Nghiên cứu một số chỉ thị DNA phục vụ cho xác định con lai giữa bò tót (bos gaurus) và bò nhà (bos taurus) tại vườn quốc gia phước bình, ninh thuận

NguyễnHữu Đức – khoa Công nghệ Sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Các số liệu,hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực, không sao chép bất cứ tài liệu, công

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ THỊ DNA

PHỤC VỤ CHO XÁC ĐINH CON LAI GIỮA BÒ TÓT

(BOS GAURUS) VÀ BÒ NHÀ (BOS TAURUS) TẠI VƯỜN QUỐC GIA PHƯỚC BÌNH, NINH THUẬN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này hoàn toàn được hoàn thiện bằng sự tìm tòinghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn của PGS TS Lê Văn Sơn – ViệnCông nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS NguyễnHữu Đức – khoa Công nghệ Sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Các số liệu,hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực, không sao chép bất

cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo.Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng và nhà trường

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Phạm Thanh Tùng

Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến ThS Lê Hoàng Đức phòng Công nghệADN Ứng Dụng, viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệViệt Nam đã cộng tác giúp tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin cám ơn phòng Công nghệ DNA ứng dụng, phòng Công nghệ trọng điểmgen, phòng Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận cho tôi hoàn thành khóa luậntốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo Học viện Nông nghiệp ViệtNam đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt khoá học

Lời cuối, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình đã luôn

ở bên tôi, chăm sóc, động viên tôi và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gianthực hiện đề tài tốt nghiệp này

Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình vànăng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhậnđược những đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Phạm Thanh Tùng

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình

vii Trích yếu luận văn

viii Thesis abstract x Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Giả thuyết Khoa học 2

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.4 Phạm vi nghiên cứu 2

1.5 Ý nghiã khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Tổng quan về bò tót 4

2.1.1 Vị trí phân loại 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái 4

2.1.3 Đặc điểm sinh học và phân bố

4 2.2 Các phương pháp giám định di truyền con lai 5

2.2.1 Phương pháp phân tích rDNA – ITS 6

2.2.2 Phương pháp phân tích gen ty thể 7

2.2.3 Phương pháp phân tích gen chức năng trên nhiễm sắc thể giới tính

7 2.2.4 Phương pháp phân tích gen chức năng trên nhiễm sắc thể sinh dưỡng 10

2.2.5 Phương pháp phân tích gen sử dụng chỉ thị phân tử 10

2.2.6 Microsatellite 11

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 15

3.1 Vật liệu nghiên cứu 15

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

3.1.2 Các chủng vi khuẩn, vector sử dụng 15

3.1.3 Hóa chất 15

3.1.4 Thiết bị 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 16

3.2.1 Phương pháp thiết kế mồi cho phản ứng PCR 16

3.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ các mẫu mô tai 17

3.2.3 Phương pháp PCR với các mồi đặc hiệu 17

3.2.4 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose: 18

3.2.5 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 18

3.2.6 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 19

3.2.7 Phương pháp tách dòng gen 19

3.2.8 Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp 21

3.2.9 Phương pháp xác định trình tự gen 22

Phần 4 Kết quả nghiên cứu 23

4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 23

4.2 Kết quả giám định con lai bằng gen trên Nhiễm Sắc Thể sinh dưỡng số 1 24

4.2.1 Kết quả PCR với 2 cặp mồi PGF1/PGR1 và PT1F/PT1R 24

4.2.2 Kết quả so sánh trình tự 25

4.3 Kết quả giám định bê đực nghi lai bằng gen ZFY trên NST giới tính Y 26

4.4 Kết quả giám định bê đực nghi lai bằng các chỉ thị SSR 28

Phần 5 Thảo luận 32

5.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 32

5.2 Kết quả giám định con lai bằng gen trên Nhiễm Sắc Thể sinh dưỡng số 1 32

5.2.1 Kết quả PCR với 2 cặp mồi PGF1/PGR1 và PT1F/PT1R 32

5.2.2 Kết quả so sánh trình tự 33

5.3 Kết quả giám định bê đực nghi lai bằng gen ZFY trên NST giới tính Y 34

5.4 Kết quả giám định bê đực nghi lai bằng các chỉ thị SSR 34

Phần 6 Kết luận và kiến nghị 36

6.1 Kết luận 36

6.2 Kiến nghị 36

Tài liệu tham khảo 37

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

SSR Single Simple Repeat

rDNA Ribosomal DNA

ZFY Zinc finger Y

DNA Deoxyribonucleic acid

PCR Polymerase Chain Reaction

EtBr Ethidium bromide

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu 16

Bảng 3.2 Thành phần gel polyacrylamide 15% 18

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng nối gen vào vector tách dòng 20

Bảng 3.4 Thành phẩn phản ứng colony PCR sử dụng mồi PUC18F/R 21

Bảng 4.1 Kết quả định lượng DNA tổng số bằng máy đo Nanodrop 23

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Bò tót, bò nhà và bê lai 2

Hình 2.1 Ảnh bò tót trong tự nhiên 5

Hình 2.2 Cấu trúc rDNA ở động vật 6

Hình 2.3 Sơ đồ gene ZFY trên NST Y 9

Hình 2.4 So sánh đánh giá đặc điểm của một số chỉ thị phân tử 10

Hình 2.5 Một số SSR lặp lại hoàn chỉnh 12

Hình 3.1 Vector tách dòng pBT 20

Hình 4.1 Kết quả tách DNA tổng số từ mô tai của 6 mẫu bê 23

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen POU1F1 bằng cặp mồi PG1F-PG1R 24

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen POU1F1 bằng cặp mồi PT1F/PT1R 24

Hình 4.4 Kết quả so sánh trình tự gen POUF1 với mồi PGF1/PGR1 của bê đực nghi lai bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế 25

Hình 4.5 Kết quả so sánh trình tự gen POUF1 với mồi PGF1/PGR1 của bê cái nghi lai số 3 bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế 25

Hình 4.6 Kết quả so sánh trình tự gen POUF1 của bê đực nghi lai với cặp mồi PT1F/PT1R bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế 26

Hình 4.7 Kết quả so sánh trình tự gen POUF1 của bê cái nghi lai (BL3) với cặp mồi PT1F/PT1R bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế 26

Hình 4.8 Kết quả PCR gen ZFY 27

Hình 4.9 Kết quả so sánh trình tự gen ZFY của bò tót bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế 27

Hình 4.10 Kết quả so trình tự gen ZFY của bê đực nhà bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế 27

Hình 4.11 Kết quả PCR-SSR của các mẫu nghiên cứu với mồi ETH10 trên gel polyacrilamide 15% 28

Hình 4.12 Kết quả PCR-SSR của các mẫu nghiên cứu với mồi BM1824 trên gel polyacrilamide 15% 28

Hình 4.13 Kết quả PCR-SSR của các mẫu nghiên cứu với mồi TGLA126 trên

gel polyacrilamide 15% 29Hình 4.14 Kết quả PCR-SSR của các mẫu nghiên cứu với mồi INRA023 trên

gel polyacrilamide 15% 29Hình 4.15 Kết quả PCR-SSR của các mẫu nghiên cứu với mồi BM1818 trên gel

polyacrilamide 15% 30Hình 4.16 Kết quả PCR-SSR của các mẫu nghiên cứu với mồi BM861 trên gel

polyacrilamide 15% 30Hình 4.17 Kết quả so sánh trình tự đoạn SSR của bê đực nghi lai và bê đực nhà

bằng phần mềm Bioedit 31

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Phạm Thanh Tùng

Tên Luận văn: “Nghiên cứu một số chỉ thị DNA phục vụ cho xác đinh con lai giữa bòtót (Bos gaurus) và bò nhà (Bos taurus) tại vườn quốc gia Phước Bình, Ninh Thuận”.Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Bò tót (tên khoa học Bos gaurus) là động vật thuộc bộ guốc chẵn, họ trâu bò(Bovidae) có lông màu sẫm và kích thước lớn, sinh sống chủ yếu ở vùng đồi của Ấn

Độ và Đông Nam Á Hiện nay, tại Việt Nam chỉ còn khoảng 300 con bò tót, phân bốchủ yếu tại vườn quốc gia Mường Nhé (Điện Biên), vùng rừng núi Tây Nguyên, vườnquốc gia Chư Mom Rây (Kon Tum) và vườn quốc gia Cát Tiên (Lâm Đồng), sân bayPhú Bài (Huế) Trong tự nhiên, bò tót thường sống thành đàn từ 8– 10 con Khi về già,

do không cạnh tranh được với những con bò tót đực trẻ, khỏe hơn trong đàn nên bò tótđực già thường tách đàn để sống riêng lẻ hoặc chúng hội nhau lại thành những nhóm bòđực già riêng lẻ Có thể do hiện tượng sa thải sinh học trên mà cuối năm 2009 tại khuvực Vườn Quốc Gia Phước Bình, có xuất hiện một con bò tót đực tách bầy, có chiềucao khoảng 1,7 mét, thân dài hơn 2 mét, nặng khoảng 1000 kg nhập bầy với đàn bò cáicủa nông dân địa phương [14] Tới năm 2012, sau một thời gian con bò tót đực về sốngchung với bò cái nhà, theo ghi nhận của Vườn Quốc gia Phước Bình đã có một số con

bê được cho là con lai của bò tót với bò nhà do có một số đặc điểm về ngoại hình vàmàu lông bê lai gần giống với bò tót Mục tiêu của nghiên cứu này sàng lọc một số chỉthị DNA phục vụ cho xác định con lai giữa bò tót (Bos gaurus) và bò nhà (Bos taurus)tại vườn quốc gia Phước Bình, Ninh Thuận Từ những kết quả PCR các vùng gen quantâm trên nhiễm sắc thể giới tính, nhiễm sắc thể thường, các đoạn SSR và phân tích cáctrình tự gen thu được ở các con bê nghi lai và bê nhà chúng tôi đã thu được các kết quả:(i) các cặp mồi PCR sử dụng trong giám định con bê nghi lai có độ đặc hiệu cao với loài

bò tót và bò nhà, qua đó có thể sử dụng các cặp mồi này để phân biệt các con bê nghi laivới bê nhà.(ii) các trình tự gen thu được ở các con bê nghi lai có độ tương đồng cao sovới loài bò tót, qua đó có thể khẳng định những con bê này chính là con lai F1 giữa bòtót đực (Bos gaurus) và bò cái nhà (Bos taurus)

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Pham Thanh Tung

Thesis title: “Study on DNA marker for identification of hybrid calf between Bosgaurus and Bos taurus Phuoc Binh national park, Ninh Thuan”

Major: Biotechnology Code: 60.42.02.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA).The gaur (Bos gaurus), also called Indian bison, is the largest extant bovine,native to South Asia and Southeast Asia The species has been listed as Vulnerable onthe IUCN Red List since 1986 Currently, Vietnam have only about 300 individuals.They are distributed mainly in Muong Nhe nature reserve (Dien Bien), Centralhighlands, Chu Mom Ray national park (Kontum), Cat Tien national parks (Lam Dong)and Phu Bai airport (Hue) In the wildlife, most gaurs often live as herd together (8-10individuals) When get older, the bull cannot compete effectively against younger malesfor breeding opportunities and therefore they are usually made up of several separategroups or live alone Perhaps due to this biological phenomena, the area of Phuoc Binhnational park (Ninh Thuan) appears a separated bull in 2009 The bull has a height ofabout 1.7 meters, 2 meters in length and 1000 kg weight, which merged with thecowherd of local farmer [14] After 3 years of living on farm, they born calves thatsupposedly is an offspring of a bull with the cows due to a number of characteristicsincluding appearance and color similar to gaur The purpose of our project is to findgenetic markers based on blood samples for identification between Bos gaurus and Bostaurus by SSR method and DNA sequencing As a result, firstly, the PCR primers used

in the assessment of suspected calf have high specificity for the bovine species andgaur, which could use this primer pair to differentiate the next generation Secondly, thegene sequences obtained of hybrid suspected calves has a high similarity index to gaurspecies, thereby confirm this calf as an F1 between male gaur (Bos gaurus) and thecows (Bos taurus)

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bò tót (Bos gaurus) là một trong những loài bò rừng lớn nhất trong tựnhiên, sinh sống chủ yếu ở vùng rừng núi của Ấn Độ và Đông Nam Á, cá thểtrưởng thành có thể cao đến 1,9 - 2 m, nặng 800 - 1.000 kg Tại Việt Nam, bò tótcòn có tên gọi là con min (người Raglai ở Ninh Thuận còn gọi là kvây, nghĩa làtrâu rừng, do chúng có hình dáng tương tự loài trâu) Theo Nghị định số32/2006/NĐ-CP, bò tót được xếp vào nhóm IB trong danh mục động vật rừngnguy cấp, quý hiếm, nghiêm cấm khai thác và sử dụng vào mục đích thương mại[1] Số lượng bò tót hoang dã ở nước ta theo điều tra ước tính chỉ còn khoảng 500

cá thể [16], phân bố chủ yếu ở 3 Vườn quốc gia Cát Tiên (Lâm Đồng, Đồng Nai,Bình Phước), Phước Bình (Ninh Thuận) và một số ít ở nơi khác Có thể nhậnthấy, vùng Tây Nguyên trong đó có Ninh Thuận và Lâm Đồng là vùng đất sinhsống chủ yếu bò tót tại Việt Nam

Trong tự nhiên, bò tót thường sống thành đàn từ 5 – 10 con (có đàn tới 20 –

30 con) Khi về già, do không cạnh tranh được với những con bò tót đực trẻ,khỏe hơn trong đàn nên bò tót đực già thường tách đàn để sống riêng lẻ hoặcchúng hội nhau lại thành những nhóm bò đực già riêng lẻ Có thể do hiện tượng

sa thải sinh học trên mà cuối năm 2009 tại khu vực Vườn Quốc Gia Phước Bình,

có xuất hiện một con bò tót đực tách bầy, có chiều cao khoảng 1,7 mét, thân dàihơn 2 mét, nặng khoảng 1000 kg nhập bầy với đàn bò cái của nông dân địaphương [14] Tới năm 2012, sau một thời gian con bò tót đực về sống chung với

bò cái nhà, theo ghi nhận của Vườn Quốc gia Phước Bình đã có một số con bêđược cho là con lai của bò tót với bò nhà do có một số đặc điểm về ngoại hình vàmàu lông bê lai gần giống với bò tót như: đầu hơi nhỏ, trán rộng và lõm, mặthình chữ V, sừng nhọn và phát triển sớm Ngoài ra, những con bê này không cónọng và u cổ, thay vào đó là một bờm lông chạy dài từ cổ đến nửa lưng Đây làđặc điểm sinh học đặc trưng nhất để phân biệt với bò nhà, do được trải qua quátrình thuần dưỡng lâu dài nên bò nhà có u và nọng cổ, nhờ đó mà bò nhà mới cóthể mang ách kéo cày, kéo xe Bên cạnh những khác biệt về mặt kiểu hình,những con bê nghi lai với bò tót rất nhát nên khó tiếp cận hơn so với bê nhàthuần chủng [15]

A B

Hình 1.1 Bò tót, bò nhà và bê lai

Nguồn: Internet

(A): Bò tót đực sống chung với bò nhà (B): Bê nhà thuần chủng (phải) và bê nghi lai bò tót (trái)

1.2 GIẢ THUYẾT KHOA HỌC

Từ một số sự khác biệt về kiểu hình và tập tính quan sát được giữa các cáthể bê nghi lai và cá thể bò nhà, chúng tôi đặt ra giả thiết các cá thể nghi lai là các cá thể được sinh ra giữa bò tót (Bos gaurus) và bò nhà (Bos taurus)

1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Sử dụng chỉ thị DNA nhắm giám định được bò tót, bê con nghi lai và bònhà Xác định được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể Qua đó liên hệ đếncác tính trạng tốt của các cá thể con lai góp phần phục vụ công tác chọn giốngchất lượng cao

Nôi dung nghiên cứu: Sử dụng phương pháp PCR, tách dòng gen, đọc trình

tự gen để tìm ra các chỉ thị DNA để khẳng định bê nghi lai chính xác là con laigiữa bò tót (Bos gaurus) và bò nhà (Bos taurus), xác định các chỉ thị DNA dùng

để phân biệt các cá thể bò tót, bê nghi lai với bò nhà

1.4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

01 mẫu cá thể bò tót đực (Bos gaurus), 04 mẫu cá thể bê con nghi lai giữa

bò tót và bò nhà thu tại vườn quốc gia Phước Bình, Ninh Thuận gồm 1 bê đực và

3 bê cái, 02 mẫu cá thể bê nhà thu tại vườn quốc gia Phước Bình, Ninh Thuận gồm 1 bê đực và 1 bê cái

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Nếu kết quả giám định gene xác nhận đàn bê lai F1 giữa bò tót đực và bòcái nhà là đúng, thì đây là trường hợp lai tạo quần thể tự nhiên hiếm gặp ở Việt

Nam từ trước đến nay Đó sẽ là sự kiện khoa học có giá trị thực tiễn quan trọngđối với ngành chăn nuôi gia súc, là cơ sở khoa học cho việc xây dựng các kếhoạch nghiên cứu và cải tạo giống bò ở Việt Nam, cải thiện năng suất, chấtlượng, khả năng chống chịu với bệnh tật, đồng thời mở ra triển vọng mới vềgiống bò thịt có khả năng cho năng suất chất lượng cao hướng tới giá trị thươnghiệu bò lai Việt Nam.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ BÒ TÓT

2.1.1 Vị trí phân loại

Lớp: Mammalia Bộ: Artiodactyla

Họ (familia): Bovidae Phân họ (subfamilia): Bovinae Giống (genus): BosLoài: B gaurus2.1.2 Đặc điểm hình thái

Bò tót (Bos gaurus) là loài thú cỡ lớn trong họ trâu bò (Bovidae), thândài 2,5 - 3 m Trọng lượng 900 - 1000 kg Đầu to, trán dẹt hơi lõm, có đốm lôngtrắng trên trán, đỉnh trán giữa hai sừng dô cao Sừng to khoẻ cân đối, uốn conglên phía trên tạo vòng cung hình bán nguyệt Gốc sừng mầu vàng xám, mút sừngnhọn đen bóng Lớp da ở cổ và trước ngực không tạo thành yếm Bộ lông ngắnmềm mượt mầu nâu thẫm hoặc đen xám hơi phớt xanh bóng ở lưng Lông ở bụngdài mầu nâu nhạt Con cái thường có mầu hung đỏ Mông đen, bốn chân từ khoeotrở xuống mầu trắng bẩn Đuôi dài mầu đen [2]

2.1.3 Đặc điểm sinh học và phân bố

Thức ăn chủ yếu của bò tót là cỏ, mầm lá non của lau sậy, chuối rừng, măngnon tre nứa Sinh sản thường vào tháng 6, 7 Mỗi năm đẻ 1 lứa, mỗi lứa 1 con.Thời gian có chửa 270 - 280 ngày Nơi sinh sống của bò tót là rừng già thườngxanh, rừng khộp, rừng hỗn giao tre nứa, rừng thứ sinh địa hình tương đối bằng ở

độ cao 500 – 1.500m so với mặt biển Sống thành từng đàn 5 - 10 con (có đàn tới

20 - 30 con) đôi khi cũng gặp những cá thể sống đơn lẻ lẫn với đàn bò rừng [2]

Hình 2.1 Ảnh bò tót trong tự nhiên

Nguồn: Internet

Ở trong nước, bò tót phân bố ở các tỉnh: Lai Châu, Sơn La, Thanh Hoá,Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên - Huế, Kontum, GiaLai, Đắk Lắk, Lâm Đồng, Đồng Nai và Bình Phước Hiện nay, do tình trạngphá rừng tràn lan nên diện tích rừng bị suy giảm nhiều làm cho vùng sống, vùngphân bố của bò tót bị chia cắt mạnh Hiện tượng săn bắn bò tót vẫn xảy ra ở một

số nơi nên số lượng bò tót đã giảm nhiều, vùng Tây Nguyên còn khoảng dưới

300 con, các vùng khác còn những quần thể nhỏ dưới 10 con Theo sách đỏViệt Nam, bò tót được phân hạng vào nhóm nguy cấp E (Endangered), có nguy

cơ tuyệt chủng cao

Để có thể cải thiện tính chống chịu với bệnh tật, thời tiết khắc nghiệt vàcho năng suất thịt cao thì việc sử dụng nguồn gen quý hiếm trong tự nhiên của bòtót lai tạo với các giống bò khác có ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn quantrọng đối với ngành chăn nuôi đại gia súc

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP GIÁM ĐịNH DI TRUYềN CON LAI

Con lai là sự kết hợp của 2 cá thể bố và mẹ, do đó nhận một nửa bộ nhiễmsắc thể của bố và một nửa bộ nhiễm sắc thể của mẹ, sự tái tổ hợp, trao đổi chéo

và tương tác giữa các gen sẽ dẫn sự khác biệt về kiểu hình của con lai với cá thể

bố mẹ và giữa các con lai với nhau Có rất nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau

để xác con lai, thông qua các dữ liệu kiểu hình (chỉ thị hình thái), thành phầnprotein và hoạt chất (chỉ thị hóa sinh) hay sự khác biệt đa hình trong DNA (chịthị phân tử) Mỗi loại chỉ thị đều có ưu - nhược điểm cũng như mức độ đánh giá

con lai khác nhau Trong đó, chỉ thị hình thái được sử dụng sớm nhất và là cơ sởban đầu để đánh giá con lai, còn chỉ thị hóa sinh và đặc biệt là chỉ thị DNA được

Những chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y là đặc biệt quan trọng vì lai trong loàisống theo bầy đàn xảy ra chủ yếu thông qua sự trao đổi gen của của con đực[30].Những mồi đặc hiệu trên nhiễm sắc thể Y hoặc những microsatellites sẽ tạo nênnhững trình tự đặc hiệu thích hợp như các chỉ thị phân tử Tuy nhiên chỉ có một

số ít các chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y được phát triển [30], các microsatellite trênnhiễm sắc thể Y đã được sử dụng trong một nghiên cứu về 11 loài bò hoang dã ởViêt Nam [21]

2.2.1 Phương pháp phân tích rDNA – ITS

rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosome, đóng vao trò quan trọngtrong các nghiên cứu phát sinh loài Ở động vật, rDNA là những vùng trình tự lặplại giàu GC và có cấu trúc phức tạp, bao gồm các vùng 18S; 5,8S và 28S mã hóacho các rRNA tương ứng, nằm xen kẽ là các vùng phiên mã bên trong ITS(Internal Transcribed Spacer) và các vùng phiên mã bên ngoài ETS (ExternalTranscribed Spacer) Các vùng 18S; 5,8S và 28S tương đối bảo tồn nên đượcxem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các loài vớinhau Trong khi đó, các vùng ITS lại là những vùng ít bảo tồn, do đó những sosánh trên các vùng này thường được sử dụng để xác định mức độ khác nhautrong loài [5]

Hình 2.2 Cấu trúc rDNA ở động vật

Do cấu trúc rDNA ở động vật rất phức tạp và có những đoạn lặp lại trảidài với thành phần nuceotide giàu G hoặc C Vì vậy, có rất ít nhóm gen rDNA ởđộng vật được tách dòng thành công [4].

Trên đối tượng bò nhà (Bos taurus), Tang và cộng sự (2002) đã dựa trêntrình tự rDNA của người để thiết kế 16 cặp mồi nhân các vùng trên rDNA của bò(Bos taurus) Kết quả cho thấy, có 5 cặp mồi nhân bản thành công các vùng 18S;ITS1; 5,8S; ITS2; 28S với các kích thước từ 498 bp – 3326 bp Kết quả nghiêncứu là cơ sở quan trọng giúp xác định sự khác biệt giữa vùng rDNA của bò tót và

bò nhà, qua đó có thể khẳng định chính xác nguồn gốc bố của con bê nghi laigiữa bò tót đực và bò cái nhà

2.2.2 Phương pháp phân tích gen ty thể

Trong quá trình thụ tinh, tinh trùng chỉ góp vào DNA nhân, còn hợp tử thừa

kế tế bào chất và các bào quan từ tế bào trứng của cá thể mẹ, nên DNA ty thể của

cá thể con chỉ có nguồn gốc từ cá thể mẹ Do đó DNA ty thể được sử dụng đểxác định trong nghiên cứu di truyền theo dòng mẹ

Hệ gen ty thể là hệ gen ngoài nhân thường được sử dụng trong giám định ditruyền, một số gen ty thể đã được sử dụng để phân biệt loài bò tót với các loài bòkhác như gen Cytochrome Oxidase subunit I (COI) và Cytochrome b (Cytb) [10,12] Tuy nhiên, phương pháp này chỉ được sử dụng để khẳng định hoặc bác bỏ mối quan hệ họ hàng trực tiếp theo dòng mẹ, do ty thể di truyền theo dòng mẹ.2.2.3 Phương pháp phân tích gen chức năng trên nhiễm sắc thể giới tínhViệc xác định trình tự DNA của một số gen chức năng trên nhiễm sắc thểgiới tính đặc trưng cho loài bò tót và bò nhà cũng có thể được sử dụng để giámđịnh con lai F1

Ở nhiễm sắc thể giới tính, ở động vật cũng như trong phần lớn các loài, cáthể cái có bộ nhiễm sắc thể đồng hợp (2n, XX), cá thể đực có bộ nhiễm sắc thể dịhợp (2n, XY).Trong chăn nuôi các đại gia súc trong đó có loài bò thì việc xácđịnh giới tính vật nuôi trước sinh rất quan trọng, giúp hoạch định cho việc chănnuôi lấy sữa hay chăn nuôi lấy thịt Nhiều nghiên cứu đã tìm ra những gen nằmtrên nhiễm sắc thể Y có thể giúp phân biệt giới tính cho phôi động vật [26]

Ở động vật có vú, giới tính được xác định theo cơ chế di truyền, sự có mặtcủa một nhiễm sắc thể Y cần thiết cho sự phát triển của kiểu hình giống đực.Chẳng hạn, những người mắc hội chứng Turner (45, X) đều là nữ Hơn nữa,

những người mắc hội chứng Klinefelter (47, XXY hoặc 48, XXXY) đều là nammặc dù họ có thể có tới hai hoặc ba nhiễm sắc thể X Điều đó chứng tỏ nhiễmsắc thể Y có chứa gene xác định tính đực (maleness) Ngày nay ta biết rõ rằng

đó chính là nhân tố biệt hóa tinh hoàn (TDF - Testis-determining factor) nằmtrên vai ngắn nhiễm sắc thể Y Trong phần lớn các loài, cá thể cái có bộ NSTđồng hợp (2n, XX), cá thể đực có bộ NST dị hợp (2n, XY) Theo Chiarelli vàcộng sự (1960), Sasaki và Makino (1962), ở loài bò, mỗi cá thể có số NST đơnbội là 60 [12]

Trong bộ NST của động vật có vú, NST X thường có kích thước lớn hơncác NST sinh dưỡng (có kích thước trung bình) Chúng chứa khoảng 5% số gencủa bộ gen Trong khi đó, NST Y thường nhỏ hơn các NST sinh dưỡng và cókích thước nhỏ nhất Người ta ước chừng trên NST X có khoảng 1000 gen, còntrên NST Y có khoảng 330 gen Cả hai loại NST này đều rất cần cho sự pháttriển và hoạt động bình thường của cơ quan tạo giao tử [5]

Theo Burgoyne (1998), NST X và Y có một vùng trình tự tương đồng vớikích thước khoảng 2600 kb tại đầu cuối vai ngắn của NST, được gọi là vùng giảNST thường- Pseudo autosomal region (PAR) bởi vì các gene định khu bên trongchúng (cho đến nay chỉ phát hiện được 9 gene) đều được di truyền giống như bất

kỳ các gene nào thuộc nhiễm sắc thể thường Và sự trao đổi chéo giữa X và Y chỉ

có thể xảy ra ở hai vùng tương đồng rất nhỏ này của Y Trong xác định giới tính,các gen nằm trên vùng PAR của 2 NST X và Y cùng với các gen đặc biệt củaNST Y nhưng nằm ở vùng trình tự không bắt cặp với NST X đóng vai trò rấtquan trọng

Năm 1987, Page và cộng sự đã khám phá ra gen ZFY trên người Bằngphân tích sự chuyển vị NST ở nam XX và nữ XY, các nhà khoa học này đã tìmthấy một đoạn xác định tinh hoàn trên vùng giả NST của NST Y Trong vùng này

có một gen với tính bảo toàn cao gọi là Zinc finger Y hay ZFY mã hoá cho mộtprotein gắn kết DNA Gen này giúp ngăn ngừa sự thiếu hụt tinh trùng trong quátrình sinh tinh Tương ứng với ZFY, trên NST X cũng có vùng ZFX có thể liênkết chéo với ZFY trên NST Y Lúc này, người ta nghĩ nó là TDF ( Testisdetermining factor- yếu tố biệt hóa tinh hoàn) [15]

Tuy nhiên, những nghiên cứu tiếp sau đó cho thấy ZFY không phải là TDF.Người ta phát hiện protein ZFY có biểu hiện ở tế bào giao tử (đây là những tế

bào không cần biệt hoá tinh hoàn) và những trình tự bắt nguồn từ NST Y thiếuZFY được tìm thấy ở những người đàn ông XX [15] Koopman et al (1991) đãkhẳng định ZFX / ZFY không là yếu tố biệt hoá và xác định giới tính chủ yếu ởđộng vật có vú mà chúng chỉ là một trong số các nhóm gen tham gia tích cực vàoquá trình này Ngày nay, người ta thường sử dụng ZFY như là một chỉ thị choNST Y trong việc sàng lọc giới tính [2].

Hình 2.3 Sơ đồ gene ZFY trên NST Y [15]

Tóm lại, gen ZFY (Zinc Finger Y) nằm trên nhiễm sắc thể Y, mã hóa chomột protein gắn kết với DNA là một gen được sử dụng như một chỉ thị chonhiễm sắc thể Y trong sàng lọc giới tính [19,32] Xác định trình tự gen ZFY đặctrưng cho bò tót đực và bò tót nhà không những giúp phân biệt được bò đực và

bò cái còn có thể trả lời chính xác câu hỏi con bê đực nghi lai có mang gen của

bò tót hay không

Phương pháp này dựa dựa trên những vùng có trình tự nucleotide khác nhautrên gen ZFY của bò tót (Bos gaurus) và bò nhà (Bos taurus) từ đó để thiết kế cáccặp mồi đặc hiệu cho gen của bò tót và bò nhà Về lý thuyết, chỉ những mồi đặchiệu cho loài bò tót (Bos gaurus) mới được khuếch đại bằng phản ứng PCR, kếtquả chỉ có những con lai Còn kết quả phản ứng PCR với những mồi đặc hiệucho bò nhà (Bos taurus) sẽ xuất hiện ở cả mẫu bò lai và bò nhà Giải trình tự cácvùng gen được nhân lên sẽ giúp xác định chính xác nguồn gốc của các mẫu giámđịnh bằng việc so sánh trình tự gen vừa xác định với các trình tự gen của bò tót

và bò nhà trên ngân hàng gen quốc tế

2.2.4 Phương pháp phân tích gen chức năng trên nhiễm sắc thể sinh dưỡngBên cạnh việc phân tích các gen trên nhiễm sắc thể giới tính, sự sai khácgiữa các trình tự gen chức năng trên nhiễm sắc thể thường của bò tót và bò nhàcũng là một cơ sở cho việc giám định bò lai F1 Phương pháp này dựa vào kếtquả so sánh giữa trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế giữa hai loài bò tót (Bosgaurus) và bò nhà (Bos taurus) từ đó để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho gencủa bò tót và bò nhà Trong đó, mẫu bò nhà chỉ khuếch đại được với cặp mồi đặchiệu cho gen bò nhà, mẫu bò tót cũng chỉ khuếch đại được với cặp mồi đặc hiệucho gen bò tót Nhưng mẫu bò lai sẽ khuếch đại được với cả 2 cặp mồi trên do bộnhiễm sắc thể của bò lai chứa cả nhiễm sắc thể của bò tót và bò nhà Kết quả này

sẽ được khẳng lại bằng giải trình tự Việc so sánh với các trình tự gen của bò tót

và bò nhà trên ngân hàng gen quốc tế sẽ giúp xác định chính xác nguồn gốc cácmẫu nghiên cứu

2.2.5 Phương pháp phân tích gen sử dụng chỉ thị phân tử

Hình 2.4 So sánh đánh giá đặc điểm của một số chỉ thị phân tử [16]

L: thấp, M: trung bình, H: cao, ex-H: rất cao, D: trội, R: lặn, C: đồng trội

Nghiên cứu tổng hợp của Joshi (1999) và Weising (2005) đã đề ra nhữngđặc điểm và cũng là tiêu chuẩn cho các loại chỉ thị phân tử như sau [16,31]:

 Có mức độ đa hình cao

 Di truyền đồng trội

 Phân định rõ ràng giữa các alen

 Tần suất xuất hiện trong hệ gen cao

 Phân bố đều trong hệ gen

 Có trạng thái trung tính (không chịu tác động đa gen)

 Dễ dàng tiếp cận đánh giá

 Có thể phân tích nhanh và đơn giản

 Khả năng tái lặp cao

 Kết quả có thể trao đổi dễ dàng giữa các cơ sở nghiên cứu

 Có chi phí phát triển và thực hiện thấp

Cho đến nay khẳng định không một chỉ thị nào có thể đáp ứng được tất cảcác yêu cầu trên, tuy nhiên hoàn toàn có thể lựa chọn trong các chỉ thị này để nghiên cứu xác định bò lai

2.2.6 Microsatellite

2.2.6.1 Khái niệm

Trong hệ gen sinh vật bậc cao,ngoài các đoạn trình tự (gen) mã hóa proteincòn có các yếu tố DNA lặp lại, phân bố trên mọi nhiễm sắc thể có kích thướckhác nhau Tùy thuộc vào sự phân bố trên hệ gen, các yếu tố DNA lặp lại đượcchia thành hai nhóm: trình tự DNA lặp lại rải rác (ví dụ như DNA transposon) vàtrình tự DNA lặp lại nối tiếp có kích thước khác nhau (VNTR-Variable Number

of TDNAem Repeat) [10,16] VNTR bao gồm hàng loạt các đơn vị trình tự(motif) lặp lại nối tiếp nhau và có mặt trên các nhiễm sắc thế (kể cả nhiễm sắcthể giới tính) [31] Các VNTR được phân chia thành các nhóm khác nhau dựatrên chiều dài motif, số lần lặp lại của các motif cũng như vị trí của chúng trêncác nhiễm sắc thể [27]

Microsatellites là một dạng của VNRT, là các đoạn lặp nối tiếp của cácmotif có kích thước rất ngắn (từ 1 đến 6bp) [16] Microsatellite có nhiều motifkhác nhau, thường có mức độ lặp lại thấp và biến đổi ở một locus nhất định,chính

vì vậy số lượng alen ở mỗi locus là rất nhiều Các microsatellite được tìm thấy ởkhắp mọi nơi, ở cả vùng exon và intron trên hệ gen trong nhân và cả hệ gen ngoàinhân (ti thể, lục lạp) [28]

Microsatellite ngày nay trở thành một thuật ngữ chung nhất để miêu tả cáctrình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 1 - 6 bp vàkích thước tại mỗi locus là 20 - 100 bp Microsatellite có tính đa hình rất cao, lànhững codominant-alen hay alen đồng trội, nó có các tính chất cần thiết cho mộtmarker Tần số đột biến từ 104 - 5.10-6, tuân theo định luật Mendel Vị trí củamicrosatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR từ một lượngDNA rất nhỏ.Có nhiều tên gọi khác nhau được dùng để chỉ microsatellite : trình

tự lặp đơn giản SRS (Simple Repetitive Sequences), đoạn lặp trình tự đơn giản SSR (Simple Sequence Repeats) hay đoạn lặp nối tiếp đơn giản - STR (SimpleTDNAem Repeats) [25]

-Trong ba loại trình tự lặp nêu trên, microsatellite - SSR có số lượng motifrất phong phú, phân tán đều khắp hệ gen và có mức độ đa hình rất cao Với bốnloại base A-T-G-C, số lượng các motif SSR trên cấu trúc sợi đôi DNA có thể lênđến 501 loại khác nhau, bao gồm 2 motif một nucleotide (monomeric), 4 motifhai nucleotide (dimeric), 10 motif ba nucleotide (trimeric), 33 motif bốnnucleotide (tetrameric), 102 motif năm nucleotide (pentameric) và 350 motif sáunucleotide (hexameric) [17] Ở hệ gen động vật có vú có các motif phổ biến:(A)n và (CA)n

Hình 2.5 Một số SSR lặp lại hoàn chỉnh [25]

Bên cạnh sự đa dạng về số lượng, sự sắp xếp các motif trong đoạn trình tựlặp cũng góp phần làm phong phú SSR trong hệ gen Những đoạn SSR phân bố ởgần tâm động hoặc đầu mút của nhiễm sắc thể, có vai trò bảo vệ và liên quan đến

sự di chuyển của nhiễm sắc thể ở các quá trình phân bào trong hệ gen của tất cảcác sinh vật nhân thực [18]

2.2.6.2 SSR ( Simple Sequence Repeats )

Dựa trên mức độ hoàn chỉnh của các motif lặp lại, Weber (1990) đã phânchia các SSR thành ba nhóm khác nhau, bao gồm: (1) SSR lặp lại hoàn chỉnh(Perpect repeats), bao gồm một motif lặp lại liên tục không bị ngắt quãng; (2)SSR lặp lại không hoàn chỉnh (imperfect repeats), chuỗi motif lặp lại bị giánđoạn bởi một hay một vài base không thuộc cấu trúc motif; và (3) SSR lặp lạiphức hợp (Compound repeats) là sự kết hợp xen kẽ có/không có quy luật của hơnhai motif khác nhau [25]

Do sự phân bố khắp mọi nơi trên hệ gen,có mức độ đa dạng alen ở mỗilocus cao, di truyền đồng trội đã đưa SSR trở thành loại chỉ thị DNA có hiệu quảnhất trong nghiên cứu di truyền Hiện nay, có nhiều loại chỉ thị DNA khác nhauđược phát triển dựa trên các trình tự lặp, phổ biến hơn cả là chỉ thị SSR

Chỉ thị SSR là chỉ thị DNA quan trọng và được sử dụng phổ biến trongnghiên cứu đa dạng di truyền, lập bản đồ gen, nhân dạng di truyền, chọn giống…Chỉ thị SSR có hai ưu điểm lớn so với các chỉ thị DNA khác:

 Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình

tự sườn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp SSR, do đó sản phẩn của phản ứngSSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị DNA ngẫu nhiên Bên cạnh đó,nhớ tính chất bảo thủ của vùng trình tự sườn mà các mồi SSR có thể được sửdụng chéo giữa các loài có quan hệ di truyền gần gũi [10]

 Di truyền đồng trội và mức độ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và cácbiến đổi di truyền, số lần lặp lại các motif SSR thay đổi rất nhiều và làm cho cácđoạn SSR có chiều dài khác nhau Bởi vậy phản ứng SSR-PCR có thể phát hiệncác alen khác nhau trong một locus SSR, qua đó phát hiện được các cá thể đồnghợp

tử/dị hợp tử ở locus đó (chỉ thị đồng trội)

Ngoài hai ưu điểm trên, với tần suất xuất hiện trên hệ gen cao của các trình

tự lặp thì số lượng chỉ thị SSR là rất phong phú với mức độ đa hình cao Dựa trên

kĩ thuật PCR và kết hợp các phương pháp phát hiện khác nhau, các phân tích sửdụng chỉ thị SSR rất đơn giản, thành công và đáng tin cậy

Kỹ thuật SSR dựa trên nguyên lý của PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu đểnhân các đoạn trình tự SSR Sự khác nhau trong cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn đến

sự thay đổi độ dài đoạn lặp lại được nhân lên và xác định khi kiểm tra bằng chạyđiện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide Các đoạn SSR đa hình về độ