Nghiên cứu đặc điểm của gen defensin phân lập từ cây đậu xanh (vigna radiata l wilczek)

Sựthiệt hại do chúng gây ra là rất lớn, làm ảnh hưởng đến nền kinh tế quốc dân,do đó công tác phòng trừ sâu mọt đậu nói chung và mọt đậu xanh nói riêngđang là một vấn đề cấp thiết cần đư

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

DEFENSIN PHÂN LẬP

TỪ CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiata L Wilczek)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu và kết quảtrình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳcông trình nào Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, ngày 29 tháng 9 năm 2014

Tác giả luận văn

Phan Hải Cường

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tìnhhướng dẫn để tôi c hoàn thành b Luận văn thạc sĩ Côngnghệ sinh học này.

Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện đại, K –nông n , Trường Đại học Sư phạm - đ ,

tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn các thầy cô Khoa Khoa học sự sống, Trường Đại họcKhoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình

.Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè và đồngnghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Thái Nguyên, ngày 29 tháng 9 năm 2014

Tác giả luận văn

Phan Hải Cường

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

vi MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

3

9

1.2.1 9

11

1.3 DEFE 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

U 22

2.1.1 Vật liệu…… ……….… 22

22

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………24

2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử……… 24

2.2.2 Phương pháp xác định trình tự nucleotide và xử lý số liệu 31

Chương 3 32

DEFENSIN 1 T 32

cDNA DEF 1 33

DEF 1 t 6 33

cDNA DEF1 35

3.3 PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN CỦA GEN DEF 1……… 39

44

44

2 44

45

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ABA Abscisic acid

bp Cặp base

cs Cộng sự

cDNA Complementary DNA (Sợi DNA bổ sung được tổng hợp

từ RNA thông tin nhờ enzym phiên mã ngược)

DEF1 Defensin 1

DEPC diethyl pyrocarbonate

DNA deoxyribosenucleic acid

dNTP deoxynucleoside triphosphate

EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid

E coli Escherichia coli

et al

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kb Kilo base

kGy Kilogray

mRNA messenger ribonucleic acid

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)RNA Ribonucleic Acid

TAE Tris acetat EDTA

VSV Vi sinh vật

X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.

1 2 2 Bảng 2.2 Thành p hần p hản ứng tổ n g h ợp c D NA 2 5

Bảng 2.3 1 2 6 Bảng 2.4 Thành p hần p hản ứng n h ân gen 2 6

Bảng 2.5 Thành p hần p hản ứng gắn gen v ào vector 29

g đ ậ u x a n h V N 6 v à trìn h t ự m an g m ã s ố A Y 4 3 763 9 t r ê n n g â n h à n g g e n Q

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis Linnes trưởng thành và tác hại

của chúng……… 10

2 1 .2 7 Hìn

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] là một loại cây công nghiệp

quan trọng của nền nông nghiệp châu Á, có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao

Về mặt dinh dưỡng, hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng 24%– 28 %), chứa 1,3% lipid, glucid 60 % và các chất khoáng như Ca, Fe, Na Cùng nhiều loại vitamin tan trong nước như A, B1, B2, C Hệ thống rễ câyđậu xanh có những nốt sần ở rễ, trên nốt sần có chứa các vi khuẩn cố địnhđạm giúp tăng giá trị dinh dưỡng cho đất

Ở nước ta, cây đậu xanh là một trong những cây trồng truyền thống, cókhả năng cung cấp dinh dưỡng cao, dễ tiêu hoá, là cây phân xanh, cải tạo đấttrống xói mòn, chính vì vậy cây đậu xanh là một trong ba cây công nghiệpngắn ngày chính, sau lạc, đậu tương Nước ta có nhiều thuận lợi để phát triểnsản xuất nông nghiệp song cũng có nhiều cơ hội tốt để sâu hại phát sinh pháttriển và phá hại nghiêm trọng các loại cây trồng ngoài đồng ruộng cũng nhưtrong kho bảo quản sau thu hoạch Sau khi thu hoạch nếu không có sự bảoquản hoặc bảo quản không tốt sẽ làm nông sản hao hụt rất lớn cả về số lượng

và chất lượng Nguyên nhân dẫn đến sự hao hụt đó là sâu mọt hạt, chúngkhông những làm thiệt hại về số lượng nông sản, làm giảm chất lượng, giảmgiá trị thương phẩm, gây mùi khó chịu, mầu sắc không bình thường mà còn lànguyên nhân ảnh hưởng tới sức khoẻ người tiêu dùng

Hiện nay trong các kho dự trữ đậu đỗ đang bị các loài sâu mọt gây hại

như: Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis (L.), mọt đậu đỏ Bruchus

quadrimaculatus, mọt đậu nành Ancanthoscelides obtectus, mọt đậu tằm Bruchus rufimanus Đặc biệt là Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis (L.)

thuộc họ Bruchid, bộ Coleoptera, đây là loài dịch hại chủ yếu và nguy hiểm.

Chúng không những gây hại trong kho dự trữ mà chúng còn lan truyền và gây

hại cả ở ngoài đồng ruộng Mọt đậu xanh gây hại trên các loại đậu: Đậu xanh,đậu tằm, đậu đũa, đậu Hà Lan, đậu đen trong đó hại nặng nhất là đậu xanh Sựthiệt hại do chúng gây ra là rất lớn, làm ảnh hưởng đến nền kinh tế quốc dân,

do đó công tác phòng trừ sâu mọt đậu nói chung và mọt đậu xanh nói riêngđang là một vấn đề cấp thiết cần được quan tâm nghiên cứu Chính vì vậy,việc chọn tạo các giống đậu xanh có năng suất cao, chất lượng tốt, có khảnăng chống chịu sâu bệnh, côn trùng đáp ứng nhu cầu thực tiễn là nhiệm vụcần thiết đối với ngành chọn giống đậu xanh

Trong những năm gần đây, có một số công trình nghiên cứu về khả năngkháng côn trùng, kháng nấm, kháng virus đã được tiến hành trên một số loạicây trồng khác nhau Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính kháng mọt

hại hạt của cây trồng rất phức tạp và có liên quan đến gen defensin 1 (DEF1).

DEF1 ở thực vật ức chế sự phát triển của một loạt các loại nấm, một số loạivirus, một số loại côn trùng gây hại lương thực Tuy nhiên, các nghiên cứu vềmối liên quan giữa đặc điểm sinh lí, hoá sinh và sinh học phân tử của genDEF1 với khả năng kháng mọt gây hại ở hạt đậu xanh còn ít được công bố

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi lựa chọn và tiến hành nghiên

cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm của gen defensin phân lập từ cây đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek)”.

2 Mục tiêu của đề tài

Xác định được trình tự cDNA DEF1 phân lập từ cây đậu xanh

tạo nguyên liệu phục vụ thiết kế vector chuyển gen kháng mọt ở đậu xanh

3 Nội dung nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh

Nguồn gốc: Đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek), có bộ NST 2n = 22,

là loại cây đậu ăn hạt, thân thảo Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn

Độ, được phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trong đó chủ yếu là ở các

nước Đông và Nam Á Dạng dại của V radiata cũng được tìm thấy ở

Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dương, Đông Phi [14]

Phân loại khoa học của cây đậu xanh:

Giới (regnum): Plantae

Ngành (division): Magnolyophita

Lớp (class): Magnolyopsida

Bộ (order): Fabales

Họ (Familia): Fabaceae

Chi (genus): Vigna

Loài (species): V radiata

Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ Đậu, bao gồm 7 chi phụ:

Vigna, Haydonia, Plactropic, Macrhyncha, Ceratotropic, Lasiospron, Sigmaidotrotopis Đậu xanh theo quan điểm lấy hạt của nhân dân ta bao gồm

các loài thuộc hai chi phụ là Ceratotropic, còn được gọi là nhóm đậu châu Á, bao gồm 16 loài hoang dại và 5 loài trồng trọt là V radiata, V mungo, V.

aconitifolia, V angularis, V umbellata [2].

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học của cây đậu xanh

Cây đậu xanh thuộc loại cây thân thảo, là loại cây trồng cạn thu quả vàhạt bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt

Đặc điểm của rễ

Hệ rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ Rễchính thường ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ănsâu tới 70 - 100 cm Rễ phụ thường gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm

Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu bì rễ biến đổi thành, có vai tròtăng cường sức hút nước và các chất dinh dưỡng cho cây Tuy nhiên, bộ rễcủa cây đậu xanh yếu hơn nhiều so với các cây đậu đỗ khác nên khả năngchịu hạn và chịu úng của cây đậu xanh tương đối kém Nếu bộ rễ phát triểntốt thì bộ lá xanh nâu, cây ra nhiều hoa, quả, hạt mẩy Ngược lại, bộ rễ pháttriển kém thì cây sẽ chóng tàn, các đợt ra hoa sau sẽ khó đậu quả hoặc quả sẽ

bị lép [10], [14] Trên rễ cây họ Đậu có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định

đạm Rhizobium Các nốt sần trên rễ bắt đầu hình thành khi cây có 2 - 3 lá thật

và đạt tối đa khi cây ra hoa rộ Trên mỗi cây có khoảng 10 - 20 nốt sần, tậptrung chủ yếu ở cổ rễ Kích thước của các nốt sần không giống nhau, đườngkính dao động từ 4 - 5 mm, so với đậu tương và lạc thì nốt sần của cây đậuxanh ít và nhỏ hơn Trên các loại rễ thì lớp rễ đầu tiên có nhiều nốt sần, còncác lớp rễ mọc ra từ cổ rễ về sau ít nốt sần hơn Người ta nhận thấy rằngnhững nốt sần hình thành sau khi cây ra hoa (nốt sần thứ cấp) hoạt động mạnhhơn loại nốt sần sinh ra ở nửa đầu thời kỳ sinh trưởng Trung bình mỗi vụ, 1

ha đậu xanh có thể bù lại cho đất tương ứng 85 - 108 kg nitơ làm cho đất tơixốp hơn [11], [12]

Đặc điểm của thân và cành

Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo hình trụ, phân đốt, cao khoảng 40

- 70 cm mọc thẳng đứng, có khi hơi nghiêng Thân đậu xanh nhỏ, tròn, cómàu xanh hoặc màu tím tùy thuộc vào kiểu gen, có một lớp lông màu nâusáng bao bọc Trên thân chia 7 - 8 đốt, ở giữa hai đốt gọi là lóng Độ dài củacác lóng thay đổi tùy theo vị trí trên cây và điều kiện khác Các lóng dài

trung bình có 1 - 5 cành Các cành mọc ra từ các nách lá thứ 2, 3 phát triểnmạnh gọi là cành cấp I, trên mỗi cành này lại có trung bình 2 - 3 mắt, từ cácmắt này mọc ra các chùm hoa Các đốt thứ 4, 5, 6 thường là mọc ra các chùmhoa Thời kỳ trước khi cây có 3 lá chét thì tốc độ tăng trưởng của thân chậm,sau đó mới tăng nhanh dần đến khi ra hoa và hoa rộ, đạt chiều cao tối đa lúc

đã có quả chắc Đường kính trung bình của thân từ 8 - 12 mm và tăng trưởng

tỷ lệ thuận với tốc độ tăng trưởng của chiều cao cây [14]

Đặc điểm của lá

Lá cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách Trên mỗithân chính có 7 - 8 lá thật, chúng xuất hiện sau khi xuất hiện lá mầm và láđơn Lá thật hoàn chỉnh gồm có: lá kèm, cuống lá và phiến lá Cả hai mặt trên

và dưới của lá đều có lông bao phủ Diện tích của các lá tăng dần từ dưới lên,các lá mọc ở giữa thân rồi lại giảm dần lên phía ngọn Chỉ số diện tích lá (m2lá/m2 đất) có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quang hợp và năng suất thu hoạch

Số lượng lá, kích thước, hình dạng và chỉ số diện tích lá thay đổi tuỳ thuộcvào giống, đất trồng và thời vụ [2], [14]

Đặc điểm của hoa

Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, tự thụ phấn, mọc thành chùm to,xếp xen kẽ nhau ở trên cuống Các chùm hoa chỉ phát sinh ra từ các mắt thứ

ba ở trên thân, nhiều nhất là ở mắt thứ tư, còn ở các cành thì tất cả các mắtđều có khả năng ra hoa Thường sau khi cây mọc 18 - 20 ngày thì mầm hoahình thành, sau 35 - 40 ngày thì nở hoa Trong một chùm hoa, từ khi hoa đầutiên nở đến hoa cuối cùng kéo dài 10 - 15 ngày Mỗi chùm hoa dài từ 2 - 10

cm và có từ 10 - 125 hoa Khi mới hình thành hoa có hình cánh bướm, màuxanh tím, khi nở cánh hoa có màu vàng nhạt Hoa đậu xanh thường nở rải rác,các hoa ở thân nở trước, các hoa ở cành nở sau, chậm hơn, có khi còn chậmhơn các chùm hoa cuối cùng ở ngọn cây [14] Trên cùng một cành, các chùmhoa cũng nở chênh lệch nhau có khi đến 10 - 15 ngày Trong một chùm hoacũng vậy, từ khi hoa đầu tiên nở đến hoa cuối cùng có thể chênh lệch 10 - 15

ngày Hoa nở được 24 giờ là tàn, sau khi nở hoa và thụ tinh khoảng 20 ngày làquả chín Số lượng hoa dao động rất lớn, từ 30 đến 280 hoa trên một cây.Công thức hoa là: K5C5A10G1 Thời gian nở hoa chia thành 3 nhóm:

Nhóm ra hoa tập trung: Hoa nở kéo dài 16 ngày

Nhóm ra hoa không tập trung: Hoa nở liên tiếp 30 ngày

Nhóm ra hoa trung gian: Hoa nở từ 16 đến 30 ngày

Đặc điểm của quả

Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặcdạng dẹt với đường kính 4 - 6 mm, dài khoảng 8 - 10 cm, có 2 gân nổi rõ dọchai bên quả, đa số là quả thẳng, có một số hơi cong, khi còn non quả có màuxanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc xám đen, đen gặp nắng dễ bịtách vỏ Một cây trung bình có khoảng 20 - 30 quả, mỗi quả có từ 5 - 10 hạt.Trên vỏ quả được bao phủ một lớp lông mịn Mật độ lông phụ thuộc vào đặcđiểm của giống và khả năng chống chịu của cây Những giống đậu xanhchống chịu bệnh khảm vàng virus và sâu đục quả có mật độ lông dày, vào thời

kì chín hoàn toàn lông trên quả thường rụng đi hoặc tự tiêu biến [1], [2] Cácquả của những lứa hoa đầu lại thường chín chậm hơn các quả ra lứa sau đó,nhưng quả to và hạt mẩy hơn Các quả của những đợt hoa ra sau thường ngắn,

ít hạt, hạt không mẩy, màu hạt cũng nhạt và bé hơn Các quả sinh ra từ cácchùm hoa trên thân nhiều quả và quả to, dài hơn quả của các chùm hoa ởcành Quả đậu xanh chín rải rác, có khi kéo dài đến 20 ngày [11]

Đặc điểm của hạt

Hạt không nội nhũ, phôi cong, hai lá mầm dày, lớn và chứa nhiều chấtdinh dưỡng Hạt gồm vỏ hạt, rốn hạt 2 lá mầm và mầm non Mầm non là nơithu nhỏ của mầm rễ, 2 lá đơn, thân chính và lá kép đầu tiên

Hạt có hình tròn, hình trụ, hình ô van, hình thoi và có nhiều màu sắckhác nhau như: màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc, vàng bóngnằm ngăn cách nhau bằng những vách xốp của quả Ruột hạt màu vàng, xanh,xanh nhạt Hình dạng hạt kết hợp với màu sắc và độ lớn của hạt là chỉ tiêu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ht t p : / / w w w.lr c -tnu e d u.vn/

quan trọng để đánh giá chất lượng của hạt Mỗi quả có từ 8 - 15 hạt Hạt củanhững quả trên thân thường to, mẩy hơn hạt của các quả ở cành Hạt của cácquả lứa đầu cũng to và mẩy hơn các quả lứa sau Số lượng hạt trung bình trongmột quả là một trong những yếu tố chủ yếu tạo thành năng suất của đậu xanh.Trọng lượng hạt của mỗi cây biến động lớn từ 20 - 90 gam tùy giống, thời vụ

và chế độ canh tác Trọng lượng 1000 hạt đậu xanh từ 50 đến 70 gam [1]

1.1.3 Đặc điểm hoá sinh của hạt đậu xanh

Hạt đậu xanh chứa 23 - 28% protein, 1,3% lipid, 56 - 60% glucid, 12%nước, các vitamin B1, B2, C… các muối khoáng như Ca, Na, Fe, K… [14]

Đối với cây trồng thu hạt nói chung và cây đậu xanh nói riêng, đánh giáchất lượng hạt được thực hiện bằng những phân tích thành phần hoá sinhtrong hạt như: hàm lượng protein, lipid, đường, thành phần amino acid, hàmlượng và hoạt độ của các enzyme trong hạt ở giai đoạn nảy mầm Trong đó,hai thành phần quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự nảy mầm của hạt và sựphát triển của cây là protein và lipid

Protein

Protein thực vật nói chung và protein đậu xanh nói riêng là nguồn cungcấp đạm dễ tiêu hoá cho con người và một số vật nuôi Trong hạt đậu xanh,các phân tử protein chiếm khoảng 23 - 28% và được chia thành hai nhóm:nhóm protein đơn giản và nhóm protein phức tạp Trong nhóm protein đơngiản chủ yếu là globulin, chiếm từ 60 - 80%, còn lại là albumin và một số loạikhác Chức năng chính của protein dự trữ là cung cấp amino acid và nitơ choquá trình nảy mầm của hạt Protein đậu xanh có chứa đầy đủ các tính chấtchung nhất của protein [14] Ngoài ra, protein đậu xanh còn có một số tínhchất riêng biệt như khả năng hút nước và dầu tạo nhũ tương, khả năng hoà tantrong nước Đó là một trong những yếu tố quan trọng trong nghiên cứu vàcông nghệ sản xuất các sản phẩm từ đậu xanh

Protein đậu xanh được đánh giá là có chất lượng tốt do có chứa đầy đủcác amino acid không thay thế và hàm lượng của chúng tương đối trùng vớitiêu chuẩn dinh dưỡng dành cho trẻ em do tổ chức nông lương thế giới (FAO)

và tổ chức y tế thế giới (WHO) đưa ra [21]

Lipid

Lipid là những hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không hoà tantrong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ether,petroleum ether, benzen Lipid cũng là thành phần cấu tạo quan trọng củamàng sinh học, là nguồn dự trữ nhiên liệu cung cấp năng lượng cho cơ thể.Lipid cùng với protein và polysaccarid cung cấp năng lượng cho sự nẩy mầmcủa hạt Tuy hàm lượng lipid trong hạt đậu xanh chiếm tỷ lệ thấp (trung bìnhkhoảng 1,3%) [14], nhưng đó lại là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá phẩmchất và khả năng bảo quản hạt

1.1.4 Tầm quan trọng của cây đậu xanh

Cây đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao Hạt đậu xanh lànguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng 23 - 28%), ngoài ra còn có lipid khoảng1,3%, glucid 56 - 60,2% , nước 12% và các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K,P cùng nhiều loại vitamin hoà tan trong nước như vitamin B1, B2, C Protein hạt đậu xanh chứa đầy đủ các amino acid không thay thế như leucine,isoleucine, lysine, methionine, phenylalanine, valine Hạt đậu xanh khôngchỉ phù hợp với nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu

có giá trị Hạt đậu xanh được dùng để chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon,

bổ, hấp dẫn như các loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè, xôi đỗ và một số

đồ uống Lá non và ngọn của cây đậu xanh có thể được dùng để làm rau,muối dưa Thân, lá xanh có thể dùng làm thức ăn cho vật nuôi [1], [2]

Ngoài ra đậu xanh còn có giá trị trong y học, vỏ hạt đậu xanh có vịngọt, mát, không độc nên có tác dụng giải nhiệt, giải bách độc [16]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ht t p : / / w w w.lr c -tnu e d u.vn/

Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất Nhờ hệ

rễ đậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium

có khả năng cố định nitơ từ khí trời, cung cấp một phần đạm cho cây và để lạilượng đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch Vì vậy, đất sau khi trồng đậuxanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [14]

1.2.

mọt gây hại hạt đậu xanh

Đậu xanh có thể bị nhiễm nấm, vi khuẩn, virus ở các giai đoạn sinhtrưởng khác nhau Một số bệnh điển hình có thể gặp là: B ệ nh đ ố m lá đậu xanh

(do nấm Sercostora); Bệnh đốm nâu hại lá đậu xanh (Phyllosticta phaseolina

Sacc); Bệnh lở cổ rễ đậu xanh (do nấm Rhizoctonia solani); B ệ nh gỉ s ắt h ại đậu

tương, đậu xanh ( Uromyc e s a p pen d i cul a t u s s ); Bệnh khảm vàng hại đậu xanh, đậu tương (Bean yellow mosaic virus); B ệ nh khảm l á đậu xan h , đậutương ( S o y bean mos a ic viru s ); Bệnh mọt hại đậu xanh (Callosobruchus

chinensis Linnes) Trong số các bệnh thường gặp ở đậu xanh thì bệnh mọt hại

đậu xanh do Callosobruchus chinensis Linnes gây ra thiệt hại tương đối lớn

[4]

Mọt đậu xanh có tên khoa học là Callosobruchus chinensis

Linnes thuộc họ Bruchidae, bộ Coleoptera Mọt trưởng thành là con đực dài

khoảng 2,5 mm, rộng 1,64 mm còn mọt cái dài 3 mm, rộng 1,8 mm [51], [54].Thân hình bầu dục ngắn, toàn thân màu đen nâu, màu nâu đỏ hay trà nâu, cónhiều lông nhỏ màu đen nâu, màu vàng nâu hay màu trắng xám Ðầu nhỏ,quặp về phía trước Râu đầu mọc ở ngay miệng mép lõm của mắt, râu đầu có

11 đốt, râu con cái hình răng cưa, râu con đực hình quạt lược Gốc râu, thânrâu màu hồng nâu, và càng về phía đầu râu màu càng đậm Ðầu màu nâu tốiđến màu đen, phủ đầy chấm lõm và lông nhung màu vàng kim thưa thớt,mảnh khảnh Mép sau ngực trước ở giữa có 2 khóm lông hình bầu dục dàimàu xám trắng Sống giữa xuyên dọc ở gốc chân môi đến giữa mép sau mắt

Mắt cao và lồi, đoạn trước lõm vào rất sâu, hình chữ U, ngực trước có hìnhchóp cụt bằng đầu, mặt lưng lồi tròn, mép sau lồi ra phía sau, ở phần chínhgiữa của phần gốc có một đôi vật lồi dạng u hình trứng dài, phủ đầy lôngcứng màu trắng sữa dạng phiến Chiều dài của cánh cứng hơi lớn hơn chiềungang, trên mỗi cánh cứng có 10 đường vân chạy thẳng, có nhiều lông màuvàng nâu, màu đen nâu hay màu xám trắng Gốc cánh cứng và đầu cánh cứngđều màu đen nâu, giữa lưng có một con đường vân màu đen chạy ngang, phíatrước và phía sau đường vân đều có mọc nhiều lông nhỏ màu xám trắng Chânmàu nâu vàng, đốt đùi chân sau có 2 đường sống ở phía bụng, có một răng ởphía trước ngọn sống, răng ngoài tù, răng trong dài và thẳng, ngọn tròn [4].

Hình 1.1 Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis Linnes trưởng thành và tác hại

của chúng (Nguồn: FDACS-DPI, Mỹ [54])

Trứng do mọt đẻ ra dài 0,4 - 0,6 mm, hình bầu dục, một đầu bé, mộtđầu to, màu vàng nhạt, không trong và không có ánh Sâu non khi đã lớn dàikhoảng 3,5 mm, màu trắng sữa, hình cong như hình cánh cứng Không cónhững đường tuyến lưng, trên các đốt lưng ở giữa có 2 đường nhỏ chạy ngangnổi lên, ở giữa 2 đường này tạo thành đường máng nhỏ Sâu non tuổi một có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ht t p : / / w w w.lr c -tnu e d u.vn/

chân rất nhỏ, tạm thời không phân đốt, cánh ngực trước có răng tù tròn.Nhộng dài 3 - 3,5 mm, hình bầu dục to và mập, có nhiều lông nhỏ màu vàngnhạt, đầu cong xuống, có vết cánh và chân rõ rệt [4]

Mỗi năm mọt thường sinh 4 - 5 lứa, nếu sống trong điều kiện thích hợpmọt có thể sinh được 8 - 11 lứa Sâu trưởng thành nở ra hơn 1 ngày chui ra từ

1 lỗ tròn Con đực nở ra độ được hơn nửa giờ bắt đầu giao phối, nhưng nóichung là sau 5 giờ rưỡi sau khi giao phối, con cái bắt đầu đẻ trứng Mọt có thể

đẻ trứng trên quả ở ngoài đồng hay trên hạt ở trong kho, có thể đẻ liên tục 2

-3 quả trên cùng 1 hạt Thời kỳ trứng kéo dài 4 - 15 ngày, bình quân 6 ngày.Thời kỳ sâu non kéo dài 13 - 34 ngày Giai đoạn nhộng kéo dài 3 - 18 ngày.Mọt có tính giả chết Mùa đông trung bình con cái sống được 39 ngày, conđực sống 36,4 ngày Mùa hè mọt hay bay bổng ra ngoài kho Ở 220C - 29,50C

và độ ẩm 88 - 100 % phát dục thích hợp nhất, dưới 100C, và trên 370C, mọtkhông có khả năng đẻ trứng [4]

Thời gian thực hiện 1 vòng đời của mọt đậu xanh sai khác nhau rấtnhiều, phụ thuộc vào các yếu tố như độ nhiệt, độ ẩm và thức ăn, thời gian đó

từ 18 - 60 ngày Trong điều kiện hoàn toàn thích hợp, một đời con cái có thể

đẻ được 80 - 100 trứng Có những trường hợp điều kiện không thích hợp, mọt

có thực hiện một vòng đời có thể kéo dài đến 196 ngày Thời gian sống củamọt đậu xanh phụ thuộc rất chặt chẽ vào thức ăn Mọt đậu xanh thuộc loại sâuhại phá hại thời kỳ đầu, nó có thể làm hỏng toàn bộ hạt đậu [4]

Mọt gây hại đậu xanh có mặt khắp thế giới, các vùng trồng đậu xanh ởnước ta đều có loại mọt này Nó ăn hại các loại đậu xanh, đậu tằm, đậu đũa,đậu Hà Lan, đậu tương, đậu biển, hạt sen, Trong đó đậu xanh là bị thiệt hạinặng nhất

Phòng và trị mọt hại đậu xanh trên thế giới

Callosobruchus có thể phòng trừ bằng xử lý xông hơi methyl bromide

hoặc phosphine, mặc dù sự đăng ký sử dụng sản phẩm này ở nhiều khu vực

có thể bị hạn chế hoặc bị cấm Việc bảo quản kín cũng có hiệu quả trong việchạn chế tác hại của loài mọt này

Theo Philips (1994) cho rằng biện pháp hóa học có hiệu quả rất cao đốivới mọt đậu Hiệu quả có thể đạt 90 – 99% với các loại thuốc hóa học thuộcnhóm Lân hữu cơ và Pyrethroid [39]

Trộn hạt với dầu thực vật, tro hoặc lá có mùi thơm, cũng có hiệu quả

trong việc hạn chế tác hại của C chinensis Sản phẩm chiết xuất từ cây có tác dụng hạn chế tác hại của C chinensis và các loài dịch hại thuộc họ Bruchidea

khác [33]

Theo Subramanyan và cộng sự (1985) [44], báo cáo về vai trò của

Bacillus thuringensis đối với phòng trừ các loại ngài thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera) gây hại trong kho Các nghiên cứu được tiến hành tại Mỹ với

các loài như: Plodia interpunctella, Ephestia cautella, E kuehniella và

Sitotroga cerealla Kết quả cho thấy chỉ cần sử dụng chế phẩm này với liều

lượng > 10 mg/kg đã hạn chế được sự gây hại của chúng trong kho ngũ cốc[6]

Theo Adler (2001) [24]; Sabah (2001) [42], thì thực vật làm thay đổi tậptính của côn trùng thông qua việc tạo ra mùi vị hấp dẫn hay xua đuổi Phòngtrừ côn trùng gây hại kho có thể sử dụng các chiết xuất của thực vật và cáchợp chất làm sạch hoặc tổng hợp theo 3 cách:

Dùng mùi vị xua đuổi để ngăn côn trùng ở khu vực xung quanh củahàng hoá đóng gói hoặc xung quanh cửa kho lây nhiễm vào trong kho

Dùng mùi vị hấp dẫn để phát hiện sớm côn trùng gây hại, giám sát kỹthuật phòng trừ hoặc bẫy bả

Các hợp chất độc đối với côn trùng: Hiệu quả của các chiết xuất từ dầuthực vật đối với côn trùng gây hại trong kho là rất tổng hợp Các loài dịch hại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ht t p : / / w w w.lr c -tnu e d u.vn/

khác nhau và các pha phát dục khác nhau của cùng một loài dịch hại có phảnứng không giống nhau đối với chiết xuất nhất định Lượng chất tinh khiếttrong một chất chiết xuất từ thực vật có thể khác nhau phụ thuộc vào điềukiện khí hậu, địa lý và giống cây

Phòng và trị mọt hại đậu xanh ở Việt Nam

Theo Bùi Công Hiển và cộng sự (1989)

Phòng trừ tự nhiên là việc làm giảm quần thể côn trùng bởi các yếu tố

tự nhiên (không do con người), đặc biệt là nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp đến

sự sinh trưởng, phát triển và gây hại của côn trùng (như số lứa trong năm, sốtrứng đẻ hoặc mức độ gây hại) Ẩm độ và nhiệt độ tác động đến cường độ traođổi chất của hàng hoá, bảo quản nên có sự ảnh hưởng trực tiếp đến côn trùnggây hại

Ngoài ra yếu tố địa hình ảnh hưởng trực tiếp đến phân bố cây ký chủ vàcôn trùng gây hại, địa hình có sự tác động đến yếu tố khí hậu (ảnh hưởng đếnlượng mưa, nhiệt độ, độ ẩm tương đối của không khí bên trong và ngoàikho Một yếu tố nữa đó là kẻ thù tự nhiên: có rất nhiều loài sinh vật là kẻ thù

tự nhiên của côn trùng gây hại trong kho như côn trùng ký sinh và bắt mồi, visinh vật gây bệnh, tuyến trùng ký sinh Lợi dụng những yếu tố trên, conngười đã sử dụng nhiều cách khác nhau để lựa chọn khu vực xây dựng khotàng bảo quản (hướng nhà, loại hình kho, cấu trúc kho, biện pháp phòng trừ

và thời gian phòng trừ, để bảo vệ và khuyến khích sự phát triển một cách

trùng gây hại luôn ở dưới ngưỡng gây hại kinh tế

(ii) Phòng trừ bằng biện pháp sinh học

Biện pháp sinh học là biện pháp làm giảm các quần thể côn trùng gâyhại bằng việc sử dụng các sinh vật sống hay các chế phẩm sinh học do conngười tạo ra Tổ chức đấu tranh sinh học quốc tế (IOBC, 1971), định nghĩa:Biện pháp sinh học là sử dụng những sinh vật sống hay các sản phẩm hoạtđộng sống của chúng nhằm ngăn ngừa hoặc làm giảm bớt tác hại do các sinhvật gây ra [13]

Biện pháp sinh học bao gồm các khía cạnh sinh học khác nhau của hệthống sống ảnh hưởng tới quá trình sinh sản, tập tính và chất lượng thức ăncủa côn trùng gây hại Biện pháp sinh học cũng bao gồm việc sử dụng cácchất độc có nguồn gốc tự nhiên, các chất xua đuổi hay dẫn dụ, những chất cóthể sử dụng trong hệ thống phòng trừ tổng hợp côn trùng gây hại trong kho.Biện pháp sinh học tạo ra cơ hội để đấu tranh có hiệu quả chống lại một loàidịch hại riêng biệt mà không gây ảnh hưởng đến các loài dịch hại khác hoặccác loài côn trùng có ích

(iii) Phương pháp phòng trừ bằng cơ học và vật lý

Hiện nay có nhiều quan niệm khác nhau về phòng trừ cơ học và vật lý

Có tác giả cho rằng phòng trừ vật lý là bao gồm cả phòng trừ cơ học, có tácgiả không nhất trí quan điểm này mà tách phòng trừ cơ học thành biện phápriêng

Phòng trừ vật lý là việc làm thay đổi môi trường trong kho bằng cácyếu tố vật lý làm cho bất lợi đối với sự phát triển của côn trùng gây hại hoặckhông cho chúng tiếp cận với hàng hoá bảo quản

Theo Marcos Kogan (1998) [35], đưa ra trên 300 công trình nghiên cứu

chắn vật lý và sử dụng khí trơ.

Sử dụng năng lượng điện tử ở mức nhẹ để phòng trừ mọt, thí nghiệmnày được tiến hành trong phòng thí nghiệm đối với mọt ở các các giai đoạnkhác nhau (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 và 18 ngày tuổi) xử lý ở mức 170 kvtrong vòng 20 phút kết quả cho thấy sự nhạy cảm đối với bức xạ điện tử giảmkhi tuổi của mọt tăng, giai đoạn trứng dễ nhiễm bức xạ điện tử cao nhưngngược lại giai đoạn 18 ngày tuổi thì mọt trưởng thành vẫn hoàn toàn phát triểnđược do vậy để đạt được tỷ lệ chết ở giai đoạn trưởng thành 80 % phải xử lý ởmức năng lượng cao hơn (200 kv tức = 10 kGy) Còn đối với trưởng thànhsống sót còn lại thì ảnh hưởng tới sức đẻ trứng, thời gian sống và những connày không có khả năng hoàn thành chu kỳ sống Đây là một biện pháp rấthiệu quả và an toàn vì nó không ảnh hưởng tới khả năng nẩy mầm của hạtđậu [49], [50]

(iv) Phương pháp bức xạ ion

Nhiều công trình nghiên cứu xác định liều gây chết và gây bất thụ ởcôn trùng gây hại trong kho cho biết liều chiếu 0,5 kGy đã đủ gây bất thụ cho

các loài ngài thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) và ở mức 0,25 kGy đã gây bất thụ cho loài côn trùng cánh cứng (Coleoptera) [6].

(v) Phòng chống bằng thuốc thảo mộc và hoá học.

Thuốc thảo mộc dùng để trừ các loài côn trùng gây hại ở ngoài đồngcũng như trong kho tàng đã được con người biết đến ứng dụng từ rất lâu

Goblob và Webley (1980), đã tổng kết nghiên cứu các kết quả nghiêncứu, thử nghiệm và áp dụng thuốc thảo mộc ở nhiều nơi trên thế giới với cácloài thực vật khác nhau, trong đó việc tạo ra các chế phẩm thuốc thảo mộc từ

cây Neem Ấn Độ (Azadirachta indica), cỏ mạt (Acorus calamus), cây ruốc cá

(Derris spp.), cây thuốc lá, thuốc lào [50].

trong kho là rất tổng hợp Các loài dịch hại khác nhau và các pha phát dụckhác nhau của cùng một loài dịch hại có phản ứng không giống nhau đối vớichiết xuất nhất định Lượng chất tinh khiết trong một chất chiết xuất từ thựcvật có thể khác nhau phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, địa lý và giống cây[42].

Hoá chất mang tích chất thực vật (phytochemicals) được biết đến phổbiến nhất là azadirachtin, chất này được dùng riêng ở dạng thuốc thảo mộchoặc ở dạng hỗn hợp như một thành phần của lá hoặc dạng chiết xuất (dạng

dung dịch hoặc dạng bột) của cây xoan Ấn độ (neem)(Azadirachta indica).

Azadirachtin có tác dụng hạn chế sự đẻ trứng và tiêu diệt côn trùng (sâu non

và trưởng thành) Dầu của cây xoan Ấn độ (Neem) và chất chiết xuất kháchoặc dẫn xuất từ cây neem có thể sử dụng trực tiếp trên hạt [49]

Đánh giá dầu thực vật trừ sâu hại bắt đầu được sử dụng từ những nămđầu của thế kỷ 19 Năm 1927, một công trình nghiên cứu tiến hành tại Mỹ đãghi nhận hạt dầu bông, hạt lanh, hạt thầu dầu có hiệu quả trừ sâu [50]

Hiện nay bệnh do vi sinh vật, côn trùng gây hại chưa có thuốc đặc trị.Tuy nhiên, các biện pháp nêu trên không mang lại hiệu quả cao trong việcphòng trừ đối với bệnh mà lại tốn nhiều thời gian, công sức Vì thế, hướnggiải quyết hiệu quả để chống lại bệnh do mọt gây ra hiện nay là tạo ra nhữnggiống cây trồng nói chung và cây đậu xanh chuyển gen nói riêng có khả năngkháng loại mọt gây hại này

1.3 DEFENSIN GEN DEFENSIN

Carvalho và cs (2011) đã nghiên cứu hoạt tính sinh học của defensins

và ứng dụng trong công nghệ sinh học Defensins thực vật là peptide cationphổ biến ở thực vật và thuộc về một siêu họ lớn của các peptide kháng khuẩnđược tìm thấy trong các sinh vật gọi chung là defensins Cấu trúc chính củapeptide gồm 45-54 amino acid Trong cấu trúc ba chiều, defensins nhỏ và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ht t p : / / w w w.lr c -tnu e d u.vn/

protein ức chế, ảnh hưởng đến chức năng kênh ion, tác động đến hoạt độngcủa α-amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật, làm thay đổi trạng thái oxihoá khử axit ascorbic, vv…[26]

Henrik và cs (2009) đã nghiên cứu sự phát triển và ứng dụng defensins

thực vật Các defensins thực vật được thể hiện trong các cơ quan nội tạngkhác nhau và cung cấp một dòng đầu tiên của defensins chống lại sự tấn côngmầm bệnh Mặc dù tương tác của các defensins thực vật với tác nhân gâybệnh chưa được hiểu rõ, các peptide này có thể được trải rộng trong cây trồngchuyển gen, kết quả là giúp cây có thể chống lại tác nhân gây bệnh Chứcnăng defensins không chỉ giới hạn ở hoạt tính kháng khuẩn, nó còn tham giavào các tín hiệu tế bào và điều hoà sự tăng trưởng [31], [32]

Tavares và cs (2008) đã nghiên cứu các peptide kháng khuẩn từ hoa.Đánh giá này tập trung vào các tác nhân gây bệnh Các peptide cation hoạtđộng đa dạng, bao gồm cả sự ức chế các enzym tiêu hóa và ức chế vi khuẩnhoặc nấm Trong nghiên cứu này, đã so sánh được peptide có cấu trúc bậc 3phân lập từ một số loài hoa Ngoài ra còn nghiên cứu sự tương tác phân tửgiữa các peptide và các tác nhân gây bệnh, trong đó bao gồm vai trò củaprotein màng tế bào và chất béo Các nghiên cứu về các peptide đã góp phầngiúp chúng ta hiểu về cơ chế kháng bệnh giúp tạo cây trồng chuyển gen gópphần cải thiện giống cây trồng tăng sức đề kháng tác nhân gây bệnh [45]

Defensins -Vigna radiata 1 (VrD1) là loại defensin thực vật đầu tiên có hoạt tính trừ sâu (kháng sâu bệnh) được ghi nhận Defensin là

một họ peptide cơ bản và giàu cystein gồm có 45 – 54 amino acid được tìmthấy ở nhiều đối tượng thực vật khác nhau như lúa mỳ, lúa mạch, đậu, cải, lúamiến và đậu xanh Chúng thể hiện hoạt tính kháng đối với diện rộng các nấmgây bệnh thực vật Nhiều defensin có khả năng ức chế α-amylase, trypsin.Cấu trúc ba chiều của defensin thực vật từ nhiều nguồn dữ liệu khác nhau đã

defensin thực vật có chung một dạng kiểu gấp liên quan đến xoắn α và tấmgấp nếp β ba phiến không song song, được giữ ổn định bởi bốn liên kếtdisulfide (ngoại trừ PhD1 có năm), tạo thành dạng cystein ổn định α, β đặctrưng (Csαβ) Đặc biệt là dạng cấu trúc đặc trưng của defensin thực vật cũngđược tìm thấy ở defensin côn trùng, độc tố bò cạp và protein ngọt, brazzein[34].

VrD1 có ở trong hạt đậu xanh có khả năng kháng mọt, bao gồm 46 gốcpeptide với bốn liên kết disulfide VrD1 là chất ức chế mạnh đối với quá trìnhtổng hợp protein, kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn và nấm VrD1 dườngnhư là một loại peptide đa chức chăng; nó thể hiện hoạt tính như là chất trừsâu sinh học, và việc chuyển gen VrD1 để kháng sâu bệnh có thể ứng dụngđối với các cây trồng nông nghiệp quan trọng Trong các defensin thực vật,

VrD1 có trình tự khá tương đồng với chất ức chế α-amylase 2 ở Sorghum

bicolor (SIα2) (45% đồng nhất) Defensin thực vật có thể được chia làm 2

nhóm phụ dựa vào hoạt tính kháng α-amylase sâu bọ: nhóm có khả năng ứcchế α-amylase và nhóm không có khả năng đó α-amylase (EC 3.2.1.1.) đượcphát hiện thấy ở nhiều đối tượng động vật, thực vật, côn trùng và VSV, vàchúng thủy phân liên kết α-1,4 glucose trong các polymer như tinh bột, và dovậy đóng vai trò chính trong trao đổi carbohydrate [34]

VrD1 ức chế α-amylase của Tenebrio molitor, α-amylase có vai trò chủ

yếu trong tiêu hóa tinh bột ở ruột các loài côn trùng, và sự biểu hiện của chất

ức chế này trong đậu chuyển gen sẽ giúp kháng lại sự phá hoại của các loàimọt Kết quả đó cho thấy hoạt tính kháng sâu bệnh của VrD1 có nền tảng cơbản là sự ức chế thủy phân các polysaccharide Khi so sánh trình tự và cấutrúc của hai nhóm defensin thực vật khác nhau, người ta phát hiện ra rằngvùng vòng giữa β2 và β3 có thể là vùng gắn của α-amylase Những kết quảthu được thông qua các thí nghiệm điện toán được sử dụng trong nghiên cứu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ht t p : / / w w w.lr c -tnu e d u.vn/

bệnh của protein VrD1 [34]

VrD1 bộc lộ thành dạng hình cầu gọn có chứa 3 tấm gấp nếp β khôngsong song, một xoắn α, và xoắn 310 Xoắn α (α1) gồm 2 cystein bắt cặp vớicystein của phiến β giữa (β3) của tấm gấp nếp β không song song (Cys19-Cys40, Cys23-Cys42) Hai cầu nối disulfide đó giúp duy trì sự bắt cặp của xoắn

α và tấm gấp nếp β Phiến β2 liên kết với vùng vòng L1 bởi nối disulfide thứ

ba (Cys13-Cys33) Sự hiện diện của ba liên kết disulfide này giúp cấu thànhđặc điểm trung tâm của cấu trúc VrD1, hình thành kiểu mẫu CSαβ Cầu nốidisulfide thứ tư (Cys3-Cys46) giúp kéo gần đầu N và C lại với nhau [34]

Một đặc trưng trong cấu trúc VrD1 đó là xoắn 310 (Glu8-Gly11) So vớicác cấu trúc defensin thực vật đã biết khác, VrD1 là dạng đầu tiên được pháthiện có xoắn 310 Đặc điểm khác biệt nổi bật của VrD1 và các defensin thựcvật khác là sự thay thế Glu26 bảo thủ cao bởi Arg

Defensin thực vật có khả năng ức chế α-amylase, trypsin, và hai hoạttính này liên quan đến cơ chế kháng sâu bệnh Trong quá trình tiến hóa, thựcvật đã sản sinh ra nhiều loại chất ức chế α-amylase, trypsin và một trong số đó

là chất ức chế α-amylase 1 (α –AI1) ở đậu Hà lan (Pisum sativum) chuyển gen

có khả năng kháng hoàn toàn sâu mọt VrD1 không thể hiện hoạt tính khángtrypsin, mặc dù nó có kháng TMA, điều này mở ra triển vọng sử dụng chất ứcchế α-amylase VrD1 trung gian làm cơ sở cho hoạt tính kháng mọt củadefensin này [34]

Chen và cs (2002) đã phân lập gen defensin liên quan đến hoạt động

của côn trùng Tác giả đã phân lập được cDNA giàu protein cysteine(VrCRP) VrCRP được phân lập từ đậu xanh kháng mọt đục hạt VrCRP mãhóa protein dài 73 amino acid, gồm 27 amino acid peptide tín hiệu, có chứa 8cysteine Dựa vào đặc điểm tương đồng và bảo thủ của các gốc ở các aminoacid, người ta cho rằng VrCRP là một thành viên của họ defensin thực vật

xanh) VrCRP là báo cáo đầu tiên về defensin thực hoạt động chống côn trùng

Callosobruchus chinensis [29].

Thomma và cs (2002) đã nghiên cứu defensin thực vật với tác dụng

kháng nấm Đến nay, trình tự của hơn 80 gen defensin thực vật khác nhau từ các loài thực vật khác nhau đã được nghiên cứu Trong cây Arabidopsis

thaliana, có ít nhất 13 gen defensin thực vật [48].

Chen và cs (2004) đã nhân bản và biểu hiện chức năng của defensin 1

đậu xanh VrD1 vào nấm men cDNA của gen defensin phân lập từ đậu xanh đã được biểu hiện trong Pichia pastoris và tạo được defensin tái tổ hợp (rVrD1) VrD1 tái tổ hợp đã biểu hiện ức chế sự phát triển của nấm như Fusarium

oxysporum, Pyricularia oryza, Rhizoctonia solani, Trichophyton rubrum và ấu

trùng mọt Loại protein này cũng ức chế tổng hợp protein trong điều kiện in

vitro Các hoạt tính sinh học đó tương tự như defensin biểu hiện ở vi khuẩn.

Biểu hiện chức năng của VrD1 ở Pichia pastoris đã cung cấp một hệ thống có

tính hữu dụng cao trong nghiên cứu quan hệ giữa cấu trúc và chức năng củaVrD1 sử dụng phương pháp phát sinh đột biến [28]

Loại defensin đậu xanh VrD1 tái tổ hợp đã được chứng minh có hoạttính kháng nấm và kháng mọt Để nghiên cứu chức năng và sự điều hòa củaVrD1, dẫn theo Chen và cs (2005) đã phân lập DNA hệ gen của defensin thực

vật từ Vigna radiata VC6089A và đậu đỏ Vigna angularis DNA của defensin

đậu đỏ VaD1 được giải trình tự và dịch mã ngược thành cDNA VaD1

Defensin VaD1 tinh sạch từ Vigna angularis tương đối đồng nhất Trình tự

amino acid hoàn chỉnh của VaD1 tinh sạch được xác định và hoàn toàn giốngvới trình tự suy diễn từ cDNA VaD1 VaD1 là protein cơ bản gồm 46 aminoacid với bốn cầu nồi disulfide và có độ tương đồng cao với VrD1 (78.3%)

VaD1 có khả năng ức chế sự phát triển của Fusarium oxysporum, Fusarium

oxysporum f sp pisi, Staphylococcus epidermidis và Salmonella