BÁO CÁO THỰC TẬP DƯỢC LIỆUBài: DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN (Cam thảo)I. Chuẩn bị1. Nguyên vật liệu thí nghiệm: Rễ và thân rễ của cây cam thảo Dung môi, hóa chất: cồn 70%, methanol, ether ethylic, anhydric acetic, acid sulfuric đậm đặc, NaCl 0,9%, HCl 0,1N, NaOH 0,1N
Trang 1BÁO CÁO THỰC TẬP DƯỢC LIỆU
Bài: DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN (Cam thảo)
I Chuẩn bị
1 Nguyên vật liệu thí nghiệm:
- Rễ và thân rễ của cây cam thảo
- Dung môi, hóa chất: cồn 70%, methanol, ether ethylic, anhydric acetic,
acid sulfuric đậm đặc, NaCl 0,9%, HCl 0,1N, NaOH 0,1N
II Thử nghiệm tính tạo bọt:
2.1 Xác định chỉ số bọt
a Cách tiến hành:
+100 ml nước cất sôi Đun trên cách thủy 30 phút
Lọc nóng
Chờ dịch lọc nguội Chuyển vào bình định mức 100ml Thêm nước cất cho đủ 100ml
Chia nhỏ ra 10 ống nghiệm
1g bột dược liệu
Dịch chiết
Dịch lọc
Dung dịch A
(10)
(2) (1)
1ml
Trang 2Thêm nước cất vào mỗi ống nghiệm cho đủ 10ml
Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 15 giây
Để yên ống nghiệm trong 15 phút
Dung dịch B
Dung dịch
Trang 3Đo độ cao cột bọt
Trang 4b Hiện tượng:
- Cột bọt trong các ống nghiệm khác nhau theo thứ tự từ 1 đến 10
- Ống nghiệm số 7 có cột bột cao đúng 1cm nên chỉ số bọt chính là
độ pha loãng của dung dịch trong ống nghiệm 7
Bảng chiều cao cột bọt:
Trang 51 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 1,0 1.2 1.3 1.5 (cm
)
Kết luận: Cột bọt số 7 cao đúng bằng 1cm nên chỉ số bột chính là độ pha
loãng của dung dịch trong ống nghiệm này
Tính kết quả: CSB = 10n x A x k
= 107 x 100 x 1 = 142.857 (ml) Trong đó: n: số thứ tự ống có cột bọt cao 1cm
A: độ pha loãng của dung dịch ban đầu
K: độ pha loãng trung gian
Vậy chỉ số bọt CSB = 142.857 ml
Giải thích:
- Saponin có tính chất hoạt động bề mặt (phân tử saponin có cùng một
lúc một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước), khi hòa tan vào nước làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch nên tạo nhiều bọt khi lắc
- Ta chọn ống nghiêm 7 vì đúng với yêu cầu khái niệm Chỉ số bọt : cột
bọt cao 1cm và bền trong 15 phút
- Phản ứng nhằm đánh giá nguyên liệu có chứa saponin -> Dược liệu
cam thảo có chứa saponin
2.2 Định tính bằng phản ứng Liebermann-Burchard:
+5ml cồn 70%
0,5g dược liệu
Trang 6Đun cách thủy 5 phút Lọc bông
Bã
Cô trên bếp cách thủy
+1ml anhydric acetic +1ml CHCl3
Khuấy kỹ cho tan
+1 ml H2SO4 đ
Hiện tượng: Mặt ngăn cách giữa 2 lớp có màu nâu đỏ
Lớp dung dịch phía trên có màu nâu đỏ
Kết quả của quá trình định tính Saponin bằng phản ứng Liebermann – Burchard: loại saponin trong Cam thảo là Saponin triterpenoid
Giải thích:
- Ban đầu dùng cồn để chiết saponin ( do phần saponin thường dễ tan
trong dung môi phân cực ) trong cam thảo sau đó dùng CH3Cl để chiết sapogenin ( do phần sapogenin tan trong dung môi kém phân cực)
- Phản ứng đặc hiệu lên màu với các dẫn chất có chứa nhân steroid, cơ
chế của phản ứng là sự khử nước của acid mạnh
Dịch lọc
Cắn
Dung dịch
Phản ứng dương
tính
Trang 72.3 So sánh cột bọt trong môi trường OH - và H + :
a Tiến hành
1ml dịch chiết/nước 1ml dịch chiết/nước 1ml NaOH 0,1N 1ml HCl 0,1N
Lắc mạnh cả 2
Để yên cho cột bọt ổn định
Dịch chiết
Trang 8Hiện tượng: cột bọt ở cả 2 ống cao ngang nhau
Kết luận: sơ bộ có thể kết luận trong Cam thảo có chứa saponin
triterpenoid
Giải thích:
- Cấu trúc genin của saponin triterpennoid có 30C, cấu tạo từ 6 đơn vị
heniterpen nối vs nhau theo quy tắc đầu đuôi Nhóm methyl ở C28 dc oxy hóa thành nhóm carboxyl kết hợp vs đường tạo thành dây nối pseudoglycosid
- Do vậy khung của triterpen bền hơn nên bọt 2 cột bằng nhau Còn
khung của steroid dễ bị khử bởi acid nên có sự chênh lệch bọt
KẾT LUẬN CHUNG:
Dựa trên hiện tượng tạo bọt và màu tạo thành của phản ứng Liebermann kết
luận loại saponin có trong Cam thảo là Saponin Triterpenoid
III Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Chuẩn bị
0,5g bột cam thảo và 5ml methanol vào 1 ống nghiệm đun cách thủy 10 phút, lọc, cô cắn, cho vào vài giọt MeOH, lắc cho tan
Bình sắc ký
được rửa sạch và để thật khô Lót 1 miếng giấy lọc quanh lòng bình
Cho hệ dung môi CHCl3 -MeOH-H2O (65:35:10; lớp dưới) vào bình sắc ký sao cho lớp dung môi trong bình cao khoảng 0,5cm
Chuẩn bị bản mỏng
Dùng bản mỏng silicagel
tráng sẵn cắt thành
những miếng có kích
thước 2,5 x 10 cm
Dùng bút chì kẻ lên bản
mỏng 1 đường thẳng
cách mép dưới 1cm để
chấm thử, 1 đường thẳng
Trang 9e Phát hiện
Đưa lên bản mẫu và khai triển; Dùng mao quản lấy mẫu, chấm lên giấy
thấm cho bớt dung dịch, sau đó chấm lên bản mỏng thành chấm cách mép dưới 1 cm( vết chấm phải cao hơn mức dung môi trong bình sắc ký) Chờ cho MeOH bay hết rồi cho vào bình sắc ký, đậy nắp
Khi dung môi chạy tới đường thẳng trên thì lấy bản mỏng ra, để nhiệt độ phòng cho khô
Trang 10Phát hiện:
Soi đèn UV 254nm và 365nm
Cam thảo
Cam thảo
Trang 11- Số lượng vết: 6 vết
- Rf của vết ( Tỉ lệ khoảng dịch chuyển của chất thử
và khoảng dịch chuyển của dung môi ):
Đọc kết quả
Trang 12Rf = la lo Với: lA là đoạn đường di chuyển của chất A
lo là đoạn đường di chuyển của dung môi
Tính toán:
Đi theo hướng chiều chuyển động của dung môi, trên bản mỏng sắc ký ta có 5 vết, đặt tên theo thứ tự là 1, 2, 3, 4, 5, 6
Ta có:
Quãng đường dung môi đi được là l o = 19
Quãng đường đi được của vết 1: l 1 = 1,5
Rf1 = 1,519 = 0,08
Quãng đường đi được của vết 2: l 2 = 7,5
Rf2 = 7,519 = 0,39
Quãng đường đi được của vết 3: l 3 = 10
Rf3 = 1019 = 0,53
Quãng đường đi được của vết 4: l 4 = 12
Rf4 = 1219 = 0,63
Quãng đường đi được của vết 5: l 5 = 15
Rf5 = 1519 = 0,79 Quãng đường đi được của vết 6: l6 = 16
Rf6 = 1619 = 0,84
Phương pháp sắc ký lớp mỏng dùng để định tính Saponin Màu sắc với các thuốc thử đặc hiệu của các vết trên sắc ký đồ là những yếu tố
Trang 13để nhận định sự có mặt của một Saponin, một nhóm Saponin trong hỗn hợp phân tích
Giải thích:
- Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho
pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách
+ Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại
+ Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận
+Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng
- Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi
ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động
Dùng methanol làm dung môi mà không dùng nước vì:
+ Dung môi thích hợp dùng trong sắc ký lớp mỏng sẽ là một dung môi
có tính phân cực khác với pha tĩnh Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử
sẽ lan tròn do mao dẫn , và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau
Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại
+ Ngoài ra nước còn hòa tan được rất nhiều chất nên ảnh hưởng đến quá trình sắc ký
2 Chuẩn bị bình sắc ký và dung môi: cho dung môi vào bình, quanh
thành bình lót giấy lọc để bão hoà dung môi trong bình sắc ký được nhanh hơn
3 Khi dùng hệ sắc ký bản mỏng, phải cho hệ dung môi vào bình đậy kín và để yên cho dung môi thấm ướt giấy lọc vì:
Trang 14Để tránh dung môi bay hơi và coi hệ dung môi có đồng nhất hay không Nếu hệ dung môi thấm ướt giấy lọc thì hệ dung môi đã đồng nhất
4 Hệ dung môi và tỷ lệ dung môi ảnh hưởng đến tỉ lệ Rf:
Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được sự liên kết với pha tĩnh
Ví dụ: Nếu silicagel được dùng như pha tĩnh, nó được xem là phân cực Cho trướt hai hợp chất phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cực mạnh hơn sẽ có sự liên kết với silicagel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động ra khỏi các chỗ lien kết Do đó hợp chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ
di chuyển lên cao hơn trên bảng sắc ký ( Rf sẽ lớn hơn) Nếu pha động được thay bằng dung môi phân cực hơn hoặc hỗn hợp các dung môi, nó sẽ có khả năng đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silicagel, và tất cả chất trên bảng sắc kí sẽ di chuyển lên cao hơn