Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền một số giống chè đặc sản trồng tại thái nguyên bằng kĩ thuật SSR

Theo thống kê Việt Nam hiện có khoảng 120 giống chè, bên cạnh các giống chè lai có năng suất cao đang được trồng phổ biến ở nhiều vùng trong cả nước thì, các giống chè địa phương tuy năn

LÊ QUANG THƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG

DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG CHÈ ĐẶC SẢN TRỒNG TẠI THÁI

NGUYÊN BẰNG KĨ THUẬT SSR

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

LÊ QUANG THƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG

DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG CHÈ ĐẶC SẢN TRỒNG TẠI THÁI

NGUYÊN BẰNG KĨ THUẬT SSR

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS HOÀNG THỊ THU YẾN

THÁI NGUYÊN - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi Các sốliệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bốtrong bất kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõnguồn gốc

Tác giả

Lê Quang Thương

LỜI CẢM ƠN

Trước tên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị Thu Yến

-Giảng viên Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - người đãtận tnh hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu đểtôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và tập thể cán bộ phòng thí nghiệm KhoaKhoa học Sự sống, cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học TháiNguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình họctập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các cán bộ công tác tại Viện Khoa học sựsống - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thựchiện đề tài

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán

bộ, Công ty chè Sông Cầu - Huyện Đồng Hỷ - Thành Phố Thái Nguyên,nhân dân vùng chè Trại Cài - Minh Lập - Đồng Hỷ và Vùng chè Tân Cương -Thành Phố Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thu thập vật liệunghiên cứu làm đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn

bè, đồng nghiệp và nhóm nghiên cứu di truyền đã luôn cổ vũ, động viên tôitrong suốt thời gian qua

Tác giả

Lê Quang Thương

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài

1 2 Mục tiêu nghiên cứu

2 3 Nội dung nghiên cứu

2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây chè 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây chè 3

1.1.2 Đặc điểm di truyền của cây chè 4

1.1.3 Tình hình sản xuất chè trên thế giới và ở Việt Nam 5

1.1.4 Đặc điểm một số dòng chè trồng tại Thái Nguyên 9

1.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè ở Việt Nam và thế giới 13

1.2.1 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè trên thế giới

13 1.2.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome che ở Viêt Nam

15 1.3 Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu tính đa dạng genome sinh vật 17

1.3.1 Kỹ thuật RFLP (Restricton Fragment Length Polymorphisms

-đa

1.3.2 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - đa

hình độ dài các đoạn được nhân bản chọn lọc) 181.3.3 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 181.3.4 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản) 19

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.1 Nguyên liệu 22

2.1.2 Hóa chất 22

2.1.3 Thiết bị 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu lá chè

23 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 23

2.2.3 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 25

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng và kiểm tra độ tinh sạch DNA tổng số 26

2.2.5 Phương pháp PCR - SSR 26

2.2.6 Phân tích số liệu 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Tách chiết DNA tổng số từ lá chè 29

3.2 Phân tích chỉ thị SSR ở các mẫu chè nghiên cứu 31

3.3 Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu chè nghiên cứu dựa trên phân tch PCR - SSR 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 53

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa tếng Việt Nghĩa tếng Anh

DNA Axit Deoxynucleic Deoxyribonucleic acid

EDTA EDTA Ethyen Diamin Tetraacetc Acid

kb Kilo base Kilobase = 1000 bp

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reacton

RNA Axit Ribonucleic Ribonucleic Acid

VNTR VNTR Variable Number of Tandem Repeat

RAPD DNA đa hình được khuếch đại

ngẫu nhiên Random Amplify Polymorphism DNAPrimer F Mồi xuôi Primer Forward

Primer R Mồi ngược Primer Reverse

SSR Trình tự lặp lại đơn giản Simple Sequence Repeat

AFLP Đa hình độ dài các đoạn được

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Sản lượng chè một số nước trên thế gới 6

Bảng 1.2 Khối lượng xuất khẩu chè của một số nước xuất khẩu chính giai đoạn 2006-2010 7

Bảng 1.3 Diện tích, sản lượng, xuất khẩu chè Việt Nam 9

Bảng 1.4 Cơ cấu giống chè tỉnh Thái Nguyên giai đoạn 2001 - 2010 10

Bảng 2.1 Danh sách tên và đia điêm thu mâu của 25 mẫu chè nghiên cứu

22 Bảng 2.2 Danh muc các thiết bị, dụng cụ được sử dụng 23

Bảng 2.3 Danh sách 9 cặp mồi SSR được sử dụng trong nghiên cứu

27 Bảng 2.4 Thành phần của phản ứng PCR - SSR 28

Bảng 2.5 Chu trinh nhiêt của phan ưng PCR - SSR 28

Bảng 3.1 Phổ hấp thụ DNA ở bước sóng 260nm và 280nm và nồng độ DNA tổng số của 25 mẫu chè 30

Bảng 3.2 Tổng số phân đoạn DNA của sản phẩm PCR - SSR với 9 cặp mồi 32

Bảng 3.3 Số phân đoạn DNA xuất hiện và số phân đoạn DNA đa hình đối với mỗi mồi 33

Bảng 3.4 Bảng hệ số tương đồng di truyền của 25 mẫu chè nghiên cứu 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh một số giống chè đặc sản trồng tại Thái Nguyên 10

Hình 1.2 Đa hình DNA SSR giữa 2 cá thể có motf (AT)n 21

Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 0.8% của 25 mẫu chè nghiên cứu

29 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm SSR của 25 mẫu chè với mồi YS28 34

Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS64 35

Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS27 36

Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS98 37

Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS83 37

Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR - SSR với mồi YTS104 38

Hình 3.8 Điện di sản phẩm PCR - SSR với mồi YS3 39

Hình 3.9 Sơ đồ quan hệ di truyền của 25 mẫu chè nghiên cứu

44

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) thuộc họ chè Theaceae là

loại cây trồng lưu niên có thời gian thu lợi kinh tế kéo dài đến hơn 60 năm.Sản xuất và chế biến chè đã trở thành một trong những ngành kinh tế nôngnghiệp quan trọng ở nhiều quốc gia với sản phẩm tạo ra có giá trị xuất khẩucao Chè (trà) không chỉ là thức uống giải khát hàng ngày mà còn là một nétvăn hóa đặc trưng, một thứ nghệ thuật (Trà đạo) của người dân châu Á Từnhững kinh nghiệm dân gian cho đến các nghiên cứu khoa học gần đây đãkhẳng định giá trị của cây chè đối với sức khỏe

Ở Việt Nam, phát triển cây chè là một trong 10 chương trinh trong điêm

vê phát triển nông nghiệp nông thôn, nươc ta co môt sô vung trông che lơn như : vùng chè Tây Bắc, vùng chè Việt Bắc, vùng chè trung du Bắc Bộ, vùng chè Bắc Trung Bô , vùng chè Tây Nguyên… [13] Theo thống kê Việt Nam hiện có khoảng 120 giống chè, bên cạnh các giống chè lai có năng suất cao đang được trồng phổ biến ở nhiều vùng trong cả nước thì, các giống chè địa phương tuy năng suất không cao nhưng lại có chất lượng tốt, được coi là đặc sản

Hiện nay có rất nhiều phương pháp để nghiên cứu sự đa dạng di truyềncủa các giống cây trồng nói chung và cây chè nói riêng như RADP, RFLP, AFLP,SSR,… Các phương pháp này đã khắc phục được nhược điểm của các phươngpháp chọn giống truyền thống bởi đánh giá được hệ gen của cây trồng

Trong những năm gần đây, diện tích trồng các giống chè địa phương có

xu hướng giảm, nhiều giống chè quí hiếm sẽ bị mất dần Như vậy, việc tmhiểu và nghiên cứu các giống chè đặc sản của địa phương sẽ góp phần bảotồn nguồn gen cây chè là rất cần thiết

Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA là cơ sở khoa học để đềxuất việc lựa chọn những giống chè có năng suất cao, chất lượng tốt,

đặc sản

làm vật liệu chọn giống là những vấn đề rất được quan tâm nghiên cứu Xuất

phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền một số giống chè đặc sản trồng tại Thái Nguyên bằng kĩ thuật SSR”.

2 Mục têu nghiên cứu

Phân tch được chỉ thị SSR ở các mẫu chè nghiên cứu của một số giốngchè đặc sản địa phương

Xác định được khoảng cách di truyền của một số giống chè đặc sản địaphương được trồng ở Thái Nguyên

3 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập các giống chè được đánh giá có chất lượng tốt và là đặc sảnđược trồng tại một số vùng trồng chè ở Thái Nguyên

- Thực hiện kỹ thuật PCR - SSR với 9 cặp mồi để đánh giá sự đa dạngtrong trình tự genome của chè

- Sử dụng phần mềm sinh học phân tử NTSYS version 2.0 để phân tíchkết quả của PCR - SSR và chỉ ra được mối quan hệ di truyền giữa các giốngnghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây chè

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây chè

Cây chè co tên khoa hoc la Camellia sinnesis (L) O Kumtze va thuôc hê

thông phân loai sau [3]:

Chi chè (Camellia hoặc Thea)

Loài (Camellia sinensis)

Họ chè có 29 chi và khoảng 550 loài phân bố chủ yếu ở các nước nhiệtđới và cận nhiệt ở cả hai bán cầu, đặc biệt ở Đông và Đông Nam Á Ở ViệtNam có khoảng 11 chi với trên 200 loài

Cây chè có nguồn gốc phát sinh ở khu vực gió mùa Đông Nam Á và có lịch sử rất lâu đời Cho đến nay, chè đã có thời gian phát triển gần 5000 năm Qua nhiều con đường, cây chè được trồng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới [3], [12] Năm 661, lịch sử của Triều Tiên đã ghi chép phong tục cúng chè dâng tổ tiên của nhà vua Soro Năm 729, Hoàng đế Shomu Nhật Bản ban tiệc chè cho 100 nhà sư thời Nara Vào thời Heian (794-1185), chè

đã trở thành nét văn hóa dân gian phổ biến ở Nhật Bản Năm 850, các lái buôn Ả Rập mua chè Trung Quốc theo con đường tơ lụa Chè xuất hiện ở

Châu Âu năm 1560 Năm 1833, Sa Hoàng nước Nga trồng chè nhập từ

Trung Quốc Giữa thế kỉ XVII, chè được trồng ở Châu Mỹ Đến thế kỷ XX, các vùng sản xuất chè được mở rộng liên tục, các nhà máy chế biến tăng

nhanh, khoa học kỹ thuật chè phát triển mạnh.

Hiện nay vẫn còn nhiều quan điểm khác nhau về nguồn gốc của cây chè.Dựa trên những cơ sở về lịch sử, khảo cổ học và thực vật học Một số quanđiểm được nhiều người công nhận nhất là:

* Cây chè có nguồn gốc từ Vân Nam - Trung Quốc

Carl Von Linnaeus là người đầu tiên xác nhận Trung Quốc là nguyên sản

của cây chè và định tên khoa học của chè là Theaceaae sinensis, phân thành hai thứ chè là Thea bohea (chè đen) và Thea viridis (chè xanh) [12].

Bên cạnh đó, các nhà khoa học Trung Quốc đã giải thích sự phân bố củachè mẹ như sau: tỉnh Vân Nam là nơi bắt đầu hàng loạt các con sông lớn đổ

về các con sông ở Việt Nam, Lào, Campuchia và Mianma Đầu tiên chè mọc

ở Vân Nam, sau đó lan dần ra các nơi khác [8]

* Cây chè có nguồn gốc từ vùng Atxam (Ấn Độ)

Năm 1823, Bruce đã phát hiện được những cây chè dại lá to ở vùngAtxam (Ấn Độ), từ đó các học giả người Anh cho rằng: nguyên sản của câychè là vùng Atxam chứ không phải là ở vùng Vân Nam - Trung Quốc

* Cây chè có nguồn gốc từ Việt Nam

Djemukhatze (1961- 1976) đã có những công trình nghiên cứu về phứcchất catechin của lá chè, so sánh về thành phần các chất catechin giữa cácloại chè được trồng và chè mọc hoang dại đã nêu luận điểm về sự tếnhóa hóa sinh của cây chè, trên cơ sở đó ông đã kết luận: “Nguồn gốc câychè chính là ở Việt Nam” [12], [7]

1.1.2 Đặc điểm di truyền của cây chè

Mặc dù là loại cây trồng quan trọng ở nhiều nước trên thế giới nhưngcho đến nay, vẫn chưa có nhiều thông tin về bộ gen của cây chè [37] Nhữngnghiên cứu từ trước đến nay đã cho kết quả rất khác nhau Năm 2001,

nghiên cứu của Hanson cho thấy kích thước bộ gen của cây chè Camellia

sinensis vào khoảng 15.298 Mbp [28] Tuy nhiên gần đây, nghiên cứu của

Tanaka và Taniguchi (năm 2007) trên các giống chè Nhật Bản lại cho thấy kíchthước bộ

gen của cây chè được ước tính khoảng 4 Gbase [37] Nghiên cứu tế bào họccác giống chè của Kondo (1979) đã xác định cây chè là loài thực vật lưỡngbội (2n = 30, số nhiễm sắc thể cơ sở là 15) và kiểu nhân (karotype) biếnđổi khác nhau giữa các giống chè [22].

Nói chung, các nhiễm sắc thể của chè có kích thước nhỏ và có xu hướng

kết lại với nhau thành khối Giá trị r (tỷ lệ chiều dài giữa cánh dài và cánh

ngắn của nhiễm sắc thể) của 15 cặp nhiễm sắc thể trong khoảng 1,00đến

1,91 Sự đồng nhất của các nhiễm sắc thể lưỡng bội cho thấy đặc điểm cùng

nguồn (monophyletc) tất cả các loài thuộc chi Camellia.

1.1.3 Tình hình sản xuất chè trên thế giới và ở Việt Nam

Hơn 300 năm sau khi chè từ châu Á du nhập vào châu Âu, nhu cầu củathị trường thế giới về các sản phẩm từ chè đã tăng vọt và kéo theo đó là

sự phát triển mạnh mẽ của ngành sản xuất và chế biến chè Từ vùng nguyênsản Đông Nam Á, đến nay trên thế giới đã có hơn 52 quốc gia sản xuất vàchế biến chè [28] Chè với vai trò là đồ uống đã được chế biến thành nhiềudạng sản phẩm như chè đen, chè xanh, chè trắng, chè Ô Long; cách thức phachế và thưởng thức chè cũng rất đa dạng, từ pha hãm truyền thống đến cácloại chè túi lọc tiện lợi và nhanh chóng Bên cạnh đó, lá chè với nhiều thànhphần có lợi cho sức khỏe cũng được sử dụng làm thuốc, mỹ phẩm…

Theo thống kê của FAO năm 2010 (bảng 1.1), sản lượng chè thế giớinăm 2000 là 2,96 triệu tấn, tới năm 2010 là 4,1 triệu tấn, tăng trungbình

4,1%/ năm, 17 nước trồng chè ở Châu Á đã chiếm 89% diện tch trồng chètrên thế giới, tếp theo là châu Phi với 18 nước chiếm 9% Trong 6 nướcđứng đầu thế giới về trồng chè về diện tích chè thì có đến 5 nước Châu Á,gồm Trung Quốc, Ấn Độ, Srilanka, Indonesia và Việt Nam, chỉ có 1 nước ChâuPhi là Kenya

Bảng 1.1 Sản lượng chè một số nước trên thế gới

(Nguồn: Số liệu thống kê của FAO, 2010)

Nhìn vào bảng trên ta thấy 5 nước có sản lượng chè lớn nhất thế giới làTrung Quốc, Ấn Độ, Srilanka, Kenya, Việt Nam Đặc biệt Trung Quốc cómức tăng sản lượng chè là lớn nhất, năm 2004 sản lượng chè Trung Quốc855,422 nghìn tấn đứng sau Ấn Độ (878 nghìn tấn), năm 2006 sản lượng chèTrung Quốc là 1028,1 nghìn tấn, nhưng tới năm 2010 sản lượng chè TrungQuốc đạt 1355,6 nghìn tấn Chè Ấn Độ năm 2006 đứng thứ hai thế giới vềsản lượng 985,2 nghìn tấn, năm 2007 tăng tới mức 989,7 nghìn tấn, nhưng sau đó thì giảm nhẹ 982,1 nghìn tấn năm 2009 và 970,3 nghìn tấn năm2010

Hàng năm có tới 45% sản lượng chè sản xuất ra là dành cho xuất khẩu.Xuất khẩu chè chiếm một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân củanhiều nước, đặc biệt là trong vấn đề an toàn lương thực Theo thống kê củaFAO, hoạt động xuất khẩu đã mang lại 33% thu nhập xuất khẩu từ các sảnphẩm nông sản cho Kenya, 55% cho Srilanka, 5% tại Tanzania, 2% ởIndonesia Bên cạnh đem lại nguồn thu cho nước xuất khẩu, xuất khẩuchè còn góp phần nâng cao vị trí của quốc gia trên trường quốc tế, chính

vì vậy mà các nước không ngừng đẩy mạnh hoạt động xuất khẩu chè ra thịtrường quốc tế Tình hình xuất khẩu chè ở một số nước xuất khẩu chínhgiai đoạn 2006-2010 được thể hiện ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Khối lượng xuất khẩu chè của một số nước xuất khẩu chính

Theo bảng 1.2 nhận thấy: bảng xếp hạng về kim ngạch xuất khẩu chè cóvài sự thay đổi khi khối lượng xuất khẩu chè của Kenya năm 2010 vươn lênđứng đầu thế giới với 281,1 nghìn tấn (tăng 28,77% so với năm 2009), năm

2009 là 361,1 nghìn tấn (tăng 15,02% so với năm 2008) Trung Quốc sụtgiảm số lượng và đứng thứ 2, giảm so với 2009 là 0,14%; năm 2006 Srilankađứng đầu với 314,9 nghìn tấn, nhưng lại bị sụt giảm liên tục những năm sauđó: năm 2007 giảm 6,57% so với năm 2006, năm 2008 phục hội nhẹ tăng2,4% so với năm 2007, năm 2009 lại giảm 7,10% so với 2008, năm 2010 tăng6,68% Năm 2010 khối lượng xuất khẩu chè của Srilanka đứng thứ 3 thế giới

Ở Việt Nam chè là cây công nghiệp dài ngày được bắt đầu sản xuất từhơn 3000 năm trước Trước đây nhân dân chỉ trồng làm bóng mát và lấy búplàm đồ uống giải nhiệt Do có khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm với 2/3 diện tíchlãnh thổ là đồi núi, cây chè đã trở thành cây trồng mang tính chất sản phẩmhàng hóa, sản phẩm chè được đưa ra bán ở nhiều thị trường khác nhau Theothống kê của Tổng cục Hải quan, (năm 2013) Viêt Nam la quôc gia sản xuất

và xuất khẩu chè đưng thư 5 thế giới Hiện nay, cả nước có 35 tỉnh trồng chèvới diện tích khoảng 131 nghìn ha Tuy nhiên, diện tích tập trung chủ yếuthuộc miền núi, trung du phía Bắc, tỉnh Nghệ An, Lâm Đồng Phát triển mạnhnhất ở các tỉnh Thái Nguyên, Tuyên Quang, Hà Giang, Phú Thọ, Yên Bái,Sơn La Số lượng các doanh nghiệp sản xuất chè quy mô công nghiệp khoảng

700 doanh nghiệp Có 230 doanh nghiệp xuất khẩu trực tếp ra nước ngoàitới khoảng hơn 100 nước trên thế giới Số lượng người lao động trong ngànhchè là 1,5 triệu người [5] Diện tích, sản lượng, xuất khẩu chè Việt Nam giaiđoạn

2001-2010 được trình bày ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Diện tích, sản lượng, xuất khẩu chè Việt Nam

Năm Tổng diện

tích (ha)

Sản lượng (tấn khô)

Số lượng XK (tấn khô)

Kim ngạch (triệu USD)

Giá XK bình quân (USD/tấn)

(Nguồn: Hiệp hội chè Việt Nam)

Theo Hiệp hội chè Việt Nam, định hướng phát triển ngành chè ViệtNam trong thời gian tới là nâng cao chất lượng, an toàn vệ sinh thực phẩm.Mục têu là phát triển diện tch trồng chè từ 130 nghìn ha năm 2010 lên 135nghìn ha năm 2015 và đến năm 2020 là 150 nghìn ha Ngành chè sẽ khôngphát triển nhiều diện tch mà giữ diện tch ổn định, nâng cao năng suất, chấtlượng chè và phấn đấu giá chè xuất khẩu bằng với giá bình quân của thế giới

1.1.4 Đặc điểm một số dòng chè trồng tại Thái Nguyên

Thái Nguyên là một tỉnh Trung du miền núi, địa hình chủ yếu là đồi bát

úp, có độ dốc không lớn [7] Với dạng địa hình này Thái Nguyên rất thuận lợicho việc phát triển sản xuất chè Những năm gần đây, Thái Nguyên đã chútrọng đến việc chọn lựa, xây dựng cơ cấu giống chè phù hợp, dần dần thaythế các giống chè trồng bằng hạt có năng suất và chất lượng thấp bằng cácgiống nhập nội cho năng suất, chất lượng cao hơn, cơ cấu giống chè tỉnh TháiNguyên thể hiện ở bảng 1.4 [15]

Bảng 1.4 Cơ cấu giống chè tỉnh Thái Nguyên giai đoạn 2001 - 2010

Chủng loại/

Giống chè

DT (ha)

Tỷ lệ (%)

DT (ha)

Tỷ lệ (%)

DT (ha)

Tỷ lệ (%)

Tổng diện tích 13.524 100,00 14.133 100,00 17,661 100,00 Chè Trung Du 12.302 92,09 10.733 75,90 11.556 65,43 Giống mới chọn tạo 960 7,18 3.000 21,22 5.013 28,38 Giống mới nhập nội 56 0,41 400 2,83 1028 5,82

(Nguồn: UBND Tỉnh Thái Nguyên)

Thông qua trồng thử nghiệm bước đầu đã xác định một số giốngnhập nội có triển vọng để bổ sung vào cơ cấu giống của tỉnh là Tri 777, PhúcVân Tiên, Keo Am Tích đó là các giống có khả năng chế biến chè xanh chấtlượng cao

Hình 1.1 Hình ảnh một số giống chè đặc sản trồng tại Thái Nguyên

Hiện nay 60% diện tch trồng chè ở Thái Nguyên là giống Trung du.Giống chè Trung du (hay còn gọi là chè ta) có đặc điểm búp nhỏ nên năng

suất không cao Nhưng nếu biết cách chế biến, chè Trung du sẽ cho ra sảnphẩm có chất lượng cao hơn hẳn các loại chè được làm từ các giống khác, đểchế biến loại chè thượng hạng tôm nõn thì nhất thiết nên dùng búp chèTrung du Chè Trung du thường rất đậm đà, cánh nhỏ đều, nước chè sánh vàhậu vị ngọt đậm, hương trà lưu lại lâu [7].

Theo tìm hiểu của chúng tôi, chè Bát Tiên ngon ngoài yếu tố giống tốtcòn do quy trình trồng, chăm sóc, nhất là khâu chế biến yêu cầu sự tỉ mỉ cao.Đất trồng chè phải có tầng canh tác trên 80 cm, kết cấu tơi xốp Tới thời kỳthu hoạch, người sản xuất thường hái chè vào ngày nắng tránh ngày mưa, nếukhông chè sẽ bị ngấm nước mất vị ngon Thời điểm thu hái tốt nhất là từkhoảng 9h sáng đến 4h chiều, khi hái thường hái búp chè bánh tẻ, chọnbúp có khoảng 5 lá Sau khi thu hoạch phải đem chè về rải ra nền sạchkhoảng 30 phút để chè thoáng, bay hết hơi nước ẩm ướt Sau đó mới tiếnhành các bước vò sao chè tới khi nào thấy chè toả ra mùi thơm như bánhmật, tếng chè nổ kêu lách tách là được Không chỉ vậy, để nước chè Bát Tiên

có màu xanh, hương thơm đặc trưng, khi pha chè chỉ pha với một lượngvừa đủ, có thể tráng chè qua nước sôi

Chè Bát Tiên có nguồn gốc từ Đài Loan được nhập nội và trồng thànhcông ở một số tỉnh trung du miền núi phía Bắc Đặc điểm của chè Bát Tiên làcây to trung bình, tán đứng, mật độ cành hơi thưa, lá màu xanh nhạt, răngcưa rõ, chóp lá hơi nhọn Do phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng khí hậu,người dân lại có kinh nghiệm trồng chè nhiều năm nên khi đưa vào trồng chèBát Tiên có tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng và phát triển tốt nhanh cho thuhoạch, năng suất khá [7]

Chè Keo Am Tích là giống chè có thân và tán to vừa, cành nhiều, lá hơithuôn, dài, hình bầu dục, lá dày, chóp lá nhọn, răng cưa sâu và rõ, mặt láphẳng, màu lá xanh nhạt, búp màu xanh nhạt, hơi phớt tím, nhiều tuyết Câysinh trưởng khá, mật độ búp dày, búp sinh trưởng khoẻ và mập Khi trồng cây

có tỷ lệ sống cao, cây 1 tuổi có đường kính thân 0,73 cm Nhân giống vô tínhbằng giâm hom có tỷ lệ sống trên 95%, chè 20 tháng tuổi đạt 348 kg/ha [8].

Giống chè Phúc Vân Tiên la giông lai giưa Vân Nam la to va Phuc

Đinh Đai Bach che Bât mâm sơm đâu thang 3, mât đô bup cao Năng suât râtcao, chè 4 - 8 tuôi đat năng suât trên 10 tân/ha, chông chịu sâu bệnh tốt,chông hạn tốt Thích hợp trồng ở vùng trung du và núi cao [8].

Giống chè Kim Tuyên được chọn lọc từ tổ hợp lai hữu tính giữa mẹ làgiống Ô Long lá to của địa phương và bố là giống Raiburi của Ấn Độ vàonăm 1975 Giống chè này nhập nội vào Việt Nam từ 1994

Giống chè Kim Tuyên có dạng thân bụi, thế lá ngang, kích thước lá nhỏrăng cưa mờ, có 8 đôi gân lá Màu sắc xanh đậm, trơn bóng, mép lượn sóng,

lá non phớt tm Bật mầm sớm, sức sinh trưởng mạnh, mật độ búp trungbình Là giống cho sản lượng khá và ổn định Năng suất trung bình 6 - 8tấn/ha, năng suất thâm canh đạt 10 - 12 tấn/ha [4]

Giống chè LDP1 và LDP2 là hai dòng chè được tạo ra từ phép lai hữutính giữa cây mẹ là Đại Bạch Trà và cây bố là giống PH1 Qua quá trình chọnlọc, hai dòng này biểu hiện nhiều ưu điểm như lá to, búp có màu xanh và mật

độ búp dày, cây sinh trưởng khỏe và cho năng suất cao

Giống chè Hùng Đỉnh Bạch là giống chè quí có nguồn gốc từ PhúcKiến -Trung Quốc Đặc điểm của Hùng Đỉnh Bạch là cây dạng thân gỗ, thế lánằm ngang, lá thuôn dài, búp lớn Vị của Hùng Đỉnh Bạch rất đậm đà

Giống chè Tri 777 có nguồn gốc từ Srilanka, được chọn lọc từ chè ShanMộc Châu - Srilanka, có đặc điểm phân cành thấp, dễ giâm cành, hệ số nhângiống cao, chịu hạn tốt, chống chịu sâu bệnh trung bình Búp 1 tôm 2 lá: 60 -75gr Tanin 30,5% Chế biến chè xanh Trồng thích hợp nhất ở vùng núi thấp

100 - 500 m so với mực nước biển [12]

Giống chè Shan là cây chè Việt Nam do Viện Nghiên cứu chè Phú Thọ điều tra phân loại, có đặc điểm lá dài, rộng, thân cao to, tán rộng, số lứa hái ít,

lông tuyết nhiều, hương thơm tự nhiên, búp lớn, P100 búp: 70gr chất lượngbúp tốt, giâm cành khó hơn so với các giống khác Chế biến chè xanh Trồng

ở vùng núi cao (> 1000m so với mực nước biển) sẽ cho năng suất cao [15].Giống chè Yabukita có nguồn gốc Nhật Bản, với đặc điểm Thân bụi, rễchùm, búp sinh trưởng đồng loạt, tỷ lệ búp mù thấp Nhiễm sâu bệnh nặng(họ cánh tơ, nhện đỏ), chịu hạn kém Trọng lượng 100 búp: 50gr Hướng sảnxuất chủ yếu để chế biến chè xanh [15]

Giống chè Yakatamidozi có nguồn gốc Nhật Bản, được chọn tạo ra bằngphương pháp lai giữa giống Yabukita và S6 Yakatamidozi là giống chè thíchánh sáng, lá mềm, búp nhỏ chịu sâu bệnh tốt, trọng lượng 100 búp: 50gr Sinhtrưởng nhanh, được trồng để chế biến chè xanh [15]

1.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè ở Việt Nam và thế giới

1.2.1 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè trên thế giới

Viêc nghiên cưu cac giông cây đươc coi la tên đê , là nguồn tư liệu tênquyết không thê thay thê trong san xuât nông nghiêp Trong qua trinh sanxuât chè, giông co vai tro rât quan trong trong viêc nâng cao năng suât , sảnlượng và chất lượng sản phẩm Do đo cac giông che tôt không ngưng đươcquan tâm nghiên cưu va triên khai vao trông trên quy mô lơn

Ấn Độ là quốc gia đứng đầu thế giới về sản lượng chè do rất quan tâm nghiên cưu triên khai cac giông tôt cho năng suất cao vao san xuât Tư nhưng năm 50 của thế kỷ XX , Ấn Độ đa thanh công trong viêc chon ra 110 giông chè tốt Công tac chon giống chè, kêt hơp chon giống có sản lượng cao và có khả năng chống hạn , chông bênh rât đươc chu y ơ Srilanca Nhơ đo đa tao đươc cac giông nôi têng nh ư Tri 777, TRI2043 Cũng theo Đỗ Ngọc Quý (2000) thì Ấn Độ, Nhât Ban, Srilanca, Trung Quôc, Liên Xô cu… đa sư dung công nghê sinh hoc trong chon giông che tôt , sư dung ưu thê lai đê tao ra giông chât lương cao phuc vu cho san xuât [14]

Trung Quôc la quôc gia san xuât che hang đâu thê giơi , các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu và sử dụng giống chè tốt trong sản xuất từrât sơm Ngoài những giống chè nổi tếng từ lâu đời , hiên nay Trung Quôc

có nhiều giống chè cho năng suất cao , chât lương tôt đê chê biên ca che xanh va che đen như : Phúc Vân Tiên , Hoa Nhât Kim , Hùng Đỉnh Bạch (Phúc Kiến ), Phú Thọ 10…[11]

Nhât Ban đăc biêt quan tâm chu ý đến nghiên cứu chọ n giống, nhiêu giông che mơi va cho năng suât cao đa đươc đưa vao san xuât Trong

đo co giông Yabukita đươc trông phô biên nhât chiêm tơi 70% diên tich che ơ Nhât Ban [14]

Ngày nay, để có được các giống chè cho năng suấ t cao thi viêc ap dung các tến bộ khoa học kỹ thuật vào quá trình sản xuất chè luôn được chú trọng đâu tư Bên canh đo , các nhà khoa học cũng bắt đầu tập trung nghiên cứu sâu hơn về cây chè ở mức độ phân tử Kích thước genome của chè lớn, khoảng 4

Gb Do thiếu sự hiểu biết về nuôi cấy mô cũng như quá trình dịch mã xảy ra ởchè nên rất ít các thông tn về trình tự genome được biết đến Đến năm

2010, chỉ có 819 trình tự nucleotide, 12.664 đoạn trình tự biểu hiện(Expressed Sequence Tags - EST), và 478 protein từ chè được công bố trênngân hàng Genbank Các nghiên cứu về chè chủ yếu tập trung vào các genliên quan đến của trình trao đổi chất thứ cấp, hầu hết được phát hiện quatrình tự EST [32]

Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, chỉ thị SSR được sử dụng rất phổbiến Tuy nhiên cho tới nay, số lượng chỉ thị SSR đặc hiệu cho cây chè cònrất ít, do đó các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị SSR trong phân tích di truyền hỗtrợ công tác chọn giống chè còn khiêm tốn Sự đa dạng di truyền sẽ chỉ rađược mức độ sai khác giữa các giống chè nghiên cứu ở mức độ phân tử,đồng thời giải thích được tính đa dạng nguồn gen của cây chè

Singh và đtg vào năm 2006 đã sử dụng chỉ thị lặp trên đoạn 5S rDNA đểphân tch di truyền 28 dòng chè thuộc ba thứ chè Assam, Sinensis và

Cambod, qua đó đã xác định được một số chỉ thị có thể phân biệt được các giống chè thuộc ba thứ chè này [35].

Năm 2008, Yao và đtg đã sử dụng chỉ thị ISSR nghiên cứu đa dạng ditruyền 48 giống chè có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Kenya và ứngdụng trong phân tích quan hệ di truyền các cây chè lai (xác định bố mẹ),

hỗ trợ công tác lai tạo giống chè tại Trung Quốc [44]

Chỉ thị RFLP đã được sử dụng trong phân tích quan hệ di truyềngiữa các giống cây trồng và họ hàng hoang dại của chúng từ năm 1989 [17]

Ở cây chè, ít có những báo cáo về sử dụng chỉ thị RFLP trong nghiên cứu

đa dạng di truyền Phần lớn các nghiên cứu sử dụng RFLP đến nay đềuđược thực hiện ở Nhật Bản [28]

Ujihara và đtg (2009) cũng sử dụng một số cặp mồi SSR thiết kế cho cây

chè hoa Camellia japonica để nhận dạng di truyền các giống chè bản địa, phục

vụ yêu cầu dán nhãn các sản phẩm chè lưu hành trên thị trường Nhật Bản [40]

Chỉ thị AFLP lần đầu tên được áp dụng với cây chè Kết quả nghiêncứu với 32 giống chè Kenya cho thấy sự phân nhóm của ba thứ chè Assam,Trung Quốc và Cambod, trong đó quần thể chè Trung Quốc có mức độ đadạng di truyền cao hơn cả Các nghiên cứu sau này của Lee (2003) và Mishra(2004, 2009) [23], [27], cũng cho kết quả tương tự

Năm 2009, Mishra và đtg đã sử dụng 8 tổ hợp mồi AFLP để phân tích

đa dạng di truyền của 29 giống chè chính của vùng Darjeeling (Ấn Độ) [27].Trong năm 2005, Chen và đtg đã công bố kết quả đánh giá nguồn gen 4quần thể chè ở Vườn bảo tồn giống chè Trung Quốc bằng chỉ thị RAPD, qua

đó xác định được 20 chỉ thị RAPD có khả năng phân biệt được 15 giống chèchính đang được trồng phổ biến [17]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè ở Việt Nam

Ở nước ta , cây che đang đươc coi la cây trông chu lưc gop phân xoa đo igiảm nghèo cho vùng sâu , vùng xa, vùng núi cao Qua nhâp nôi, lai tao, trong

nhưng năm gân đây nươc đa tao đươc nhiêu giông che mơi đem lai hiêu qua kinh tê cao.

Qua nhiêu năm nghiên cưu , Viên nghiên cưu che đa ưng dung th ống kê sinh hoc qua phân tich tương quan dưa vao đăc trưng hinh thai kêt hơp vơi xem xet cac đăc điêm phat triên bô rê , sinh trương sinh, màu sắc lá , sâu bênh, khả năng giâm cành… để chọn nhanh các loại chè có triển vọng k hi cây che 2

- 3 tuôi Tại trung tâm nghiên cứu phát triển chè - Viên KHKT Nông lâm nghiêp miên nui phia Băc , băng phương pháp gây đôt biên băng bưc xa đa chọn được một số cá thể chè sinh trưởng và phát triển tốt Ngoài ra, Viên con sư dung Consixin xư ly trên mâm che giông PH 1 trong thơi gian 24 - 48h vơi nông đô 0,2% cũng đã thu được kết quả bước đầu Ngoài ra, các nhà khoa học đa tên hanh nghiên cưu nhân giông băng phương phap nhân vô tinh t

ừ rất sơm như ghep, giâm canh va đa thu đươc nhưng kêt qua tôt [4]

Ngày nay, nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giốngcây trồng đã được nhiều nhà khoa học quan tâm Việc sử dụng các chỉ thịphân tử khác nhau được nghiên cứu và phát triển đã trở thành công cụmạnh mẽ để phân tích đa dạng di truyền và xác định các mối quan hệgiữa các giống cây trồng, vật nuôi như RAPD, SSR, RFLP, AFLP Trong đó, chỉthị SSR (Simple Sequence Repeats) là một loại chỉ thị được sử dụng kháphổ biến, chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xâydựng bản đồ liên kết, phân lập gen, xác định quan hệ di truyền giữa cácgiống, dòng cây trồng

Trong những năm gần đây phương hướng sản xuất chè ở nước ta là pháttriển diện tích trồng chè, nâng cao năng suất nhưng phải đảm bảo chất lượngchè, phấn đấu giá chè xuất khẩu bằng giá bình quân của thế giới Tuy nhiêntrong thực tế sản xuất chè, Việt Nam vẫn phải nhập nội rất nhiều giốngchè mà vẫn bị thất thu, do giống không đảm bảo chất lượng Vì vậy, việc

suất cao,

chất lượng tốt, thích nghi với điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu của địa phương

có vai trò hết sức quan trọng

Ở Viêt Nam co rât nhiêu công trinh nghiên cưu vê cây chè được đề xuất ,triên khai co hiêu qua , góp phần không nhỏ vào việc nâng cao sản lượng và chât lương che thanh phâm , giúp cho ngành chế biến và sản xuất chè ở Việt Nam ngay cang co thương hiêu , đap ưng đươc yêu câu của thị trường Các nghiên cứu về chè ở mức độ phân tử cũng bắt đầu được đề cập đến

Nguyễn Thị Thu Hương và đtg (2008), đã dùng kĩ thuật RADP với 8mồi ngẫu nhiên để đánh giá sự đa dạng di truyền ở 1 số dòng chè Shan

(Camellia sinensis var Assamica (Mast) Pierre sec Phamh) Kết quả có 77

phân đoạn DNA ngẫu nhiên được nhân bản, trong đó 100% số phân đoạnđều đa hình [6]

Nguyễn Hữu La và đtg (2004) đã sử dụng 10 mồi RAPD trong nghiên cứuđánh giá đa dạng di truyền một số giống chè Shan ở Phú Hộ, Phú Thọ [9].Năm 2009, Trần Đức Trung đã kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị SSR

nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền các giống chè (Camellia sinensis (L.) O.

Kuntze) ở Việt Nam Kết quả ghi nhận được sự đa dạng di truyền ở mức độcao giữa các giống chè [16]

1.3 Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu tính

đa dạng genome sinh vật

1.3.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms - đa hình

độ dài các đoạn cắt giới hạn)

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA

hệ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng tạo ra hàng loạt đoạn DNA có độdài xác định, số lượng các đoạn này phụ thuộc vào số điểm nhận biết trong

hệ gen Đa hình độ dài này được phát hiện bởi đánh dấu phóng xạ các mẫu

dò DNA bổ sung tạo ra từ cùng một locus RFLP là chỉ thị đồng trội Ưuđiểm của RFLP là: chỉ thị tin cậy trong phân tch liên kết và chọn giống vìchúng

có thể xác định được một tnh trạng ở trạng thái đồng hợp hoặc dị hợp trongmột cá thể, tận dụng được biến dị tự nhiên, phát hiện tính biến dị của DNAtrong các giai đoạn phát triển ở cơ quan khác nhau và xây dựng quan hệ ditruyền, nghiên cứu quan hệ họ hàng Nhược điểm của RFLP là kỹ thuậtphức tạp, tốn kém và mất thời gian Phương pháp này đòi hỏi mộtlượng DNA lớn (50 - 200ng từ mỗi cá thể) [1].

1.3.2 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - đa hình

độ dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)

Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR AFLP phát hiện mộtcách có chọn lọc các đoạn DNA hệ gen được cắt bởi enzyme giới hạn và gắnvới adaptor (đoạn tếp hợp) AFLP hoạt động dựa trên nhiều nguyên tắctương tự như RADP, tuy nhiên có điểm khác biệt là mồi bao gồm hai phần:phần cố định dài khoảng 15 bp chứa điểm nhận biết của enzyme giới hạn,phần thay đổi dài khoảng 2-4 bp Phân tch sản phẩm PCR được điện di trêngel polyacryamide có độ phân giải cao Sự đa hình được xác định bởi sự cómặt hay không có mặt của một phân đoạn DNA AFLP rất có hiệu quả trongxác định quan hệ di truyền và lập bản đồ Hiện nay, phân tch AFLP sử dụngphương pháp nhuộm bạc nên dễ áp dụng, tuy giá thành cao hơn với phươngpháp RAPD Kỹ thuật AFLP có ưu điểm là phân tch đa hình trong khoảng thờigian ngắn, đòi hỏi lượng DNA ít, cho sự đa hình cao, tuy nhiên việc thiết

kế mồi rất phức tạp

1.3.3 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình các phân đoạn DNA đượcnhân bản ngẫu nhiên, do hai nhóm nghiên cứu của Williams và đtg (1990)[43] ; Welsh và McClelland (1991) đồng thời xây dựng [40] Đây là một kỹthuật phát hiện chỉ thị di truyền dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR).PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích hệ gen thực vật, vì nó cókhả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự DNA đặc hiệu từ bất kỳ cơ

thể nào Hiện nay PCR được xem là phương pháp nhanh, chính xác, tươngđối đơn giản để đánh giá sinh vật chuyển gen, phân tích nhanh chóng sựbiến dị di truyền ở phạm vi quần thể và giữa các cá thể.

Sự hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này là phải dựa trên một trình tự DNAđặc hiệu Tuy nhiên, hạn chế này đã được các nhà sinh học phân tử cải tiến,khắc phục đó là kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên hay còn gọi là kỹthuật RAPD [20]

Trong những năm gần đây, kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trongnghiên cứu đa dạng di truyền Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, RAPD là mộtphương pháp có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể

và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền [1] Kỹthuật RAPD còn dùng để nhận biết, phân loại các giống cây trồng khác nhaunhư chè, chuối, lúa mì, đu đủ, đậu tương và phát hiện, bảo tồn sự đa dạng

di truyền đặc biệt là các loài quí hiếm hay một số giống thực vật địa phương

1.3.4 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản)

Kỹ thuật SSR còn được gọi là kỹ thuật microsatellies (vi vệ tinh) Kĩ thuậtnày được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của PCR [26].Trong hệ gen sinh vật bậc cao, ngoài các đoạn trình tự (gen) mã hóaprotein còn có các yếu tố DNA lặp lại, phân bố trên mọi nhiễm sắc thể và cókích thước khác nhau Tùy thuộc vào sự phân bố trên hệ gen, các yếu tố DNAlặp lại được chia thành hai nhóm: trình tự DNA lặp lại rải rác (ví dụ như cácDNA transposon) và trình tự DNA lặp lại nối tếp có kích thước khác nhau(VNTR-Variable Number of Tandem Repeat) [19], [42] VNTR bao gồm hàngloạt các đơn vị trình tự (motf) lặp lại nối tếp nhau và có mặt trên các nhiễmsắc thể (kể cả nhiễm sắc thể giới tnh) Các VNTR được phân chia thành cácnhóm khác nhau dựa trên chiều dài motf, số lần lặp lại của các motif cũngnhư vị trí của chúng trên các nhiễm sắc thể [38], [42], bao gồm DNA vệ tinh(Satellite DNA- các đoạn lặp dài từ 100 đến 300 bp), minisatellite (các đoạnlặp dài từ 10 đến 60 bp) và DNA vi vệ tnh (Microsatellite - các đoạn lặp ngắn

từ 1 đến 6 bp)

Theo Litt và Luty (1989), vi vệ tinh có nhiều motif khác nhau, thường

có mức độ lặp lại thấp và biến đổi ở một locus nhất định, chính vì vậy sốlượng alen ở mỗi locus vi vệ tinh là rất nhiều Các vi vệ tnh có thể được tìmthấy khắp nơi, ở vùng mang mã (exon) và không mang mã (intron) trên

hệ gen nhân và cả hệ gen ngoài nhân (ti thể, lục lạp) [39] Có nhiều danhpháp khác nhau được dùng để chỉ vi vệ tnh: trình tự lặp đơn giản - SRS(Simple Repetitive Sequences), đoạn lặp trình tự đơn giản - SSR (SimpleSequence Repeats) hay đoạn lặp nối tiếp đơn giản - STR (Simple TandemRepeat), trong số này, SSR là danh pháp được sử dụng phổ biến nhất [10]

Vi vệ tinh - SSR có số lượng motf rất phong phú, phân tán đều khắp hệgen và có mức độ đa hình rất cao Theo Jurka và Pethiyagoda (1995), với bốnloại base nitơ A-T-G-C, số lượng các motif SSR trên cấu trúc sợi đôi DNA cóthể lên đến 501 loại khác nhau, từ motf có một nucleotide (monomeric) đếnmotf có sáu nucleotde (hexameric) Motf phổ biến nhất ở hệ gen thực vật

là (A)n, (AT)n, (GA)n và (GAA)n Bên cạnh đa dạng về số lượng, sự sắp xếpcác motf trong đoạn trình tự lặp cũng góp phần làm phong phú SSR trong

hệ gen Dựa trên mức độ hoàn chỉnh của các motf lặp lại, đã phân chia cácSSR thành ba nhóm khác nhau, bao gồm: (i) SSR lặp lại hoàn chỉnh (perfectrepeats), có chứa một motf lặp lại liên tục không bị ngắt quãng; (ii) SSR lặplại không hoàn chỉnh (imperfect repeat), chuỗi motf lặp lại bị gián đoạn bởimột hay một vài base không thuộc cấu trúc motif; (iii) SSR lặp lại phức hợp(compound repeat), là sự kết hợp xen kẽ có hoặc không có quy luật của hơnhai motif khác nhau [42]

Trước đây, DNA lặp được coi là “ADN tạp” bởi chức năng của chúngchưa được tm ra [42] Ngày nay, mặc dù vai trò của DNA lặp đối với hệ genvẫn chưa được làm sáng tỏ nhưng chúng đã trở thành công cụ quantrọng trong nghiên cứu di truyền, đặc biệt là các chỉ thị SSR dựa trên DNA vi

vệ tinh Các DNA vi vệ tinh có số lượng rất lớn, phân bố khắp mọi nơi trênhệ

gen với tần suất xuất hiện cao (mỗi 21,2 kb ở thực vật hai lá mầm vàmỗi

64,6 kb ở thực vật một lá mầm) nên số lượng chỉ thị SSR rất phong phú [32].Bên cạnh đó, các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tự sườn cótính bảo thủ cao của các đoạn lặp, do đó sản phẩm nhân gen của phản ứngSSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị DNA ngẫu nhiên Đặc biệt, chỉ thịSSR di truyền đồng trội, có khả năng phân biệt được cá thể đồng hợp tử/ dịhợp tử và có mức độ đa dạng alen cao ở mỗi locus Chính nhờ những ưuđiểm đó mà SSR là loại chỉ thị DNA hiệu quả và được sử dụng phổ biến nhấttrong các nghiên cứu chọn giống cây trồng

Hình 1.2 Đa hình DNA SSR giữa 2 cá thể có motif (AT)n

Tuy nhiên, khác với các chỉ thị ngẫu nhiên (RAPD) hay chỉ thị dựa trêncác vị trí giới hạn (RFLP, AFLP), chỉ thị SSR được phát triển dựa trên trình tựDNA đã biết trước của đối tượng nghiên cứu Quy trình phát triển chỉ thịSSR gồm hai giai đoạn chính là xác định các trình tự lặp trên hệ gen và thiết

kế mồi đặc hiệu cho đoạn trình tự đó; đây là quy trình phức tạp, đòi hỏi ápdụng nhiều kỹ thuật - phương pháp khác nhau và đặc biệt có chi phí rất cao[10], [32], [39] Đây chính là rào cản lớn nhất cho việc áp dụng chỉ thị SSRtrong nghiên cứu chọn giống các loại cây trồng

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Lá của 25 mẫu chè đặc sản đang được trồng tại Thái Nguyên được thuhái làm nguyên liệu nghiên cứu Danh sách tên và đia điêm lây mâu của cácmẫu lá chè nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh sách tên và đia điêm thu mâu của 25 mẫu chè nghiên cứu

TT Ký

hiệu

Tên giống

Đia điêm thu mâu TT

Ký hiệu

Tên giống

Đia điêm thu mâu

1 M1 Keo Am Tích

C Ty che Sông Câu, Huyện Đồng Hỷ, Thái Nguyên

14 M14 LDP2 C.Ty chè

Sông Cầu

2 M2 Hùng Đỉnh Bạch 15 M15 Keo Am Tích

Xã Tân Cương, Thái Nguyên

9 M9 Long Vân 22 M22 Kim Tuyên

- Hóa chất điện di DNA (agarose - hãng invitrogen, ethidium bromide)

- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR của hãng QIAGEN

- Các hoa chất thông dụng khác như : Nước khử ion, ethanol

1 Máy soi gel với tia UV (USA) Bình đá

2 Bể ổn nhiệt (Jeio Tech - Hàn Quốc) Bình tam giác các cỡ

3 Máy đo quang phổ (Thermo electron) Cốc đong, ống đong

4 Bộ nguồn điện di và bể điện di ngang Đầu côn các cỡ

5 Cân điện tử (Satorius - Đức) Găng tay cao su, khẩu trang

6 Lò vi song (Sharp, Malaysia) Micropipet: 1 - 5 μl

8 Máy PCR (Singapore) Micropipet: 20 - 100 μl

10 Nồi hấp khử trùng (Đài Loan) Micropipet: 100 - 1000 μl

11 Tủ lạnh nhiệt độ 40C, - 200C (Italia)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu lá chè

Các mẫu lá chè tươi với phần búp non có 1 - 2 lá bánh tẻ (một tôm hailá) được thu hái trực tếp ngay tại các địa điểm lấy mẫu Các mẫu lá chè đượcrửa sạch, và tến hành tách chiết DNA tổng số ngay

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết từ lá chè theo phương pháp của SamuelSun (1994), Anwanda và đtg (1997) có cải tiến [18], [21]

Lá chè tươi thu về rửa sạch sau đó tiến hành tách chiết ngay, quy trìnhtách chiết DNA tổng số bao gôm cac bươc cơ ban sau:

Lá chè tươi thu về rửa sạch sau đó tến hành tách chiết ngay

Nghiền 0,2 g lá chè trong cối chày sứ (cối chày sứ vô trùng giữ ở tủ

-20 0C) với nitơ lỏng cho đến khi thành dạng bột mịn Bổ sung vào mẫu đệmrửa có thành phần (Tris - HCl 100 mM, pH = 8,0; EDTA 5 mM, pH 8,0; NaH2PO4

0,4%; sorbitol 350 mM; H2O) Chia ra các ống eppendorf 1,5 ml Li

tâm 12000 vòng/phút, 15 phút, 40C, thu cặn Bước này lăp lại 2 lần

- Bổ sung 800 l đệm chiết có thành phần Tris - HCl 100 mM, pH = 8,0; EDTA 20 mM, pH = 8,0; CTAB 4%; NaCl 1,4 M; H2O, lắc đều và giữ ở 650C

trong thời gian 30 phút đến 1 tếng, 5 phút lắc đều 1

lần

- Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút, rồi bổ sung 800 lChloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc đều trong thời gian 10phút

- Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C

- Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 2 ml

- Bổ sung một thể tch tương đương isopropanol (lạnh) và đảo nhẹ, giữmẫu trong đá 10 phút

- Ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C

- Loại dịch nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 l cồn 80%, ly tâm 14000vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 40C (bước này thực hiện 2 lần), sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol (tránh để các cuộn DNA rơi ra ngoài)

- Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không, rồi hòa tan trong

thời gian 5 phút ở 40C