Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên8 ht t p: / /ww w .lr c- tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Nồng độ các hoá chất trong dung dịch đệm tách DNA tổng

Trang 1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN VĂN QUANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NHÂN TẠO ĐỂ LÂY NHIỄM VIRUS GÂY BỆNH XOĂN VÀNG LÁ CÀ CHUA

Chuyên nghành : Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Hải Yến

Thái nguyên tháng 10 - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ht t p: / /ww w .lr c- tnu.edu.vn/

i

Trang 2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ii

ht

t p: / /ww w .lr c- tnu.edu.vn/

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn này là do tôinghiên cứu, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Hải Yến và sự giúp đỡ củacác cộng sự trong nhóm nghiên cứu Các số liệu và kết quả trình bày trong luậnvăn đã được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu, các tài liệutrích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Nguyễn Văn Quang

Trang 3

Thái nguyên, ngày10 tháng 9 năm 2014

Học viên

Nguyễn Văn Quang

Trang 4

4

ht

MỤC LỤC MỤC Trang

MỞ ĐẦU………

1 Đặt vấn đề………

1 1 2 Mục tiêu nghiên cứu……… 2

3 Nội dung nghiên cứu ……… 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 3

1.1 Giới thiệu về cây cà chua và một số bệnh hại cà chua………… 3

1.1.1 Nguồn gốc và Phân loại……… 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học……… 4

1.1.3 Một số bệnh hại cà chua……… 5

1.2 Virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua……… 7

1.2.1 Triệu chứng biểu hiện bệnh……… 7

1.2.2 Phân loại virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua……… 8

1.2.3 Đặc điểm hình thái và cấu tạo………

1.2.4 Đặc điểm lây lan và môi giới truyền bệnh………

8 10 1.2.5 Một số biện pháp phòng bệnh xoăn vàng lá cho cà chua………

1.3 Các phương pháp lây nhiễm TYLCV trong thực nghiệm………

13 16 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu……… 19

2.1.1 Vật liệu thực vật……… 19

Trang 5

5

ht

2.1.2 Chủng vi khuẩn ……… 20

2.1.3 Hoá chất, thiết bị máy móc……… 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 21

2.2.1 Phương pháp lây nhiễm bằng bọ phấn ……… 21

2.2.2 Phương pháp lây nhiễm bằng ghép áp……… 22

2.2.3 Phương pháp lây nhiễm bằng Agro - inoculation ……… 22

2.2.4 Phương pháp quang phổ hấp thụ (đo quang phổ - đo OD)…… 23

2.2.5 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ biểu hiện bệnh……… 23

2.2.6 Phương pháp phân tích sự có mặt của virus TYLCV…………

2.2.6.1 Thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số………

24 24 2.2.6.2 Phương pháp điện di trên gel agarose……… 25

2.2.6.3 Phương pháp PCR nhân gen của TYLCV ……… 26

Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………… 27

3.1 Kết quả tạo nguồn bệnh……… 27

3.1.1 Kết quả lây nhiễm virus trong vườn có nguồn bệnh………… 27

3.1.2 Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của virus trên cây bệnh…… 28

3.2 Kết quả lây nhiễm TYLCV cho cà chua bằng bọ phấn ………… 30

3.3 Kết quả lây nhiễm TYLCV bằng phương pháp ghép cây lành với cây bị bệnh………

3.4 Kết quả lây nhiễm TYLCV bằng Agro - inoculation …………

32 35 3.5 Đánh giá hiệu quả lây nhiễm TYLCV của các phương pháp lây nhiễm nhân tạo……… 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……… 41

1 KẾT LUẬN……… 41

Trang 6

vi

ht

2 ĐỀ NGHỊ……… 41

Trang 7

EDTA

Nghĩa tiếng Anh base pair

Cetyltrimethylammonium BromidCoat protein

Deoxyribonucleic AcidDeoxynucleoside triphosphateEthylene Diamine Tetraacetic

Acid

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction

TYLCV Virus gây bệnh xoăn vàng lá

Trang 8

8

ht

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Nồng độ các hoá chất trong dung dịch đệm tách DNA tổng số 24 2.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen từ mẫu DNA tổng số 26 3.1 27 3.2 Kết quả theo dõi mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua 31

sau lây nhiễm qua bọ phấn

3.3 Kết quả theo dõi mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua 33

sau lây nhiễm bằng ghép áp

3.4 Kết quả giá trị OD ở bước sóng 660 nm của các chủng khuẩn sau 35

nuôi lắc phục vụ thí nghiệm lây nhiễm

3.5 Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh sau lây nhiễm TYLCV bằng 36

Agro- inoculation vào các giống cà chua

3.6 Tổng hợp kết quả theo dõi biểu hiện bệnh trung bình của thí 38

nghiệm lây nhiễm TYLCV vào cây cà chua bằng 3 phương pháp

Trang 9

9

ht

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang

1.1 Sơ đồ cấu trúc genome của TYLCV 9

1.2 Chu kỳ sinh trưởng của bọ phấn (Bemisia tabaci) 11

2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 21

2.2 Các mức độ biểu hiện bệnh xoăn vàng lá cà chua 24

3.1 Hình ảnh cây cà chua bị bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV trồng 27

tại vườn có nguồn bệnh sau 50 ngày 3.2 Kết quả điện di sản phẩm tách DNA tổng số của một số dòng cà 28

chua nhiễm bệnh 3.3 Kết quả PCR kiểm tra gen CP của TYLCV trong các mẫu cà chua 29

nhiễm bệnh 3.4 Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV kiểm tra sự có mặt của 32

virus trong các dòng cây thí nghiệm sau lây nhiễm bằng bọ phấn 3.5 Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV kiểm tra sự có mặt của 34

virus trong các dòng cây thí nghiệm sau lây nhiễm bằng phương pháp ghép 3.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra TYLCV sau 10 ngày lây 37

nhiễm bằng Agro- inoculation 3.7 Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra TYLCV sau 50 ngày lây 37

nhiễm bằng Agro- inoculation

Trang 10

10

ht

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Tên đề tài: “Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus

gây bệnh xoăn vàng lá cà chua”.

2 Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hải Yến

3 Người thực hiện: Nguyễn Văn Quang

4 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm được phương pháp lây nhiễm virus TYLCV phù hợp để lây bệnh cho

cà chua nhằm tạo phương pháp chuẩn để đánh giá khả năng kháng virus này cho

cà chua trong điều kiện nhà lưới và vườn thí nghiệm

5 Nội dung nghiên cứu

1 Thu thập các giống cà chua mẫn cảm với virus, kháng tự nhiên với virus

3 Tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo cho cà chua

4 Theo dõi và phân tích kết quả, đánh giá mức độ biểu hiện bệnh sau khi lây

nhiễm

5 Đưa ra quy trình lây nhiễm nhân tạo virus TYLCV cho cà chua

6 Kết quả nghiên cứu

(1) Thu thập giống cà chua phục vụ thí nghiệm:

+ Giống PT 18 do viện rau quả Việt Nam cung cấp Cà chua PT18 có chiềucao trung bình 80 – 100 cm, dạng cây gọn, màu lá xanh nhạt, phân cành ít, sinhtrưởng hữu hạn PT18 là giống khá mẫn cảm với bệnh xoăn vàng lá do TYLCV.+ Giống F1 GM - 2008, là giống nhập nội có nguồn gốc từ Pháp Quả của F1

GM 2008 có dạng tròn dẹt, chín có màu đỏ tươi, thịt dày, rắn chắc F1 GM

-2008 sinh trưởng hữu hạn, chịu lạnh và nóng rất tốt, giống F1 GM2008 được laitạo theo hướng kháng bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV

Trang 11

130 cm,

nhiều hoa, sai quả, được chọn tạo theo hướng kháng virus TYLCV

(2) T được 63 dòng cây bị bệnh trong tổng số 75 cây

Các dòng cây bệnh đã được kiểm tra sự có mặt của TYLCV bằng phương pháp PCR với cặp mồi pRV 324N/pRC889N

(3) Đã tiến hành lây nhiễm thành công virus TYLCV trên 3 giống cà chua PT18,

GM - 2008, DV - 2962 bằng 3 phương pháp : (i) phương pháp ghép áp giữa cây

lành với cây bệnh, (ii) phương pháp nuôi thả bọ phấn, (iii) Lây nhiễm bằng Agro

- inoculation.

(4) Đã đưa ra 01 quy trình lây nhiễm nhân tạo virus TYLCV cho cà chua phùhợp trong điều kiện phòng thí nghiệm là phương pháp ghép áp giữa cây lành vớicây bệnh, có thể áp dụng trong thực nghiệm để đánh giá khả năng kháng virusTYLCV của các giống cà chua

Trang 12

1 ht t p: / /ww w .lr c- tnu.edu.vn/

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây cà chua (Lycopersicon esculentum) là loại cây trồng phổ biến hiện nay,

quả cà chua chín là loại thực phẩm giàu dinh dưỡng và vitamin, được con người sửdụng thường xuyên Cà chua dễ trồng, chi phí đầu tư ban đầu thấp, là loại cây thíchứng với nhiều điều kiện sinh thái khác nhau, thời gian từ khi trồng đến thu hoạchngắn, do vậy có thể mở rộng sản xuất ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới

Cũng như các cây trồng khác, các giống cà chua đang trồng ở trên thế giới vàViệt Nam bị tấn công bởi các loại sâu bệnh như nấm, côn trùng, vi khuẩn và đặcbiệt là virus Trong số bệnh virus hại cà chua ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới,bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV gây nên được xem là bệnh gây hậu quả nghiêmtrọng nhất [17], [21] Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá trên cà chua với tỉ lệ nhiễmbệnh trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có khi tới 100% TYLCV là loài

virus thuộc chi Begomovirus, họ Geminividae và chúng chỉ truyền nhiễm vào cây thông qua vector truyền bệnh là bọ phấn Bemisia tabaci một cách nhanh chóng và

liên tục dẫn đến bùng phát thành dịch bệnh [7], [9] Sự kiểm soát bệnh TYLCV ởcác vùng trồng cà chua chú trọng chính vào sự kiểm soát bọ phấn bằng các loạithuốc hóa học tiêu diệt côn trùng hoặc các bẫy bắt, các rào cản vật lý nhưlưới chắn bọ phấn… Tuy nhiên, các phương pháp kiểm soát bệnh TYLCV vừa nêugây tốn kém về kinh phí và sức lực con người trong sản xuất, hơn nữa còn gây ônhiễm môi trường và tích lũy độc tính trong quả vì sử dụng thuốc trừ sâu hóa họcđộc hại diệt bọ phấn [26]

Biện pháp hiệu quả nhất để phòng, chống virus là sử dụng giống cà chuakháng virus, trong thực tế hiện nay các giống tự nhiên kháng virus không nhiều vìvậy các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen để tạo các giống có khả

Trang 13

năng kháng virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua để đưa vào sản xuất Tuy nhiên,

để đánh giá các dòng cây tạo ra có kháng được với virus hay không thì công việclây nhiễm virus để kiểm tra khả năng kháng là rất quan trọng Virus gây bệnh xoănvàng lá cà chua không truyền qua hạt giống, qua hạt, đất, qua va chạm cơ họcnhưng lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn Dựa trên đặc điểm lan truyền củaTYLCV, các nhà khoa học cũng đã đề xuất một số phương pháp để lây nhiễmTYLCV cho cà chua, tuy nhiên vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu một cách hệthống

Xuất phát từ thực tiễn và cơ sở lý luận trên chúng tôi thực hiện nghiên cứu

đề tài là “Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua” Nhằm phục vụ trong nghiên cứu, đánh giá khả năng kháng

virus TYLCV ở cà chua

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được phương pháp lây nhiễm virus TYLCV cho cà chua trồngtrong điều kiện nhà lưới và vườn thí nghiệm, nhằm tạo phương pháp chuẩn để đánhgiá khả năng kháng virus này cho cà chua

3 Nội dung nghiên cứu

1 Thu thập các giống cà chua mẫn cảm với virus, kháng tự nhiên với virus

3 Tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo cho cà chua

4 Theo dõi và phân tích kết quả, đánh giá mức độ biểu hiện bệnh sau khi lây

nhiễm

5 Đưa ra 01 quy trình lây nhiễm virus TYLCV cho cà chua

Trang 14

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây cà chua và một số bệnh hại cà chua

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cà chua (Lycopersicon esculentum L.) có bộ nhiễm sắc thể 2n = 24 và đa số

chúng là cây tự thụ phấn Cà chua có nguồn gốc từ Nam mỹ (Bolivia, Chile,Colombia, Peru) [19] Những loài cà chua hoang dại gần gũi với loài cà chua trồnghiện nay vẫn tìm thấy ở dọc dãy núi Andes (Peru), đảo Galapagos (Ecuado) vàBolivia Từ thế kỷ 16 cà chua đã được trồng ở Châu Âu, sau đó lan sang các vùngkhác như Trung Quốc và Đông Nam Á (thế kỷ 17), Nhật Bản (thế kỷ 18) Đến thế kỷ

18, nhiều vùng trên thế giới trồng cà chua làm thực phẩm và giống cà chua đã trởnên phong phú và đa dạng Vào đầu thế kỷ 19, quả cà chua đã trở thành loại thựcphẩm phổ biến và quen thuộc của con người Đến cuối thế kỷ 19 cà chua được đưavào trồng ở nước ta ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và một số tỉnh vùng cao

Cà chua thuộc họ cà (Solanaceae), bộ cà (Solanales), phân lớp cúc(Asteridae), lớp ngọc lan (Magnoliosida) [40], [31] Từ lâu đã có nhiều tác giảnghiên cứu về phân loại cà chua và thành lập hệ thống phân loại theo quan điểmcủa riêng mình Theo hệ thống phân loại của Muller (1940) thì cà chua trồng hiện

nay thuộc chi phụ Eulycopersion C.H.Muller Tác giả phân loại chi phụ thành 7 loài, loài trồng hiện nay (Lycopersicon esculentum) thuộc loài thứ nhất Theo Nonnecke(1989) thì L esculentum là loài cà chua trồng có 4 chủng chính (1) L esculentum var Commune bao gồm hầu hết những giống cà chua hiện nay với đặc điểm là lá rậm, quả có khối lượng trung bình lớn; (2) L esculentum var Grandiolium có đặc điểm lá rộng và láng bóng, số lá trên cây ít; (3) L esculentum var Validium là cà chua anh đào với thân đứng mập và (4) L esculentum var Pyriforme là cà chua quả lê.

Trang 15

1.1.2 Đặc điểm sinh học

Đặc điểm bộ rễ cà chua là rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năngphát triển rễ phụ rất lớn Trong điều kiện thuận lợi nhất những giống tăng trưởngmạnh có rễ ăn sâu 100 - 150 cm và rộng 150 - 250 cm Vì vậy cà chua chịu hạn tốt

Bộ rễ ăn sâu, mạnh hay yếu đều có liên quan đến mức độ phân cành và phát triểncủa bộ phận trên mặt đất, do đó khi trồng cà chua tỉa cành, bấm ngọn, bộ rễ thường

ăn nông và hẹp hơn so với điều kiện trồng tự nhiên

Cây cà chua có thân tròn, thẳng đứng, mọng nước, phủ nhiều lông, khi câylớn gốc thân dần dần hóa gỗ Thân mang lá và phát hoa ở nách lá là chồi nách Chồinách ở các vị trí khác nhau có tốc độ sinh trưởng và phát dục khác nhau, thườngchồi nách ở ngay dưới chùm hoa thứ nhất, có khả năng tăng trưởng mạnh và phátdục sớm so với các chồi nách gần gốc Tùy khả năng sinh trưởng và phân nhánh màcác giống cà chua được chia làm 4 dạng là: (1) Dạng sinh trưởng hữu hạn

(determinate) (2 ) Dạng sinh trưởng vô hạn (indeterminate) (3) Dạng sinh trưởng bán hữu hạn (semideterminate) (4) Dạng lùn (dwart)

Lá thuộc lá kép lông chim lẻ, mỗi lá có 3 - 4 đôi lá chét, rìa lá chét đều córăng cưa nông hay sâu tùy giống Phiến lá thường phủ lông tơ Đặc tính lá củagiống thường thể hiện đầy đủ sau khi cây có chùm hoa đầu tiên

Hoa mọc thành chùm, lưỡng tính, tự thụ phấn là chính Sự thụ phấn chéo ở càchua khó xảy ra vì hoa cà chua tiết nhiều tiết tố chứa các alkaloid độc nên khônghấp dẫn côn trùng và hạt phấn nặng không bay xa được Số lượng hoa trên chùmthay đổi tùy giống và thời tiết, thường từ 5 - 20 hoa

Quả cà chua thuộc loại mọng nước, có hình dạng thay đổi từ tròn, bầu dục đếndài Vỏ quả có thể nhẵn hay có khía Màu sắc của quả thay đổi tùy giống và điềukiện thời tiết Thường màu sắc quả là màu phối hợp giữa màu vỏ và thịt quả

Trang 16

Cà chua là loại cây thân thảo, ngắn ngày sinh trưởng hàng năm, ưa khí hậu

ấm áp và ánh sáng đầy đủ Đủ ánh sáng cây mới sinh trưởng phát triển tốt nhất Càchua sinh trưởng, phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ trung bình từ 22oC –

26oC Nếu nhiệt độ trên 35oC cây ngừng sinh trưởng, khi nhiệt độ xuống dưới 10oC

cà chua không ra hoa [38] Cà chua có khả năng chịu hạn song trong quá trình sinhtrưởng, phát triển cà chua cần một lượng nước lớn do vậy khi trồng cần phải đượctưới nhiều nước, thiếu nước cây sẽ ít hoa và dễ rụng quả [ 32]

1.1.3 Một số bệnh hại cà chua

- Bệnh mốc sương (Phytophtaora infestans)

Bệnh mốc sương gây ra do một loại nấm có tên là Phytophtaora infestans.

Đây là loài nấm ký sinh chuyên tính có khả năng hình thành nhiều chủng khácnhau Nấm gồm 16 chủng trong đó có cả các chủng đơn và chủng hỗn hợp tuynhiên số lượng chủng nấm thay đổi tuỳ khu vực sinh thái trồng trọt hoặc ở từngnước khác nhau Bệnh mốc sương thường phát triển trong điều kiện nhiệt độ từ 15 -

22oC, thích hợp nhất là 18 - 20oC và độ ẩm không khí cao Độ ẩm thấp nhất chonấm phát triển là 76%, có ý kiến cho là 65%, độ ẩm càng cao bệnh lây lan và gâyhại càng mạnh Trong điều kiện thiếu ánh sáng, trời âm u, mưa phùn càng tạo điềukiện thuận lợi cho nấm phát triển Bệnh thường xuất hiện đầu tiên ở mép chóp látạo vết xám xanh nhạt sau đó lan rộng vào phiến lá Phần giữa vết bệnh chuyểnmàu đen và xung quanh vết bệnh thường có cành bào tử màu trắng xốp bao phủgiống một lớp mốc trắng như sương muối làm cho lá chết lụi nhanh chóng, bệnhcũng xuất hiện ở cuống lá, cành và thân [38]

- Bệnh héo xanh vi khuẩn (Pseudomonas solanacearum

Smith)

Bệnh gây hại nghiêm trọng đối với cây cà chua ở các vùng trồng cà chua ởViệt Nam, các vùng nhiệt đới, bán nhiệt đới và những vùng trên thế giới có khí hậu

Trang 17

ấm áp Bệnh phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 26oC - 30oC, bệnh thích nghi độ pHtrong phạm vi tương đối rộng, độ pH thích hợp cho bệnh phát triển từ 6,8 - 7,2,bệnh phát triển mạnh ở những chân đất cao, đất vàn, trên những chân ruộng luâncanh với cây trồng cạn, đặc biệt là cây họ cà Bệnh héo xanh thường thể hiện triệuchứng ngay sau khi vi khuẩn xâm nhập vào rễ hoặc phần thân sát mặt đất Vi khuẩngây bệnh héo xanh là loài đa thực có phổ ký chủ rộng, có thể xâm nhiễm, ký sinhgây hại trên nhiều họ cây trồng khác nhau, đặc biệt trên các cây trồng thuộc họ cà,

họ đậu, họ bầu bí Vi khuẩn có thể sống trong đất từ 5 - 6 năm, trên các bộ phậncủa cây vi khuẩn này có thể tồn tại từ 6 - 7 tháng còn nếu bám dính trên bề mặt hạtchỉ tồn tại 2 ngày Vi khuẩn xâm nhiễm qua những vết thương trên cây, lan truyềnnhờ nước và côn trùng Vi khuẩn gây hại ở tất cả các thời kỳ sinh trưởng phát triểncủa cây, nhưng nghiêm trọng nhất là thời kỳ hoa và đậu quả

Hiện nay, chưa có loại thuốc đặc hiệu để phòng trừ loại bệnh này, nên khibệnh hại xâm nhiễm đã gây ra tổn thất lớn cho sản xuất Biện pháp phòng trừ chủyếu là thông qua biện pháp canh tác

- Bệnh đốm nâu (Alternaria solani)

Bệnh do nấm gây hại ở hầu hết các vùng trồng cà chua có khí hậu nhiệt đới.Nấm phá hại thân, lá, hoa, quả Triệu chứng bệnh là những đốm nâu, gồm nhữngvòng tròn đồng tâm trên những lá già và những vết lõm màu nâu tối ở trên thân, khicây bị bệnh hại nặng thì quả cũng bị hại Bệnh phát triển nhanh trong điều kiện thờitiết nóng ẩm Nếu phòng trừ không kịp thời, toàn bộ cây sẽ bị khô chết như bị đốtcháy Phòng trừ bằng kỹ thuật canh tác tổng hợp Khi cây bị bệnh cần tăng cườngchăm sóc, bón thúc Thực hiện luân canh, vệ sinh đồng ruộng

- Bệnh héo vàng (Fusarium oxysporiumf sp Lyco-perisici)

Trang 18

Nguồn bệnh cư trú trong đất, xâm nhập vào cây qua bộ rễ Bệnh phát triểnmạnh ở nhiệt độ cao 28oC Triệu chứng của bệnh đầu là những lá ở dưới thấp bịvàng, héo, sau đó lây lan sang lá non và hoa Toàn bộ bó mạch ở hệ rễ bị biến đổithành màu nâu và cây bị chết Có thể phòng bệnh bằng cách coi trọng công tác vệsinh đồng ruộng, luân canh triệt để, xử lý đất Khi bệnh phát triển mạnh có thểdùng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây Khi dùng thuốc phải tuân thủ sự hướngdẫn của ngành bảo vệ thực vật

- Bệnh xoăn lá do virus

Bệnh do virus gây hại cà chua và gồm rất nhiều loại, thuộc nhóm

Germinivirus Bệnh có triệu chứng xoăn ngọn lá, những cây bị bệnh hại sinh

trưởng, phát triển kém, thường không cho quả Vì vậy gây tổn thất nghiêm trọngđến năng suất, có khi không cho thu hoạch Đặc biệt từ sau khi trồng đến thời kỳ rahoa, cây bị hại sẽ làm giảm khối lượng quả rất lớn Ở Việt Nam, bệnh xoăn lá càchua phát triển mạnh trong vụ cà chua sớm và vụ xuân hè khi nhiệt độ không khí từ

25 - 30oC, độ ẩm trên 70%

1.2 Virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua

1.2.1 Triệu chứng biểu hiện bệnh

Bệnh do virus thuộc nhóm Geminivirus gây hại cà chua ở những vùng nhiệt

đới Virus thường gây ra triệu trứng xoăn lá, nhất là ngọn xoăn rất mạnh Lá códạng xoắn vào trong, cây lùn thấp, mặt lá thường bị khảm đốm vàng Những cây bịbệnh, sinh trưởng phát triển kém, thường không cho quả

Bệnh xoăn lá do virus có thể gây nhầm lẫn với một số tình trạng bệnh càchua khác như: nụ hoa cà chua lớn, cà chua vàng trên đầu, bệnh xoăn lá sinh lý vàbệnh thiếu phosphate và magie Bệnh nụ hoa cà chua lớn có thể phân biệt được vì

nó làm cho hoa có màu xanh lá cây Bệnh vàng đầu cà chua có biểu hiện là chỗ lánon có kích thước nhỏ và tròn, mép lá cong lên hoặc cong xuống Bệnh xoăn lá

Trang 19

sinh lý do áp lực nước làm cây còi cọc và mô lá non phát triển mềm chứ khôngcứng Thiếu phosphate làm cho cây cứng, nhuộm màu hơi tím và các bộ phận củacây nhỏ lại Thiếu magie làm vàng những gân lá ở giữa và dưới thân cây [27]

Biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu là thực hiện nghiêm ngặt chế độ luâncanh, không trồng cà chua trên ruộng mà vụ trước đã trồng cây họ cà Vệ sinh đồngruộng kỹ trước khi làm đất, gieo trồng Khi phát hiện cây bị bệnh phải nhổ bỏ Khichăm sóc chú ý tránh tác động mạnh làm lây lan bệnh Khi trồng vụ sớm nên chọncác giống có đặc tính kháng bệnh cao Ngoài ra, cần thiết phải diệt bọ phấn truyềnvirus [9]

1.2.2 Phân loại virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua

Theo hệ thống phân loại virus quốc tế (ICTV) năm 2013, TYLCV thuộc chi

Begomovirus, họ Geminiviridae Họ này có 7 chi bao gồm Begomovirus (288 loài), Curtovirus (3 loài), Eragrovirus (1 loài), Mastrevirus (29 loài), Topocuvirus (1 loài), Turncurtovirus (1 loài) và Becurtovirus (2 loài) Geminiviridae là họ virus gây bệnh thực vật lớn thứ hai với 325 loài Begomovirus là chi lớn nhất trong họ chủ yếu được lan truyền thông qua vector truyền bệnh là loài bọ phấn Bemisia tabaci [15], [29].

1.2.3 Đặc điểm hình thái và cấu tạo

TYLCV có dạng hình chày, hạt virion luôn ở dạng cầu ghép đôi với kíchthước trung bình xấp xỉ 20 × 30 nm Lớp vỏ protein có trọng lượng khoảng

28 – 34 × 103 đvC gồm 22 capsome giống nhau, mỗi capsome gồm có 5 phân tửprotein [18], [38] Những loài TYLCV phát hiện trước đây có hệ gen gồm các gentrùm nằm trên cùng một vòng DNA – A sợi đơn kích thước khoảng 2,8 kb (thểmonopartite) Sau đó, người ta phát hiện nhiều chủng virus có hệ gen gồm hai vòngDNA sợi đơn tách biệt với kích thước xấp xỉ nhau khoảng 2,5 – 3,0 kb là DNA – A

và DNA – B (thể bipartite) Gần đây, người ta còn phát hiện một số loài thuộc

Trang 20

nhóm một vòng gen ngoài vòng DNA – A còn có một hoặc hai vòng DNA vệ tinh(DNAβ và DNAα) với kích thước xấp xỉ một nửa DNA – A có tác dụng tăngcường tái bản hệ gen virus và biểu hiện triệu chứng bệnh trên cây chủ [6], [10],[15], [23]

Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc genome của TYLCV

Hệ gen của TYLCV gồm 6 gen chức năng đó là gen CP (V1), prepCP (V1),C1, C2, C3, C4 Các gen trong hệ gen của TYLCV có thể nằm trên cùng một vòngDNA – A hoặc hai vòng DNA – A và DNA – B riêng biệt ngăn cách với nhau bởimột vùng liên gen (IR – intergenic region) có độ dài khoảng 200 nucleotide Trênvùng IR đó có chứa điểm khởi đầu sao chép và vùng điều khiển cho sự tái bản vònggen virus theo cả hai hướng Dạng trình tự điển hình nhất trong vùng IR là hai trình

tự bảo thủ lặp lại đảo ngược của TAATATT/AC được định vị trên một cấu trúcvòng (stem – loop) có liên quan tới việc tái bản sợi DNA mới và một trình tự lặp lạicần thiết cho việc nhận biết và bám vào của protein Rep (Replication) trong quátrình phiên mã [18], [25]

Các chủng Begomovirus monopartite ngoài vòng DNA – A có thể có một hoặc

hai vòng DNA sợi đơn với kích thước xấp xỉ một nửa DNA – A được gọi là DNA

Trang 21

vệ tinh (gồm DNAβ và DNAα) DNA vệ tinh được phát hiện lần đầu tiên trongchủng virus gây bệnh xoăn lá cà chua (TLCV) phân lập từ phía bắc Australia vàonăm 1997 với kích thước khoảng 682 nucleotide đó là ToLCV – sat [20]

Vòng DNAβ có kích thước xấp xỉ khoảng 1360 nucleotide, trình tự nucleotidekhá bảo thủ Trên đó bao gồm một vùng giàu adenin (A – rich region), một vùng vệtinh (SCR – Satelite conserved region) và một trình tự đọc mở (ORF) trên sợi bổsung mã hóa cho protein βC1 Vùng SCR chứa cấu trúc vòng (stem – loop) mangđoạn trình tự khởi đầu tái bản TAATATT/AC giống như vùng liên gen (IR) củaDNA – A Chức năng của vòng DNAβ được cho là góp phần làm tăng cường biểuhiện triệu chứng bệnh bằng cách làm bất hoạt gen của cây chủ hoặc thuận lợi choviệc mở rộng phạm vi lây nhiễm

DNAα cũng giống như DNAβ có trình tự rất bảo thủ trong đó có chứa mộtkhung đọc mở mã hóa cho protein tái bản (Rep), một trình tự giàu Adenin và mộtđiểm khởi đầu tái bản nằm trên cấu trúc vòng (stem – loop) chứa trình tự bảo thủTAATATT/AC giống như những nanovirus khác DNAα có khả năng tự tái bảnnhưng cần sự trợ giúp của virus trong quá trình biểu hiện và vận chuyển trong câychủ DNAα hiện chưa xác định là có ảnh hưởng lên sự biểu hiện bệnh ở cây chủ[16]

1.2.4 Đặc điểm lây lan và môi giới truyền bệnh

Các virus này lây truyền từ cây này qua cây khác trong tự nhiên nhờ một loại

vector đó là loài bọ phấn trắng (Bemicia tabaci) Đây là loại côn trùng nhỏ hút

nhựa cây có mặt ở khắp nơi trên thế giới, được phát hiện đầu tiên tại Úc (năm1989) trên cây thuốc lá và cho đến nay đã biết được khoảng hơn 1000 loài [3], [5],[28], [39]

Trang 22

Bọ phấn trắng có chu kỳ sinh trưởng khoảng 18 – 28 ngày để phát triển từtrứng thành con trưởng thành trong điều kiện thời tiết ấm áp và khoảng 30 – 40ngày trong mùa đông Chu kỳ sinh trưởng gồm những giai đoạn sau: (1) trứng nởtrong khoảng 7 đến 10 ngày; (2) giai đoạn bò kéo dài khoảng 3 – 4 ngày; (3) Giaiđoạn thiếu trùng kéo dài khoảng 6 – 12 ngày; (4) giai đoạn nhộng kéo dài khoảng 4– 6 ngày; (5) con trưởng thành sống trong khoảng thời gian 6 – 16 ngày và có thểsống đến 50 ngày (Hình 1.2)

Trang 23

nhanh làm đen lá và đen

bề mặt quả Trong điều Hình 1.2 Chu kỳ sinh trưởng của bọ phấn (Bemisia tabaci)

kiện tự nhiên bọ phấn trắng có thể di chuyển xa tới 2 km và làm lây lan bệnh rấtnhanh [4]

Năm 1966, Cohen và Nitzany đã tiến hành những thử nghiệm đầu tiên nhằmkiểm soát dịch bệnh TYLCV Trước hết là tìm hiểu mối quan hệ giữa virus – vectorbằng cách kiểm tra hiệu quả truyền TYLCV bởi bọ phấn trắng Sau 48 giờ nuôicộng sinh bọ phấn trắng với cây WT (wild type – cà chua dại) nhận thấy chỉ có 5%ruồi đực truyền virus, tuy nhiên hiệu quả truyền virus ruồi trắng cái tới 32% gấp 6lần ruồi đực Tiến hành thử nghiệm với các số lượng 1, 3, 5, 10 và 15 bọ phấn cái/1

Trang 24

cây WT thì hiệu quả nhiễm bệnh tương ứng là 32%, 83%, 84%, 86% và 100% [8].Những virus này được duy trì liên tục trong cơ thể côn trùng Khi bọ phấn tiêmchích lên cây chủ, virus sẽ được truyền sang và lây lan Các ngưỡng thu nhận vàtruyền tải đã được tìm thấy là khoảng 15 đến 30 phút Tuy nhiên, để có tỷ lệ lâynhiễm cao cần ít nhất 4 giờ Giai đoạn tiềm ẩn khoảng từ 21 – 24 giờ Thử nghiệmvới những bọ phấn cái có thời gian sống khoảng 20 – 50 ngày cho thấy, sau 48 giờlây nhiễm, chỉ có 2 trong 28 con cái là giữ lại các virus tới 20 ngày Thời gian cộngsinh ngắn dẫn đến khoảng thời gian lưu giữ virus cũng ngắn hơn.

Hiệu quả lây nhiễm TYLCV qua bọ phấn giảm theo thời gian, hầu hết nhữngcon cái có thể truyền virus trong khoảng 10 ngày sau khi mang nguồn bệnh Bêncạnh nguồn bệnh từ những con trưởng thành, các virus còn được tìm thấy trong cơthể bọ phấn ở các giai đoạn phát triển khác Khi cộng sinh trên thực vật bị nhiễmbệnh, 28% số con trưởng thành có thể làm lây lan virus

Để kiểm tra sự lây truyền virus từ bọ phấn mẹ cho thế hệ con, người ta đãtiến hành thử nghiệm bằng cách cho bọ phấn cái mang virus đẻ trứng trên cây bôngkháng với TYLCV cho nở thành nhộng Sau đó các con trưởng thành được chuyểnsang các thực vật nhạy cảm với TYLCV Nhận thấy, chỉ có TYLCV truyền từ môigiới trung gian sang cây chủ và ngược lại mà không được truyền qua các thế hệ côntrùng

Trong khi nghiên cứu sự tương tác giữa vector và virus, một hiện tượng độc

đáo gọi là “periodic acquisition” đã được quan sát [11], [22] Đó là sau khi mang

nguồn virus từ các cây bệnh, những cá thể bọ phấn mang virus dần dần mất khảnăng lây nhiễm sau khoảng 10 ngày trích hút trên thực vật, hầu hết chúng khôngcòn khả năng truyền virus nữa Trong suốt thời gian trích hút, lượng virus bị suygiảm không thể bù đắp thêm từ những cây bệnh Bọ phấn phải hoàn toàn mất khảnăng truyền tải trước khi nó có thể thu nhận thêm virus [38]

Trang 25

Ở nước ta, bệnh xoăn lá cà chua do virus phát triển mạnh trong vụ cà chuasớm và vụ xuân hè Sự lây lan của TYLCV có thể ngăn bằng cách loại bỏ các cây

ký chủ ra khỏi vùng có bệnh và bằng cách ngăn chặn loài bọ phấn có mặt trên đồngruộng trước khi loại bỏ cây Tuy nhiên, phương pháp này tốn kém, gây ô nhiễmmôi trường và nông phẩm khi sử dụng chất hóa học độc hại tiêu diệt côn trùng

Trang 26

1.2.5 Một số biện pháp phòng bệnh xoăn vàng lá cho cà chua

Bệnh xoăn vàng lá cà chua đã được biết đến nhiều năm, tuy nhiên vẫn chưa

có phương pháp phòng tránh hiệu quả và những thiệt hại do virus này gây ra vẫn rấtđáng kể Tổn thất trung bình từ 5 – 90 % và có thể lên tới 100% khi mật độ quầnthể bọ phấn cao Việc khống chế TYLCV chủ yếu thông kiểm soát qua môi giớitruyền bệnh Các biện pháp truyền thống đã được sử dụng bao gồm phương pháp

cơ học, hóa học và sử dụng các giống kháng với TYLCV Một số phương phápphòng chống TYLCV có thể kể đến bao gồm:

- Phương pháp tránh nguồn lây bệnh

Thời gian hoặc hoặc địa điểm canh tác được bố trí nhằm tránh những nơihiện diện của quần thể bọ phấn thường sẽ có tác động đáng kể đến việc giảm tỷ lệmắc bệnh do TYLCV trên đồng ruộng Ở một số nước như Israel, TYLCV lây lanchủ yếu trong thời gian cuối mùa hè và đầu mùa thu mật độ bọ phấn cao điểm từtháng chín đến tháng mười một Do đó, để tránh nguồn bệnh, cà chua được trồngvào đầu mùa xuân, thường là cuối tháng ba hoặc đầu tháng tư, và được thu hoạch 3tháng sau đó Cà chua sẽ được thu hoạch trước khi các quần thể lớn bọ phấn đượchình thành Ngoài ra, các khu vực cà chua canh tác mới không nên đặt gần khu vực

đã trồng cũ cũng như không nên ở gần bất kỳ loại cây trồng nào là vật chủ củaTYLCV Điều này đặc biệt đúng khi các giống cà chua kháng TYLCV không cótriệu chứng bệnh nhưng vẫn có thể là nguồn lây nhiễm TYLCV cho cây trồng nhạycảm

- Các biện pháp cơ học

Sử dụng tấm phủ phản quang trong việc giảm khả năng lây nhiễm của

TYLCV lên cà chua đã từng được áp dụng thành công Tấm phủ phản quang cótác dụng phản xạ hiệu quả hoàn toàn hoặc một phần aluminized và phản ánh của

Trang 27

ánh sáng cả ngày Nó có tính chất phản xạ cả ánh sáng khả kiến và tia cực tím cótác dụng làm mất phương hướng của bọ

Sử dụng phương pháp này có thể khống chếđồng thời các vector của virus khác (các loài rệp và bọ trĩ) và làm giảm tỷ lệ mắcbệnh với một số virus cà chua khác Biện pháp này tỏ ra hiệu quả khi được sửdụng trên đồng ruộng ở Florida và Israel Bằng cách sử dụng lớp phủ màu vàng, ởcác ruộng được bảo vệ bởi lớp phủ chỉ có 10% xuất hiện các triệu chứng TYLCV

so với gần 100% của các ruộng trồng cà chua không che phủ Tuy nhiên, hiệu quả

sử dụng giảm tương ứng với sự tăng lên của những tán cây và các lớp bao phủ

Nhựa hấp thụ tia cực tím được sử dụng dưới dạng như nhà kính hoặc lưới

chống côn trùng đã thu được thành công trong việc khống chế bọ phấn ở cánh đồngthuộc Israel Nhựa hấp thụ UV có thể làm giảm mức độ của ánh sáng tia cực tím,gây mù các cá thể bọ phấn mà sử dụng bước sóng ánh sáng tia cực tím để địnhhướng Những lưới hấp thụ tia cực tím đã cho thấy hiệu quả trong việc ức chế sựxâm nhập của bọ phấn vào nhà kính và giảm chuyển động của bọ phấn trong nhàkính Tỷ lệ nhiễm TYLCV của cà chua được trồng trong các tấm hấp thụ UV chỉ có1% so với khoảng 80% trong điều kiện không có bất kỳ ứng dụng của thuốc trừsâu Điều quan trọng cần lưu ý là bên cạnh chi phí sản xuất cao hơn, việc sử dụngmàn lưới này cũng có thể dẫn đến tăng nhiệt độ và độ ẩm bên trong nhà lưới

Hàng rào vật lý như lưới chống côn trùng đã được sử dụng trong lưu vực

Địa Trung Hải từ năm 1990 để bảo vệ cây trồng từ TYLCV Kết hợp với một vàiđợt phun thuốc trừ sâu, tỷ lệ nhiễm TYLCV trong các khu vực được bảo vệ trong

18 tuần sau khi trồng chỉ còn 1%

Trang 28

Sử dụng chất hóa học

Phương pháp sử dụng các chất hóa học để tiêu diệt bọ phấn nhằm làm giảmthiệt hại do TYLCV ở cây trồng được sử dụng nhiều nhất Một số các lớp hóa chấtkhác nhau đã được sử dụng để tiêu diệt bọ phấn bao gồm các hydrocarbon clo,organophosphates, neonicotinoids, pyridin-azomethines, và pyrethroids Tuy nhiênkhi sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thường xuất hiện các tác động không mongmuốn Các hóa chất ngoài tác dụng diệt bọ phấn, thường có tác động gây hại lênmôi trường và các côn trùng có ích Ngoài ra, trong nhiều trường hợp sử dụng, bọphấn đã phát triển đề kháng với rất nhiều các hóa chất này và hiệu quả đã giảm theothời gian Mặt khác, việc sử dụng lặp đi lặp lại và thường xuyên của các thuốc bảo

vệ thực vật trong việc kiểm soát bọ phấn đã gây ra sự bùng phát của sâu bệnh thứcấp ví dụ như sâu ăn lá

kháng đã được sử dụng như TY-1 trên nhiễm sắc thể số 6 của L chilense) Gen kháng với TYLCV khác có nguồn gốc từ L pimpinellifolium trên nhiễm sắc thể số

6 nhưng khác locus với TY-1 đã được xác định bằng phản ứng RAPD dựa vàomarker phân tử Gen kháng với TYLCV-Thái lan được tìm thấy trên nhiễm sắc thể

số 8 và 11 của L hirsutun.

Giống cà chua kháng TYLCV đầu tiên được tạo ra là kết quả của lai giống

gen kháng TY20 có nguồn gốc từ L peruvianum Ngoài ra, gen kháng TY-1 cũng đã được sử dụng thành công để kháng lại Tomato yellow mosaic virus (ToYMV) và

Trang 29

Tomato mottle virus (ToMoV) Tuy nhiên, những giống kháng thương mại tạo ra

bằng lai giống bị hạn chế bởi trong kiểu gen thường mang những gen không mongmuốn và quá trình đưa một gen kháng từ một giống hoang dại vào một giốngthương mại thường rất mất thời gian và phức tạp do liên quan đến cơ chế di truyềncủa toàn bộ genome

Hiện nay, chuyển gen tạo cây kháng đang là giải pháp hiệu quả nhất Câykháng được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền có nhiều lợi thế hơn các cây kháng thuđược từ lai giống các gen của bộ gen thực vật Trong thực tế, một số cây trồngchuyển gen kháng virus đã được phát triển bằng cách sử dụng một trình tự củagenome virus trong thay đổi vật chất di truyền cây trồng Khái niệm này được gọi

là tính kháng có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh (PDR) Cho đến nay, sử dụngPDR trong việc nâng cao sức đề kháng của cà chua chống lại TYLCV cũng như các

Begomovirus khác đã cho thấy đây là một phương pháp triển vọng Để tạo cây

trồng kháng với TYLCV có thể tác động vào các đích sau: (1) tác động đến protein

vỏ (2) tạo cây kháng thông qua ức chế protein vận chuyển (3) làm thay đổi DNA,(4) sử dụng các gene antisense và (5) sử dụng các gen chức năng đã bị cắt ngắnhoặc đột biến để chuyển vào cây trồng Trong thực tế, một số giống kháng đã đượctạo ra bởi cách tiếp cận này đã cho thấy khả năng xây dựng tính kháng có thể trở

thành nền tảng cho các chương trình quản lý Begomovirus trên toàn thế giới.

1.3 Các phương pháp lây nhiễm TYLCV trong thực nghiệm

Việc tìm hiểu về các con đường truyền nhiễm virus thực vật trong tự nhiên

và nhân tạo, có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác chọn tạo giống cây trồngkháng lại mầm bệnh do virus thực vật gây ra Đây là công việc thực sự có ý nghĩatrong khoa học và ứng dụng vào công tác chọn tạo giống cây trồng kháng lại virus

và vector vật truyền trung gian

Trang 30

Đối với TYLCV Trong tự nhiên chỉ lây nhiễm từ cây này sang cây khác qua

Bemicia tabaci, do đó bằng cách sử dụng Bemicia tabaci làm vật truyền trung gian

(vector truyền bệnh) để lây nhiễm nhân tạo TYLCV từ cây mang mầm bệnh sangcây lành trong vườn thí nghiệm, nhà lưới hoặc đồng ruộng rồi thống kê kết quả vàđánh giá khả năng kháng lại TYLCV của các giống cà chua tham gia khảo nghiệm,nhằm chọn tạo ra giống có khả năng kháng bệnh tốt nhất do loài virus này gây ra.Phương pháp này đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và báo cáovào năm 1960 [5], [8], [26]

Năm 2007, Inoue-Nagata

2 đến 4 tuần [21] Hiện nay, phương pháp lâynhiễm TYLCV thông qua bọ phấn để đánh giá khả năng kháng bệnh do virus nàyvẫn được sử dụng [16], [1], [38], [26] Hiệu quả phương pháp này là cao nhưng phụthuộc nhiều vào điều kiện sinh thái của bọ phấn Mặt khác việc nuôi dưỡng bọ phấnmang virus rất phức tạp và tốn nhiều công sức do bọ phấn có kích thước rất nhỏ,vòng đời ngắn và sức sống yếu

Trong quá trình nghiên cứu, người ta nhận thấy sau khi TYLCV được nhiễmvào cây cà chua thì sự lan truyền của chúng qua cầu nối sinh chất giữa các tế bàocạnh nhau trong mô cây là rất nhanh chóng Do đó phương pháp ghép áp cây lànhvới cây đã bị bệnh để gây nhiễm TYLCV đã được thử nghiệm và mang lại hiệu quảcao [32] Phương pháp này được tiến hành như sau: Tiến hành trồng các dòng câycần lây nhiễm vào chậu thí nghiệm, tiến hành ghép sau khi cây đạt chiều caokhoảng 30 – 35 cm Dùng dao lam cắt vát một miếng nhỏ (dài 1,5 – 2 cm, rộng 0,4– 0,5 cm) vừa chạm vào lớp mạch gỗ của thân ở vị trí gần cành non của cây Áp

Trang 31

chỗ cắt của cây lành với cây bệnh, dùng băng dính buộc chặt lại, tạo điều kiện chovirus di chuyển từ cây bệnh sang cây lành Dùng bình xịt phun sương lên cây saukhi ghép, chụp lồng cách li côn trùng Theo dõi biểu hiện bệnh trong 50 ngày.Phương pháp này cho hiệu quả lan truyền rất cao [38].

Những năm gần đây, phương pháp Agro - inoculation sử dụng để lây truyền

virus thực vật nói chung và TYLCV nói riêng đã lây nhiễm thành công virus vào

cây ký chủ [1], [2] Phương pháp Agro - inoculation sử dụng trong lây nhiễm

TYLCV là phương pháp mới nhất, sự tổng hợp đoạn DNA đầy đủ trình tự củagenome virus được tái tổ hợp trong plasmid – T và được lây nhiễm thông qua vi

khuẩn đất Agrobacteium tumefaciens truyền TYLCV vào cây cà chua, sau một thời

gian sự biểu hiện triệu chứng bệnh do virus này gây ra xuất hiện, sử dụng cácphương pháp sinh học phân tử như PCR đặc hiệu đã xác định được sự có mặt của

TYLCV trong cây bệnh với tần suất cao Nhược điểm của phương pháp inoculation là biểu hiện bệnh thường nhẹ, không rõ ràng và khó để phân loại mức

Agro-độ biểu hiện bệnh dẫn đến kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh cho cà chua khóchính xác

Trang 32

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu thực vật

(1) Giống cà chua PT18

Cà chua PT18 có chiều cao trung bình 80 - 100cm, dạng cây gọn, màu láxanh nhạt, phân cành ít, sinh trưởng hữu hạn (100 - 120 ngày), kháng bệnh khá,nhất là bệnh héo xanh vi khuẩn PT18 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong mùakhô dưới nhiệt độ 21 – 25oC Thời vụ gieo hạt thích hợp nhất là tháng 9 - 10 Càchua PT18 trồng được cả 3 vụ (vụ sớm, vụ chính và vụ muộn) Đây là giống khámẫn cảm với bệnh xoăn vàng lá do TYLCV

(2) Giống cà chua F1 GM – 2008

Giống cà chua F1 GM – 2008 là giống nhập nội có nguồn gốc từ Pháp Quảcủa F1 GM – 2008 có dạng tròn dẹt, chín có màu đỏ tươi, thịt dày, rắn chắc F1GM

2008 sinh trưởng hữu hạn, chịu lạnh và nóng rất tốt, có thể trồng sớm ngay từ tháng

7, nhanh thu hoạch Đây là giống lai tạo theo hướng kháng bệnh héo xanh và xoănlá

(3) Giống cà chua DV 2962

DV 2962 là giống cà chua lai F1 có nguồn gốc từ Ấn Độ DV 2962 là giống càchua có biên độ thích ứng rộng, sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ 17 – 32oC,thích hợp cho ăn tươi và chế biến công nghiệp Giống thuộc loại hình sinh trưởngbán

hữu hạn, sinh trưởng khoẻ Cây cao trung bình từ 110 - 130 cm, nhiều hoa, sai quả

DV 2962 có khả năng chống chịu tốt một số bệnh nguy hiểm như héo xanh, mốcsương, xoăn lá do virus

Trang 33

(4) Cà chua dại mang virus TYLCV thu thập ở vườn có áp lực bệnh cao Sử dụng

trong lây nhiễm bằng bọ phấn và ghép áp để lây nhiễm TYLCV

Trang 34

2.1.2 Chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA404 mang vector

PCAMBIA 2300 chứa genome TYLCV do bộ môn bệnh cây nhiệt đới, Trường Đại

học Nông nghiệp Hà Nội cung cấp gồm 2 dòng : A tumefaciens LBA404/2300/TY (chứa đầy đủ vòng DNA – A của TYLCV) và A tumefaciens LBA404/2300/β

(chứa vòng DNA vệ tinh β của TYLCV) Chủng vi khuẩn này có đặc tính khángrifamycin và kanamycin

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 do Phòng Công nghệ tế

bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệViệt Nam cung cấp

2.1.3 Hoá chất, thiết bị máy móc

(1) Hoá chất

Sodium chloride (NaCl), Tris – HCl, EDTA, CTAB, sorbitol, sodiumdihydrogen phosphate (NaH2PO4), chloroform (C H C l 3 ), isoamyl alcohol((CH3)2CHCH2CH2OH), ethanol (C2H5OH) Taq polymerase, dNTPs (dATP,dCTP, dGTP, dTTP), buffer PCR, MgCl2, mồi xuôi (Forward primer), mồi ngược(Reverse primer), agarose, TAE, glycerol, bromophenol blue, thang DNA chuẩn(Fermentas) – DNA marker, ethydium bromide (EtBr), glucose, Tris – base, NaOH,SDS, CH3COOK, MES, AS, bacto – tryptone, yeast extract, bacto – agar,kanamycin, rifamycin, cồn 90o

(2) Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

Các thiết bị, dụng cụ thuộc phòng thí nghiệm Khoa Khoa học Sự sốngtrường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên gồm: máy ly tâm lạnh (Hettich -Germany), box cấy (Nuaire - USA), máy lắc (Korea), máy soi gel (Wealtec - USA),

bộ điện di (USA), máy vortex (CLP - USA), máy đo quang phổ, máy PCR

Trang 35

(Applied Biosystems), máy đo pH (Martini - Rumani), tủ lạnh - 20 – 4oC (Fiochetti

- Italy), cân điện tử (Sartorius), lò vi sóng (Sharp - Japan), bể ồn nhiệt (Joiotech),nồi hấp vô trùng, máy cất nước, pipetman (Hettich - Germany), đầu côn các loại,ống eppendorf, ống fancol, cối chày sứ, bơm kim tiêm y tế, bình tam giác (loại 100,

250, 500 ml), cốc đong, ống đong, gang tay cao su, đũa thủy tinh

Ngoài ra trong đề tài còn sử dụng các dụng cụ, thiết bị khác như lọ penicilin,bông, kéo, găng tay y tế, xi lanh tiêm, lồng lưới, chậu trồng cây, dao lam, băng dính

y tế, giấy bạc, đũa inốc, bình xịt thuốc sâu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

THU THẬP GIỐNG

TẠO NGUỒN BỆNH

Phương pháp nuôi thả bọ phấn

Trang 36

LÂY NHIỄM VIRUS Phương pháp ghép Theo dõi biểu hiện Phương pháp Agroinoculation

KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ PCR nhân gen virus

ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH LÂY NHIỄM

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp lây nhiễm bằng bọ phấn

Gieo hạt và cách li cây sau nảy mầm, sau đó tiến hành lây nhiễm bọ phấn, tiếnhành thả 10 -20 cá thể bọ phấn cùng với cây bệnh trong lồng cách li Nuôi cộng sinhtrong 48 giờ, tiến hành phun thuốc diệt côn trùng để diệt bọ phấn Sau lây nhiễm 10

Trang 37

ngày, tiến hành thu lá để tách DNA kiểm tra gen virus trong các dòng lây nhiễm bằngPCR với cặp mồi đặc hiệu Theo dõi biểu hiện bệnh sau 50 ngày sau nuôi thả bọphấn, tiến hành thu lá tách DNA kiểm tra gen virus.

2.2.2 Phương pháp lây nhiễm bằng ghép áp

2.2.3 Phương pháp lây nhiễm bằng Agro - inoculation

(1) Gieo hạt và trồng cây thí nghiệm

(2) Cách ly cây sau nảy mầm bằng lồng cách ly

Trang 38

(3) Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: nuôi lắc các dòng khuẩn lây nhiễmC58/PC2300/TY (PCAMBIA 2300 mang vòng DNA – A genome TYLCV) vàC58/PC2300/β (PCAMBIA 2300 mang vòng DNAβ vệ tinh của TYLCV) riêngbiệt trên môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin và rifamycin, sau đó

ly tâm thu cặn tế bào vi khuẩn và hòa từng dòng khuẩn vào dung dịch lây nhiễm(MgCl2 10 mM, MES 10 mM, AS 100 µM, H2O), cuối cùng trộn hai dòng khuẩnnày lại với nhau với tỷ lệ 1 : 1, để ở nhiệt độ phòng 1 – 2 giờ rồi tiến hành tiêm chocác cây cà chua thí nghiệm

(4) Tiến hành lây nhiễm bằng tiêm: Sau khi cây con cao khoảng 10 cm khỏemạnh, tiến hành tiêm khoảng 5 ml/cây (OD dịch khuẩn 0,5 – 1) Lặp lại thí nghiệm

3 lần, mỗi lần cách nhau 10 ngày

1.2.6 Phương pháp quang phổ hấp thụ (đo quang phổ - đo OD)

Dung dịch tế bào vi khuẩn được đo OD bằng máy quang phổ ở bước sóng

660 nm (OD660) Khi độ OD660 = 0,5 – 1 thì dịch khuẩn có thể dùng cho thí nghiệmlây nhiễm ở trên (mục 2.2.3)

DNA được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm Nồng độDNA được tính theo công thức:

Nồng độ DNA (ng/µl) = OD260 × 50 × hệ số pha loãng

Độ sạch DNA = OD260/OD280

Trong đó: OD260 là chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm, OD280 là chỉ số đođược ở bước sóng 280 nm

Nếu tỷ lệ OD260/OD280 = 1,8 – 2,0 thì DNA đó là tinh sạch

2.2.5 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ biểu hiện bệnh

Trang 39

Để xác định các mức độ biểu hiện bệnh chúng tôi căn cứ theo tiêu chí Lapidot

và Friedman đưa ra năm 2002 Theo tác giả, biểu hiện bệnh xoăn vàng lá do TYLCVđược chia thành 5 mức độ từ 0 đến 4 (Hình 2.2)

Trang 40

0:Cây không nhiễm

bệnh, sinh trưởng và

phát triển bình

thường.

1: Những lá trên đỉnh ngọn

có biểu hiện vàng nhẹ ở mép lá.

2: Lá vàng và xoăn nhẹ ở mép lá.

3: Lá vàng, xoăn và cụp xuống đồng thời kích thước bị thu nhỏ lại.

4: Lá xoăn, kích thước lá thu nhỏ nhiều, cây cằn cỗi và

trưởng.

Hình 2.2 Các mức độ biểu hiện bệnh xoăn vàng lá cà chua

2.2.6 Phương pháp phân tích sự có mặt của virus TYLCV

2.2.6.1 Thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số

a, Thu thập và bảo quản mẫu

Dùng găng tay và kéo đã khử trùng bằng cồn, cắt lấy những lá non của các câythí nghiệm nghi nhiễm bệnh xoăn vàng do TYLCV (thu mẫu vào thời điểm khô ráo).Các mẫu lá sau khi thu được bảo quản trong bình thuỷ tinh có chứa các hạt silica gelhút ẩm và bảo quản nơi khô ráo trong điều kiện nhiệt độ phòng

b, Tách chiết DNA tổng số các mẫu lá

Để tách chiết DNA tổng số của các mẫu cà chua chúng tôi tiến hành pha dungdịch đệm tách với nồng độ các chất theo công thức dưới đây (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Nồng độ các hoá chất trong dung dịch đệm tách DNA tổng số

Định dạng
Số trang	83
Dung lượng	3,57 MB