Định loại các loài cá bơn phổ biến tại khánh hòa dựa trên đặc điểm hình thái, di truyền và ước tính thời gian phân hóa loài

L ỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả của đề tài: “Định loại các loài cá bơn phổ biến tại Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái, di truyền và ước tính thời gian phân hóa loài” là công

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VI ỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐỊNH LOẠI CÁC LOÀI CÁ BƠN PHỔ BIẾN TẠI KHÁNH HÒA

Gi ảng viên hướng dẫn: TS Đặng Thúy Bình

Sinh viên th ực hiện: Ph ạm Thiên Phú

Khánh Hòa − 2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VI ỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

B Ộ MÔN SINH HỌC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐỊNH LOẠI CÁC LOÀI CÁ BƠN PHỔ BIẾN TẠI KHÁNH HÒA

GVHD: TS Đặng Thúy Bình SVTH: Phạm Thiên Phú MSSV: 56131191

Khánh Hòa, tháng 7 năm 2018

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả của đề tài: “Định loại các loài cá bơn phổ biến tại

Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái, di truyền và ước tính thời gian phân hóa loài” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này

Nha Trang, ngày 19 tháng 7 năm 2018

Sinh viên

Ph ạm Thiên Phú

L ỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài tại trường Đại học Nha Trang, em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của nhà trường, sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, đặc biệt là các thầy cô giáo và cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã truyền những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong các năm học vừa qua Với tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến TS Đặng Thúy Bình (Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường) đã định hướng và tận tình hướng dẫn cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến NCS Vũ Đặng Hạ Quyên, ThS Trương Thị Oanh và ThS Trần Quang Sáng (Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường) và ThS Đoàn Vũ Thịnh (Khoa Công Nghệ Thông Tin) đã động viên và dìu dắt em trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài và viết luận văn tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè và các anh chị trên phòng thí nghiệm sinh học phân tử đã quan tâm, giúp đỡ và hỗ trợ em trong suốt thời gian thực hiện để em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Mặc dù, em đã rất cố gắng để hoàn thiện đồ án nhưng do thời gian và kiến thức còn hạn chế, nên trong quá trình thực hiện đồ án không thể nào tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được những đóng góp ý kiến quý báu của thầy, cô giáo để đồ án được hoàn thiện hơn.Em xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 19 tháng 7 năm 2018

Sinh viên

Ph ạm Thiên Phú

TÓM T ẮT

Thành phần các loài cá bơn ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng Đây là loài cá

có giá trị thương phẩm và được sử dụng làm thực phẩm phổ biến của người dân ven biển Bộ cá bơn (Pleuronectiformes) ở Việt Nam được ghi nhận có tới 97 loài, thuộc 33 giống, 7 họ Vùng biển Khánh Hòa là nơi có mật độ cá bơn tập trung cao Tuy nhiên trong những năm vừa qua, nghề khai thác thủy sản ven bờ tỉnh Khánh Hòa phát triển quá mức cùng với lượng chất thải độc hại gia tăng đã làm suy giảm nghiêm trọng nguồn lợi này Mặt khác, chưa có các nghiên cứu di truyền đi sâu vào khảo sát mối quan hệ phát sinh chủng loại và ước tính thời gian phân hóa của các loài thuộc bộ cá bơn (Pleuronectiformes) tại khu vực này Chính vì vậy, nghiên cứu hiện tại tiến hành định loại một số loài cá bơn phổ biến tại Khánh Hòa dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền (sử dụng gen CO1 mtDNA) Nghiên cứu đã ghi nhận được 16 loài thuộc 10 giống, 4 họ Cây phát sinh loài cho thấy sự đồng dạng của các loài cá nghiên cứu ở mức giống, tuy nhiên, ở mức độ họ, họ cá bơn vỉ (Bothidae) được sắp xếp với các loài thuộc họ cá bơn sọc (Soleidae) và họ cá bơn cát (Paralichthyidae) Thời gian phân hóa của bộ cá bơn khi

so sánh với dẫn liệu hóa thạch ước tính cách đây khoảng 72,58 triệu năm về trước (Ma), thuộc kỷ Cretaceous, thế Upper Cretaceous, tầng Campanian Thời gian phân hóa của các loài cá bơn có thể liên quan đến sự hình thành các đặc điểm phân loại (vây ngực, xương trước nắp mang, sự hình thành mắt)

Các dữ liệu trong nghiên cứu có thể được sử dụng cho những nghiên cứu về đa dạng sinh học, các nghiên cứu chuyên sâu về quá trình tiến hóa và trong công tác bảo tồn các loài cá tầng đáy nói chung cũng như cá bơn nói riêng

M ỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

L ỜI CẢM ƠN ii

TÓM T ẮT iii

M ỤC LỤC iv s DANH M ỤC HÌNH vi

DANH M ỤC BẢNG vii

DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

M Ở ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu 4

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu (bộ cá bơn – Pleuronectiformes) 5

1.2.1 Giới thiệu về bộ cá bơn (Pleuronectiformes) 5

1.2.2 Tình hình nghiên c ứu hình thái bộ cá bơn (Pleuronectiformes) ngoài nước và trong nước 7

1.2.3 Tình hình nghiên cứu di truyền bộ cá bơn 8

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 11

1.3.1 T ổng quan về hệ gen ty thể 11 s 1.3.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài 13

1.3.3 Giới thiệu về ước tính thời gian phân hóa loài (divergence time) và phương pháp phân tích đồng hồ phân tử (molecular clock) 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Sơ đồ nghiên cứu 16

2.2 Thu thập và định loại các loài cá bơn phổ biến tại Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái 17

2.2.1 Đối tượng, địa điểm và phương pháp thu mẫu 17

2.2.2 Định loại các loài cá bơn phổ biến dựa vào đặc điểm hình thái 17

2.3 Khuếch đại và giải trình tự đoạn gen CO1 mtDNA một số loài cá bơn phổ biến tại vùng biển Khánh Hòa 18

2.3.1 Tách chi ết DNA tổng số 18

2.3.2 Kiểm tra DNA tổng số 18

2.3.3 Khuếch đại đoạn gen CO1 mtDNA bằng phản ứng PCR 19

2.3.4 Giải trình tự gen CO1 mtDNA 20

2.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại và ước tính thời gian phân hóa loài (divergence time) của cá bơn 20

2.4.1 Xây d ựng cây phát sinh chủng loại của các loài cá bơn phổ biến tại Khánh Hòa sử dụng trình tự gen CO1 mtDNA 20

2.4.2 Ước tính thời gian phân hóa (divergence time) của các loài cá bơn 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Thu thập và định loại các loài cá bơn phổ biến tại Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái 24

3.2 Đặc điểm hình thái các loài thuộc bộ cá bơn (Pleuronectiformes) thu tại Khánh Hòa 25

3.3 Khuếch đại và giải trình tự đoạn gen CO1 mtDNA một số loài cá bơn phổ biến tại vùng biển Khánh Hòa 32

3.3.1 Tách chi ết DNA tổng số 32

3.3.2 Khu ếch đại, giải trình tự đoạn gen CO1 mtDNA một số loài cá bơn 32

3.3.3 So sánh s ự tương đồng trình tự với Genbank 33

3.3.4 So sánh sự khác biệt về trình tự gen CO1 mtDNA giữa 16 loài cá bơn phổ biến ở Khánh Hòa 36

3.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại cá bơn 38

3.5 Ước tính thời gian phân hóa của các loài cá bơn 42

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

4.1 KẾT LUẬN 49

4.2 KIẾN NGHỊ 49

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 50

PH Ụ LỤC 59

DANH M ỤC HÌNH

Hình 1.1 Bản đồ hành chính khu vực tỉnh Khánh Hòa 4

Hình 1.2 Quá trình biến đổi mắt của cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus) 6

Hình 1.3 DNA ty thể loài cá Bơn Mắt Lệch (Crossorhombus azureus) bao gồm 37 gen mã hóa đặc trưng cho 22tRNA, 2rRNA và 13 vùng mã hóa protein (Shi và cs, 2013) 12

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 16

Hình 2.2 Một số đặc điểm hình thái dùng trong định loại cá bơn 17

Hình 2.3 Các chỉ số đếm trong phân loại cá bơn (Carpenter và Niem, 2001) 18

Hình 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi FishF1 - FishR1 20

Hình 3.1 Tỷ lệ (%) các giống, loài trong thành phần bộ cá bơn thu tại Khánh Hòa 25

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CO1 mtDNA mẫu cá bơn 32

Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loại từ phương pháp Maximum Likelihood (mô hình tiến hóa GTR+G+I) dựa trên trình tự gen CO1 mtDNA của các loài cá bơn phổ biến tại Khánh Hòa 38

Hình 3.4 Cây ước tính thời gian phân hóa các loài cá bơn dựa trên trình tự gen CO1 mtDNA 43

Hình 3.5 Đặc điểm không có vây ngực của họ cá bơn lưỡi bò (Cynoglossidae) 44

Hình 3.6 Sự xuất hiện của vây ngực trên các giống thuộc họ cá bơn sọc (Soleidae) 45

Hình 3.7 Đặc điểm không có xương trước nắp mang của họ cá bơn sọc (Soleidae) và họ cá bơn lưỡi bò (Cynoglossidae) 46

Hình 3.8 Đặc điểm mắt của các loài thuộc họ cá bơn môi vỉ (Bothidae) 46

Hình 3.9 Đặc điểm giống cá bơn khoang (Zebrias) và cá bơn lưỡi trâu (Brachirus) 47 Hình 3.10 Đặc điểm giống cá bơn vảy tròn (Liachirus) và cá bơn hoa (Pardachirus) 48

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 19Bảng 2.2 Trình tự gen CO1 mtDNA các loài cá bơn sử dụng trong xây dựng cây phát sinh chủng loại 21Bảng 3.1 Danh sách các loài cá bơn thu tại Khánh Hòa, Việt Nam 24Bảng 3.2 Chỉ tiêu hình thái các loài cá bơn phổ biến ở Khánh Hòa 31Bảng 3.3 Kết quả độ tương đồng của các trình tự CO1 mtDNA từ 16 loài cá bơn thu tại Khánh Hòa với dữ liệu từ Genbank 33Bảng 3.4 Sự khác biệt về trình tự CO1 mtDNA của 16 loài cá bơn phổ biến ở Khánh Hòa 37

DNA Deoxyribonucleic acid

GB Ký hiệu cho các loài từ Genbank

mt DNA Mitochondrial deoxyribonucleic acid ND1 NADH dehydrogenase, subunit 1

PCR Polymerase Chain Reaction

Rag 1 Recombinase Activating Gene 1

RNA Ribonucleic acid

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

Ma Million years ago − triệu năm về trước

RAG1 Recombination Activating Gene 1

RAG2 Recombination Activating Gene 2

E1 Early Growth Response Protein genes 1 E2B Early Growth Response Protein genes 2B E3 Early Growth Response Protein genes 3 MLL Mixed-lineage Leukemia

M Ở ĐẦU

Nguồn lợi cá tầng đáy tại vùng biển Việt Nam đa dạng và phong phú với tiềm năng lớn, chiếm vai trò quan trọng trong các loài hải sản nước ta (Bùi Đình Chung và cs, 2001) Cá bơn (Pleuronectiformes) là nhóm cá trải qua quá trình biến đổi trong vòng đời của chúng với cơ thể bất đối xứng đặc trưng nhằm thích nghi với lối sống ở tầng đáy (Robin và cs, 2015) Tính tới năm 2016, trên thế giới đã phát hiện được 772 loài cá bơn thuộc 129 giống và 14 họ khác nhau Theo thống kê của Voronina và cs (2016), bộ cá bơn tại biển Việt Nam đa dạng về thành phần loài và phân bố tại nhiều khu vực khác nhau với 97 loài, 33 giống thuộc 7 họ

Cá bơn là loài có giá trị thương phẩm và được sử dụng làm thực phẩm phổ biến của người dân ven biển (Lê Quang Dũng, 2013) Các loài cá bơn nhỏ không đánh bắt và buôn bán tại vùng biển phía bắc Australia lại có giá trị kinh tế ở thị trường của hầu hết các nước Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam (Robin và cs, 2015) Tuy nhiên trong những năm vừa qua, nghề khai thác thủy sản ven bờ phát triển quá mức đã làm suy giảm nghiêm trọng nguồn lợi cá tầng đáy (Bộ Tài nguyên và Môi trường, 2016) Các chất thải độc hại từ các nhà máy, xí nghiệp chưa qua xử lí thải trực tiếp ra biển, các sự cố tràn dầu,…đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nước biển, gây ô nhiễm đáy biển do lắng đọng các kim loại nặng, hóa chất độc hại Điều kiện môi trường nước thay đổi sẽ ảnh hưởng đến sự phân bố của các thủy sinh vật và nhóm động vật đáy (Dương Trí Dũng

và cs, 2007)

Đã có những nghiên cứu về di truyền ứng dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại, xây dựng cây phát sinh loài ở Việt Nam như nghiên cứu của Huỳnh Thị Hậu (2016) sử dụng trình tự gen CO1 mtDNA trên đối tượng cá nước ngọt thuộc khu vực Duyên hải Nam Trung Bộ và Tây Nguyên, nghiên cứu của Đinh Thị Phượng (2015) sử dụng trình

tự gen 16S rRNA trên đối tượng cá tầng đáy tại Phú Yên và Khánh Hòa Ngoài ra, cũng

đã có những nghiên cứu về di truyền trên đối tượng cá bơn ứng dụng các chỉ thị phân tử (16S rRNA, CO1 mtDNA, cyt b, RAG2, ND1, RAG1, RH, E1, E2B, E3, MLL) trên thế giới (Exadactylos và Thorpe, 2001; Pardo và cs, 2005; Kartavtsev và cs, 2008; Sharina

và Kartavtsev, 2010; Roje, 2010; Campbell và cs, 2013; Campbell và cs, 2014; Betancur

và Ortí, 2014) Tuy nhiên, mới chỉ có nghiên cứu của Campbell và cs (2013) về ước tính thời gian phân hóa loài trên cá bơn sử dụng các chỉ thị phân tử

Nhiều nghiên cứu về đa dạng sinh học các loài cá bơn (Pleuronectiformes) ở Việt Nam đã được tiến hành với phương pháp phân loại truyền thống là dựa trên đặc điểm hình thái (Nguyễn Hữu Phụng, 1999; Đinh Thị Phương Anh và Phan Thị Hoa, 2010; Trần Đắc Định và cs, 2013; Voronina và cs, 2016) Tại Khánh Hòa, các nghiên cứu đa dạng sinh học các loài cá tầng đáy nói chung và cá bơn nói riêng đã được thực hiện bởi Trần Văn Phước (2011), Trần Thị Hồng Hoa (2014), Đinh Thị Phượng (2016) Tuy nhiên, đặc điểm hình thái dưới tác động của môi trường và biến dị cá thể có thể gây nhầm lẫn trong công tác phân loại Mặt khác, các nghiên cứu trên chỉ mang tính thống

kê về số lượng, thành phần các loài mà chưa đi sâu vào nghiên cứu khảo sát mối quan

hệ phát sinh chủng loại và ước tính thời gian phân hóa của các loài thuộc bộ cá bơn (Pleuronectiformes)

Do đó, nhận thấy việc định danh, phân loại, thu thập bổ sung dữ liệu di truyền và tiến hóa về đối tượng cá bơn là cần thiết, đề tài “Định loại các loài cá bơn phổ biến tại

Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái, di truyền và ước tính thời gian phân hóa loài” được thực hiện nhằm cung cấp dẫn liệu về hình thái, di truyền và bước đầu khảo sát về thời gian phân hóa của một số loài cá bơn ở địa bàn tỉnh Khánh Hòa Đây là những dẫn liệu đầu vào làm cơ sở cho các nghiên cứu đa dạng sinh học, công tác bảo tồn, đánh giá nguồn lợi hải sản cũng như cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn về quá trình tiến hóa của bộ cá bơn (Pleuronectiformes)

 M ục tiêu của đề tài

Mô tả đặc điểm hình thái, khảo sát sự đa dạng thành phần loài, mối quan hệ phát sinh chủng loại và ước tính thời gian phân hóa của các loài cá bơn phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa dựa trên trình tự gen CO1 mtDNA

 N ội dung nghiên cứu

− Thu thập và định loại các loài cá bơn phổ biến tại Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái

− Khuếch đại và giải trình tự đoạn gen CO1 của DNA ty thể một số loài cá bơn phổ biến tại vùng biển Khánh Hòa

− Xây dựng cây phát sinh chủng loại và ước tính thời gian phân hóa loài (divergence time) của cá bơn

 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Nghiên cứu cung cấp dữ liệu về đặc điểm hình thái, di truyền và bước đầu ước tính thời gian phân hóa loài dựa trên trình tự gen CO1 mtDNA của một số loài cá bơn phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa Các dữ liệu có thể được sử dụng cho những nghiên cứu về đa dạng sinh học, các nghiên cứu chuyên sâu về quá trình tiến hóa và trong công tác bảo tồn các loài cá tầng đáy nói chung cũng như cá bơn nói riêng

CHƯƠNG 1 T ỔNG QUAN 1.1 T ổng quan về vùng nghiên cứu

Khánh Hòa là một tỉnh thuộc khu vực duyên hải Nam Trung Bộ Việt Nam, có hình dạng thon hai đầu và phình ra ở giữa, phía Bắc giáp tỉnh Phú Yên, phía Nam giáp tỉnh Ninh Thuận, phía Tây giáp tỉnh Đắc Lắc, phía Đông giáp Biển Đông, với tổng diện tích

5197 km² (Nguyễn Thế Biên và cs, 2006) (Hình 1.1) Diện tích vùng biển của Khánh Hòa rộng gấp nhiều lần đất liền với đường bờ biển kéo dài 385 km từ xã Đại Lãnh tới cuối vịnh Cam Ranh (Nguyễn Thế Biên và cs, 2006)

(Nguồn: khanhvinh.khanhhoa.gov.vn, có chỉnh sửa) Thềm lục địa Khánh Hòa rất hẹp, các đường đẳng sâu 50 m, 100 m và 200 m chạy gần song song và sát gần bờ (Trịnh Thị Minh Trang và cs, 2015), sườn lục địa khá dốc Trầm tích tầng mặt chủ yếu là các hạt mịn bao gồm bùn và bùn cát, các vùng diện tích nhỏ hẹp với thành phần sét cát là chủ yếu (Trần Anh Tuấn và Nguyễn Thế Tiệp, 2015) Trên địa bàn Khánh Hòa có 7 bán đảo lớn, khoảng 200 hòn đảo lớn nhỏ ven bờ và các đảo san hô trong quần đảo Trường Sa tạo thành nhiều đầm, vịnh kín gió tạo điều kiện

cho các đàn cá di cư đến sinh sản (Nguyễn Tuấn, 2007) Các điều kiện về địa hình này góp phần tạo nên sự đặc trưng về địa mạo, trầm tích, dưới tác động của các yếu tố thủy động lực làm cho Khánh Hòa trở nên đa dạng và phong phú về nguồn lợi cá đáy nói riêng và nguồn lợi thủy sản nói chung

Khánh Hòa nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa Nhiệt độ trung bình năm của khu vực là 26,5oC; cao nhất vào tháng 6 đến tháng 8 Độ ẩm trung bình khoảng 80,5% Khí hậu chia thành hai mùa rõ rệt: mùa mưa ngắn, từ khoảng tháng 9 – 12, lượng mưa chiếm khoảng 80% tổng lượng mưa cả năm; mùa khô từ tháng 1 đến tháng 8 (Nguyễn Hữu Hồ và cs, 2003)

Tốc độ dòng chảy vùng biển Khánh Hòa khá lớn trong cả mùa hè và mùa đông, có thể đạt đến 100 cm/s Mùa đông, dòng chảy theo hướng bắc – nam Vào mùa hè, khu vực này chịu ảnh hưởng của gió mùa Tây Nam nên hướng dòng chảy chủ yếu theo hướng bắc – đông bắc (Nguyễn Mạnh Hùng, 2014) Chính các dòng hải lưu này tạo ra các dòng hải lưu hội tụ (hiện tượng chìm xuống của một hoặc hai khối nước) mang theo các sinh vật phù du và các sinh vật khác sống ở độ sâu khác nhau

1.2 T ổng quan về đối tượng nghiên cứu (bộ cá bơn – Pleuronectiformes)

1.2.1 Gi ới thiệu về bộ cá bơn (Pleuronectiformes)

Bộ cá bơn (Pleuronectiformes) thuộc lớp cá vây tia, gồm 772 loài thuộc 129 giống

và 14 họ (Nelson và cs, 2016) Bộ này gồm 2 phân bộ: (1) phân bộ cá ngộ (Psettodoidei) chỉ chứa duy nhất 1 họ cá bơn ngộ (Psettodidae) gồm 3 loài (2) Phân bộ cá bơn vĩ (Pleuronectoidei) chiếm số lượng loài lớn, gồm 13 họ còn lại trong bộ cá bơn (Robin và

cs, 2015) Các họ có thành phần loài đa dạng nhất của bộ cá bơn đều thuộc phân bộ cá bơn vĩ: họ cá bơn sọc (Soleidae), họ cá bơn lưỡi bò (Cynoglossidae) và họ cá bơn vỉ (Bothidae) (Robin và cs, 2015; Nelson và cs, 2016) Dựa trên kết quả phân tích hóa thạch xương ốc tai cho thấy những loài đầu tiên thuộc bộ cá bơn có thể xuất hiện trong khoảng từ cuối kỷ Paleocene tới đầu kỷ Eocene, khoảng 53 – 57 triệu năm về trước (Campbell và cs, 2013)

Các loài thuộc bộ cá bơn khi trưởng thành có hai mặt bên không đối xứng với hai mắt cùng nằm về một bên phải hoặc trái của đầu, có thể nhô cao lên để quan sát, trong khi ấu trùng cá bơn có cơ thể đối xứng với hai mắt nằm về hai bên của đầu Quá trình phát triển từ ấu trùng thành cá trưởng thành làm biến đổi cấu trúc xương sọ, sắp xếp lại

các dây thần kinh, kết quả làm di chuyển một mắt từ mặt bên này sang mặt còn lại của đầu, màu sắc thân trở nên khác biệt giữa hai mặt (Robin và cs, 2015; Nelson và cs, 2016) Cá bơn có thân dẹp bên, vây lưng và vây hậu môn của các loài thuộc bộ cá bơn kéo dài Các loài trong bộ này thường có 6 – 7 nhánh xương nắp mang (branchiostegal ray), rất ít trường hợp có 8 nhánh (Nelson và cs, 2016)

Hình 1.2 Quá trình biến đổi mắt của cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus)

(Nguồn: Okada và cs (2003) có hiệu chỉnh)

A - Giai đoạn ấu trùng, chưa bắt đầu di chuyển mắt; B → E - Quá trình di chuy ển của mắt từ bên trái sang bên phải của đầu; F - Cá trưởng thành

Các loài thuộc bộ cá bơn phân bố trên nhiều loại địa hình đáy: bùn, cát, thềm đáy nhiều đá, sỏi Bộ cá bơn được tìm thấy ở nhiều môi trường sống: nước mặn, nước lợ và nước ngọt, với vùng phân bố trải dài từ phía nam Bắc Băng Dương tới Nam Cực, ở các

độ sâu khác nhau từ vùng nước nông, trong các bãi rạn, vùng ven cửa sông tới vùng thềm lục địa Các vùng biển có khí hậu nhiệt đới là nơi đa dạng về thành phần loài cá bơn nhất (Robin và cs, 2015)

Từ quan sát tại các hệ sinh thái trên khắp thế giới cho thấy rằng cá bơn chủ yếu săn hai loại thức ăn chính: họ giun nhiều tơ và những động vật giáp xác nhỏ vùng đáy, những con cá bơn có miệng rộng hơn thì ăn gần như toàn bộ các loài cá và mực Một số loài khác là thức ăn cho cá bơn nhưng ít phổ biến như các loài hai mảnh vỏ, động vật da gai, lớp giun ít tơ, ấu trùng của côn trùng,… Chúng là loài săn mồi đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái vùng đáy Nhìn chung, các yếu tố quyết định tới chế độ ăn của

cá bơn là đặc điểm hình thái, tập tính sinh học và những con mồi có sẵn trong môi trường xung quanh chúng (Robin và cs, 2015)

1.2.2 Tình hình nghiên c ứu hình thái bộ cá bơn (Pleuronectiformes) ngoài nước

và trong nước

 Ngoài nước

Dagang và cs (1992) đã nhận diện được 14 loài cá bơn thuộc 12 giống tại vùng nước ven biển Hoàng Hải, Trung Quốc dựa trên đặc điểm hình thái Nghiên cứu đã tóm tắt các đặc điểm sinh học của bộ cá bơn tại vùng biển này gồm: thành phần loài, tuổi, sự trưởng thành của tuyến sinh dục, thức ăn, sự phát triển, sự phân bố và di cư dựa trên phân tích về kích thước cơ thể, tuyến sinh dục, dạ dày và xương ốc tai của các mẫu cá Manickchand (1994) nghiên cứu thành phần loài và mức độ đa dạng của cá bơn tại vùng thềm lục địa Nam Mỹ, kéo dài từ Suriname tới Colombia Phân tích đặc điểm hình thái đã nhận diện được 41 loài cá bơn thuộc 18 giống và 4 họ Kết quả nghiên cứu cho thấy mật độ cá bơn tại vùng nghiên cứu thấp hơn rõ rệt so với các vùng có khí hậu ấm

áp hơn

Nghiên cứu về mối liên hệ giữa sự phân bố của các loài thuộc bộ cá bơn với địa hình đáy của Amezcua và Nash (2001) tại vùng biển phía bắc của Ireland đã định danh được 15 loài cá bơn Qua khảo sát các nhân tố về điều kiện môi trường, chỉ số dự trữ năng lượng (HIS) cùng với các yếu tố về mùa vụ và địa hình đáy, nghiên cứu xác định được mối liên hệ giữa sự đa dạng của cá bơn thuộc vùng biển bắc Irish với các yếu tố

về mùa vụ và đặc điểm địa hình đáy

Kumar và Deepthi (2009) thu thập mẫu cá bơn bằng tàu lưới rà tại vùng duyên hải Kerala của Ấn Độ và phân loại dựa trên hình thái Kết quả đã xác định được 34 loài, thuộc 17 giống và 4 họ Đáng chú ý, loài Laeops natalensis (Norman, 1931) lần đầu tiên

được tìm thấy tại vùng duyên hải của Ấn Độ Ngoài ra, loài Aseraggodes umbratilis

(Alcock, 1894) cũng được tìm thấy kể từ sau các báo cáo về loài này của Alcock vào năm 1894 và 1899

 Trong nước

Ở Việt Nam, mới chỉ có những nghiên cứu về loài cá bơn dựa trên đặc điểm hình thái Năm 1999, Nguyễn Hữu Phụng đã thống kê có 82 loài, nằm trong 33 giống, 6 họ thuộc bộ cá bơn được tìm thấy tại vùng biển trong nước Nghiên cứu sự đa dạng trong thành phần loài của Voronina và cs (2016) tại vùng biển Việt Nam tìm được 47 loài, thuộc 28 giống cá bơn, thuộc 6 họ Kết quả của nghiên cứu này đã bổ sung thêm 15 loài

cá bơn mới vào danh sách 82 loài đã biết trước đây, bao gồm: Arnoglossus macrolophus,

họ Bothidae), Samariscus filipectoralis, Samariscus luzonensis (thuộc họ Samaridae),

Cynoglossus kopsi, Cynoglossus quadrilineatus, Paraplagusia japonica, Symphurus

và Soleichthys tubiferus lần đầu tiên được báo cáo tìm thấy tại vùng biển Đông Mặc dù

có sự khác biệt về khí hậu và thủy văn nhưng thành phần loài cá bơn giữa vùng biển miền bắc và miền nam Việt Nam thể hiện sự tương đồng

Ở Nam Bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng, Đinh Thị Phương Anh và Phan Thị Hoa (2010) xác định được 164 loài cá thuộc 111 giống, 65 họ thuộc cá tầng đáy bằng hình thái Trong đó bộ cá bơn (Pleuronectiformes) có 4 loài thuộc 3 họ khác nhau, chiếm 1,83% tổng số loài đã phát hiện được Đa dạng thành phần loài ở khu vực nghiên cứu thấp hơn một số khu hệ khác ở khu vực miền Trung, cụ thể số lượng loài tại đây bằng 62,36% vùng ven biển Khánh Hòa

Trần Văn Phước (2011) đã xác định thành phần loài thủy sản khai thác bằng nò sáo tại thôn Tân Đảo, đầm Nha Phu, tỉnh Khánh Hòa, sử dụng phương pháp so sánh về hình thái Kết quả phát hiện được 63 loài thủy sản, trong đó có 2 loài thuộc bộ cá bơn, nằm trong họ cá bơn sọc (Soleidae) chỉ chiếm 3,17% cấu trúc thành phần loài tại vùng nghiên cứu Kết quả cho thấy sản lượng khai thác thủy sản thấp, chủ yếu là các loài giáp xác chiếm hơn 50% tổng lượng thủy sản đánh bắt được

Trần Thị Hồng Hoa và cs (2014) nghiên cứu về tính đa dạng loài và nguồn lợi cá khai thác tại vịnh Vân Phong, tỉnh Khánh Hòa Kết quả đã xác định được 351 loài cá thuộc 19 bộ, 100 họ và 215 giống, chủ yếu là nhóm cá đáy ven bờ và nhóm cá rạn san

hô (283 loài, chiếm 80,63%) Trong đó, đã xác định được 22 loài thuộc bộ cá bơn, thuộc

15 giống, nằm trong 6 họ Nghiên cứu này góp phần cung cấp dữ liệu về thành phần nguồn lợi cá khai thác, đồng thời làm rõ đặc điểm các nghề, mùa vụ khai thác

1.2.3 Tình hình nghiên c ứu di truyền bộ cá bơn

Nghiên cứu của Campbell và cs (2014) lần đầu sử dụng trình tự hệ gen ty thể để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài thuộc bộ cá bơn Nhóm nghiên cứu đã dóng hàng, phân tích sử dụng trình tự hệ gen ty thể của 39 loài thuộc bộ cá bơn và 66

loài cá khác Kết quả của nghiên cứu cho thấy các loài cá bơn không thể hiện tính đồng dạng ở mức độ bộ (Order) Ngoài ra, các loài thuộc phân bộ cá bơn ngộ (Psettodoidei) không thể hiện sự gần gũi về mặt di truyền với các loài khác thuộc bộ cá bơn

Để kiểm tra giả thuyết về tính đồng dạng của bộ cá bơn (Pleuronectiformes), Campbell và cs (2013) phân tích trên 6 vùng gen nhân RAG1, RH, E1, E2B, E3, và MLL từ 25 loài cá bơn, 15 loài thuộc nhóm Carangimorpha và 48 loài thuộc bộ cá vược (Perciformes), sử dụng 2 loài thuộc bộ Beryciformes làm nhóm ngoại Kết quả phân tích cho thấy bộ cá bơn không đồng dạng do các loài thuộc giống Psettodes thuộc một nhánh khác trên cây tiến hóa Ước tính thời gian phân hóa loài dựa trên thuật toán Bayesian kết hợp với dữ liệu hóa thạch suy ra được phân bộ cá bơn vỉ (Pleuronectoidei) đã có từ

73 triệu năm trước, trong khi thời gian phân hóa của các loài thuộc giống Psettodes (được cho là tổ tiên của phân bộ cá bơn vỉ) là từ 77 triệu năm về trước

Trong một nghiên cứu khác, Pardo và cs (2005) đã xây dựng mối quan hệ phát sinh loài của 30 loài cá bơn thuộc 7 họ thu được phần lớn từ vùng bờ biển Galician (Tây Ban Nha) và Brazil dựa trên một phần trình tự của đoạn gen 16S thuộc DNA ty thể Kết quả cho thấy các loài thuộc các họ: Soleidae, Scophthalmidae, Achiridae, Pleuronectidae

và Bothidae đều nằm trên một nhánh đồng dạng (monophyly), riêng các loài thuộc họ Paralichthyidae nằm trên hai nhánh khác nhau, một trong số hai nhánh này có liên hệ với họ Pleuronectidae Kết quả của nghiên cứu góp phần củng cố thêm cho giả thuyết rằng các loài thuộc bộ cá bơn hiện nay đều có nguồn gốc từ một tổ tiên chung

Roje (2010) đưa ra giả thuyết về mối liên hệ giữa các loài cá bơn thuộc họ Pleuronectidae dựa trên phân tích di truyền của 30 loài cá thuộc 22 giống, sử dụng 2 loài thuộc họ Paralichthyidae làm nhóm ngoại trong xây dựng cây phát sinh loài, kết hợp với phân tích đặc điểm hình thái ấu trùng thuộc họ cá này Đối với phân tích mối liên hệ di truyền giữa các loài thuộc họ Pleuronectidae, sử dụng thuật toán Bayesian và Maximum Like-lihood để phân tích trình tự gen RAG2 của nhân, gen ND1 và 16S của ty thể Phân tích về đặc điểm hình thái của ấu trùng cá thuộc họ Pleuronectidae nhằm kiểm tra lại giả thuyết về mối liên hệ di truyền giữa các loài cá bơn sau khi xây dựng cây phát sinh loài Điều này khẳng định lại sự quan trọng của việc phân tích hình thái ấu trùng cá, nó đóng vai trò như bằng chứng để kiểm tra về mối liên hệ di truyền giữa các loài khi kết quả

phân tích thông qua đặc điểm hình thái của cá trưởng thành và thông qua trình tự DNA không thống nhất với nhau

Nghiên cứu của Sharina và Kartavtsev (2010) đã định danh 13 loài thuộc bộ cá bơn (Pleuronectiformes) thuộc 4 họ, thu được từ vịnh Kievka và Vostok (Liên bang Nga), đồng thời cũng xây dựng và phân tích mối quan hệ phát sinh loài giữa chúng bằng cách sử dụng trình tự đoạn gen CO1 mtDNA với 2 loài thuộc bộ cá vược (Perciformes) đóng vai trò làm nhóm ngoại Kết quả phân tích cây phát sinh loài góp phần ủng hộ cho giả thuyết về tính đồng dạng của các họ cá bơn trong nghiên cứu: họ Pleuronectidae, Soleidae, Cynoglossidae và Paralichthyidae Các loài cá đại diện cho các họ và loài có

sự khác biệt rõ rệt về mặt di truyền

Exadactylos và Thorpe (2001) định danh, phân loại 7 loài cá bơn nằm trong 3 họ: Pleuronectidae, Soleidae, Scophthalmidae từ vùng biển đông bắc Đại Tây Dương tới biển Địa Trung Hải Nghiên cứu sử dụng 11 loại enzyme được mã hóa bởi 14 loci từ 17 quần thể để phân tích mối quan hệ di truyền giữa 7 loài cá này Nhìn chung, tất cả các loài đều có sự khác biệt về mặt di truyền và chỉ tương đồng ở một vài allen Kết quả phân tích sự khác biệt về di truyền cho thấy hai loài Pleuronectes platessa và

giống khác (Limanda)

Kartavtsev và cs (2008) đã định danh được 6 loài cá bơn thuộc 3 giống của họ Pleuronectidae thu được tại vùng cực đông của nước Nga dựa vào trình tự của vùng gen CO1 mtDNA, đồng thời xây dựng mối quan hệ phát sinh loài giữa chúng Kết quả nghiên cứu cho thấy các loài thuộc họ Pleuronectidae trong nghiên cứu cùng nằm trên một nhánh đồng dạng Phân tích dữ liệu từ các trình tự nghiên cứu ủng hộ cho quan điểm về

sự phân hóa loài của bộ cá bơn chủ yếu phụ thuộc vào đặc điểm địa lý thông qua tích lũy nhiều đột biến di truyền nhỏ trong thời gian tiến hóa

Potapova và cs (2014) định danh và so sánh trình tự đoạn gen CO1 trong ty thể của hai loài Liopsetta glacialis và Liopsetta pinnifasciata thu tại vịnh Taui thuộc vùng biển Okhotsk (Liên bang Nga) Sự khác biệt về trình tự của 10 cá thể Liopsetta glacialis (π = 0,00370) ít hơn so với sự khác biệt giữa 28 cá thể Liopsetta pinnifasciata (π =

0,00446) Tỷ lệ khác biệt di truyền giữa các cá thể thuộc hai loài cá thân bẹt này phản ánh về tình trạng loài của chúng

Nghiên cứu của Märss và cs (2017) sử dụng các đặc điểm của răng và xương mang

để phân loại hình thái ba loài thuộc bộ cá thân bẹt: Pleuronectes platessa, Platichthys

được so sánh, sự khác nhau giữa chúng là nguồn dữ liệu cho nghiên cứu hình thái và di truyền của bộ cá thân bẹt Đồng thời, kết quả của nghiên cứu giúp tăng thêm sự hiểu biết

về tập tính săn mồi của chúng

1.3 T ổng quan về phương pháp nghiên cứu

Ty thể là bào quan hình cầu, có màng kép gồm màng trong và màng ngoài ty thể Chúng có nhiệm vụ chuyển đổi năng lượng từ các vật chất hữu cơ thành dạng mà các tế bào có thể sử dụng được (Genetics Home Reference, 2018) DNA ty thể (mtDNA) là một hệ gen độc lập có kích thước nhỏ (14 – 42 kb), cấu trúc mạch vòng và nằm trong ty thể, bao gồm 37 gen mã hóa đặc trưng cho 13 mRNA, 2 rRNA và 22 tRNA (Wolstenholme, 1992)

Trong tế bào chứa vài trăm ty thể, mỗi ty thể chứa hàng chục bản sao bộ gen của

nó, vì vậy trong một tế bào có thể chứa được hàng nghìn bản sao của bộ gen ty thể (Taylor và Turnbull, 2005; Galtier và cs, 2009; Budimir và cs, 2014) Điều này khiến cho việc tách chiết DNA ty thể trở nên rất dễ dàng ngay cả với một lượng mẫu nhỏ DNA ty thể có đặc điểm di truyền theo dòng mẹ, vùng mã hóa lớn, không có hiện tượng tái tổ hợp (Dimauro và Davidzon, 2005) Trong khi đó, DNA nhân di truyền từ cả bố và

mẹ thì bị phân ly qua mỗi thế hệ nên việc dò tìm tổ tiên và mối quan hệ di truyền của đoạn DNA nào đó trở nên rất khó khăn Ngoài ra, vùng không mã hóa ở DNA nhân chiếm tới 93%; trong khi ở DNA ty thể, vùng không mã hóa chỉ chiếm 3% (Taylor và Turnbull, 2005) Các vùng không mã hóa này sẽ làm cho quá trình giải trình tự thêm phức tạp vì đôi khi cần phải tạo dòng để thu được đoạn gen mong muốn (Tautz và cs, 2003; Schander và Willassen, 2005) Việc khuyếch đại các đoạn gen của DNA ty thể

chỉ cần một số lượng giới hạn các đoạn mồi (Hebert và cs, 2004) Việc sử dụng DNA ty thể để xác định loài với tỉ lệ thành công trên 95% (Waugh, 2007) Mặt khác, các gen ty thể trong cùng chủng, cùng loài có tính bảo tồn sinh học ở một số gen như gen 16S rRNA, Cytochrome Oxidase subunits 1 (CO1) mtDNA (Mas-Coma và cs, 2009) Nhìn chung, DNA ty thể là công cụ hữu hiệu trong xác định các loài, đánh giá mối quan hệ của các loài với nhau và cung cấp dữ liệu di truyền trong công tác bảo tồn các loài đang

bị đe dọa và có nguy cơ tuyệt chủng (Grande và cs, 2008)

Hình 1.3 DNA ty th ể loài cá Bơn Mắt Lệch (Crossorhombus azureus) bao gồm 37 gen mã hóa đặc trưng cho 22tRNA, 2rRNA và 13 vùng mã hóa protein (Shi và cs, 2013) Mũi tên đỏ chỉ vùng gen CO1 (Cytochrome Oxidase subunits I) được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại

Tuy nhiên, việc sử dụng DNA ty thể cũng có một số giới hạn Kích thước của DNA

ty thể nhỏ, nên chỉ thể hiện một phần vật chất di truyền Tỷ lệ đột biến ở DNA ty thể cao hơn DNA nhân (Brown và cs, 1979), trong khi DNA ty thể lại nhỏ, nên đột biến có thể dễ dàng xảy ra mà không phản ánh được mối quan hệ phát sinh loài hay lịch sử tiến hóa Hơn nữa, việc không tuân theo quy luật di truyền của Mendel không phù hợp với nhiều nghiên cứu di truyền (Wong, 2011) Mặt khác, nghiên cứu di truyền dựa trên một chỉ thị phân tử hoặc trình tự protein riêng lẻ chỉ cho thấy sự tiến hóa của gen mục tiêu

đó và tần số tiến hóa của các gen có thể khác nhau (Anand và Roy, 2014) Các marker

DNA ty thể được sử dụng kết hợp với marker DNA nhân trong một số trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn (Schander và Willassen, 2005).

1.3.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài

Hiện nay, việc sử dụng các chỉ thị phân tử đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài Một số chỉ thị phân tử thường được sử dụng trong nghiên cứu có thể kể đến như: 16S rRNA, 12S rRNA, CO1,…Các phương pháp nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài dựa trên đặc điểm hình thái vẫn được sử dụng rộng rãi cho

dù vẫn còn một số hạn chế Tuy nhiên, việc sử dụng các chỉ thị phân tử vẫn cần phải kết hợp với các đặc điểm hình thái để làm rõ mối quan hệ phát sinh loài (Anand và Roy, 2014)

Đoạn gen 16S rRNA thường được sử dụng trong phân loại vi khuẩn Đây là đoạn gen có tính bảo tồn sinh học, nhưng tần số tiến hóa của nó khác nhau tùy vào loài sinh vật Nhờ tính chất này nên có thể phân biệt các nhóm vi khuẩn dựa trên đoạn gen 16S rRNA (Anand và Roy, 2014)

Đoạn gen 12S rRNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài Đoạn gen này có tính bảo tồn sinh học tương đối, tốc độ tiến hóa chậm hơn so với tốc độ tiến hóa trung bình của các gen ty thể (Palumbi, 1996; Jin và cs, 2013) Ngoài

ra, gen này cũng thích hợp cho việc phân biệt các loài, nghiên cứu quá trình tiến hóa, di truyền quần thể của các loài cá biển (Jin và cs, 2013)

Enzyme cytochrome c oxidase là một protein có mặt trong chuỗi truyền điện tử,

nó được tìm thấy ở màng tế bào vi khuẩn hoặc ty thể Đoạn gen CO1 nằm trên ty thể chịu trách nhiệm mã hóa cho một trong bảy tiểu phần polypeptid của enzyme này (Anand và Roy, 2014) Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở vị trí số 3 trong các chuỗi bộ ba của đoạn gen này cao hơn so với các đoạn gen 12S rRNA và 16S rRNA dẫn tới tỷ lệ đột

biến cao hơn khoảng 3 lần (Knowlton và Weigt, 1998) Trong thực tế, sự thay đổi này

là đủ nhanh để cho phép xảy ra mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các loài và trong cùng một loài Trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài, việc sử dụng đoạn gen CO1 làm chỉ thị mang lại các lợi thế quan trọng so với những đoạn gen mtDNA khác: đoạn gen này được sử dụng phổ biến với nhiều loài động vật (Sharina và Kartavtsev, 2010), cung cấp sự hiểu biết về phân loại cao hơn do sự thay đổi trong chuỗi amino acid chậm hơn các gen ty thể khác dù tỷ lệ thay thế các nucleotide cao hơn (Habeeb và Sanjayan,

2011; Mandal và cs, 2014), chỉ cần sử dụng một đoạn gen ngắn (khoảng 500 – 700 bp)

là có thể phân loại các loài (Kartavtsev và cs, 2008) Vì vậy, đoạn gen CO1 của ty thể được sử dụng trong các nghiên cứu về sự tiến hóa và biến đổi di truyền của sinh vật

1.3.3 Gi ới thiệu về ước tính thời gian phân hóa loài (divergence time) và phương pháp phân tích đồng hồ phân tử (molecular clock)

Ước tính thời gian phân hóa là xác định khoảng thời gian mà các loài phân hóa thông qua dữ liệu sinh học (thường là DNA hoặc Protein), với tham chiếu là thông tin

về hóa thạch Trong việc ước tính thời gian phân hóa loài dựa trên so sánh sự khác biệt giữa các trình tự phân tử, dẫn liệu hóa thạch đóng vai trò là thông tin tối ưu để hiệu chỉnh kết quả tính toán Các trình tự phân tử chỉ cho thấy sự khác biệt/ phân tách về mặt di truyền, trong khi đó thông tin hóa thạch (hoặc các sự thay đổi về mặt địa lý được ghi nhận trong khoảng thời gian tiến hóa) mới có thể suy đoán và ước tính được thời gian phân hóa (Barba-Montoya và cs, 2017) Ước tính chính xác về thời gian phân hóa là rất quan trọng để hiểu được về lịch sử sinh học của sinh vật theo các niên đại địa lý (Heath, 2016) và giải thích mối quan hệ phát sinh loài (Yoo và cs, 2005) Hiện nay, với một số lượng lớn các chuỗi trình tự sinh học, dẫn liệu phân bố địa lý (geographic distributions)

và hóa thạch có khả năng cung cấp nhiều thông tin hữu ích để khảo sát lịch sử tiến hóa của sự sống trên trái đất

Uớc tính thời gian phân hóa loài sử dụng lý thuyết đồng hồ phân tử để thiết lập khung thời gian tiến hóa dựa trên khoảng cách di truyền giữa các loài sinh vật (O’Reilly

và cs, 2015) Đồng hồ phân tử ban đầu là một giả thuyết dự đoán giữa các loài có tồn tại một tần số tiến hóa phân tử không đổi Lý thuyết này đóng vai trò như một công cụ hữu ích nhằm phân tích di truyền, ứng dụng trong ước tính tần số và thời gian tiến hóa từ dữ liệu DNA hoặc protein (Mark, 2012) Tuy nhiên, lý thuyết cổ điển về đồng hồ phân tử vẫn còn hạn chế do tần số tiến hóa có thể khác nhau giữa các sinh vật Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã cải tiến lý thuyết về đồng hồ phân tử, những lý thuyết mới này (“relaxed” molecular clocks) cho phép tần số tiến hóa có thể thay đổi theo một quy luật giữa các loài có mối quan hệ gần gũi về mặt di truyền (Ho, 2008)

 Phương pháp phân tích đồng hồ phân tử (molecular clock)

BEAST (Bayesian evolutionary analysis by sampling trees) là phần mềm tích hợp các nguồn dữ liệu khác nhau này để giải quyết các giả thuyết tiến hóa (Drummond và

Rambaut, 2007) BEAUti là một phần mềm tạo dữ liệu đầu vào cho BEAST (file XML

- eXtensible Markup Language) (Bouckaert và cs, 2014) Các mô hình đồng hồ phân tử được sử dụng trong ước tính thời gian phân hóa sử dụng phần mềm BEAST gồm:

− Strict Clock: Mô hình này giả định rằng các nhánh của cây phát sinh loài đều tiến hóa theo cùng một tỷ lệ nhất định Mô hình này chỉ có một tham số đại diện cho tỷ

lệ giữa độ dài của nhánh cây và thời gian tiến hóa

− Relaxed Clock: Mô hình này giả định rằng các nhánh có thể thay đổi theo một quy luật nhất định Trong phân tích cây phát sinh loài sử dụng BEAST2, mô hình đồng

hồ phân tử này bao gồm hai lựa chọn:

+ Relaxed Clock Log Normal: Mô hình này giả định rằng tần số tiến hóa của từng nhánh trên cây tiến hóa được lấy một cách độc lập từ một phân phối log normal riêng (Drummond và cs, 2006)

+ Relaxed Exponentinal Clock: Mô hình này giả định rằng tần số tiến hóa của từng nhánh trên cây tiến hóa được lấy theo một phân phối cấp số nhân (Drummond

và cs, 2006)

− Random Local Clock: Mô hình này cho phép có sự thay đổi nhất định trong tần

số tiến hóa nhiều hơn mô hình Strict Clock (tần số tiến hóa không đổi) nhưng ít hơn các

mô hình Relaxed Clock (tần số tiến hóa khác nhau giữa các nhánh) (Drummond và Suchard, 2010)

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ khối nghiên cứu trình bày ở Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Thu th ập mẫu cá

Mô tả đặc điểm hình thái

Tách chiết DNA tổng số

Khu ếch đại đoạn gen CO1 mtDNA

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Wizard® SV Genomic DNA Purification System

Thiết bị PCR Bio-Rad

Gi ải trình tự

Xây dựng cây phát sinh loài và ước tính thời gian phân hóa Điện di kiểm tra sản

ph ẩm DNA tổng số

2.2 Thu th ập và định loại các loài cá bơn phổ biến tại Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái

2.2.1 Đối tượng, địa điểm và phương pháp thu mẫu

Các loài cá bơn được thu vào tháng 10/2017 tới tháng 02/2018 dựa trên phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên từ các ngư dân đánh bắt tại vùng biển Khánh Hòa với một cá thể cho mỗi dạng hình thái khác nhau Mẫu sau khi thu được rửa sạch bằng nước ngọt

và mã hóa, tiến hành phân loại sơ bộ bằng hình thái ngay khi mẫu còn tươi Mô cơ cá được cố định trong cồn 95° và bảo quản lạnh ở - 20°C cho các nghiên cứu di truyền

2.2.2 Định loại các loài cá bơn phổ biến dựa vào đặc điểm hình thái

Sau khi thu mẫu, các loài cá bơn được định loại theo các khóa phân loại và mô tả của Carpenter và Niem (2001), Trần Đắc Định và cs (2013), Voronina và cs (2016) Một

số đặc điểm hình thái ngoài (Hình 2.2) được sử dụng để định loại gồm:

− Hình dạng (dạng lưỡi dài, dạng trứng, dạng bầu dục) và hoa văn (nếu có) trên thân

− Vị trí của mắt (bên trái hoặc bên phải thân)

− Xương trước nắp mang (lộ ra bên ngoài hoặc bị che phủ bởi vẩy và da)

− Số lượng, hình dạng và phân bố của đường bên trên thân cá

− Vây đuôi nối liền hay không nối liền với vây lưng và vây hậu môn

− Sự có mặt của vây ngực và vây bụng

Hình 2.2 M ột số đặc điểm hình thái dùng trong định loại cá bơn

(Nguồn: Carpenter và Niem, 2001 - có chỉnh sửa)

− Số lượng các tia vây mềm có trên vây lưng, hậu môn, ngực, bụng, đuôi, số vẩy trên

đường bên ở giữa và số vẩy giữa các đường bên (Hình 2.3) Các chữ cái đầu của tiếng

Anh được dùng để ký hiệu cho các số đếm:

+ D (Dorsal fin): Số lượng tia vây lưng

+ A (Anal fin): Số lượng tia vây hậu môn

+ P1 (Pectoral fin): Số lượng tia vây ngực

+ P2 (Pelvic fin): Số lượng tia vây bụng

+ C (Caudal fin): Số lượng tia vây đuôi

+ ll (Lateral line): Số lượng vẩy trên đường bên ở giữa

+ Sll (Scales between lateral line): Số lượng vẩy giữa các đường bên (nếu có)

2.3 Khu ếch đại và giải trình tự đoạn gen CO1 mtDNA một số loài cá bơn phổ biến tại vùng biển Khánh Hòa

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết từ 30 mg mẫu cơ của từng cá thể cá bơn bằng bộ kit Wizard® SV Genomic DNA Purification System (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Phụ lục A), sau đó bảo quản trong tủ đông - 40°C

2.3.2 Ki ểm tra DNA tổng số

Sản phẩm tách chiết DNA tổng số được điện di trên gel agarose 1,5% nhuộm Ethidium bromide

chứa trong bình tam giác 100 mL, đun sôi trong lò vi sóng cho đến khi gel tan hoàn toàn

Để nguội đến nhiệt độ khoảng 60 – 70°C rồi chuyển qua bình tam giác 100 mL thứ hai Thêm 2 μL Ethidium bromide, lắc nhẹ tránh tạo bọt và trộn đều Ethidium bromide vào gel (hóa chất này độc hại cần tuyệt đối cẩn thận khi thao tác) Đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược (lược 10 giếng hoặc 15 giếng) Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lược ra theo phương thẳng đứng để tránh rách các giếng

Chạy điện di: Cho gel vào bể điện di và thêm đệm TBE 1X cho đến khi ngập bản

gel Dùng micropipette trộn đều 5 μL mẫu với 1 μL loading dye 6X, rồi tra vào các giếng của gel Hút 2 μL DNA Ladder (thang DNA) vào 1 giếng Tiến hành chạy điện di với nguồn điện 90V, 500mA trong 20 phút

Đọc kết quả: Sau khi chạy xong, lấy gel đặt lên bàn UV Transilluminator và xem

các band DNA tổng số dưới tia cực tím

2.3.3 Khu ếch đại đoạn gen CO1 mtDNA bằng phản ứng PCR

Nghiên cứu tiến hành phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen CO1 mtDNA sử dụng cặp mồi FishF1 (5ʹ-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3ʹ) và FishR1 (5′-TAG ACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′) (Ward và cs, 2005) và cặp mồi HCO (5′-TA AACTTCAGGGTGACCAAAAATCA-3′) và LCO (5′-GGTCAACAAATCATAAAG ATATTGG-3′) (Folmer và cs, 1994)

Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25 μL bao gồm các thành phần

được thể hiện ở B ảng 2.1 Phản ứng được chạy trên máy luân nhiệt C1000 Touch (Bio

- Rad) theo chu trình nhiệt độ như sau:

Biến tính ban đầu tại 94°C trong 5 phút; sau đó là 35 chu kỳ của 94°C trong 45 giây, nhiệt độ lai 52°C trong 45 giây (đối với cặp mồi FishF1 – FishR1) hoặc nhiệt độ lai 42°C trong 45 giây (đối với cặp mồi HCO – LCO), 72°C trong 1 phút; cuối cùng là

bước kéo dài tại 72°C trong 5 phút và giữ mẫu ở 4°C (Hình 2.4)

Dream Taq polymerase 5 U/μL

Hình 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi FishF1 - FishR1

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% nhuộm Ethidium bromide Sản phẩm của quá trình khuếch đại là các band có kích thước vào khoảng 700 bp

2.3.4 Gi ải trình tự gen CO1 mtDNA

Sản phẩm PCR được giải trình tự theo nguyên tắc Dye – labelles dideoxy terminator (Big Dye Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt như sau: 96°C trong 20 giây, 50°C trong 20 giây, cuối cùng là 60°C trong 4 phút Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3.700 DNA Analyser (Applied Biosystems)

2.4 Xây d ựng cây phát sinh chủng loại và ước tính thời gian phân hóa loài (divergence time) c ủa cá bơn

2.4.1 Xây d ựng cây phát sinh chủng loại của các loài cá bơn phổ biến tại Khánh Hòa s ử dụng trình tự gen CO1 mtDNA

 K ết nối trình tự:

Các trình tự gen CO1 mtDNA của các loài cá bơn được kết nối sử dụng tính năng ContigExpres thuộc phần mềm VectorNTI (Huang, 1996) Sau đó, các trình tự được kiểm chứng bằng chương trình BLAST Nucleotide trên website của Ngân hàng Gen (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/) Các trình tự được dóng hàng bằng phần mềm BioEdit

72°C, 1 phút 72°C, 5 phút

4°C, ∞

7.0.5.3 (Hall, 1999), sau đó được kiểm tra, xác định mức độ tương đồng và sự khác biệt

di truyền của các loài cá

Sự khác biệt di truyền giữa các cặp trình tự của các loài cá bơn được tính theo công thức như sau:

Sự khác biệt di truyền = Số nucleotide khác biệt

Tổng số nucleotide dóng hàng ×100%

 Xây d ựng cây phát sinh chủng loại của các loài cá bơn

Mối quan hệ phát sinh loài được tiến hành với 16 trình tự gen CO1 mtDNA của các loài cá bơn phân bố ở Khánh Hòa từ nghiên cứu hiện tại và 12 trình tự từ GenBank Thông tin về các trình tự cá bơn được thể hiện ở Bảng 2.2

1 Asterorhombus intermedius Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

2 Asterorhombus cocosensis Nhật Bản AB908989 Katayama và Satoh

3 Crossorhombus cf azureus Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

4 Crossorhombus azureus Trung Quốc KP267582 Li và Lin, 2014

5 Crossorhombus kobensis Mỹ AP014589 Campbell và cs, 2014

6 Engyprosopon cf grandisquama Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

7 Engyprosopon macrolepis Trung Quốc KP266767 Li và Lin, 2014

8 Engyprosopon maldivensis Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

9 Engyprosopon multisquama Trung Quốc KY315400 Xu, 2016

10 Pseudorhombus arsius Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

11 Pseudorhombus oligodon Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

12 Pseudorhombus dupliciocellatus Trung Quốc KJ433562 Si và cs, 2014

13 Pseudorhombus natalensis Canada JF494315 Steinke và cs, 2011

14 Cynoglossus bilineatus Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

15 Cynoglossus feldmanni Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

16 Cynoglossus itinus Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

17 Cynoglossus puncticeps Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

18 Cynoglossus acaudatus Canada JF493312 Steinke và cs, 2011

19 Cynoglossus dubius Ấn Độ FJ347908 Lakra và Verma, 2008

20 Paraplagusia blochii Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

21 Paraplagusia japonica Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

22 Brachirus orientalis Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

23 Brachirus orientalis Trung Quốc KJ433558 Shi và cs, 2014

24 Liachirus melanospilos Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

25 Pardachirus pavoninus Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

26 Pardachirus marmoratus Pháp JQ350177 Hubert và cs, 2012

27 Zebrias quagga Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

28 Zebrias altipinnis Mỹ MH235730 Segura và Tun 2018

Phân tích mối quan hệ phát sinh loài được tiến hành dựa trên thuật toán Maximum Likelihood (ML) sử dụng phần mềm R-Studio (Seefeld và Linder, 2007) Mô hình tiến hóa được kiểm tra bằng Modeltest trong R-studio (Seefeld và Linder, 2007) sử dụng gói

dữ liệu ape (Paradis và cs, 2004; Paradis, 2012; Popescu và cs, 2012), vegan (Oksanen

và cs, 2018), phangorn (Schliep, 2011) trước khi xây dựng cây phát sinh loài Mô hình tối ưu là GTR+G+I dựa trên 24 mô hình tiến hóa với tần suất các base nitơ là A = 0,3191209; C = 0,2869568; G = 0,1213185; T = 0,2726039; tỉ lệ các vị trí không biến đổi là 0,4945325 và thông số dạng phân bố gamma là 0,500721 với giá trị bootstrap (độ tin cậy) (BT) lặp lại 1000 lần

2.4.2 Ước tính thời gian phân hóa (divergence time) của các loài cá bơn

 T ạo dữ liệu đầu vào

Dữ liệu đầu vào để xác định thời gian phân hóa của cá bơn được xác định bằng phần mềm BEAUti (Bouckaert và cs, 2014) Dữ liệu 28 trình tự của các loài cá bơn

(B ảng 2.2) (dạng fasta file) được chuyển sang định dạng nexus file Công cụ Molecular

Clock được sử dụng dựa trên 4 mô hình (Strict Clock, Relaxed Clock Exponential, Relaxed Clock Log Normal, Random Local Clock) để lựa chọn thông số tiến hóa phù hợp nhất Để xác định thời gian phân hóa, mô hình Fossilized Birth Death được áp dụng trong công cụ Time Priors dựa trên dữ liệu hóa thạch xương ốc tai của loài cá bơn từ 53 – 57 triệu năm trước (theo Campbell và cs (2013)) Phân tích sử dụng thuật toán Markov chain Monte Carlo (MCMC) với 10.000.000 thế hệ với tần suất tính toán trên 1000 thế

hệ Dữ liệu đầu ra là file dạng XML (eXtensible Markup Language)

 Ước tính thời gian phân hóa loài

Thời gian phân hóa của các loài cá bơn được ước tính bằng phần mềm BEAST v2.4.8 (Bouckaert và cs, 2014) với thông số mặc định (Heath, 2016) Công cụ Treeannotator v.1.8.4 (Drummond và Rambaut 2007) được áp dụng với giá trị Burn-in phù hợp nhằm loại bỏ cây phân hóa (trong khoảng 10.000 cây thu được) có giá trị không

ổn định, sau đó cây tiến hóa với thời gian phân hóa tối ưu nhất (Maximum clade credibility time tree) được lựa chọn Cây tiến hóa tối ưu được biểu diễn bằng phần mềm R-studio (Seefeld và Linder, 2007) sử dụng gói dữ liệu phytools (Revell, 2012) và strap

(Wills, 1999)

CHƯƠNG 3 K ẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thu th ập và định loại các loài cá bơn phổ biến tại Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái

Sau khi phân tích hình thái, nghiên cứu phát hiện 16 loài cá bơn thuộc 10 giống, 4

họ Danh sách các loài cá bơn được trình bày ở Bảng 3.1

Crossorhombus

(Giống cá bơn mắt lệch) Crossorhombus cf azureus Cá bơn mắt lệch

Paralichthyidae

(Họ cá bơn cát)

Pseudorhombus

(Giống cá bơn hoa vằn)

Paraplagusia

(Giống cá bơn

môi dài)

Zebrias

(Giống cá bơn khoang)

Liachirus

(Giống cá bơn vảy tròn) Liachirus melanospilos Cá bơn vảy tròn

Pardachirus

(Giống cá bơn hoa)

 T ỷ lệ các loài cá xét theo họ

Trong số các họ mà nghiên cứu ghi nhận được thì họ cá bơn lưỡi bò – Cynoglossidae có số loài nhiều nhất với 6 loài (chiếm 37,5%), tiếp đến là họ cá bơn vỉ – Bothidae và họ cá bơn sọc - Soleidae với 4 loài mỗi họ (mỗi họ chiếm 25%) Cuối cùng là họ cá bơn cát – Paralichthyidae với 2 loài (chiếm 12,5%)

 T ỷ lệ các loài cá xét theo giống

Trong số các giống ghi nhận được thì giống cá bơn lưỡi bò – Cynoglossus có số loài nhiều nhất với 4 loài (chiếm 25%), tiếp đến là giống cá bơn trán hẹp –

có một loài (mỗi giống chiếm 6,25%) Tỷ lệ (%) các giống, loài trong các họ thuộc bộ

cá bơn của nghiên cứu hiện tại được thể hiện ở Hình 3.1

Hình 3.1 T ỷ lệ (%) các giống, loài trong thành phần bộ cá bơn thu tại Khánh Hòa

 Nh ận xét

Hầu hết các loài cá bơn (14/16) thu thập và định loại trong nghiên cứu hiện tại được ghi nhận phân bố tại vùng biển miền trung Việt Nam (theo Nguyễn Hữu Phụng,

1999) Riêng loài Engyprosopon maldivensis và loài Paraplagusia japonica được ghi

nhận bởi Voronina và cs (2016) tại Nha Trang

3.2 Đặc điểm hình thái các loài thuộc bộ cá bơn (Pleuronectiformes) thu tại Khánh Hòa

30

10

40

2025

Gi ống

Crossorhombus

1 – Phần giữa hai mắt lõm, rộng, miệng có kích thước trung bình

H ọ Bothidae

1– Cả hai mắt nằm bên trái thân

2 – Xương trước nắp mang hiện rõ

3 – Đường bên cong lên ở vị trí vây ngực

4 – Vây đuôi không nối liền với vây lưng và vây hậu môn

5 – Vây bụng không đối xứng