếch đại từ ADN tổng sổ với cặp mồi đặc hiệu nhân lên một đoạn gen có kích thước 197 bp đối với mẫu thường và 201 bp đối với mẫu đột biên Theo hình 1, kết quả điện di của sản phẩm PCR từ ADN tổng số của người thường cho một băng duy nhất ở vị trí khoảng 200 bp so với thang chuẩn Kích thước này phù hợp với tính toán lý thuyết Như vậy, thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân lên thành công đoạn ADN nghiên cứu [Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014; Nguyễn Văn Huynh,2013]

M 1 2

200

100

H ình 1 Ảnh điện di sản p h ẩm P C R trên gel ag aro se 2 %

M: thang chua lĩ A D N 100 bp; 1: đoi chứng âm, 2: mâu người thường.

Phân tích sản p hẩm PCR theo phư ơ ng pháp SSC P trên gelpoỉỵacrylam ide 10%

Thành phần đệm Formamide và quy trình xử lý sản phẩm PCR theo phương pháp SSCP được tối ưu để thu được băng điện di sắc nét trên bản gel polyacrylamide 10% Dựa vào sự khác biệt của phổ băng ADN, có thể phân biệt các mẫu thành hai nhóm.Trong đó, một nhóm có xuất hiện thêm băng ADN ở vị trí khoảng 400 bp (Hình 2, các mẫu số 5, 6,

8), và băng này không xuất hiện ở nhóm mẫu còn lại (Hình 2, các mẫu 2, 3, 4 và 9) Nhóm

mẫu đầu tiên có khả năng là những mẫu mang đột biến tăng bốn nucleotide của gen NPM I

[Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014; Nguyễn Văn Huynh, 2013]

6

Hình 2: Sản p h ẩm P C R đ ư ọ c p h ân tích th eo SSC P trê n polyacrylam ide 10 %

M: thang chnân A D N lowrange; 1: đôi chứng âm; 5; 6; 8: nghi ngờ có đột biên NPM1; 2;

3; 4; 7; 9: mẫu không mang đột biến.

Phân tích sản phẩm PCR trên gel Ultraphor agarose

Điện di trên gel Ultraphor agarose3 % cho thấy sản phẩm PCR từ một số mẫu cho một băng ADN duy nhất tại vị trí 200 bp của thang chuẩn (Hình 3, mẫu số 2), trong đó, sản phẩm PCR từ một số mẫu khác cho hai băng ADN rất gần nhau Dựa vào tính toán theo thang chuẩn ADN lowrange, băng ADN ở phía trên có kích thước lớn hơn vài nucleotide so với băng ADN phía dưới, và là băng ADN có khả năng mang đột biến Do đó, phương pháp

điện di trên Ultraphor agarose 3 % có khả năng phân tách băng ADN thường và đột biến

trong sản phẩm PCR [Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014]

M I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ỉ O O l

L -ÊÍ ếm ằ im rn ^ lỆ

H ình 3 Đ iện di sản p h ẩm P C R trê n gel gel ag aro se U ltra p h o r 3 %

2: mâu người thường; những mâu còn lại - nghi ngờ mang đột biến.

Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phư ơ ng pháp PCR/SSCP

Hỗn hợp trộn plasmid thường và plasm id chứa đột biến N P M lc h tn 4 nucleotide

TCTG từ mẫu đã sàng lọcvới các tỷ lệ khác nhau được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR Ket quả SSCP của sản phẩm PCR từ hỗn hợp plasmid cho thấy rằng, phương pháp này có thể phát hiện được mẫu có 10%đột biến trở lên (Hình 4, mẫu từ 10% đến 90%) Trong khi

đó, mẫu có mang 100% đột biến cho kết quả âm tính do không có mặt đồng thời mạch ADN thường và ADN đột biến; tuy nhiên, mức độ đột biến 100 % chưa tìm thấy ở

genNPM l [Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014].

M (-) 0 10 20 3 0 40 50 60 70 80 90 100 M

H ình 4 Kiểm tr a độ nhạy của phư otig p h á p PC R /SSC P

M: Thang chuẩn AND; (-): Đ ổi chứng âm; 0-100: % đột biến NPM1 trong hon hợp.

7

Các mẫu ADN tổng số của bệnh nhân MELAS, bệnh nhân hội chứng Leigh, bệnh nhân hội chứng rối loạn cơ và bệnh nhân đột biến FLT3-ITD được dùng làm khuôn cho PCR và phân tích theo phưcmg pháp SSCP để xác định độ đặc hiệu của phương pháp Ket

quà cho thấy chỉ mẫu mang đột biến NPM1 cho kết quả dương tính, còn những mẫu khác

đều cho kết quả âm tính (Hình 5) Như vậy, phương pháp PCR/SSCP là đặc hiệu để xác

định đột biến NPM1 từ các bệnh nhân AML[Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014].

M

É

H ình 5: Xác định độ đặc hiệu của phương p h á p P C R -S S C P

1: Đối chứng âm 2, 3: M ầu có đột biến NPM1; 4, 5: Mau đột biến FLT3-ITD;

6: Hội chứng Leigh; 7: Hội chứng rối loạn cơ; 8, 9: Hội chứng M ELAS

Sàng lọc đột biến NPM1 trên bệnh nhân A M L và phân tích trìn h tự đ ộ t biến

Sàng lọc từ 156 bệnh nhân AML theo phương pháp PCR/SSCP, chúng tôixác định

được 50 mẫu có khả năng mang đột biến tăng 4 nucleotide trên gen N P M Ỉ, chiếm

32,l%[Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014].Mau người thường và 11 mẫu nghi ngờ là đột biến

NPM1 được chọn để nhân dòng và giải trình tự Ket quả so sánh với trình tự tham chiếu

trênGenBank (số NM 002520) cho thấy mẫu ADN từ người thường cho trình tự có mức tương đồng 100%, còn trình tự của mẫu nghi ngờ xuất hiện thêm bổn nucleotide thuộc các kiểu hình đã được công bố trước đây Theo đó, những đột biến chúng tôi tìm thấy thuộc loại

A (chèn 4 nucleotide TCTG), B (chèn 4 nucleotide CATG), D (chèn 4 nucleotide CCTG) và

J (chèn 4 nucleotide TATG) (Hình 6) Trong số 11 mẫuđã giải trình tự, 7 mẫu (63,6%) trong

số 11 mẫu thuộc đột biến loại A, 1 mẫu (9,1%) thuộc loại B, 2 mẫu (18,2% ) thuộc loại D, và

1 mẫu (9,1%) thuộc loại J [Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014] Kết quả này thống nhất với các nghiên cứu khác cho thấy loại A là đột biến thường gặp nhất, và loại J là ít gặp nhất [Boonthimat, 2008] Tất cả những đột biến này tạo ra protein dài hơn hơn protein thường (Bảng 1)

So sánh trình tự với trình tự tham chiếu của gen NPM1 (dòng đầu tiên), mẫu người thường

(dòng Nor), mau đột biến (loại A, B, D and J).

Bảng 1 T rìn h tự am ỉn o acid của m ẫu th ư ờ n g và m ẫu đ ộ t biến

mẫu) _

Mầu đột biến loại D L287CLAVEEVSLRK* 2 _

8

Mầu đột biến loại J L287CMAVEEVSLRK* 1

4.3 Gen FLT3

4.3.1 Đột biến FLT3-ITD

Thiết lập quy trìn h p h át hiện đột biến FLT3-ITD

Nhằm phát hiện đột biến FLT3-ITD, một quy trình được thiết lập gồm các bước sau: (1) Khuếch đại đoạn gen FLT3 với cặp mồi đặc hiệu; (2) Điện di sản phẩm PCR trên gel

agarose 2% và phân tích phổ băng Sau khi thiết kế, quy trình được thử nghiệm với 36 mẫu bệnh đầu tiên và 3 mẫu đối chứng không mang bệnh [Đỗ Thị Thanh Trung, 2014]

FLT3-ITD (Hình 7) Kết quả nhân dòng băng duy nhất của mẫu 19 và băng có kích thước

lớn hơn của mẫu 20 sau khi cắt khỏi bản gel, tinh sạch, và giải trình tự ADN tái tổ họp cho

thấy băng ở mẫu 19 có trình tự giống với gen FLT3 bình thường, còn băng có kích thước

lớn hơn ở mẫu 20 có chứa thêm một đoạn lặp 33 bp Điều đó khẳng định mẫu 20 là mẫu có

chứa đột biến lặp đoạn FLT3-ITD và quy trình phát hiện đột biến gen FLT3-ITD thiết lập

trên đã thành công [Vũ Quang Lâm, 2013; Đỗ THỊ Thanh Trung, 2014]

400 bp

300 bp

H ình 8: Tối ưu độ n h ạy của p h ản ứ ng P C R

(-): Đ ổi chứng âm của PCR; M: marker 100 bp; (+): đổi chứng dương là mau 2 0 p lasm id với nồng độ khuôn ban đầu; 1-9: mâu 2 0 p la sm id với các nồng độ khuôn pha loãng từ 10

đến 10'10

Đáng chú ý là khi kích thước đoạn lặp rất nhỏ khiến băng đột biến nằm sát với băng thường trên bản gel agarose có thể dẫn đến kết luận âm tính giả (mẫu không chứa đột biến)

9

Trong trường hợp này, nếu nồng độ khuôn quá cao, sản phấm PCR tạo ra nhiều, lúc điện di

sẽ cho băng sáng đậm càns gây khó khăn cho việc phân tích phổ băng Neược lại, đối với

những bệnh nhân mang đột biến FLT3-ITD có mức đột biến thấp (lượna, tế bào bạch cầu

mang gen đột biến ít hơn nhiều so với lượng tế bào bạch cầu mang gen không đột biến), nếu

sử dụng nồna, độ khuôn quá thấp có thể không quan sát thấy sàn phẩm khuếch đại của đoạn gen mang đột biến Đây cũne là một nguyên nhân dẫn tới kết quả xét nghiệm âm tính giả [Meshinchi, 2008] Nhằm tối ưu độ nhạy của quy trình, mẫu plasmid chứa đoạn gen thường

có nồng độ 400 ng/|il đã được pha loãng từ 1CT2 đến 10‘10 lần và dùng làm khuôn cho phản ứng PCR sử dụng Dream Taq polymerase Ket quả điện di trên gel agarose 2 % cho thấy khi pha loãng đến 10' 7 lần (tương đương với lượng ADN tổng số là 0,33 ng), lượng sản phẩm PCR tạo ra vẫn quan sát được băng rõ nét (Hình 8) [Đỗ Thị Thanh Trung, 2014]

Sàng lọc và p h ân tích đặc điểm đột biến FLT3-ITDỞ 156 m ẫu bệnh n h ân A M L Việt

Nam

Sau khi thực hiện phản ứng PCR với 156 mẫu, sản phẩm PCR từ 13 mẫu (8,4%) khi điện di thấy xuất hiện thêm băng cao hơn băng 329 bp gốc (Hình 9) Trong đó, có 5 mẫu đã được chọn lọc để nhân dòng và đọc trình tự Kết quả đọc trình tự cho thấy đoạn gen lặp lại được chèn ngay cạnh đoạn gen gốc và ở các vị trí khác nhau tùy từng mẫu Như vậy, phương pháp PCR cùng với điện di trên gel agarose là phương pháp thực nghiệm có thể

phát hiện đột biến gen FLT3-ITD ờ bệnh nhân AML Sử dụng quy trình trên quy mô phòng thí nghiệm đối với 156 m ẫu cho tỉ lệ xuất hiện đột biến FLT3-ITD ở bệnh nhân AML Việt

Nam là 9,0%[ĐỖ Thị Thanh Trung, 2014]

400 bp

300 bp

H ình 9: Đ iện di m ột số m ẫu có k h ả n ăn g chứ a đ ộ t biến FLT3-ITD

M: marker 100 bp; 1: đổi chứng âm; 6: mẫu người thường; 2: đổi chứng dương; 3-5, 7-12:

các mẫu có khả năng chứa đột biến FLT3-ITD

Điện di trên gel agarose không những cho phép phát hiện được đột biến FLT3-ITD

mà còn cho thấy một số đặc điểm có vai trò quan trọng trong tiên lượng Đầu tiên, mức đột biến có thể được xác định dựa trên so sánh mật độ sáng tính toán với phần mềm ImageJ 13 mẫui xuất hiện phổ băng đột biến có mức đột biến dao động trong khoảng từ 25% đến 70% Thứ hai, dựa trênđộ di động trên bản gel agarose của các băng marker 100 bp và của các

m ẫu có thể ước tính đoạn lặp có độ dài từ 20-90 bp Kết quả đọc trình tự khẳng định một số đột Ibiến có kích thước từ 24-63 bp gần đúng với kích thước ước tính trên (Bảng 2) [Đỗ Thị Thanh Trung, 2014] số liệu này phù hợp với công bố về kích thước đột biến trong một nghiên cứu khác trên thế giới, cho thấy đoạn lặp có độ dàitừ 15-174 bp là phổ biến nhất, chiếm 52% các trường họp [Meshinchi, 2008]

10

Bảng 2: Kích th u ó c và m ức đột biến của các đột biến FLT3-ITD

nhân (ước tính, bp) (giải trình tự, bp) (quan sát) (ước tính, %)

Đặc điểm phân tử của đột biến FLT3-ITD cũng được nghiên cứu bằng máy Fragment

Analyzer (AATI) (Hình 10) Ket quả cho thấy, chúng ta có thể quan sát được số lượng và độ dài đoạn chèn trong một mẫu dựa trên hình ảnh số, theo đó, số lượng đoạn chèn từ 1-3; kích thước đoạn chèn nằm trong khoảng25-96 bp, và mức đột biến có thể từ 4,6% đến 63,7% Như vậy, phương pháp đọc bằng máy Fragment Analyzer chính xác hơn (chỉ sai lệch 1-3 nucleotide), nhưng phân tích bằng ImageJ trên gel agarose là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện để phát hiện và nghiên cứu đặc điểm của các đột biến làm thay đổi kích thước của

iữo

t=t*

<-N

H ình 10 K êt quả phân tích băng máy F rag m en t A nalyzer của m âu 69

Đồ thị bên trái với những đỉnh nhọn cho thấy nồng độ của các đoạn AD N và kích thước tương ứng của những đoạn đó Bên phải là một hình ảnh gel số hỏa, trong đó N là băng

bình thường, * và ** chỉ các băng đột biến.

Trình tự nucleotiđe của đột biến FLT3-ITD được chuyển thành trình tự amino acid, cho thấy đột biến FLT3-ITD không làm thay đổi khung đọc mở Chỉ có một mẫu chứa đoạn

lặp ở intron, trong khi tất cả những mẫu còn lại đều chứa doạn lặp ở exon 14 Đoạn lặp ở các vùng khác nhau từ vị trí 597 đến 608 của trình tự protein FLT3 (Bảng 3) Đoạn lặp thường là đoạn nucleotide ở ngay trone, sen nhưne ở một số mẫu có 1-2 nucleotide neoại lai nằm ở phía vùng xa nhất ở đầu 5’ của đoạn lặp [Đỗ Thị Thanh Trung, 2014]

Bảng 3: T rìn h tự đột biên FL" r3-ITD

T hiết lập và tối U'U quy trìn h p h á t hiện đ ộ t biến FLT3-TKD

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thành công đối với việc thiết lập và tối ưu hóa

quy trình phát hiên đột biến FLT3-TKD D835 thông qua 3 bước: (1) Khuếch đại đoạn gen

FLT3 với cặp mồi đặc hiệu; (2) c ắ t sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn E coK V ; (3) Điện

di sản phẩm cắt trên gel polyacrylam ide 12% và phân tích Chi tiết các bước được trình bày

cụ thể sau đây

Tối ưu phản ứng khuếch đại đoạn 114 bp của gen FLT3

Nhằm tối ưu phản ứng PCR, chúng tôi thay đổi các điều kiện bao gồm nồng độ khuôn, nồng độ mồi, nồng độ Taq polym erase, và chu trình nhiệt Ket quả cho thấy sử dụng điều kiện mô tả trong phần Phương pháp nghiên cứucho phép nhân lên băng đặc hiệu nằm trong khoảng giữa hai băng 100 bp và 150 bp của thang chuấn ADN trên bản gel điện di (Hình 1 la) Sau đó, băng này được tinh sạch, nhân dòng và giải trình tự rồi so sánh với trình

tự gen FLT3 đã được công bố, cho thấy, băng có kích thước 114 bp như dự kiến vàtrình tự

hoàn toàn khớp với gen gốc Như vậy, có thể kết luận ràng chu trình nhiệt và thành phần phản ứng PCR là phù hợp để nhân lên đoạn gen mong muốn và mẫu đã đọc trình tự được coi là mẫu đối chứng thường cho các thí nghiệm sau

12

— 70

z GO

■ p

<c 40 114

Thòi gian ù máu

Hình 11: Tối ưu thòi gian ủ mẫu

a: Anh điện di sản phâm căt sản phâm PCR của gen FLT3 với các thời gian ủ khác nhau từ 30 giây đến 30 phút; (-) mau gốc; b: % băng 114 bp còn lại sau khi cắt Tối ưu phản úng cắt eniynte giới hạn

Nhằm so sánh và phát hiện mẫu đột biến bởi sự thay đổi phổ băng điện di sản phẩm PCR sau khi cắtenzyme giới hạn, đầu tiên phải xác định đầu vào của phản ứng cắt sao cho hiệu suất đạt 100% đối với mẫu không đột biến Vì vậy, cần phải tính toán một cách chính xác đế tối ưu lượng sản phẩm PCR, lượng enzyme sử dụng, cũng như thời gian phản ứng

Trong nghiên cứu này, nếu đoạn gen FLT3-TKD 114 bp không chứa đột biến thì sẽ bị cắt

thành hai đoạn 68 bp và 46 bp; ngược lại, nếu đoạn gen FLT3-TKD chứa đột biến sẽ không

bị cắt Nồng độ của sản phẩm PCR 114 bp và sản phẩm Cắt68 bp, 46 bp được tính toán bằng phần mềm ImageJ

Thời gian tối ưu được xác định bằng cách chia hỗn hợpphản ứng cắt thành những thể tích bằng nhau và dừng phản ứngở các thời điểm khác nhau từ 5 phút đến 30 phút Ket quả cho thấy sau 10 phút 90% sản phẩm PCR đã bị cắt, và sau 30 phút lượng này lên tới 98,5% (Hình 1 la; 1 lb) Trong một thí nghiệm khác, khi kéo dài thời giản phản ứng tới 3 giờ, bản gel điện di cho thấy vẫn còn một lượng nhỏ (1-2%) băng 114 bp không cắt hết Vì vậy, thời gian 30 phút được chọn là thời gian tối ưu để phản ứng hoàn toàn cho quy trình phát hiện

đột biến FLT3-TKD.

Sau khi tối ưu, phản ứng cắt đoạn 114 bp được thực hiện với 6-8 ng sản phẩm PCR,0,1 |il enzyme £coR V (20 u/|il) và ủ ở 37°c ở 30 phút

Xác địnhtỉnh chính xác và độ nhạy của quy trình

Nhằm khẳng định tính chính xác của quy trình FLT3-TKD, một đột biến nhân tạo ở

đoạn ADN 114 bp được tạo ra sử dụng bộ kit Phusion Mutagenesis, thay Nucleotide đầu

tiên trong trình tự nhận biết của enzyme EcoR V từ G thành T Đây là đột biến thay thế phổ biến nhất thuộc vùng TKD [Yamamoto, 2001] Đột biến này được sử dụng làm mẫu đối

chứng dương cho quy trình nghiên cứu

Độ nhạy của phương pháp được xác định bằng cách sử dụng hỗn hợp plasmid mang đoạn gen chứa đột biến nhân tạo mô tả ở trên và plasmid mang đoạn gen thường làm khuôn cho phản ứng PCR Hai loại plasmid này được trộn theo các tỉ lệ khác nhau từ 0%-100% của plasmid đột biến Ket quả cho thấy quy trình này có thể phát hiện được mẫu chứa 5% ADN đột biến Bẻn cạnh đó, kết quả cũng chỉ ra rằng nếu sản phẩm cắt còn lại ít nhất 25%

của băng 114bp thì mẫu đó có thể chứa đột biến FLT3-TKD (Hình 12).

13

H ình 12: Xác định độ nhạy của quy trìn h vói phưoìig pháp cắt enzym e giói hạn

a: Anh điện di sản phẩm cắt sản phẩm PCR của gen FLT3 với tỉ lệ đột biến khác nhau (giếng 2-9); M: Thang chuẩn ADN Lowrange (giếng 1); b: % băng 114 bp còn

lại sau khi căt.

Sàng lọc và phân tích trìn h tự đột biến FLT3-TKD ỏ’ mẫu bệnh nhân AM L Việt Nam

Bước đầu sàng lọc trên 156 mẫu bệnh nhân AML Việt Nam sử dụng quy trình đã thiết lập xác định được 5 mẫu (3,2%) nghi ngờmangđột biến (các mẫu số 9, 40, 76, 83, và 105, Hình 13) Phần trăm của sản phấm PCR không cất trong phản ứng cắt enzyme giới hạn của các mẫu này được tính toán bằng phần mềm ImageJ và trình bày chi tiết trong bảng 4 Việc phân tích trình tự các mẫu trên cho thấy tất cả đều chứa đột biến thay thế nucleotide trong

bộ ba mã hóa D835 Nucleotide đầu tiên của codon này, từ G đều bị thay thế thành T, dẫn đến thay đổi acid Aspartic thành Tyrosine (D835Y) [Đỗ Thị Thanh Trung, 2014]

M 74 7i l i 77 71 19 177 mt írt M «1 tnt »0 83 8Í 87 «8 91 19i

Hình 13: Điện di sản phẩm cắt cùa 156 m ẫu sử dụng quy trìn h đã được thiết lập

M: thang chuẩn ADN; mt: mẫu đột biến; wt: mẫu không đột biến:

4.4 Gen CEBPA

T hiết lập quy trìn h p h á t hiện đột biến CEBPA

Quy trình phát hiện đột biến CEBPA/bZIP được thực hiện theo các bước như sau: (1) Khuếch đại đoạn gcn CEBPA/bZIP với cặp mồi đặc hiệu; (2) phân tích sản phẩm PCR theo

phương pháp SSCP Chi tiết các bước được trình bày cụ thế sau đây

K/tuếch đại đoạn gen CEBPA/bZIP

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện đi trên gel polyacrylamide 15% và cho 1 băng ADN sắc nét tại vị trí khoảng 100-150 bp của thana, chuẩn ADN Kích thước băng ADN này phù họp với kích thước dự kiến là 143 bp của đoạn gen khuếch đại dựa trên tính toán lý thuyết (Hình 14) Như vậy, phản ứng khuếch đại đã nhân lên thành công vùng

CEBPA/bZIP cần nghiên cứu[Bùi Hường Quỳnh, 2014].

(-) M 1 2

150 J

100 J

H ình 14: Đ iện di sản p h ẩm P C R trê n gel polyacrylam ide 15%

Khuôn cho phản ứng khuếch đại là A D N tổng so của bệnh nhân AM L (giếng so 1 và 2),

hoặc nước (đổi chứng âm) M: thang chuẩn A D N

Tạo đột biến CEBPA/bZIP nhân tạo và thiết lập quy trình p h á t hiện đột biến bằng phương pháp SSCP

Băng cách thiết kế chèn trình tự AAG vào mồi xuôi C EBPAỈ407ịương ứng với vị trí 1530-1531 trên gen CEBPA, chúng tôi tạo ra đột biến lặp đoạn ba nucleotide nhân tạothuộc vùng CEBPA/bZIP, dẫn tới sự xuất hiện thêm một nhóm Lysine tại vị trí 313-314 của

protein CEBPA Quá trình tạo đột biến dựa vào plasmid pGEM-T đã mang đoạn gen 143 bp

CEBPA/bZIP bìnhthường Phản ứng khuếch đại với cặp mồi tạo đột biến nhân lên một đoạn

ADN thẳng có kích thước 3161 bp, gồm toàn bộ khung vector 3015 bp đoạn CEBPA/bZỈP

143 bp, và 3 nucleotide chèn thêm vào trong trình tự mồi xuôi Ở hình 15a, giếng số 1 có một băng ADN có kích thước khoảng 3 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết Đoạn ADN

thẳng này được nối tròn lại bằng T4 ligase và plasm id tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E

coli Điện di sản phẩm PCR từcác khuẩn lạc theo phương pháp PCR/SSCP cho thấy hai phổ

băng ADN khác biệt

15

Hình 15: Tạo đột biến CEBPA/bZIP-E a: Khuếch đại toàn bộ plasm idpG E M -T easy có mang đoạn CEBPA/bZIP dài 143 bp - giếng số 1 b: Sàng lọc các khuẩn lạc mang plasm id có đột biến cần tạo theo phương pháp

P C R /SSC P giếng số 1 và 2 M: thang chuân low range (-): đối chứng âm.

Giải trình tự cho thấy, phổ băng có một băng ADN duy nhất là từ khuẩn lạc mang plasmid thường (Hình 15a, giếng số 2), còn phổ băng xuất hiện băng lạ ở khoảng kích thước

200 bp là từ khuẩn lạc mang plasmid có đột biến nhân tạo (Hình 15b, giếng số 1) Như vậy,

băng lạ xuất hiện trên gel polyacrylamide 10% là do sự có mặt của cả 2 đoạn CEBPA/bZIP

thường và đột biến trong SSCP Kết luận, chúng tôi đã tạo thành công đột biến nhân tạo chứa đoạn lặp 3 nucleotide AAG và sử dụng plasmid mang đột biến này để xây dựng

phương pháp phát hiện đột biến lặp đoạn ngắn thuộc vùngCEBPA/bZĨP[Bùỉ Hương Quỳnh,

2014]

Độ nhạy của phương pháp PCR/SSCP trong việc phát hiện đột biến CEBPA/bZIP

Plasmid có mang đoạn CEBPA/bZIP thường (gọi tắt là plasmid thường), và plasmid

có mang đoạn CEBPA/bZIP đột biến nhân tạo (gọi tắt là plasmid đột biến) được trộn theo

các tỷ lệ khác nhau theo bảng 5 Ket quả của các hỗn hợp trộn là băng lạ xuất hiện ở những mẫu có 5% đột biến trở lên (Hình 16) Điều đó kết luận rằng, phương pháp PCR/SSCP có thể phát hiện đột biến với tỷ lệ đột biển ít nhất là 5%

Bảng 5: H ỗn hợp trộ n giữa plasmid thư ờ ng và pỉasm id đỏt biến với các tỉ lê khác nhau

plasmid thườne

của7.2 X 109 6.84 X 109 6.48 X 109 5.76 X 109

H ình 16: Thí nghiệm xác định độ nhạy của phương pháp PC R/SSCP.

Hon hợp trộn giữa plasm id thường và plasmid đột biến với các tỉ lệ khác khác nhau từ 0%

đến 100% được làm khuôn cho phản ứng PCR và SSCP.

Kết quả sàng lọc và phân tích trìn h tự đột biếnCEBPẠ/bZỈP ở 156 bệnh nhân AML

Trong số ADN tổng số từ 156 bệnh nhân được tiến hành kiểm tra theo phương pháp PCR/SSCP, 12 mẫu (7,7%) có xuất hiện băng lạ và nghi ngờ mang đột biến

CEBPA/bZỈP(Hình 17a) [Bùi Hương Quỳnh, 2014] Kết quả giải trình tự 1 mẫu nghi ngờ

cho thấy 3 nucleotide CTG chèn được chèn vào vị trí 1536-1537, tương ứng với một amino acid Leucine mới xuất hiện tại vị trí 315 ở protein CEBPA (Hình 17b) Hơn nữa, từ độ sáng của băng lạ ở bản gel SSCP và so sánh với tỷ lệ đột biến từ thí nghiệm độ nhạy cho thấy, mẫu đột biến đã được giải trình tự có mức đột biến từ 5-10%

V rTQ Q K V L L

H ình 17: Sàng lọc đột biến CEBPA/bZIP trong 156 m ẫu bệnh nhân AML.

a: A D N tống so được làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR (mau so 1 và 2), mẫu đổi chứng dương (+) dùng plasm id mang đột biến nhân tạo làm khuôn, đối chứng âm (-) không

có A D N khuôn, b: Trình tự amino acid của mau thường (dỏng 1), đột biến nhân tạo có mang 3 nucleotide AAG (dòng 2), đột biến của mâu 2 có 3 nucleotide CTG (dòng 3).

ĐAI HỌC QUỐC GIA HA NỘl ÍRUNG TAM t h ô n g tin thư VIẺN

17

o o n Ê ô o o o /,5 ?

4.5 Sự có m ặt của đột biến N P M l và F L T 3-IT D và sự liên quan đến đặc điểin lâm

sàng

Bệnh nhân AML được nghiên cứu trong đề tài nàynằm trong khoảng từ 17-85 tuổi với độ tuổi trung bình là 43, và tỉ lệ nam/nữ là 75/81 Trong tổng số 156 mẫu đã sàng lọc, có

56/156 (35.9%) mang mộttrong hai đột biến, hoặc NPM1, hoặc FLT3 (Hình 18) Đột biến ở

2 gen này thường được tìm thấy ở nhóm bệnh nhân AML có tỉ lệ rủi ro cao Nhiều nghiên

cứu gần đây đã chỉ ra rằng bệnh nhân mang đột biến NPM1 đơn có phản ứng tốt hơn với hóa trị liệu sovới bệnh nhân có đột biến FLT3-ITD đơn hoặc mang cả 2 đột biến Trong

cácsố liệu công bố trước đây, tỉ lệ trường hợp mang cả 2 đột biến là 10-12% Khi sàng lọc

đột biến FLT3-ITD và NPM1 trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện được 8 mẫu (5,1%)

có khả năng chứa cả 2 đột biến, trong đó 2 mẫu đã được khẳng định bàng việc đọc trình tự

Hình 18 S ự x u ất hiện của đột biến F LT 3 IT D và NPM1 ở 156 bệnh nhân AML

FLT3-IDT/NPM1-Wt: bệnh nhân mang đột biến FLT3-IDT, nhưng không mang đột biến NPM1; NPM l-mut/FLT3-wí: bệnh nhân mang đột biến NPM1 nhưng không chứa đột biến FLT3-ITD;FLT3-ITD/NPM1 -mut: bệnh nhân mang cả 2 đột biến; FLT-wt/NPM l-wt: bệnh

nhãn không mang đột biến nào trong hai đột biến FLT3-ITD và NPM1.

Ket quả nhuộm nhiễm sắc thể tế bào kèm theo biên bản thu mẫu được thực hiện ở 126/156 mẫu bệnh nhân cho thấy 94 bệnh nhân (79,4%) có kiểu hình nhiễm sắc thể bình thường, trong đó 35 bệnh nhân (37,2%) xuất hiện đột biến được nghiên cứu Trong 32 mẫu còn lại có bất thường ở cấp độ nhiễm sắc thể (25,6% ), 11 mẫu (34,4%) mang đột biến gen

NPM1 hoặc/và FLT3 Bên cạnh đó, tỉ lệ xuất hiện các đột biến ở hai gen giữa nam và nữ có

sự chênh lệch đáng kể Cụ thể đột biển có tiên lượng tốt NPM1 xuất hiện ở nữ nhiều hơn

nam, chiếm 66,0% và tỉ lệ mang đột biến FLT3-ITD thì ngược lại, ở nam nhiều hơn nữ, chiếm 64,3% Trong nghiên cứu này, đột biến NPM1 được tìm thấy ở các nhóm từ MI đến

M6 theo phân loại FAB, trong khi đột biến FLT3-ITD không tìm thấy ở MO và M3.

Bảng 6: T hống kê các đặc điểm lâm sàn g ở bệnh nhân AM L

Đặc điềm

lâm sàng

FLT3-mut N=13

NPMl-mut N=50

FLT3-wt/

NPM1-Wt N=100

FLT3- mut và NPMỈ- wt N=5

NPMỈ- niut và FLT3- wt N=42

FLT3- mut vù NPM1- mut N=8

Tỏng sô N=155

Nam/nữ (n) 8/5 17/33 39/42 4/1 13/29 4/4 74/81

Đặc điêm

lâm sàng

FLT3-mut N=13

NPMl-muí N=50

FLT3-wt/

NPM1-WÍ N=100

FLT3- mut và NPM1- wt N=5

NPMÌ- mut và FLT3- wt N=42

FLT3- mut vù NPMỈ- mut N=8

không mang đột biến nào trong hai đột biến FLT3 và NPM1.

5 Đ ánh giá về các kết quả đã đ ạt được và kết luận

5.1 Quy trình p h á t hiện đột biến

Hai quy trình phát hiện đột biến tăng 4 nucleotide trên gen NPM1 và đột biến lặp đoạn 1TD trên gen FLT3 đã được chuyển giao thành công tới khoa Sinh học phân tử, Viện

Huyết học - Truyền máu Trung ương Cả hai quy trình đảm bảo tính lặp lại, độ tin cậy và độ nhạy để sử dụng trong việc thực hiện xét nghiệm cho bệnh nhân AML, cho phép phát hiện đột biền nhanh chóng và đơn giản, phù hợp với nhu cầu của cơ sở y tê

Mỗi quy trình đều bao gồm đối chứng thường và đối chứng đột biến đã được xác định trình tự Đối chứng đột biến của quy trình phát hiện đột biến lặp trình tự ngắn thuộc

vùng bZIP trên gen CEBPA và đột biến điểm thuộc vùng tyrosine kinase TKD trên gen

FLT3 là các đột biến nhân tạo Việc nhóm nghiên cứu chủ động tạo ra các đối chứng dương

là điểm mới thay cho kỹ thuật nhân dòng đột biến sẵn có khó áp dụng với đột biến

CEBPA/bZIP và FLT3-TKD vì tần suất xuất hiện thấp của hai loại này Quy trình phát hiện

đột biến CEBPA/bZIP sử dụng phương pháp điện di trên gel Ultraphor là một loại agarose

có khả năng phân tách cao các đoạn ADN chênh lệch một vài nucleotide về kích thước có thế dễ dàng thực hiện tại phòng xét nghiệm ở bệnh viện Tất cả các quy trình cho kết quả sau 3-5 tiếng bắt đầu từ nguyên liệu ban đầu là ADN tổng số lách từ mẫu máu người bệnh

5.2 Sàng lọc các đột biến nghiên cứu trong 156 bệnh nhân ẢM L Việt Nam

Các quy trình được nghiên cứu phát triển được sử dụng để phát hiện đột biến tăng 4

nucleotide trên gen NPM1, FLT3-ITD, FLT3-TKD, và đột biến lặp đoạn CEBPA/bZIP ở 156

bệnh nhân AML Việt Nam Ket quả cho thấy tần suất xuất hiện của các đột biến trên lần lượt là 32,1 %, 8,4 %, 3,2 %, và 7,7 %, trong đó, đối với mỗi đột biến, ít nhất là 1 và nhiều

nhất là 10 đột biến đã được khẳng định bằng phương pháp giải trình tự Như vậy, trừ FLT3-

ITD, tần suất xuất hiện của các đột biến còn lại trong mẫu bệnh nhân AML Việt Nam đều

cao hơn hoặc xấp xỉ các bài báo được công bố trước đây về những nghiên cứu trên bệnh nhân nước ngoài

Đây là một trong những báo cáo đầu tiên thống kê về tỉ lệ nhừng đột biến gen cơ bản, thường gặp nhất ở bệnh nhân AML tại Việt Nam Tuy nhiên, do lượng mẫu còn ít, chưa đến

19

200 so với 500-600 cho tới hàng nghìn mẫu thu thập ở các nghiên cứu thực hiện trên thế giới, sc liệu này có thể chưa mang tính chất đại diện cho Việt Nam Đe tăng độ tin cậy của tần suấ: đột biến tính toán trong đê tài sẽ cần số mẫu lớn hơn.

5.3 Phân tích đặc điếm phân tủ' của các đột biến được phát líiện và giải trình tự

Sử dụng phương pháp điện di phát hiện chênh lệch về độ dài có thể xác định được

một cách tương đối kích thước đột biến lặp đoạn FLT3-ITD và CEBPA/bZIP bằng cách so sánh vơi đối chứng dương và thang chuẩn Riêng với FLT3-ITD, do khả năng xuất hiện

nhiều doạn lặp trong cùng một mẫu, số đoạn lặp cũng là một đặc điểm phân tích được khá

rõ trên bản gel agarose sau khi nhuộm hoặc hình ảnh số hóa thu được từ máy Fragment Analyzer Ngoài ra, do các mẫu có thể chứa đồng thời bạch cầu thường và bạch cầu đột biến, một đặc điểm nữa là mức đột biến, nói cách khác là tỉ lệ tế bào bất thường trong tổng

số tế bào, cũng có thể tính toán được khá chính xác qua hình ảnh Và, như đã nêu trong phần 5.2, tùy loại đột biến, có 1-10 mẫu đã được giải trình tự sau khi sàng lọc sử dụng các quy trình phát triển trong đề tài này

Bốn đặc điểm phân tử trên hầu như chưa được nghiên cứu một cách bài bản ỞViệt Nam Tuy nhiên, những công bố quốc tế trước đây đã chỉ ra tầm quan trọng của chúng trong tiên lượng bệnh để từ đó có phương thức điều trị hợp lý Ví dụ như số đoạn lặp nhiều, kích thước đoạn lặp lớn và mức đột biến cao thường là yếu tố tiên lượng xấu đối với bệnh nhân AML [Meshinchi, 2008; Stirevvalt, 2006] Bên cạnh đó, việc phân tích trình tự chính xác các đột biến còn có ý nghĩa thống kê, cho thấy rõ sự khác biệt về mức độ phổ biến và phân bố của đột biến

Kẹt luận

Đe tài đã phát triển thành công bốn quy trình phát hiện các đột biến thường gặp ở bệnh nhân AML, trong đó hai quy trình được chuyển giao cho Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương Sàng lọc ban đầu trên 156 người mắc AML góp phần đưa ra cái nhìn sơ lược

về tỉ lệ những đột biến nghiên cứu tại Việt Nam Ngoài những con số thống kê, nhóm nghiên cứu cũng phân tích di sâu vê các dặc điêm phân tử của đột biên Các kêt quá của đê tài là tiền đề quan trọng cho việc chẩn đoán, tiên lượng và điều trị bệnh và cần được tiếp tục trên quy mô lớn hơn

6 Tóm tắ t kết q u ả (tiếng Việt và tiếng Anh)

Tiếng Việt' Đề tài tập trung vào một số đột biến phổ biến nhất liên quan tới bệnh ung

thư bạch cầu cấp dòng tủy trên ba gen: NPM1, FLT3, và CEBPA Việc phát hiện những đột

biến này cung cấp thông tin cần thiết cho việc tiên lượng bệnh, từ đó hỗ trợ bác sỹ điều trị lựa chọn phương án điều trị hợp lý nhất cho bệnh nhân Bốn quy trình chẩn đoán đã được phát triển thành công, bao gồm một quy trình phát hiện đột biến tăng 4 nucleotide trên gen

NPM1, hai quy trình phát hiện đột biến lặp đoạn ITD và thay thế nucleotide vùng tyrosine

kinase TKD trên gen FLT3, và một quy trình phát hiện đoạn lặp thuộc vùng bZIP của gen

CEBPA Mỗi quy trình bao gồm hai bước chính: khuếch đại đoạn gen chứa đột biến nghiên

cứu sử dụng cặp mồi thiết kế đặc hiệu, và phân tách sản phẩm PCR trên gel agarose hoặc polyacrylamide, có thể tiền xử lý với enzyme giới hạn hay chất biến tính Các plasmid chứa đoạn gen thường và đột biến đã được khẳng định bằng cách giải trình tự được sử dụng làm đối chứng thường (chứng tỏ kết quả âm tính) và đối chứng bệnh (dương tính) Đặc biệt, đối

với đột biến FLT3-TKD và CEBPA/bZIP, hai đối chứng bệnh đã được tạo ra bàng phương

pháp gây đột biến nhân tạo

Các quy trình sau khi kiểm tra chứng nhận hiệu quả được sử dụng trên quy mô phòng thí nghiệm với ỉ 56 mẫu máu thu thập từ bệâh nhân AML, cho thấy số mẫu nghi ngờ mang đột biến lần lượt là 50 (32,1 %), 13 (8,4%), 5 (3,2%), và 12 (7,7%) tương ứng với 4 loại đột

20

biến tăng 4 nucleotide trên gen NPMỈ , FLT3-ITD, FLT3-TKD, và lặp đoạn CEBPA/bZIP

Đáng chú ý là có 8 mẫu (5,1%) mang cả hai loại đột biến NPM1 và FLT3-ITD Tần suất xuất hiện của FLT3-ITD thấp hơn so với các nehiên cứu công bố trước đây có thế là do sự

không đồng nhất của các đợt thu mẫu khác nhau, sắp tới, chúng tôi sẽ thu thập lượng mẫu lớn hơn và có đầy đủ các thône tin lâm sàng để có thể đưa ra số liệu mang tính đại diện cao hơn và phân tích sâu hơn về mối liên hệ với các yếu tố lâm sàng

Tiếng A n h : The proịect íocused on most frequent AML-linked mutations on three

genes: NPM1, FLT3, and CEBPA Detection o f these mutations provides necessary

information for AML prognosis and treatment, vvhich is important to improve survival rate Four diagnostic procedures were sucessfully established including one íor tetranucleotide

additionon NPM1, two for FLT3 intemal tandem duplication (FLT3-ITD) and substitutionin tyrosine kinase domain (FLT3-TKD ), and one for duplication in bZIP domain on CEBPA

Each procedure included two main steps: amplitìcation of the íragment carrying mutations using speciíĩcally designed primers, and separation o f PCR Products on either agarose or polyacrylamide gels, with or without pre-treatment with either restriction enzyme or denaturant Plasmids carrying either verifíed normal or mutated sequences were used as normal (negative) and mutant (positive) Controls, respectively Especially, for FLT3-TKD and CEBPA/bZIP mutation detection, tvvo positive Controls were synthesized using mutagenesis

The screening o f 156 AML samples using the validated procedures gave the result o f

50 NPM1 mutants (32.1%), 13 FLT3-ITD mutants (8.4%), 5 FLT3-TKD mutants (3.2%),

and 12 CEBPA/bZIP mutants (7.7%) Interestingly, there were 8 samples constituting 5.1 %

carrying both NPM1 and FLT3-ITD m utations The fact that the FLT3-ITD í'requency

(8.4%) reported in this study vvas lower than other studies would be explained by the bias in sample collection Besides, the blood samples o f 156 AML patients were collected in 3 different batches and the mutation frequency o f each batch was different, e.g., 8/45 (17.8%)

o f the íìrst batch, 2/30 (6.7% ) o f the second and 4/80 (5%) o f the third.In the near tìiture, we might apply the procedure in larger sample size or in cooperation with other clinical facilities to have more representative statistical data on AML gene mutations

21

Danh m ục ch ữ viết tắt

Polymorphism

Đa hình câu trúc mạch đơn

PCR-RPLP Restriction Fragment Length

Polymorphism

Đa hình chiêu dài đoạn căt giới han

Electrophoresis

Điện di polyacrylamide

22

Tài liêu tham khảo

1 Giles F.J., Armand K., et al, 2002 "‘Acute myeloid \eukimia'\Hematology, 73-110.

2 Gunz F w , 1990 “Leukemia in the past" ỉn: Henderson ES, Lister TA (eds)

Leukemia WB Saunders Company: Philadelphia, 3-11.

3 Trần Thị Minh Hương, Đỗ Trune Phấn, 2002.“Tình hình bệnh máu tại viện Huyết

Học - Truyền Máu Bệnh viện Bạch M ar.K ỷ yếu côns trình nghiên cứu khoa học

Huyết Học - Truyền Máu, Nhà xuất bản Y học, 1:15-24

4 Khalidi H.S., Medeiros L.J., Chang K.L., Brynes R.K., Slovak M.L., Arber

D.A.,1998 “The immunophenotype o f adult acute myeloid leukemia: high írequency

o f lymphoid antigen expression and comparison o f immunophenotype, French-

American-British classiíication, and karyotypic abnormalities” American Journaỉ o f

Clinical Pathology, 109(2): 211-220.

5 Bene M.C., Bemier M., Castoldi G., 1999 “Impact o f immunophenotyping on

management o f acute leukemia” Haematological, 84-123.

6 Kiyoi H., Naoe T., Nakano Y., Yokota s., Minami s., Miyawaki s., Asou N.,

Kuriyama K., Jinnai I., Shimazaki c , Akiyama H., Saito K., Oh H., Motoji T., Omoto

E., Saito H., Ohno R., Ưeda R., 1999.“Prognostic implication o f FLT3 and N-RAS gen mutations in acute myeloid leukem ia”.,ổ/ooí/) 93: 3074-3080

7 Ammatuna E., Nogueral N.I., Zangrilli D., Curzi p., Panetta p., Bencivenga p.,

Amađori s., Federici G., Lo-Coco F., 2005.“Rapid detection o f nucleophosmin

(NPM1) mutations in acute myeloid leukemia by denaturing HPLC”.Clinicaỉ

Chemistry 51(11): 2165-2167.

8 Calvo K.L., Ojeda M.J., Am m atuna E., Lavorgna s., Ottone T., Targovnik H.M., Lo-

Coco F., Noguera N.I., 2009.“Detection o f the nucleophosmin gen mutations in acute

electrophoresis”.European Journal o f Hematology, 82(1): 69-72.

9 Dôhner K., Schlenk R.F., Habdank M., SchollC., Rũcker F.G., Corbacioglu A.,

Bullinger L., Frốhling s., Dốhner H., 2005.“Mutant nucleophosmin (NPM1) predicts

favorable prognosis in younger adults with acute myeloid leukemia and normal

cytogenetics: interaction with other gene mutations” Blood, 106:3740-3746.

10.Lin L.I., Chen C Y , Lin D.T., Tsay w „ Tang J.L„ Yeh Y.C., Shen H.L., Su F.H.,

Yao M., Huang S.Y., Tien H.F., 2005.“Characterization o f CEBPA mutations in acute

m yeloid leukemia: most patients vvith CEBPA mutations have biallelic mutations and

show a distinct immunophenotype o f the leukemic cells”.Clinical Cancer Research,

11(4): 1372-1379

11 Lim M.J., Xin w w , PhD., 2006 „Nucleophosmin and human cancer“ Cancer

Detect Prev, 30(6): 481-490

12 Falini B., Mccucci c , Tiacci E., Alcalay M., Rosati R., Pasqualucci L., La Starza R.,

Diverio D., Colombo E., Santucci A., Bigerna B., Pacini R., Pucciarini A., Liso A.,

Vignetti M., Fazi p., Meani N., Pettirossi V., Saglio G., Mandelli F., Lo-Coco F.,

Pelicci P.G., Martelli M.F., GIM EM A Acute Leukemia Working Party, 2005

“Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal

karyotype” The New England Journaỉ ofM edỉcine, 352:254-266.

B O rita M., Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K., Sekiya T., 1989.“Detection o f

polymorphisms o f human DNA by gel electrophoresis as single-strand coníbrmation

polymorphism ” Proceedings o f the National Academy o f Sciences USA, 86:2766-

2770

23

14 Boonthimat c , Thongnoppakhun w , Auewarakul c u ,2 0 0 8 “Nucleophosmin

mutation in Southeast Asian acute myeloid leukemia: eight novel variants, FLT3

coexistence and prognoslic impact o f NPM1/FLT3 mutations” Haematological,

93(10): 1565-1569'

15.Darline G.J., Ross S.E., MacDougald O.A., 1998.“The role o f C/EBP genes in

adipocyte differentiation” The Journal o f Biological Chemistry, 23: 30057-30060

16 Hendricks-Taylor L.R., Bachinski L.L., Sicilliano M.J., Fertitta A., Trask B., de Jong

P J., Ledbetter D.H., Darlington G.J., 1992.“The CCAAT/enhancer binding protein

(C/EBPa) sene (CEBPA) maps to human chromosome 19q 13.1 and the related

nuclear factor NF-IL6 (C/EBP B) gene (CEBPB) maps to human chromosome

20ql3.1” Genomics 14: 12-17.

17.Fuchs o , Kostecka A., Provazníková D., Krásná B., Kotlín R., Stanková M.,

Kobylka p., Dostálová G., Zeman M., Chochola M., 2010.“CCAAT/Enhancer-

Binding Protein a (CEBPA) Polymorphisms and Mutations in Healthy Individuals

and in Patients with Peripheral Artery Disease, Ischaemic Heart Disease and

Hyperlipidaemia”.Folia Biologica (Proha), 56: 51-57.

18 Fuster o , B arragán E., B oluỉer p., Such E & Valencia A., ỉbánez M., Dolz s , JuanI.d., Jiménez A., Gómez M.T., Buno I., Martínez J, Cervera J., Montesinos p.,

Moscardó F., Sanz M.Á., 2012.“Fragment length analysis screening for detection of

CEBPA mutations in intermediate-risk karyotype acute myeloid leukemia” Annals of

Hematology, 91(1): 1-7

19 Agnès F., Shamoon B., Dina c , Rosnet o , Bimbaum D., Galibert F., 1994.“Genomic

structure o f the downstream part o f the human FLT3 gene: exon/intron structure

conservation among genes encoding receptor tyrosine kinases (RTK) o f subclass III”,

Gene, 145: 283-288.

20 Meshinchi s., Stirewalt D.L., Alonzo T.A., Boggon T.J., Gerbing R.B., Rocnik J.L.,

Lange B.J., Gilliland D.G., Radich J.p., 2008 “Structural and numerical variation of

FLT3/ITD in pediatric AML”, Blood, 111 (10): 4930-4933.

21 Yamamoto Y., Kiyoi H., Nakano Y., Suzuki R., Kodera Y., Miyawaki s., Asou N.,

Kuriyama K., Yagasaki F., Shimazaki c , Akiyama H., Saito K., Nishimura M.,

Motọịi T., Shinagawa K., Takeshita A., Saito H., Ueda R., Ohno R., Naoe T., 2001

“Activating mutation o f D835 within the activation loop o f FLT3 in human

hematologic malignancies”, Blood, 97 (8): 2434-2439

22 Kim Y.K., Kim H.N., Lee S.R.,Ahn J.s., Yang D.H., Lee J.J., Lee I.K., Shin

M.G.,Kim H.J., 2010.“Prognostic signiíĩcance o f nucleophosmin mutations and FLT3

intemal tandem duplication in adult patients with cytogenetically normal acute

myeloid leukemia”, Korean Journal ofHem atology, 45 (1): 36-45.

23 Gilliland D.G and Griffín J.D., 2002 “The roles o f FLT3 in hematopoiesis and

leukemia”, Blood, 100 (5): 1532-1542.

24 Bagrintseva K., Geisenhof s., Kem R., Eichenlaub s., Reindl c , Ellwart J.w ,

Hiddemann w , Spiekermann K., 2005 “FLT3-ITD-TKD dual mutants associated

with AML confer resistance to FLT3 PTK inhibitors and cytotoxic agents by

overexpression o f Bc\-x(LỴ\Blood, 105 (9): 3679-3685.

25.Kiyoi H., Towatari M., Yokota s., Hamaguchi M., Ohno R., Saito H., Naoe T., 1998

“Intemal tandem duplication o f the FLT3 gene is a novel modality o f elongation

mutation which causes constitutive activation o f the product” Leukemia, 12 (9):

1333-1337

24

PHẨN III SẢN PHẦM, CÔNG BÓ VÀ K ÉT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐÈ TÀI

3.1 Kết quả nghiên cứu

Đ ạt

2 Bộ kít phát hiện đột biên

FLT3-ITD

3.2 Hình thức, câp độ công bô kêt q uả

Tình trạn g

(Đã in/ chấp nhận in/ đã nộp đơn/ đã được chấp nhận đơn hợp lệ/ đã được cấp giấy xác nhận SHTT/

xác nhận sử dụng sản phâm)

(Đạt, không đạt)

1 Công trình công bô trên tạp chí khoa học quôc tê theo hệ thông ISI/Scopus

4 Bài báo quôc tê không thuộc hệ hông ISI/Scopus

4.1 Prevalence and Co-occuưence

5 Bài báo trên các tạp chí khoa học của Đ H QG H N , tạp chí khoa học

chuyên ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa học đăng tro n g kỷ yếu hội

VNU Journal o f Science:

Technology, 30(3S): 260-267

5.2 Screening and Characterization

o f NPM1 Tetranucleotide

Insertion from Acute Myeloid

Leukemia Patients in Vietnam

ưsing PCR-SSCP Procedure

VNU Joumal o f Science:

5.3 Xây dựng quy trình phát hiện

đột biến gen FLT3-ITD ở bệnh

nhân bạch cầu cấp dòng tủy tại

Việt Nam Tạp chí Y dược lâm

5.4 Nghiên cứu đặc điêm phân tử

của đột biến gen FLT3-ITD trên

nhân Lơ Xemi cấp dòng tủy

thứ tụ <tên tác giả, tên công trình, tên tạp chí/nhà xuất bản, sổ p h á t hành, năm phải hành, trang đăng công trình, mã công trình đăng tạp chí/sách chuyên khảo (DOI), loại tạp chí ISI/Scopus>

Các ấn phấm khoa học (bài báo, báo cáo KH, sách chuyên khảo ) chỉ đươc chấp nhân nếu có ghi nhận địa chỉ và cảm ơn tài trợ của ĐHQGHN theo đủng quy định.

cáo Riêng sách chuyên khảo cần có bản phô tô bìa, trang đầu và trang cuối có ghi thông tin mã số xuất bản.

26

3.3 K ết q u ả đ ào tạo

STT Họ và tên

Thòi gian và kinh phí tham gia đề tài/d ự án

(số tháng/so tiên)

Công trìn h công bố liên quan

(Sản phâm KHCN, luận án, luận văn)

Nghiên cứu sinh

1

2

Học viên cao học

02 bài báo khoa học

3.4 Sản phẩm khác

STT Họ và tên

Thời gian và kinh phí tham gia đề tài/d ự án

(số thảng/sổ tiền)

C ông trìn h công bố liên quan

(Sản phâm KHCN, luận án, luận văn)

nhận nghiên círu sinh/thạc sỹ nếu học viên đã bảo vệ thành công luận án/ luận văn;

PHẦN IV TO NG H Ợ P K ÉT QUẢ CÁC SẢN PH Ẩ M K H & C N VÀ ĐÀO TẠ O CỦA

3 Đăng ký sở hữu trí tuệ

4 Bài báo quôc tê không thuộc hệ thông ISI/Scopus

5 Sô lượng bài báo trên các tạp chí khoa học của

ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia

hoặc báo cáo khoa học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc

tế

6 Báo cáo khoa học kiên nghị, tư vân chính sách theo đặt

27

hàng của đơn vị sử dụng

7 Kêt quả dự kiên được ứng dụna tại các cơ quan hoạch

định chính sách hoặc cơ sở ứng dụng KH&CN

8 Đào tạo/hô trợ đào tạo NCS

Kinh phí thự c hiện

(triệu đồng)

Ghi chú

Á 1 • A

sô liệu

2 Các thông tin về bệnh nhân (nhóm máu, kết quả xét nghiệm karyotyping, công thức máu, tình trạng trước và sau khi điều trị, vv.) chưa được đầy đủ nên không phân tích được mối tương quan giữa đột biến trên ba gen nghiên cứu với các đặc điếm lâm sàng cũng như ảnh hưởng của đột biến tới khả năng chữa khỏi bệnh Do vậy, có thể thu thập các thông tin này và theo dõi tiến triển của các bệnh nhân đã lấy mẫu máu để phân tích sâu hơn về y học

PHẦN V II PHỤ LỤ C (minh chứn% các sản phẩm nêu ở Phần III)

Đơn vị chủ trì đề tài 'V'!'

tíơ n V Ị cnu t n ae tai 'h'V'

r

(Thủ trưởng đơn vị kỷ tên, đóng dâu)

C hủ nhiêm đê tài

(Họ tên, chữ kỷ)

PHỤ LỤC 1

1 Quy trình phát hiện đột biến trên gen N PM 1 thường gặp ở bệnh nh ânViệt Nam

2 Quy trình phát hiện đột biến trên gen FLT3 thường gặp ở bệnh nhânV iệt Nam

3 Quy trình phát hiện đột biến trên gen CEBPA thường gặp ở bệnh nhânV iệt Nam

4 Bộ kít phát hiện đột biến lặp đoạn FLT3-ITD

2 Quy trìn h xác định đột biến gen NPM1 bằng kỹ th u ậ t SSCP

PC R được tiên hành với khuôn là ADN genome được tinh sạch từ mẫu máu tổng số và các mâu đối chứng

Đ ôi chứng âm của phản ứng có thành phần tương tự như các mẫu khác trong đó ADN khuôn đ ư ợ c thay bằng nước cất khử ion khử trùng.

Bước 1: Làm tan tất cả các thành phần được giữ ở -20°c và trộn đều sau đó ly tâm nhanh Bước 2: Ghi tên mẫu và đối chứng lên ống PCR.

lượng m â u được thử dựa theo bảng sau:

(1 phản ứng)

Thê tích (|il) (5 phản ứng)

sử d ụ n g nước dã cung cấp thay cho khuôn)

Bước ốv Ly tâm nhanh các ống PCR và đặt vào máy PCR với chu trình nhiệt như sau:

Sau khi kết thúc, 5-6 |il sản phẩm PCR của các mẫu ADN tổng số và đối chửng âm,

và 4 |il đối chứng dương được trộn với đệm fonnamide 5X (thành phân trong bảng sau) trong ống 1,5 ml

Hỗn hợp được xử lí nhiệt ở 95°c trong vòng 10 phút và làm lạnh ngay trên đá trong

10 phút Sau đó, hỗn hợp được tra vào giếng điện di trên gel polyacrylamide 10% (theo bảng dưới đây) _

Đ iện di được thực hiện trong đệm TBE 0,5 X ở hiệu điện thế 150V trong thời gian 60-

75 phút (d ừ n g chạy khi băng dye Bromophenol blue ở cách mép dưới bản gel khoản 1 cm) Bản gel đ ư ợ c tách ra khỏi bản kính và được soi dưới tia ƯV để quan sát các băng điện di Neu bản gel pol yacrylam ide không có ethidium bromide khi chuẩn bị, thì bản gel được ngâm trong dung dịch K thidium Bromide 0,5 ng/ml trong 10 phút, rửa kỹ bằng nước và quan sát dưới tia

u v

3 Phân tíc h kết quả:

Kêl q u ả thu được hai băng điện di có kích thước khoảng 200 bp và 800 bp đôi với mâu không có d ộ t biến Đổi với mẫu có đột biến thêm 4 nucleotide, phổ băng xuất hiện thêm một băng ADN ở vị trí khoảng 400 bp

Tài liệu tham khảo:

1 Lim MJ, Xin w w , PhD Nucleophosmin and human cancer Cancer Detect Prev 2006; 30(6): 481-490

2 Palini B, Mecucci c, Tiacci E, Alcalay M, Rosati R, Pasqualucci L, et al Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a nonnal karyotype N Engl J Med 2005;352:254-266

3 Orita M, ĩwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T Detection o f polymorphisms

o f human DNA by gel electrophoresis as single-strand coníormation polymorphism Proc Natl Acad Sci U S A 1989 Apr; 86(8):2766-70

FLT 11F: 5’-GCA ATT TAG GTA TGA AAG CCA GC-3’

FLT 12R: 5’-CTT TCA GCA TTT TGA CGG CAA CC-3’

DreamTaq™ DNA Polymerase (# EP0702 - 500 units) được đặt mua từ hãng Thermo Scientiíìc

Mầu chuẩn:

Đối chứng thường: ADN genome của người không có đột biến ĨTD trên gen FLT3 Đối chứng dương: ADN genome của người có đột biến ĨTD trên gen FLT3 (kích thước đoạn lặp: 33 bp)

Đối chứng âm (nước cất khử ion khử trùng) được cung cấp để chạy kèm với hai mẫu chuân trên trong mỗi thí nghiệm

2 Các b u ó c của quy trìn h phát hiện đột biến trên gen FLT3:

PCR được tiến hành với khuôn là ADN genome được tinh sạch từ mẫu máu tổng số và các mẫu đối chứng

Đ ối chứng âm của phản ứng có thành phần tương tự như các mẫu khác trong đó ADN khuôn được thay bằng nước cất khừ ion khử trùng

Bước l i Làm tan tất cả các thành phần được giữ ở -20°c và trộn đều sau đó ly tâm nhanh Bước 2: Ghi tên mẫu và đối chứng lên ống PCR.

lượng m au được thử dựa theo bảng sau:

(1 phản ứng)

Thê tích (nl) (5 phản ứng)

B u ác 5: Dùng các đầu côn khác nhau cho mỗi mẫu để thêm 2 |J khuôn (với đối chứng âm

sử dụng nước đã cung cấp thay cho khuôn)

Bước 6: Ly tâm nhanh các ống PCR và đặt vào máy PCR với chu trình nhiệt như sau:

Sau khi kết thúc, 2 |il sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 2% (90 V, 45 phút) với thang chuẩn 100 bp (Fermentas) Bản gel được nhuộm với ethidium bromide và soi dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp ảnh Gel Doc

3 P h ân tích kết quả:

K et quả thu được một băng điện di duy nhất có kích thước khoảng 0,33 kb nếu ADN không ch ứ a đột biến ITD trên gen FLT3; và thu được hai băng điện di trong đó có một băng

có kích thước khoảng 0,33 kb và một băng có kích thước lớn hơn từ 15-350 bp nếu ADN tổng

số chứa đột biến ĨTD trên gen FLT3

Tài liệu th am khảo:

1 Kayser, s et al (2009) Insertion o f FLT3 internal tandem duplication in the tyrosine kinase dom ain-l is associated vvith resistance to chemotherapy and iníerior outcome Blood

114(12): 2386-2392

2 Naoe, T., Kiyoi, H eí aỉ (1999) Prognostic implication of FLT3 and N-RAS gene

m utations in acute myeloid leukemia Blood 93: 3074-3080.

94°c - 3 phút

94°c - 30 giây

72°c - 10 phút

PHỤ LỤC - Kết quả đọc trình tự:

Trong 36 mẫu đã sàng lọc, có một mẫu chứa đột biến FLT3-ĨTD Mầu này đã được gửi di đọc trình tự, kết quả thu được đột biến chèn thêm 33 nucleotide trên trình tự gen của FLT3:

AML_FLT3-ITD 1: chiều dài 361 nucleotide

GGTTGCCGTCAAAATGCTG (trình tự reverse-compliment của mồi FLT 12R)

Trình tự khônu, Rạch chân: đoạn gen chứa đột biến AML1 được đọc trình tự

Trình tự có gạch chân: đoạn gen gốc (>gi|160358346:4977-102295 Homo sapiens fms- related tyrosine kinase 3 (FLT3), ReíSeqGene on chromosome 13)

Trình tự in nghiêng: trình tự bị đột biến được chèn vào dài 33 nucleotide

CEBPA for 1: 5’- TCGGTGGACAAGAACAGC -3’

CEBPA rev 1: 5’- AGGCGGTCATTGTcACTGG -3 ’Dream Taq™ DNA Polymerase (# EP0702 - 500 units) được đặt mua từ hãng Thermo Scientiíìc

Mau chuẩn:

Đ ối c h ứ n g dương: hỗn hợp sản phẩm P C R từ plasm id th ư ờ n g chứa đoạn gen CEBPA/bZĨP không có đột biến và plasmid đột biến chứa đoạn gen CEBPA/bZIP có đoạn lặp 3 nucleotide AAG nhân tạo

Đ ố i c h ứ n g â m (nước cất khử ion khử trùng) được cung cấp để chạy kèm vói mẫu chuẩn trên trong mỗi thí nghiệm

2 Các b iró c của q uy trìn h phát hiện đột biến trên gen C E B PA /bZ ĨP:

PC R được tiến hành với khuôn là ADN genome được tinh sạch từ mẫu máu tổng số và các m ẫu đối c h ứ n g

Đối chứne âm của phản ứng có thành phần tương tự như các mẫu khác trong đó ADN khuôn đ ư ợ c th a y b ằ n g nước cất khử ion khử trùng.

Bước I: Làm tan tất cả các thành phần được giữ ở -20°c và trộn dều sau đó ly tâm nhanh Bước 2: Ghi lên mẫu và đối chứng lên ống PCR.

lượng m ẫ u dược th ử dựa theo bảng sau:

(1 phản ứng)

Thê tích (ịil) (5 phản ứng)

Bưóc 5: Dùng các đầu côn khác nhau cho mỗi mẫu để thêm 2 ịil khuôn (với đối chứng âm

sử dụng nước đã cung cấp thay cho khuôn)

Bước 6: Ly tâm m anh các ống PCR và đặt vào máy PCR với chu trình nhiệt như sau:

Sau khi kết thuc, 5-6 |il sản phẩm PCR của các mẫu ADN tổng số và đối chứng âm,

và 4 |.il đổi chứng dương được trộn với đệm formamide 5X (thành phần trong bảng sau) trong ốna 1,5 ml

H ồ n hợp được xử lí nhiệt ở 95°c trong vòng 10 phút và làm lạnh ngay trên đá trong

10 phút Sau đỏ hỗn hợp được tra vào giếng điện di trên gel polyacrylamide 10% (theo bảng dưới d ầ y ) _ _

Đi ệ n di drợc thực hiện trone đệm TBE 0,5 X ở hiệu diện thế 150V trong thời gian 60-

75 phút ( d ừng ciạy khi băng dye Bromophenol blue ở cách mép dưới bàn geỉ khoản 1 cm) Bản gel d iu ợ c tách ra khỏi bản kính và được soi dưới tia ƯV để quan sát các băng điện di Nêu bản gel p o ] yacry amide không có ethidium bromide khi chuẩn bị, thì bản gel được ngâm trong dung dịch Ethidum Bromide 0.5 1-ig/ml trong 10 phút, rửa kỹ bàng nước và quan sát dưới tia

u v

B ộ KÍT PHÁT HIỆN ĐỘT BIÊN FLT3-ITD

Dream Taq buffer (lOx)Dream Taq (DNA polymerase)Mồi FLT3 xuôi (Forward)

6 Mồi FLT3 ngược (Reverse)

7 Đối chứng thường (Nonnal control)

8 Đối chứng bệnh (+33 mutant control)

* Trừ đôi chứng lượng đủ cho 5 phản ứng

1.234

PH Ụ LỤ C 2 HỢP ĐỒNG CHƯ YẺN G IA O QUY TRÌ NH

1 Hợp đồng chuyển giao quy trình