Xây dựng quy trình sản xuất dầu thô giàu hoạt chất sulforaphene từ hạt mầm cải củ (rhaphanus sativus l )

Tác dụng sinh học của các hợp chấtchứa lưu huỳnh nói chung và Sulforaphene nói riêng đã định hướng chúng tôibước đầu nghiên cứu, tiến tới khai thác hiệu quả nhất giá trị làm thuốc củaSul

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiêncứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đượccảm ơn và các thông tin được trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Hồng Nhung

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc đến TS Hoàng Hải Hà – Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệpViệt Nam; TS Bành Như Cương, TS Trần Hữu Thị, ThS Phạm Thị Mai - Viện nghiêncứu thực phẩm chức năng đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạođiều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm, Khoa Công nghệ thực phẩm – Họcviện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đềtài và hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điềukiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luậnvăn

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Hồng Nhung

MỤC LỤC

i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danhmục chữ viết tắt .vDanh mục bảng viDanh mục hình

viii Thesis abstract x Phần 1 Mởđầu 1

2.3.2 Tính chất dược lý có lợi cho sức khỏe của Sulforaphene 14

2.3.3 Cơ chế tác dụng của Sulforaphene 162.3.4 Tính an toàn của Sulforaphene 172.3.5 Tình hình nghiên cứu công nghệ tách chiết và thu nhận hoạt chất

sulforaphene 17

Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 21

3.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 21

21

chất 21

3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.3 Phương pháp nghiên cứu 26

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 26

3.3.2 Phương pháp xác định hoạt chất Sulforaphene 30

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 31

Phần 4 Kết quả và thảo luận 32

4.1 Ảnh hưởng của thời gian nảy mầm đến hàm lượng sulforaphene trong hạt mầm cải 32

4.2 Xác định các điều kiện kỹ thuật tách chiết sulforaphene từ hạt mầm cải củ 35

4.2.1 Ảnh hưởng của loại dung môi đến khả năng tách Sulforaphene từ hạt mầm cải củ 35

4.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng tách Sulforaphene từ hạt mầm cải củ 36

4.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến khả năng tách Sulforaphene từ hạt mầm cải củ 38

4.2.4 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng tách Sulforaphene từ hạt mầm cải củ trong sản xuất dầu thô 39

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Kiến nghị 43

Tài liệu tham khảo 45

Phụ lục .48

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

CK : Chất khô

DNA : Deoxyribonucleic acid

DMSO : Dimethyl sulfoxide

DW : Dry Weight

ESP : Epithiospecifier protein

FDA : Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm MỹGGCS : 4γ-glutamylcysteine synthetase

GLS : Glucosinolate

GST : Glutathione transferase

HCCLH : Hợp chất chứa lưu huỳnh

HPLC : Hight Performance Liquid ChoromatographyITC : Isothiocyanate

PCOOH : Phosphatidyl choline-hydroperoxide

RA : Rheumatoid Arthritis

SCO2 : Supercritical CO2

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các chỉ số hóa lý đặc trưng của dầu hạt cải 4Bảng 2.2 Thành phần axit béo trong dầu hạt cải 5Bảng 2.3 Một số ITCs đã được nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư

12

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thời gian nảy mầm đến hàm lượng Sulforaphene trong

hạt mầm cải củ Đà Lạt (A) và hạt mầm cải củ phía Bắc (B)

33

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của loại dung môi đến khả năng tách Sulforaphene từ hạt

mầm cải củ Đà Lạt (A) và hạt mầm cải củ phía Bắc (B)

35

Bảng 4.3 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng tách

Sulforaphene từ hạt mầm cải củ Đà Lạt (A) và hạt mầm cải củ phía Bắc (B) 37Bảng 4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến khả năng tách Sulforaphene từ hạt

mầm cải củ Đà Lạt (A) và hạt mầm cải củ phía Bắc (B)

38

Bảng 4.5 Ảnh hưởng thời gian trích ly đến khả năng tách Sulforaphene từ hạt

mầm cải củ Đà Lạt (A) và hạt mầm cải củ phía Bắc (B)

40

Hình 3.3 Đường chuẩn Sulforaphene 31Hình 4.1 Quy trình sản xuất dầu thô giàu hoạt chất Sulforaphene từ hạt mầm

cải củ 41

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Nguyễn Hồng Nhung

Tên luận văn: “Xây dựng quy trình sản xuất dầu thô giàu hoạt chất Sulforaphene

từ hạt mầm cải củ (Rhaphanus sativus L.)”

Phương pháp nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: hạt cải củ Đà Lạt và hạt cải củ phía Bắc

- Phương pháp bố trí thí nghiệm:

+ Xác định thời gian nảy mầm thích hợp nhằm thu lượng Sulforaphene cao nhấttrong hạt mầm cải củ: Hạt cải củ Đà Lạt và cải củ phía Bắc được cho nảy mầm ở 25oCtrong các thời gian khác nhau: hạt chưa nảy mầm (0 giờ), 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ,

Kết quả chính và kết luận

- Hàm lượng Sulforaphene trong hạt mầm cải củ thay đổi theo thời gian nảy mầmcủa hạt Sau 48 giờ nảy mầm, hạt mầm cải củ cho hàm lượng Sulforaphene cao nhất Vìvậy lựa chọn thời gian nảy mầm hạt cải củ của cả hai giống là 48 giờ

- Các yếu tố loại dung môi, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian cóảnh hưởng đến quá trình chiết Sulforaphene từ hạt mầm cải củ của cả hai giống cải củ

Đà Lạt và phía Bắc Điều kiện tối ưu để tách chiết Sulforaphene từ mầm hạt cải củ của

cả hai giống là dung môi diclometan với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 6/1, ở nhiệt độ

50oC trong thời gian 120 phút Hàm lượng Sulforaphene đạt được ở điều kiện đó là3,41±0,03 mg/g CK đối với giống hạt cải Đà Lạt và 3,41±0,01 mg/g CK đối với giốnghạt cải củ phía Bắc

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Nguyen Hong Nhung

Thesis title: “Development of a process for production of crude oil rich inSulforaphene from germinated radish seeds (Rhaphanus sativus L.)”

Major: Food technology Code: 60.54.01.03

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)Research Objectives

Development of a procedure for producing, processing raw materials and crudeoils rich in Sulforaphene from germinated radish seeds

Materials and Methods

- Materials: The radish seeds gathered in Da Lat Province and the North Viet Nam

- Methods of experimental arrangement:

+ Determination of the the best sprout age (after the seed incubation) affording thehighest content of Sulforaphene: the seeds of both radid cultivars

+ Establishment the technical parameters of oil extraction: Evaluation of theinfluence of solvents and material/solvent ratio, extraction temperature and time on theoil yields and Sulforaphene content

 Solvent choice: Extraction is performed with 3 solvent separately: ethanol,dichlorometane and ethyl acetate

 Solvent/material ratio (v/w): Each solvent is tested at the followingsolvent/material ratios (v/w): 2/1, 3/1, 4/1, 5/1, 6/1, 7/1, 10/1

 Influence of extraction temperature: The materials are extracted by each of allthe tested organic solvents at the temperatures of 20oC, 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC,

Main findings and conclusions

- The content of Sulforaphene obviously varies with the sprout age: at the point of48h after germination it reaches the highest

- By the above extraction trials for choice of the solvent, solvent/material ration(v/w), extraction temperature and time, the best extraction way for gettingsulphoraphen-rich oils from the sprouts of both tested radish cultivars (one from Da Latand the other from North Vietnam) is finally established as follows: Solvent –dichlorometane; solvent/material ratio (v/w) – 6 to 1; extraction temperature – 50oC,extraction time – 120 mins In this way of extraction, the content of sulphoraphen in theobtained crude radish oils reached 3.41±0.03 mg/gDW for the radish cultivar of Da Latand 3.41±0.01 mg/gDW for that of the North Vietnam

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cũng như ở hầu hết các nước trên thế giới, tại Việt Nam, các loài câythuộc họ Cải (hay họ Thập tự/Hoa Thập tự) rất phong phú, đa dạng loài, dồi dào

về sản lượng nhưng chủ yếu chỉ được dùng làm rau ăn

Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện trong loài Cải có mặt một số hợpchất chứa lưu huỳnh (HCCLH) có những tác dụng sinh học quý giá như chốngoxi hóa, phòng chống ung thư, viêm loét dạ dày, tá tràng do vi khuẩnHelicobacter pylori,… (Faley et al, 2002) Trong đó, nổi bật nhất làSulforaphane có nhiều trong súp lơ xanh và Sulforaphene chủ yếu trong hạt mầmcải củ Bởi ngoài các tác dụng sinh học như các HCCLH khác, Sulforaphane vàSulforaphene còn có tác dụng đặc biệt là phòng chống thoái hóa hoàng điểm,phòng chống đột quỵ Các công trình khoa học trên thế giới mới chỉ tập trungnghiên cứu xác định Sulforaphane trong mầm và hoa súp lơ xanh, trong khihạt mầm cải củ có chứa lượng lớn Sulforaphene, có tác dụng phòng vệ hóahọc mạnh hơn súp lơ xanh đến 4 – 5 lần lại chưa được quan tâm nghiên cứu(O’Hare et al, 2011)

Chúng tôi lựa chọn cải củ Việt nam (Raphanus sativus L.) làm đối tượngnghiên cứu, bởi loài này được trồng khắp mọi miền, chiếm tỷ trọng lớn trongnhóm thực phẩm “rau cải”, và chủ yếu dùng củ (phần thân rễ), là bộ phận chođến nay chưa có tài liệu nào công bố có chứa Sulforaphene Trong khi, hạt cải

củ Việt Nam được dự đoán có thể giàu Sulforaphene lại chỉ mới được dùnglàm hạt giống Giá trị thực phẩm, tác dụng sinh học liên quan đến HCCLH nóichung và Sulforaphene nói riêng chưa được quan tâm nghiên cứu, khai thác

và sử dụng

Mặt khác, cũng như hầu hết các hợp chất hóa thực vật khác, hàm lượngSulforaphene trong cây biến động theo thời kỳ sinh trưởng, phát triển và hìnhthành, tích lũy, phân bố ở những bộ phận khác nhau của cây, thường chỉ tậptrung và thực sự tạo nên giá trị ở một số bộ phận nhất định Nghiên cứu, khảo sátcác biến động đó là nhiệm vụ của đề tài nhằm bước đầu đưa ra căn cứ đề xuất vềtrồng trọt, lựa chọn bộ phận và thời điểm thu hoạch mang lại giá trị mong muốn.Qua tham khảo tài liệu và khảo sát sơ bộ, đối tượng nghiên cứu cụ thể được lựachọn là hạt mầm cải củ

Cuối cùng, về dạng sản phẩm tiêu dùng, ngoài dạng rau ăn (nguyên liệuthô) thông thường, để tăng giá trị “chức năng” (có lợi cho sức khỏe), sản phẩm

đã được nghiên cứu khai thác và sử dụng Tác dụng sinh học của các hợp chấtchứa lưu huỳnh nói chung và Sulforaphene nói riêng đã định hướng chúng tôibước đầu nghiên cứu, tiến tới khai thác hiệu quả nhất giá trị làm thuốc củaSulforaphene hạt cải củ Việt Nam, dưới dạng dầu hạt cải, bắt đầu bằng “Xâydựng quy trình kỹ thuật sản xuất dầu thô giàu hoạt chất Sulforaphene từ hạtmầm cải củ (Raphanus sativus L.)”

 Xác định được các điều kiện chiết tách Sulforaphene thích hợp từ hạt mầmcải củ

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ HỌ CẢI

Họ Cải (Brassicaceae), còn gọi là họ Thập tự (Cruciferaceae), là một họthực vật có hoa, gồm một số loài có tầm quan trọng về mặt kinh tế, cung cấpnhiều loại rau về mùa đông trên khắp thế giới Trong tiếng Việt, hầu hết các loạicây trồng trong họ này đều mang yếu tố phân loại là “Cải”: cải củ, cải củ ThụyĐiển, cải canh, cải xanh, cải trắng, cải chíp, cải ngọt, cải thìa, cải bẹ, cải bẹ vàng,cải bắp, cải bắp trắng, cải xoong, cải dầu, cải làn, cải ngựa, cải xoăn, cải xoănnước mặn, cải bông xanh,…

Trước đây, họ này được gọi là Họ Thập tự hay Họ Hoa Thập tự(Cruciferaceae) do bốn cánh hoa hợp thành hình chữ thập (thập tự) Hiện nay tênnày (Cruciferae) vẫn được công nhận là hợp thức (Điều 18.5 của ICBN (Quy tắc

St Louis)) Tên Brassicaceae có nguồn gốc từ tên chi điển hình của họ là chiBrassica

Họ Brassicaceae có quan hệ “hóa phân loại” với họ Bạch hoa(Capparaceae) với đặc trưng là các thành viên của chúng đều sản sinh các hợpchất glucosinolate có mùi hăng đặc trưng của rau cải Gần đây, theo định nghĩatruyền thống, Capparaceae được coi là cận ngành với họ Brassicaceae (Hall et

al, 2002) Trong số các chi gần gũi, chi Cleome có quan hệ họ hàng gần nhất với

họ Brassicaceae Vì thế, Hệ thống phân loại sinh học thực vật APG II đã hợp cảhai họ này thành một họ lớn dưới tên Brassicaceae Các hệ thống phân loại khácvẫn tiếp tục công nhận họ Capparaceae nhưng với định nghĩa chặt chẽ hơn, hoặcđưa cả chi Cleome và các chi gần của nó sang họ Brassicaceae, hoặc tách chúngthành một họ riêng là Cleomaceae Trên website của APG, chúng được ghi nhậnthành 3 họ riêng biệt

Họ này bao gồm các loài cây thân thảo có chu kỳ sống là một, hai nămhay lâu năm Các thành viên trong họ chủ yếu có các lá mọc so le (ít khi mọcđối) Phần lớn các loài có hợp chất Glucosinolate có mùi hăng đặc trưng vốnthường gắn liền với các loại rau cải

Tầm quan trọng của họ Cải trong việc cung cấp rau cho con người đã dẫntới việc tạo giống chọn lọc trong suốt chiều dài lịch sử Brassica oleraceae, một

loài cây hoang dại ở khu vực Địa Trung Hải và châu Âu ven Đại Tây Dương, là

tổ tiên của cải bắp, cải brussels, cải bông xanh, su hào, súp lơ, cải xoăn và gầnđây nhất là súp lơ bông xanh, một loại cây lai ghép giữa cải bông xanh và súp lơ

Cải củ (Raphanus sativus L.) là một loại rau ăn củ thuộc họ Cải, đượcthuần hóa ở châu Âu từ thời kỳ tiền La Mã (Roman) Hiện nay cải củ được trồng

và sử dụng trên khắp thế giới Cải củ có nhiều thứ khác nhau, khác biệt về kíchthước, màu sắc và mùa vụ Một vài thứ cải củ được trồng để lấy hạt dùng trongchế biến dầu hạt cải

Hiện nay, có 2 loại cải củ chính được dùng phổ biến, đó là củ cảitrắng (mùa đông) và củ cải đỏ (xuân hoặc hè) Củ cải trắng thường có hình dángdài, nhỏ chứ không tròn như củ cải đỏ

Ngoài ra ở Việt Nam, củ cải trắng còn là một vị thuốc chữa bệnh TheoĐông y, củ cải tươi sống có vị cay, tính mát, củ cải nấu chín có vị ngọt, tính bình,quy kinh phế và vị, có công dụng chữa một số bệnh đường hô hấp, tiêu hóa, tiếtniệu,

2.2 DẦU HẠT CẢI

2.2.1 Tính chất hoá lý và thành phần axit béo của dầu hạt cải

Dầu hạt cải thường được thu nhận bằng phương pháp ép Ở điều kiệnthường, dầu hạt cải ở dạng lỏng, có màu vàng trong, được sử dụng nhiều trongsản xuất thực phẩm và dược phẩm Dầu hạt cải được xem là thức ăn rất tốt, dễđồng hoá đối với cơ thể con người

Dầu hạt cải không tan trong nước, dễ tan trong dung môi hữu cơ như etepetrol, n- hecxan,… Các chỉ số hóa lý đặc trưng của nó được trình bày ở bảng2.1

Bảng 2.1 Các chỉ số hóa lý đặc trưng của dầu hạt cải

Dầu hạt cải được đánh giá là một trong những loại dầu ăn tốt nhất cho timmạch nhờ có chứa các axit béo omega- 3, omega-6 có lợi cho sức khỏe Trongdầu hạt cải có chứa rất ít các axit béo no Thành phần các axit béo trong dầu hạtcải được trình bày trong bảng 2.2.

Bảng 2.2 Thành phần axit béo trong dầu hạt cải

Nguồn: Vũ Thị Đào và Đào Thị Nguyên (1999)

2.2.2 Vai trò của dầu hạt cải đối với đời sống con người

Dầu hạt cải (canola) là loại dầu ăn đạt mức tiêu thụ đứng thứ ba trên thịtrường thế giới Đã từ lâu dầu hạt cải được dùng làm nguyên liệu sản xuấtMargarin, các chất béo dùng để làm bánh, để chiên, đặc biệt trong việc làm cácmón ăn chiên giòn Snack Ngoài ra, dầu củ cải còn được sử dụng trực tiếp nhưmột loại dầu chiên xào Các sản phẩm thực vật có thể được tạo ra từ dầu hạt cảibao gồm: Margarin, Shortening, Mayonaise, mỳ chiên, bánh bích quy, sôcôla,dầu ăn và các chất béo chuyên dùng Dầu hạt cải được đánh giá cao nhờ đặc tính

ổn định ở nhiệt độ cao, ít bị ôi khét (do oxy hóa) và không nhựa hóa (chốngpolyme hoá) nên nó rất thích hợp để làm dầu chiên xào, kéo dài thời gian sử dụngcủa thực phẩm Hơn nữa, cũng giống như những loại dầu thực vật khác, dầu hạtcải không chứa cholesterol, nhưng khác biệt với các loại khác là cần rất ít hoặckhông cần xử lý hoá chất, có thể được sử dụng ở trạng thái tự nhiên cho nhiềuứng dụng trong thực phẩm, không cần qua hydro hoá Đó là đặc điểm quí giá, ưuviệt của dầu hạt cải Bởi gần đây các loại dầu hydro hoá bị khuyến cáo không nêndùng vì các axit béo dạng trans tạo ra do hydro hóa có hại cho sức khoẻ

Ngoài ứng dụng trong thực phẩm, dầu hạt cải còn được ứng dụng rộng rãitrong các ngành công nghiệp khác như làm dầu đốt, mực, sơn, mỹ phẩm, xàphòng và các sản phẩm hoá dầu khác như các axit béo Mặt khác, khô dầu của cảidầu sau khi ép được dùng làm nước chấm, làm thức ăn gia súc

Dầu hạt cải còn chứa một lượng Vitamin E dồi dào và khi chưa tinh luyện

nó có chứa một lượng lớn Vitamin A, β- caroten Do đó, sử dụng dầu hạt cải thaythế dầu, mỡ chiên xào làm tăng cholesterol như bơ, các chất béo góp phần phòngngừa, ngăn chặn ung thư, tăng lưu thông máu, làm giảm nguy cơ mắc các bệnh

về tim mạch

Năm 2006, theo Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phầm Mỹ (FDA), chấtbéo không bão hòa có trong dầu hạt cải giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh về timmạch vì chúng làm giảm lượng LDL - cholesterol có hại và khuyến cáo ngườidân nên dùng 1,5 muỗng dầu hạt cải trong thực phẩm hằng ngày

Gần đây, hệ thống thức ăn nhanh nổi tiếng thế giới McDonald's đã chuyểnsang sử dụng dầu hạt cải Chuyên gia dinh dưỡng nổi tiếng Ellie Krieger của Mỹcũng sử dụng dầu hạt cải trong các công thức nấu ăn của mình, để đảm bảo chấtlượng thực phẩm và sức khỏe cho người tiêu dùng

Ngoài ra, dầu hạt cải còn được sử dụng để sản xuất dầu diesel sinh học,dùng cho các động cơ Diesel sinh học được làm từ các nguồn tái tạo vừa khôngđộc vừa có thể giúp giảm thải khí nhà kính, thân thiện với môi trường hơn hẳncác loại nhiên liệu khác (Trần Thúy, 2013)

2.2.3 Các phương pháp sản xuất dầu hạt cải

Trong công nghệ khai thác dầu thực vật hiện nay, hai phương pháp thườngđược sử dụng là ép và chiết tách (bằng dung môi hữu cơ) Mỗi phương pháp đều

có những ưu, nhược điểm riêng Ngoài ra, có thể sử dụng phương pháp enzyme

và phương pháp chiết CO2 siêu tới hạn Lựa chọn phương pháp thích hợp tuỳthuộc vào loại nguyên liệu và tính chất của sản phẩm dầu

a Quá trình xảy ra đối với phần dầu

Quá trình xảy ra đối với phần dầu là quá trình làm thoát dầu ra khỏi cáckhe vách giữa các bề mặt bên trong cũng như bên ngoài Dưới tác động của lựcnén cơ học, các phần tử chứa dầu bắt đầu biến dạng Các khoang, khe chứa dầu

bị hẹp dần, dầu bị dồn lại Khi đạt đến độ dày nhất định, dầu thoát ra, chảy thànhnhững “đường dòng” theo các khe thông Lớp dầu nằm sát vách khe bị dính lại,hãm lại, tốc độ chảy chậm Những lớp dầu xa vách khe linh động hơn, tốc độ

“đường dòng” cao hơn Tốc độ thoát dầu trung bình phụ thuộc vào độ nhớt củadầu và áp lực gây chảy (lực ép) Độ nhớt càng thấp và áp lưc ép càng lớn, dầuthoát ra từ các khoang, khe càng nhanh Độ nhớt cao chỉ làm chậm chứ khônglàm ngăn cản sự thoát dầu Nói chung, đoạn đường chảy dầu càng dài, dầu thoát

ra càng chậm Sau khi phần lớn lượng dầu trong các ống thoát ra, đường kính

“ống” bị nhỏ hẹp dần Khi các phần tử không thể tiếp tục biến dạng thêm nữa,dầu cũng không thoát ra được cho dù lực ép có tăng lên Lượng dầu còn lại trongkhô dầu là do bị “hấp thụ”, bị kết dính vững chắc, không thể “chảy” dưới bất kểlực ép nào, nên không thể thu được bằng ép Đó là hàm lượng dầu đặc trưng củakhô dầu

b Quá trình xảy ra đối với phần rắn

Khi các phần tử trong nguyên liệu bắt đầu bị biến dạng, áp lực nén tănglên sẽ làm tăng sự biến dạng Đến một lúc, các phân tử bị ép sát nhau đến mức cốkết chặt chẽ với nhau, chống chịu được áp lực bên ngoài, sự biến dạng sẽ khôngxảy ra nữa Nếu trong các khe vách không còn dầu có thể tăng áp lực đến mứccác phần tử nguyên liệu dính chặt nhau lại, cố kết, tạo thành khối chắc Nhưngthực tế, về cơ khí, áp lực chỉ đạt đến một giới hạn nhất định, nhất là đối với loạimáy ép thủ công Một lượng nhỏ dầu còn nằm lại ở chỗ tiếp giáp giữa các phần

tử rắn, nên khô dầu vẫn có tính xốp Đặc biệt, khi ra khỏi khuôn ép, tính xốp lạităng lên bởi sự giãn nở do được giải nén

Trong quá trình ép, lực nén càng cao các phần tử rắn biến dạng càngnhiều, dầu thoát ra càng nhanh và càng kiệt Tuy nhiên, tăng lực ép làm tăng tốc

độ dòng dầu, tăng chảy dầu, các “ống” dẫn dầu hẹp lại nhanh chóng, tăng trở lựcđối với các dòng dầu, đường thoát dầu dần bị bịt kín Hiện tượng này xảy ra đặcbiệt rõ rệt trong trường hợp ép bằng các loại máy ép thủ công và máy ép thủy lực

vì nguyên liệu ép luôn luôn ở trạng thái tĩnh, không được đảo trộn Nghĩa là, đốivới một máy ép nhất định, đối với mỗi loại nguyên liệu, có một lực ép tối ưu.Vượt qua giá trị đó, tiếp tục tăng áp lực không làm tăng hiệu quả tách dầu Đốivới máy ép thủ công, khi áp lực đạt đến mức nhất định, tốc độ chảy dầu cao, tiếptục tăng áp lực, dầu tiếp tục chảy ra, nhưng khi áp lực tăng quá giới hạn chảydầu, dầu cũng không thoát ra nữa, mặc dù vẫn còn dầu trong nguyên liệu Đối với

máy ép vít liên tục, lực ép tăng dần đến giới hạn thích hợp, nhờ nguyên liệu luônđược đảo trộn, hiện tượng tắc “ống” chảy dầu hầu như không xảy ra, tạo điềukiện cho quá trình thoát dầu nhanh hơn.

Do vậy, quá trình ép dầu (hiệu suất ép) phụ thuộc vào các yếu tố chính sau:

- Loại thiết bị ép: ép thủ công, ép thủy lực hay máy ép vít liên tục;

- Phương thức ép: ép kiệt 01 lần hay ép kiệt 02 lần;

- Đặc tính tự nhiên, cơ học của nguyên liệu ép như kích thước hạt, nhiệt

độ, độ ẩm, tính dẻo, tính đàn hồi Các đặc tính này phụ thuộc vào khâu chuẩn bịnguyên liệu như cắt, xay, nghiền, tán, tẩm, hấp, chưng, sấy … để đảm bảonguyên liệu có thích hợp cho quá trình thoát dầu (Ngô Xuân Dũng, 2012)

2.2.3.2 Phương pháp chiết tách dầu bằng dung môi hữu cơ

Nguyên liệu trước khi đưa vào chiết tách cần qua sơ chế tạo điều kiện thuậnlợi cho quá trình chiết Tùy theo độ xốp và khả năng thâm nhập của dung môichiết mà nguyên liệu có thể nghiền nhỏ hoặc không Do nước có tính “kỵ dầu”,ngược lại các dung môi chiết hữu cơ lại “thân dầu”, hàm lượng nước cao sẽ cảntrở và làm giảm hiệu quả chiết Cho nên nguyên liệu chiết dầu thường được sấykhô hoặc phơi khô Nhiệt độ và thời gian sấy có ảnh hưởng đáng kể tới chấtlượng dầu chiết được Vì vậy, cần xác định nhiệt độ và thời gian sấy thích hợp đểtránh gây biến chất sản phẩm chiết và cả các thành phần khác trong nguyên liệugây cản trở quá trình chiết, làm giảm chất lượng sản phẩm

Cần khảo sát lựa chọn dung môi thân dầu thích hợp đồng thời xác lậpphương pháp trích ly xác định các yếu tố ảnh hưởng, lựa chọn thông số kỹ thuậttối ưu bao gồm: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian, số lần trích ly(Vũ Thị Đào và Đào Thị Nguyên, 1999)

Ngoài bản chất loại nguyên liệu có dầu, các yếu tố ảnh hưởng đến quátrình xử lý enzyme để tách dầu ra khỏi nguyên liệu bao gồm: nhiệt độ, pH, tỷ lệenzyme/nguyên liệu, thời gian,

Cho đến nay, ở Việt Nam mới chỉ mới nghiên cứu khảo sát quá trình trích

ly dầu màng gấc bằng phương pháp enzyme qui mô phòng thí nghiệm, sử dụngcác loại enzyme: Viscozym, Pectinex, Cellulast, Alcalase Một số loại enzyme cótác dụng phá vỡ các mô thực vật, thuỷ phân một số chất không tan, làm giảm độnhớt của nguyên liệu màng gấc, giúp quá trình tách dầu dễ dàng và nâng cao hiệusuất Tuy nhiên, công trình chưa được áp dụng thực tiễn bởi sử dụng enzymekhông thích hợp đối với việc chiết dầu màng gấc, thậm chí không thật cần thiết,

vì trong màng gấc thành phần cellulose, tinh bột không cao, ít ảnh hưởng tới quátrình thoát dầu Trong khi, giá các loại enzyme thuỷ phân rất cao, chi phí sản xuấtlớn (Ngô Xuân Dũng, 2012)

2.2.3.4 Các phương pháp khác

Ngoài các phương pháp nêu trên, hai phương pháp mới có triển vọng

số điều kiện nhất định, nên phương pháp này không khả thi trong thực tế sản xuấtdầu thực vật

Tan trong dầu, CO2 làm giảm độ nhớt, nâng cao hiệu suất ép Sau khi ép, CO2

được loại ra khỏi dầu dễ dàng, đơn giản chỉ bằng giảm áp Phương pháp này vừakhai thác ưu điểm của ép thủy lực bổ sung CO2 và phương pháp CO2 siêu tới

nguyên liệu tách vỏ và chưa tách vỏ, có thể tăng trên 30% so với ép thôngthường Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, chi phí sảnxuất rất cao

Mặc dù, có nhiều phương pháp để lựa chọn, hiện nay gần 90% sản lượngdầu thế giới được sản xuất bằng phương pháp ép thông thường vì có ưu điểmvượt trội là thao tác đơn giản, chi phí sản xuất thấp và độ an toàn cao Phươngpháp trích ly có ưu thế sử dụng khi dầu có giá trị cao mà hàm lượng thấp (< 20%)và/hoặc nhạy cảm nhiệt, môi trường…

2.3 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ SULFORAPHENE

2.3.1 Sự hình thành, cấu trúc hóa học và tính chất hóa lý của sulforaphene2.3.1.1 Sự hình thành Sulforaphene

chuyển hóa Glucoraphenin - một Glucosinolate được tìm thấy với hàm lượngcao: 202±18,3 mg/g CK trong mầm hạt cải củ (Nieves et al, 2016) bởi enzymemyrosinase

Hình 2.1 Quá trình chuyển hóa Glucoraphenin thành Sulforaphene trong

thực vật (Nieves et al., 2016)Glucosinolate (GLS) là các hợp chất dẫn xuất từ hợp chất chứa glucose vàacid amin, có liên kết với sulfur, được gọi là β-thioglucoside-N-hydroxysulphates Chúng có chủ yếu trong các loại rau họ cải, hạt mù tạt đen.Hợp chất glucosinolate phổ biến là sinigrin, thuộc họ glucosides (có nhiều trong

mù tạt Wasabi) Glucosinolate là β-D-thioglucoside tự nhiên tìm thấy trong

15 họ thực vật hai lá mầm, bao gồm Akaniaceae, Bataceae, Brassicaceae,Bretschneideraceae, Capparaceae, Caricaceae, Resedaceae, Euphorbiaceae,Limnanthaceae, Moringaceae, Salvodoraceae, Tovariaceae, Gyrostemonaceae,

Pentadiplantdraceae, Tropaeolaceae Các cây trồng có chứa GLS thuộc về họBrassicaceae chiếm đa số, đặc biệt là cải bắp, súp lơ, súp lơ xanh (bông cảixanh), mầm cải Brussels, củ cải, mù tạt… (Verkerk et al., 2008) Cấu trúc củaGLS bao gồm một gốc R liên kết thioglucosid với carbon của một oximesunfonat hóa Cấu trúc chung của GLS được trình bày trong hình 2.2 Trong đó,nhóm R có nguồn gốc từ các amino acid, rất phong phú, thể là chất béo (alkyl,alkenyl, hydroxyalkenyl), hợp chất thơm (benzyl, …) hoặc dị vòng (indolyl, …).

Hình 2.2 Công thức hoá học chung của glucosinolate (Li et al.,

2012)Khi nghiền ướt các mô thực vật hoặc các hạt chứa GLS, các enzymemyrosinase nội sinh sẽ xúc tác sự phân cắt thủy phân của thioglucosidictạo thành D-glucose và một thiohydroximate O-sulphonate (aglycone) Nếu

pH trung tính (pH = 5 – 8), phản ứng rất nhanh, tạo một isothiocyanate, dễ bayhơi, có mùi mạnh và vị đắng Đây là sản phẩm thủy phân phổ biến ở nhiều loài.Với pH axit (pH = 2 – 5), sản phẩm tạo thành là nitrile Trong môi trường kiềmnhẹ (pH > 8), chỉ tạo ra một thiocyanate Tóm lại, sản phẩm thủy phân men củaGLS phụ thuộc vào cấu trúc của mạch bên GLS và điều kiện môi trường (pH=5-

8, pH=2-5, pH>8) bao gồm glucose, sulfate, và một loạt các chất có hoạttính sinh học như isothiocyanate, thiocyanate, nitrile, … (Higdon et al., 2007)

Hình 2.3 Một số sản phẩm thuỷ phân của Glucosinolate (Li et al., 2012)

Isothiocyanate (ITC) là các hợp chất nhóm - N = C =S , là sản phẩm thuỷphân của GLS ở pH trung tính Những ITC tự nhiên như allylisothiocyanate, còn được gọi là mù tạt (mustard).

Hình 2.4 Cấu trúc hoá học chung của isothiocyanate (Li et al., 2012)Bên cạnh việc đóng góp hương vị cho các loại rau thuộc họ Cải, các hợpchất này được quan tâm vì ảnh hưởng của chúng đến sức khỏe con người Một sốnghiên cứu đã tìm hiểu vai trò của ITC trong việc ức chế sự phát triển của cácloại ung thư khác nhau

Bảng 2.3 Một số ITC đã được nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư

i

Nguồn: Higdon et al (2007)

Myrosinase (EC 3.2.3.1) là enzyme β-thioglucosidase là enzyme thủyphân glucosinolates, một nhóm các chất chuyển hóa tự nhiên có mặt trong hầuhết các loại rau họ cải Đã xác định và phân loại trên 100 loại glucosinolate khácnhau ở chuỗi R allyl (sinigrin), benzyl, and indoyl (I) Enzyme thủy phân thườngxảy ra khi phá vỡ tế bào hay quá trình chế biến Các enzyme xúc tác quá trìnhthủy phân của các S-glucosides để tạo ra β – D – glucose (II) và các đoạnaglycone (III), Các aglycone không ổn định sau đó sắp xếp lại để tạo sulfate vàisothiocyanate (IV).

Metabolism of glucosinolates as catalyzed by myrosinase.

M Grazia Botti et al J Biol Chem 1995;270:20530-20535

©1995 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Hình 2.5 Cơ chế của glucosinolate khi xúc tác bởi enzyme myrosinase

Cơ chế xúc tác của enzyme myrosinase vẫn đang được nghiên cứu, khảnăng xúc tác chuyển hóa glycoside của enzyme đã được kiểm tra Sự ổn định vàhoạt tính thủy phân của enzyme giảm khi có mặt của các dung môi hữu cơ, baogồm cả cồn, nhưng không đủ để ngăn chặn hoàn toàn Tuy nhiên, khác với hầuhết các β-glycosidases khác, myrosinase không xúc tác phản ứng chuyển hóaglycoside với rượu hoặc các chất nhận glycosyl khác Do đó, các enzyme-glycosyl trung gian giả định dường như không có tác dụng Có thể vì D-glucose

là sản phẩm đầu tiên thu được từ các enzyme Một chất ức chế cạnh tranh mạnhβ-glucosidase đã được tìm thấy lại ức chế không cạnh tranh yếu đối vớimyrosinase Đặc biệt, myrosinase được hoạt hóa bởi axit ascorbic

2.3.1.2 Cấu trúc hóa học và tính chất hóa lý của Sulforaphene

Hình 2.6 Cấu trúc hóa học của sulforaphene

c Công thức hóa học: C6H9NOS2

d Khối lượng phân tử trung bình: 175,272 g/mol

e Trạng thái vật lý: Chất lỏng không mùi, màu vàng sáng

f Tính chất: Hòa tan trong nước lạnh, methanol, dimethyl sulfoxide (DMSO) và chloroform

2.3.2 Tính chất dược lý có lợi cho sức khỏe của Sulforaphene

2.3.2.1 Tác dụng trong phòng và điều trị ung thư

Nhiều nghiên cứu in vitro trên các dòng tế bào ung thư ruột kết, ung thưmáu, tụy, phổi và ung thư da đã chứng minh tác dụng ức chế của Sulforaphene vềkìm hãm vòng đời tế bào Nghiên cứu trên các dòng tế bào ung thư bàng quang

và tuyến tiền liệt cho thấy Sulforaphene làm tăng quá trình tự chết tế bào Khảnăng phá vỡ sự polyme hóa tubulin và ức chế phân bào của Sulforaphene cũng đãđược chứng minh trong các mô hình động vật ung thư vú Nó ức chế histonedeacetylase và tăng sự chết tế bào đối với các dòng tế bào ung thư ruột kết, tuyếntiền liệt và thận

Mầm hạt cải củ đã được chứng minh là rau xanh có tác dụng phòng vệhóa học tốt hơn súp lơ xanh bằng thử nghiệm khả năng cảm ứng men khửđộc pha 2 là quinone reductase trên các dòng tế bào vú Đó là do trong súp lơ

xanh có mặt một protein là epithiospecifier protein (ESP) có tác dụng láiphần lớn (trên 90%) quá trình thủy phân glucoraphanin sang hướng khôngthành chất cảm ứng mạnh là sulphoraphane mà tạo thành sản phẩm khôngcảm ứng men là sulphoraphane-nitrile Cải củ trắng/cải củ không có EPS, và

do vậy trên thực tế tất cả Glucoraphenin đều bị thủy phân thànhSulforaphene có tính cảm ứng men mạnh Phát hiện này có ý nghĩa thực tiễnlớn lao Nhiều nghiên cứu trên thế giới nhằm vào tác dụng phòng vệ hóa họccủa súp lơ xanh, nhầm tưởng rằng tất cả Glucoraphanin chuyển hóa hoàntoàn thành Sulphoraphane (O’Hare et al., 2011)

Đi xa hơn, từ tác dụng cảm ứng men phòng vệ hóa học khử độc có tácnhân gây ung thư, công trình này tiến thử nghiệm hoạt lực kiềm chế pháttriển tế bào ung thư của mầm hạt cải củ In vitro, chiết phẩm mầm hạt cải củ

tỏ ra có tác dụng kìm chế phát triến tế bào ung thư máu người còn tốt hơn cảmầm hạt súp lơ xanh, một phần là do trong súp lơ xanh tạo ra một lượng lớnSulforaphane-nitril không có tác dụng kiềm chế phát triển tế bào ung thư(O’Hare et al., 2008)

2.3.2.2 Phòng và điều trị bệnh tim mạch và tăng huyết áp

Glucoraphenin và Sulforaphene đủ khả năng bảo vệ tim mạch thôngqua tính chất chống oxy hóa và chống viêm của chúng, dẫn đến giảm stressoxy hóa, cải thiện công thức lipid và giảm huyết áp Thử nghiệm giai đoạn 1liên quan đến hút thuốc lá (sáu người đàn ông và sáu phụ nữ) để điều tra mức

sử dụng 100g mầm bông cải xanh tươi hàng ngày (hàm lượngGlucoraphenin/Sulforaphene không quy định) trong một tuần ảnh hưởng đếndấu hiệu stress oxy hóa và mức cholesterol Mức cholesterol, axit amin tronghuyết tương, hoạt tính giết tế bào tự nhiên, coenzyme huyết thanh Q10 vàcác dấu hiệu của stress oxy hóa là phosphatidyl choline-hydroperoxide(PCOOH) huyết tương, 8-iso-prostane nước tiểu, 8-hydroxy-deoxyguanosinenước tiểu được đo trước và sau điều trị Chỉ sau một tuần sử dụng mầm bôngcải xanh, chỉ số lipid tổng và LDL-cholesterol của tất cả các đối tượng và tất

cả các dấu hiệu căng thẳng oxy hóa đều giảm (Murashima et al., 2004)

2.3.2.3 Chống viêm đường hô hấp trên

Các hạt bụi từ khí thải động cơ diesel trong không khí là nguyên nhân làmtăng bệnh phổi và bệnh tim mạch vì gây stress oxy hóa Sulforaphene ức chế sựsản xuất cytokine trong tế bào biểu mô đường hô hấp của người tiếp xúc với phế

thải dầu diesel qua sự cảm ứng của các gen enzyme giai đoạn 2 NQO1 vàglutathione-S-transferase M1 Trong nghiên cứu đầu tiên để chứng minh khảnăng điều hòa của Sulforaphene trong đường hô hấp của người, Reidl và cộng sự

đã cho sử dụng sản phẩm BroccoSprouts® (BSH) ở 57 tình nguyện viên khỏemạnh (tuổi trung bình 34) với liều lượng tăng dần (25, 50, 75, 100, 125, 150, 175

và 200g) Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự tăng đáng kể về transferases, HO-1, và NQO1 ở liều lượng 200g BSH so với nhóm đối chứngdùng giả dược Tất cả các liều được dung nạp tốt và không có tác dụng phụnghiêm trọng (Reidl et al., 2009)

tỷ lệ sống synoviocyte lên đến 51% so với ban đầu, giảm đáng kể IL-17 vàTNF-α, và áp chế các phản ứng tăng sinh trong các tế bào đa nhân trung tính ởmức cơ bản Kiểm tra mô học cho thấy ít viêm, ít tăng sản hoạt dịch và ít pháhủy xương ở những con chuột được điều trị bằng Sulforaphene so với nhóm đốichứng (Kong et al., 2010)

2.3.3 Cơ chế tác dụng của Sulforaphene

Sulforaphene là một chất cảm ứng mạnh của các enzyme pha 2 phụthuộc vào Nrf2 (ery-throid-derived 2) tham gia vào giải độc xenobiotic Cácenzyme cảm ứng bởi Sulforaphene bao gồm thành phần đáp ứng chất chốngoxy hóa (ARE) nhằm vào: NQO1, 4γ-glutamylcysteine synthetase (GGCS),HO-1, 32 glutathione transferases (GST), transferases glucuro-nosyl, vàhydrolases epoxide Các enzyme này được quy định bởi các yếu tố chuyển nạpNrf2, được giải phóng từ một liên kết kiểu Kelch (KEAP1) giữa protein vàECH, gắn kết vào các vị trí ARE trong các gen của enzyme và tiếp tục điềukhiển khử độc chất gây ung thư Hiệu ứng qua trung gian Nrf2 khác của

Sulforaphene bao gồm ức chế quá trình oxy hóa LDL, ức chế quá trình oxy hóadopamine, cải thiện yếu tố miễn dịch Th1 liên quan đến tuổi thông qua khôiphục lại trạng thái cân bằng oxi hóa khử và giảm stress oxy hóa gây ra bởi cácchất gây ung thư ái điện tử (Gao et al., 2001).

Sulforaphene cũng điều biến các enzyme cytochrome P450 (CYP) của pha

1 bằng cách giảm hoạt tính của CYP1A1, CYP2B1/2 và CYP3A4, do đó ức chế

sự hoạt hóa các chất tiền ung thư và ngăn chặn sự sinh ra các sản phẩm cộngDNA trong giai đoạn khởi đầu của bệnh ung thư Ảnh hưởng thực tổng thể tớicác enzym của pha 1 và 2 là sự gia tăng quá trình chuyển hóa và giải độc các chấthóa học gây ung thư (Clarke et al, 2008)

2.3.4 Tính an toàn của Sulforaphene

Cho đến nay vẫn chưa ghi nhận tác dụng phụ nào của các isothiocyanategây ra cho người Các nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng các isothiocyanate

ức chế sự phát triển của ung thư khi được hấp thụ trước khi xuất hiện các chấtgây ung thư (trước khi bắt đầu ung thư) Các nghiên cứu về Sulforaphene còn rấthạn chế Trên thế giới mới chỉ có một số nghiên cứu về ứng dụng và tính an toàncủa Sulforaphane – một isothiocyanate tương tự Sulforaphene Trong một sốnghiên cứu ngẫu nhiên, có đối chứng giả dược đánh giá sự an toàn củaSulforaphane đối với người thấy dịch chiết mầm bông cải xanh không có tácdụng phụ ở liều 25 và 100 micro-mol Glucoraphanin/một ngày trong 7 ngày Mộtnghiên cứu khác trên 200 người lớn khỏe mạnh dùng dịch mầm bông cải xanhmỗi ngày trong hai tuần (400 micro-mol hay 175 mg Glucoraphanin/một ngày)cũng cho thấy không có tác dụng phụ (Tarozzi et al., 2009) Trong một nghiêncứu an toàn tăng liều, dịch chiết mầm bông cải xanh có chứa Sulforaphane liềucao (340 nmol) được dùng tại chỗ trên da cẳng tay ba lần liên tiếp Trên mô sinhthiết, có cảm ứng men đáng kể đối với hoạt tính enzyme giai đoạn II mà không

có bất kỳ phản ứng bất lợi nào (Campas-Baypoli et al., 2010)

2.3.5 Tình hình nghiên cứu công nghệ tách chiết và thu nhận hoạt chấtsulforaphene

2.3.5.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới chưa có nhiều nghiên cứu về Sulforaphene từ hạt mầm cải

củ Một số nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết và tinh chế glucoraphanin từ

hạt súp lơ xanh West et al (2002) đã sử dụng sắc ký tương tác giữa ion cặp vàchất ái nước để tinh chế nhiều loại glucosinolates Tương tự, Toribio et al (2007)tinh chế sinalbin và glucoraphanin bằng sắc ký, tách ly tâm và trao đổi ion Tuynhiên cả hai kỹ thuật này chỉ có giá trị khoa học, chỉ chiết tác hoạt chất mà thuđược dịch chứa glucoraphanin từ hạt súp lơ có giá trị thực phẩm, thương phẩm,kinh tế.

Gần đây, Wehrli and Schuts (2013) đã đề xuất phương pháp tách chiếtglucosinolates đơn giản và thiết thực hơn, phù hợp cho việc sản xuấtglucosinolates, đặc biệt là glucoraphanin, dùng trong thực phẩm Glucosinolateđược chiết qua các bước sau:

 Tách chiết glucosinolate từ hạt và/hoặc các bộ phận của cây bằng dungmôi chứa cồn hoặc ketone hoặc hỗn hợp cả hai loại, thu được dịch chiết chứa cồnhoặc ketone (1)

 Bay hơi một phần hay hoàn toàn dung môi (2)

 Sắc ký trao đổi ion dịch chiết (1) hoặc (2) - thu được sản phẩm (3)

 Hấp phụ dịch chiết (1) hoặc (2) hoặc (3) bằng nhựa

 Rửa thu dịch chiết chứa glucosinolate

Dung môi thích hợp được sử dụng từ bước 2 đến bước 5 bao gồm: nước,C1-4 alcohol, C3-4 ketones và hỗn hợp của chúng Nhựa trao đổi cation thíchhợp là ở dạng axit và thích hợp hơn là nên sử dụng chất trao đổi ion axit mạnh.Nếu cần thiết có thể thực hiện thêm một bước nữa sau bước 5 để thu được dịchchiết chứa glucosinolate Theo đó tiến hành làm bay hơi những hợp chất dễ bayhơi của dịch chiết chứa glucosinolate Kết quả thu được dịch chiết chứaglucosinolate bao gồm glucoraphanin, glucoraphenin, glucorucin và glucoiberin

Năm 2011, Tập đoàn Nghiên cứu và Phát triển Công nghiệp Nông thônthuộc Chính phủ Australia đã tổng hợp các bài báo cáo có liên quan và xuất bảntập Lợi ích sức khỏe của mầm hạt cải củ trắng – Hàm lượng Glucosinolate vàtiềm năng lợi ích sức khỏe Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng Sulforaphene tronghạt mầm cải củ có tác dụng phòng vệ hóa học cũng như hoạt tính cảm ứng menkhử độc pha 2 cao hơn Sulforaphane nhiều lần Đề xuất của Dự án này thực sự là

cú hích tạo sự chuyển hướng mạnh mẽ từ súp lơ xanh sang cải củ trắng Nói tómlại, mầm hạt cải củ trắng hoặc cải củ nói chung chắc chắn sẽ chiếm chỗ của mầmsúp lơ xanh về mặt chống ung thư, không chỉ ở Australia mà trên toàn thế giới

Năm 2013, Pengqun và cộng sự đã nghiên cứu tách và tinh sạchSulforaphene từ hạt cải củ sử dụng nhựa macroporous và sắc ký lỏng hiệu năngcao Nghiên cứu này đã mô tả một phương pháp nhanh chóng và tiết kiệm chi phí

để tách và tinh chế Sulforaphene tự nhiên từ hạt cải củ bằng nhựa macroporousSP-700 và sắc kỷ lỏng hiệu năng cao (HPLC) Sulforaphene với độ tinh khiết caothu được bằng hệ thống HPLC với cột C18 và pha động là 30% methanol trongnước siêu tinh khiết 12,5 kg hạt cải củ trong đó có 87,5g Sulforaphene, sản xuấtđược 117,5g dịch chiết giàu Sulforaphene 65,8%, sau đó phân tách bằng nhựamacroporous SP-700 5,9g Sulforaphene 96,5% thu được từ 9,5 g dịch chiết giàuSulforaphene bằng HPLC

2.3.5.2 Các nghiên cứu trong nước

Các nghiên cứu trong nước về các loài thuộc họ Cải và hợp chấtGlucosinolate còn rất hạn chế Vì vậy nghiên cứu này sẽ mở ra một hướng đi mớicho các nhà khoa học ở Việt Nam để khai thác các hợp chất chứa lưu huỳnh nóichung và Sulforaphene nói riêng để ứng dụng vào dược học và thực phẩm

Năm 2008, Lê Doãn Diên và cộng sự khi “Nghiên cứu thăm dò hoạt chấtGlucosinolate nhóm Sulforaphane và Indol-3-carbinol trong một số loài súp lơxanh (Brassica sp., Họ cải - Brassicaceae) ở Việt Nam” bước đầu cho kết quả:

đã tìm thấy trong những loại cải này chứa hoạt chất quý giá có nhiều tác dụngđối với sức khỏe con người Hai hoạt chất quan trọng chứa lưu huỳnh được tìmthấy là Sulforaphane và Indol-3-carbinol với một tỷ lệ khả quan Nhóm tác giảcũng đã tách chiết và thu nhận được nhóm hoạt chất có lưu huỳnh chiết suất từmột số loại rau họ cải có tác dụng chống các chất oxy hóa trong cơ thể thôngqua việc làm giảm hàm lượng Peroxit và Peroxitlipit cho người nghiện thuốc lá.Hàm lượng Peroxit trong nước tiểu ở ngày đầu là 6,90 mM/ mL/ min; ngày thứ

30 là 5,79 mM/ mL/ min Hàm lượng Peroxit trong huyết tương: ngày đầu là3,10 mM/ mL/ min; ngày thứ 30 là 1,28 mM/ mL/ min Trong cả nước tiểu lẫnhuyết tương, giá trị Peroxitlipit giảm một nửa Đó là một trong những chỉ tiêucho thấy tác dụng chống oxy hóa thành công của dịch chiết cải hoa, chống lạinhững gốc tự do, góp phần làm tăng hàm lượng các chất chống oxy hóa trong

cơ thể Trong tất cả những người nghiện thuốc lá được nghiên cứu, số lượngTripeptide glutathione tăng lên một cách đáng kể Giá trị trung bình củaTripeptide glutathione trong nước tiểu: ngày đầu là 1,29 và tăng lên 2,96mM/mL ở ngày thứ 30 Còn trong huyết tương ngày đầu là 2,37 và ngày thứ 30

là 5,72 mm/mL Các nhà khoa học ở Viện nghiên cứu Thực phẩm chức năngbước đầu cũng đã tạo ra một số chế phẩm như Sucuvina, Bidimine từ rau mầm

họ cải có tác dụng làm sạch đường tiêu hóa, hỗ trợ phòng chống viêm loét dạdày, tá tràng do nhiễm vi khuẩn H pylori, phòng ngừa ung thư dạ dày, phòngchống ung thư tuyến tiền liệt, đặc biệt phòng chống việc thoái hóa hoàng điểm,rất tốt cho lứa tuổi trung niên

Vũ Thị Thu Hiền (2012) trong quá trình nghiên cứu một số chất khángoxy hóa trong rau mầm họ cải, bước đầu đã xác định được hàm lượngGlucosinolate trong 6 giống rau mầm họ cải (cải bắp trắng, cải củ trắng, cải bẹvàng, cải xanh, cải chíp, cải ngọt) thu hoạch ở các thời điểm khác nhau Hàmlượng Glucosinolate trong 5 giống rau mầm trên (cải củ trắng, cải bẹ vàng, cảixanh, cải chíp, cải ngọt) đều đạt giá trị cao nhất tại ngày thứ 3 (hàm lượngGlucosinolate dao động từ 7,02 - 57,61 µmol sinigrin/ g chất khô) và rau mầmcải bắp vào ngày thứ 2 (57,61 µmol sinigrin/g chất khô) Ngoài ra, rau mầmtrồng từ hạt cải bắp trắng so với rau mầm trồng từ hạt cải củ trắng, hạt cải chíp,hạt cải bẹ vàng, hạt cải ngọt, hạt cải xanh đều có hàm lượng Glucosinolate và khảnăng kháng oxy hóa cao

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là hạt mầm cải củ Đà Lạt (được cung cấp bởiCông ty TNHH C.H Việt Nam) và hạt mầm cải củ phía Bắc được mua tại chợĐồng Xuân

được vớt ra ủ ở nhiệt độ phòng 8h Hạt ủ gieo đều trên khay 35cm x 45cm lótgiấy gieo hạt của Đan Mạch, dưới lớp giấy là giá thể bão hòa nước Mầm hạt

bảo bầu không khí luôn bão hòa hơi nước Hạt mầm thu hoạch được rửa, loại bỏhết tạp chất và hạt lép không nảy mầm

Chế biến hạt mầm theo mô tả của Lê Doãn Diên và cs (2008): Hạt mầm

Myrosinase hoạt động thủy phân các glucosinolate tạo thành Sulforaphene Sấy

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

3.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ

- Cân phân tích điện tử AR2140 (d=0.0001g, Ohaus Crop-pine Brook, Mỹ)

- Máy Vortex maxi mix II (Mỹ)

 UV/VIS detector SPD-20A

 Bộ kiểm soát CBM-20A

 Cột sắc ký Phenomenex C18 (Phenomenex, CA, Mỹ)

 Dụng cụ

Ống falcon 15 ml, 50 ml; ống ependoff; bình tam giác thể tích 100 ml, 250ml; bình định mức 10 ml, 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1000 ml; pipet 100 µl, 1000µl,…; pipet 5 ml, 10 ml; ống nghiệm, cốc đong; ống đong

3.1.2.2 Hóa chất

- Các loại hóa chất xuất xứ Trung Quốc: diclometan, etyl acetate, ethanol

- Chất chuẩn Sulforaphene (Sigma, Đức)

- Các hóa chất phân tích HPLC: acetonitrile, methanol của Merck (Đức).3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Viện Nghiên cứu Thực phẩm chức năng, Phòng thí nghiệmKhoa Công nghệ thực phẩm – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Thời gian: 4/2016 – 9/2016

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Để xác định thông số kỹ thuật cho quy trình sản xuất dầu thô giàu hoạtchất Sulforaphene, quá trình sản xuất dầu thô được tiến hành theo quy trình mô

tả trong hình 3.1 Trong đó các bước đi từ nguyên liệu đến bột nghiền, ly tâmmẫu, cô cạn dung môi thu hồi dầu được thực hiện theo nghiên cứu của Lê DoãnDiên và cs (2008), đề tài này sẽ làm rõ các vấn đề về loại dung môi dùng đểsản xuất, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian chiết mẫu với cácnội dung sau đây:

Nội dung 1: Nghiên cứu xác định thời gian nảy mầm thích hợp nhằm thu lượng Sulforaphene cao nhất trong hạt cải củ

Hàm lượng Sulforaphene trong hạt cải củ được đánh giá tại các thời điểmkhác nhau trong quá trình nảy mầm và so sánh với hàm lượng chất này trong hạt

2008), sau khi hạt nảy mầm hàm lượng Sulforaphene được theo dõi tại các mốc thời gian:

- 24 giờ sau nảy mầm

- 48 giờ sau nảy mầm

- 72 giờ sau nảy mầm

- 96 giờ sau nảy mầm

- 120 giờ sau nảy mầm

Giống sử dụng là hai loại giống hạt cải củ Đà Lạt và giống hạt cải củ phíaBắc được mô tả trong mục 3.1.1.

Nội dung 2: Xác định điều kiện kỹ thuật chiết tách Sulforaphene trong hạtmầm cải củ

Để xác định điều kiện kỹ thuật cho quá trình tách chiết Sulforaphene tronghạt mầm cải củ, nghiên cứu đã tiến hành xác định vai trò của dung môi và tỷ lệ

sử dụng dung môi đối với nguyên liệu hạt mầm cải củ, vai trò của nhiệt độ và vaitrò của thời gian đối với khả năng chiết tách Sulforaphene từ hạt mầm cải củ,những nội dung cụ thể được thực hiện như sau:

Nội dung 2a: Ảnh hưởng của các loại dung môi tới khả năng chiết táchSulforaphene trong hạt mầm cải củ

Do Sulforaphene hòa tan tốt trong các dung môi hữu cơ lỏng, phân cực

(d < 1), với đặc điểm này có thể sử dụng nhiều loại dung môi để thực hiện quátrình tách chiết Sulforaphene Trong nghiên cứu này, hạt mầm cải củ được chiếtbằng 3 dung môi khác nhau, hàm lượng Sulforaphene trong mỗi dịch chiết từ cácdung môi khác nhau được định lượng và so sánh với nhau để xác định loại dungmôi phù hợp nhất, các dung môi đã được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu ảnh hưởng đến khả năng chiết tách hợp chất

vì khi lượng dung môi tăng sẽ làm tăng khả năng, tốc độ khuếch tán các hợp chấtSulforaphene vào dung môi, tăng hiệu quả chiết Tuy nhiên, cần lựa chọn tỷ lệdung môi/nguyên liệu sao cho quá trình chiết ổn định, đạt hiệu quả cao mà đồngthời giảm được chi phí sản xuất Trong nghiên cứu này, hạt mầm cải củ đượcchiết bằng dung môi ở 7 tỷ lệ khác nhau, hàm lượng Sulforaphene trong mỗi dịchchiết từ dung môi có các tỷ lệ khác nhau được định lượng và so sánh với nhau để

xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu phù hợp nhất, các tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đã được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 2/1

- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 3/1

- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 4/1

- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 5/1

- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 6/1

- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 7/1

- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 10/1

Giống sử dụng là hai loại giống hạt cải củ Đà Lạt và giống hạt cải củ phíaBắc được mô tả trong mục 3.1.1

Nội dung 2c: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng chiết tách Sulforaphene trong hạt mầm cải củ

Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng không nhữngtới hiệu suất trích ly mà còn tới chi phí và chất lượng của Sulforaphene Sự suygiảm của Sulforaphene và Glucosinolate do nhiệt đã được nghiên cứu bởiSlominski và Campbell (1987, 1988, 1989 a,b), chứng tỏ Sulforaphene rất mẫn

dạng DIM hoặc dạng hợp chất khác Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, hạtmầm cải củ được chiết bằng dung môi ở 6 mức nhiệt độ khác nhau, hàm lượngSulforaphene trong mỗi dịch chiết ở các nhiệt độ khác nhau được định lượng và

so sánh với nhau để xác định nhiệt độ chiết phù hợp nhất, các mức nhiệt độ đã được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

Nội dung 2d: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng chiết tách Sulforaphene trong hạt mầm cải củ

Bên cạnh yếu tố loại dung môi, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ thìthời gian chiết cũng là một trong những yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến hiệusuất và chất lượng của sản phẩm thu được Trong quá trình chiết, các hợp chấtnhóm Glucosinolate chuyển hóa dần, các cấu tử Sulforaphene được hình thành,hàm lượng tăng dần Cần tiến hành thí nghiệm mô phỏng (cùng điều kiện) để xácđịnh thời gian tối ưu Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, hạt mầm cải củ đượcchiết trong thời gian khác nhau, hàm lượng Sulforaphene trong mỗi dịch chiếttrong các thời gian khác nhau được định lượng và so sánh với nhau để xác địnhđược thời gian chiết phù hợp nhất, các khoảng thời gian đã được sử dụng trongnghiên cứu bao gồm:

Nguyên liệu

NghiềnBột nghiền

+Dung môi hữu cơKhô bã

Ly tâmDịch thu hồi

Dầu thô

Hình 3.1 Quy trình tổng quát công nghệ sản xuất dầu thô bằng

phương pháp trích ly (Vũ Thị Đào và Đào Thị Nguyên, 1999)

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Xác định các thông số kỹ thuật cho quá trình sản xuất dầu thô từ hạt mầmcải củ, quy trình sản xuất được thực hiện theo mô hình được mô tả trong sơ đồhình 3.1

Theo mô hình này, nghiên cứu đã làm rõ các khâu: loại dung môi với tỷ lệdung môi/nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian chiết thích hợp bằng các phươngpháp sau:

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

3.3.1.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm xác định thời gian nảy mầm thích hợp nhằm thu lượng Sulforaphene cao nhất trong hạt cải củ

Hạt cải củ của hai giống cải Đà Lạt và cải củ phía Bắc được ngâm nước ở

đều trên khay 35cm x 45cm lót giấy gieo hạt của Đan Mạch, dưới lớp giấy là giá

thể bão hòa nước Mầm hạt được giữ trong nhiệt độ 25oC ở các thời gian khácnhau Thí nghiệm này được bố trí gồm 12 công thức như sau:

 Đối với hạt cải củ Đà Lạt  Đối với hạt cải củ phía Bắc

Hạt chưa nảy mầm (0 giờ) Hạt chưa nảy mầm (0 giờ)

24 giờ sau nảy mầm 24 giờ sau nảy mầm

48 giờ sau nảy mầm 48 giờ sau nảy mầm

72 giờ sau nảy mầm 72 giờ sau nảy mầm

96 giờ sau nảy mầm 96 giờ sau nảy mầm

120 giờ sau nảy mầm 120 giờ sau nảy mầm

Mỗi công thức được lặp lại 3 lần

Mầm hạt sau khi thu hoạch được rửa sạch, loại bỏ hết tạp chất và hạt lép

xay mịn và cho qua rây 0,5 mm

Cân 20g mẫu bột mịn đã rây, cho 100ml dung môi diclometan, lắc ngang

ở 37oC trong 60 phút Ly tâm 6000 vòng/phút để thu hồi dịch trong (Lê DoãnDiên và cs., 2008) Cô cạn dung môi thu dầu thô và xác định hàm lượng hoạtchất Sulforaphene trong dầu

Ở mỗi giống hạt, công thức nào có hàm lượng Sulforaphene cao nhất sẽđược lựa chọn làm thời điểm thu hạt mầm cho các thí nghiệm tiếp theo

3.3.1.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của dung môi, tỷ

lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian đến quá trình tách chiếtSulforaphene

Kết quả nghiên cứu của thí nghiệm mô tả ở mục 3.3.1.1 được sử dụng làmđiều kiện nảy mầm cho hạt cải củ của cả hai giống Đà lạt và phía Bắc Hạt mầm

các thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ

 Đánh giá ảnh hưởng của loại dung môi đến quá trình tách chiếtSulforaphene

Ở thí nghiệm này bố trí 3 công thức cho mỗi giống cải củ với 3 loại dungmôi khác nhau: