Phân lập các loài vi nấm kí sinh trên nấm linh chi và đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh gây hại cây trồng của những loài có triển vọng

Khảo sát khả năng đối kháng của 2 loài nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi đối với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro .... Vì v

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP CÁC LOÀI VI NẤM KÍ SINH TRÊN NẤM LINH CHI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG CỦA NHỮNG LOÀI

CÓ TRIỂN VỌNG

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THÁI MINH HIẾU MSSV: 1051110073 Lớp: 10DSH01

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả trong

Đồ án là trung thực Mọi thông tin trích dẫn trong Đồ án đều được ghi rõ nguồngốc Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thái Minh Hiếu

Xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại họcCông Nghệ Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoànthành tốt khóa học 2010 – 2014.

Xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm và Môitrường đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quan trọng tạo nền tảngkiến thức vững chắc để hoàn thành tốt Đồ án và sau này có thể ứng dụng vào côngviệc thực tiễn

Xin chân thành cám ơn TS Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ

em trong suốt quá trình thực hiện để em hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này

Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khóa và đặc biệt là em HuỳnhNhi đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần, cùng em trải quanhững khó khăn trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp

Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn bên cạnh,

cổ vũ, động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con có thể hoàn thành tốt Đồ án tốtnghiệp này

Tp HCM, Ngày 31 tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thái Minh Hiếu

MỤC LỤC

-MỤC LỤC i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH .

vii MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Mục tiêu nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi 3

1.1.1 Phân loại (Sissi Wachtel-Galor và Iris F.F.Benzie, 2011) 3

1.1.2 Hình thái quả thể nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2001) 4

1.1.3 Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của nấm Linh chi đỏ 5

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm Linh chi trên thế giới và Việt Nam

6 1.1.5 Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2005)

7 1.2 Giới thiệu về nấm Trichoderma

12 1.2.1 Phân loại 12

1.2.2 Đặc điểm hình thái 12

1.2.3 Đặc điểm sinh lí, sinh hóa (Gary J Samuels, 2004) 13

1.2.5 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma trên thế giới và

ở Việt Nam 18

1.3 Giới thiệu với nấm Aspergillus 20

1.3.1 Phân loại 20

1.3.2 Đặc điểm hình thái 20

1.3.3 Đặc điểm sinh lý, hóa sinh 21

1.3.4 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Aspergillus trên thế giới và ở Việt Nam 22

1.4 Bệnh do nấm Rhizoctonia spp gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) 23

1.5 Bệnh do nấm Fusarium spp gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) 25

1.6 Bệnh do nấm Colletotrichum spp gây ra 28

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 31

2.2 Vật liệu 31

2.2.1 Nguồn mẫu phân lập 31

2.2.2 Nguồn nấm bệnh 31

2.2.3 Dụng cụ và thiết bị 31

2.2.4 Hóa chất 32

2.2.5 Các loại môi trường 33

2.3 Nội dung nghiên cứu 33

2.4 Phương pháp nghiên cứu 34

2.4.1.Phương pháp phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi (Agrios, 2005) 34

2.4.2 Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) 35

2.4.3 Phương pháp lây bệnh nhân tạo kiểm chứng tác nhân gây bệnh

(Agrios, 2005) 36

2.4.4 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh (Tô Duy Khương, 2007) 37 2.4.5 Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro (Laila Naher và

cộng sự, 2012) 38

2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm .

39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Kết quả phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi 40

3.1.1 Kết quả phân lập nấm kí sinh trên nấm Linh chi 40 3.1.2 Đặc điểm hình thái của 3 chủng nấm T1, T2, A1

loài Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi51 3.3 Khảo sát khả năng đối kháng của 2 loài nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi đối với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro .

52

3.3.1 Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp 53 3.3.2 Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia sp

55

3.3.5 Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp3 61

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

4.1 Kết luận 64 4.2 Kiến nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái của T virens và T harzianum phân lập ban đầu 50 Bảng 3.4 Đường kính vòng phân giải của hai loài nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuôi cấy 52 Bảng 3.5 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Fusarium 54 Bảng 3.6 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Rhizoctonia

sp .56

Bảng 3.7 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Colletotrichum sp1 .58 Bảng 3.8 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Colletotrichum sp2 .60 Bảng 3.9 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Colletotrichum sp3 .62

DANH MỤC HÌNH ẢNH

-Hình Trang Hình 1.1 Nấm Linh chi (Gerdonama luciadum) .3

Hình 1.2 Hình thái quả thể nấm Linh chi đỏ .5

Hình 1.3 Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm .9

Hình 1.4 Hình thái nấm Trichoderma harzianum 12

Hình 1.5 Trichoderma kí sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở cây họ đậu (Nấm Trichoderma (màu vàng) tấn công nấm Pythium (màu xanh)) 15

Hình 1.6 Trichoderma tiết enzyme chitinase và kháng sinh peptaibols phân hủy vách tế bào nấm bệnh .16

Hình 1.7 Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma hazianum 17

Hình 1.8 Hệ bào tử đính của giống nấm sợi Aspergillus 21

Hình 1.9 Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra .25

Hình 1.10 Héo Fusarium trên cây chuối do F oxysporum f.sp.cubense .26

Hình 1.11 Biểu hiện bệnh héo vàng do nấm Fuasarium spp gây ra trên cây cà chua 27

Hình 1.12 Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra trên các loại trái cây nhiệt đới 28

Hình 1.13 Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum acutatum gây ra trên trái ớt và lá ớt .29

Hình 1.14 Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra trên trái thanh long và cành thanh long 30

Hình 2.1 Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp 40

Hình 3.1 Hình thái đại thể chủng nấm T1 nuôi cấy trên môi trường PGA 42

Hình 3.2 Hình thái vi thể chủng nấm T1 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X .42

Hình 3.4 Hình thái vi thể chủng nấm T2 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X 43Hình 3.5 Hình thái đại thể chủng nấm A1 nuôi cấy trên môi trường PGA 44Hình 3.6 Hình thái vi thể chủng nấm A1 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính40X 44Hình 3.7 Kết quả giải trình tự 28S rRNA vả tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm T1 45Hình 3.8 Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm T2 46Hình 3.9 Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm A1 47Hình 3.10 Biểu hiện nhiễm bệnh trên nấm Linh chi sau 15 ngày lây bệnh nhân tạo 49

Hình 3.11 Vòng phân giải chitin và CMC của 2 loài nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuôi cấy 53 Hình 3.12 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Fusarium

sp .55

Hình 3.13 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Rhizoctonia sp 57 Hình 3.14 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Colletotrichum sp1 .59 Hình 3.15 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Colletotrichum sp2 .61 Hình 3.16 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Colletotrichum sp3 .63

Nấm Linh chi hiện đã được biết đến là loài nấm có giá trị sử dụng cao để làmdược liệu và được sản xuất phổ biến ở nhiều nước trên thế giới Beta glucan vàchitine là thành phần chính cấu tạo nên thành tế bào của nấm Linh chi (Pai-FengKao và cộng sự, 2012) Tuy nhiên, Kumar và cộng sự (2011) cho biết, trong quátrình sinh trưởng, phát triển, nấm Linh chi bị kí sinh bởi nhiều loài nấm, trong đó cócác loài nấm Trichoderma Tác giả cũng đánh giá đây là nhóm nấm có triển vọng

trong quản lý bệnh hại cây trồng Enzyme là nhân tố quan trọng giúp Trichoderma

có khả năng tấn công trực tiếp lên nấm Linh chi các loài nấm khác Trong số các

enzyme được tiết ra từ nấm Trichoderma spp thì Endochitinase và Glucanase

1,3-beta-glucosidase đóng vai trò rất quan trọng trong hoạt động kí sinh của nấm

Trichoderma spp (Margolles Clark và cộng sự, 1995) Hầu hết vách tế bào nấm

bệnh đều có cấu bởi chitin và glucan (Agrios, 2005) Vì vậy, các loài nấm kí sinhtrên nấm Linh chi sẽ có khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh khác Một số

chủng Trichoderma cũng đã được thông báo có khả năng phòng trừ được nấm Colletotrichum (Stanley Freeman và cộng sự, 2004) Đây là loài nấm nguy hiểm

cho sản xuất nông nghiệp vì gây hại trên rất nhiều loại cây trồng và trong bảo quảnsau thu hoạch nhiều loài hoa quả (Agrios, 2005)

Cũng như trên thế giới, nấm Linh chi đang được trồng khá phổ biến ở nhiềutỉnh thành của Việt Nam Theo Lê Duy Thắng (2001), nấm Linh chi bị một số loài

nấm kí sinh gây hại Trong số này có nấm Trichoderma là loài gây hại nghiêm trọng

nhất, nhóm mốc này tấn công trên bịch đã có tơ ăn đầy, thậm chí trên cả tai nấm

Linh chi và ức chế mạnh lên sự phát triển của tơ nấm Nấm Trichoderma đã được

nghiên cứu và sử dụng nhiều ở Việt Nam nhưng chủ yếu được phân lập từ đất và đểphòng trừ nấm gây hại cây trồng có trong đất (Dương Minh và cộng sự, 2005) Việc

phân lập nấm Trichoderma từ nấm Linh chi và lợi dụng chúng để phòng trừ bệnh

hại cây trồng chưa được quan tâm Bên cạnh đó, biện pháp quản lý nấm gây hại trên

lá và quả các loài cây trồng chủ yếu nhờ vào các loại thuốc hóa học và chưa có tác

nhân sinh học nào tỏ ra có hiệu quả đối kháng với loài nấm bệnh này Vì vậy, việcphân lập và lợi dụng các chủng nấm kí sinh trên nấm Linh chi để quản lý một sốbệnh hại cây trồng trên mặt đất là khả thi và rất cần thiết.

Xuất phát từ lý do trên, sinh viên tiến hành đề tài “ Phân lập các loài vi nấm

kí sinh trên nấm Linh chi và đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh gây hại cây trồng của những loài có triển vọng”.

2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập và định danh đến loài các vi nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linhchi Tuyển chọn các loài vi nấm có triển vọng ứng dụng kháng nấm bệnh hại câytrồng

3 Mục tiêu nghiên cứu

− Phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi và định danh đến loài cácchủng nấm phân lập được

− Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của một sốchủng nấm kí sinh gây bệnh

− Khảo sát khả năng đối kháng của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh có tiềmnăng với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi

1.1.1 Phân loại (Sissi Wachtel-Galor và Iris F.F.Benzie, 2011)

Nấm Linh chi có trên khoa học là Ganoderma lucidum, thường được tìm

thấy ở các nước Á Đông Từ xưa đến nay, ở Trung Quốc, Nhật Bản và một số nướcchâu Á khác đã sử dụng nấm Linh chi như một loại thảo dược để giúp tăng cườngsức khỏe và kéo dài tuổi thọ của con người Đây là một loại nấm lớn, màu tối, vỏngoài nhẵn bóng và nhìn giống như một khúc gỗ… Ở mỗi nơi nấm Linh chi đượcgọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc),Yeongji (Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan) Ngoài ra còn một số tên gọi khácnhư nấm vạn niên (Nhật bản) hay nấm trường sinh (Trung Quốc) Theo 2 cuốn sáchrất nổi tiếng mô tả về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben CaoJing” (25- 220 trước Công nguyên, thuộc triều đại Đông Hán) và “Ben Cao GangMil” của Li Shi Zhen (1590 trước Công nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), có 6chủng nấm được biết đến tại thời điểm lúc bấy giờ Trong đó có hơn 250 loại nấmLinh chi được đề cập

Nấm Linh chi xuất thân từ loài nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, cóhàng trăm loài khác nhau cùng họ nấm gỗ (Ganodermataceae) Trong đó, chiGanoderma có đến 80 loài có màu sắc khác nhau thay đổi từ vàng, cam, đỏ tía rất đa dạng.Vị trí phân loại của nấm Linh chi như sau:

iớ

Fu

ộ:

Pol

1.1.2 Hình thái quả thể nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2001)

Nấm Linh chi là một loại nấm hóa mộc, cứng khi khô nhưng khi tiếp xúcvới nước trở nên hơi mềm Quả thể nấm Linh chi gồm:

Mũ nấm: mặt trên thường có một lớp bóng màu nâu đỏ, mặt dưới nấm cónhiều lổ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử nếu cắt ngang có dạng tổ ong Ngoàithiên nhiên, nấm luôn có dạng bất đối xứng, tức là cuống nấm thường ở một bênnhư vị trí tay quạt Đối với nấm trồng, mũ nấm tròn và gần như đối xứng, cuốngnấm ở giữa trung tâm do được trồng theo từng đơn vị, không có sự chèn ép và ảnhhưởng môi trường bên ngoài

Bào tử: hình thuẩn có gai lõm Một đầu tròn lớn, một đầu nhỏ có lỗ, nơi đâybào tử sẽ nảy mầm cho ra khuẩn ty ăn luồn vào thân cây Bào tử nấm tương tự nhưmột loại phấn hoặc hạt mầm, có thể phát triển thành một cây nấm hoàn chỉnh,nhưng khác ở chỗ nó được cấu tạo từ một tế bào duy nhất Đường kính của bào tửnấm Linh chi chỉ từ 5 – 8 µm So sánh cùng trọng lượng, bào tử nấm Linh chi códược tính mạnh hơn quả thể 75 lần, gồm các dược chất thiên nhiên nhưtriterpenoids, polysaccharides (β - D - glucans), germannium và các hoạt chấtkhác

Cuống nấm: cuống nấm đặc và cứng, sậm màu, bám vào đài vật như thâncây Chân nấm có thể dài cũng có thể ngắn, là bộ phận giúp nấm lấy chất dinhdưỡng

A B

C D

Hình 1.2 Hình thái quả thể nấm Linh chi đỏ: A: Nấm mọc tự nhiên; B: Nấm trồng

nhân tạo; C: Bào tử nấm; D: Hình thái cấu trúc giải phẫu nấm

1.1.3 Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của nấm Linh chi đỏ

Thành phần trong nấm Linh chi tươi thì nước là chủ yếu, chiếm 90% khốilượng Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10 - 40%, chất béo chiếm từ 2 - 8%,carbohydrate chiếm 3 - 28%, chất xơ chiếm 3 - 32%, hàm lượng tro chiếm 8 -10% Ngoài ra, nấm Linh chi còn có các thành phần vi lượng như một số loạivitamin và các khoáng chất khác nhau như là kali, can-xi, phốt pho, magiê, selen,sắt, kẽm…(Borchers và cộng sự, 1999) Trong một nghiên cứu của các thành phầnkhông bay hơi của Linh chi cho thấy rằng nấm chứa tro 1,8%, 26 - 28%carbohydrate, 3 - 5% chất béo thô, 59% chất xơ thô, và 7 - 8% protein thô (Mau vàcộng sự, 2001)

Hàm lượng của protein trong nấm Linh chi khoảng 7 - 8%, thấp hơn so vớinhiều loại nấm khác (Chang và cộng sự, 1996; Mau và cộng sự, 2001) Đặc biệtthành phần protein của nấm Linh chi có rất nhiều các amino acid thiết yếu nhất làlysine và leucine Hàm lượng chất béo tổng thấp nhưng chứa nhiều acid béo khôngbão hòa nhiều nối đôi, đây là các hợp chất rất có lợi cho sức khỏe của con người(Chang và cộng sự, 1996 ; Borchers và cộng sự, 1999)

Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạt chấtsinh học có tác dụng dược lý trong nấm Linh chi bao gồm các nhóm chính:polysaccharides, triterpenoids, protein, peptide, adenosine và nucleoside ( Zhou và

cộng sự, 2007; Zhang W và cộng sự, 2008).

Đến nay, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào nhóm polysaccharides

và nhóm triterpenoids Hơn 200 polysaccharides đã được phân lập từ quả thể vàsợi nấm của loại nấm này, trong số đó β - 1 - 3 và β - 1 - 6 D - glucans là nhữngthành phần có hoạt tính sinh học chính (Bao X và cộng sự, 2002) Nhiều tác dụngdược lý của chúng chẳng hạn như điều hoà miễn dịch, chống oxy hóa, hoạt độngkháng u…đã được chứng minh trong nhiều mô hình động vật (Gou L và cộng sự,2009; Chang KC và cộng sự, 2007) Cho đến nay, hơn 130 triterpenes đã được

phân lập từ G lucidum và các hợp chất này được chú ý do tác dụng bảo vệ gan, ức

chế sự tăng trưởng khối u (Kimura Y và cộng sự, 2002) Đặc biệt trong nấm Linhchi, có hàm lượng germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 – 8 lần) (Boh B vàcộng sự, 2007)

Ngoài ra, nấm Linh chi cũng có chứa một mạng lưới chitin, đây là thànhphần mà cơ thể người không tiêu hóa được và đóng vai trò tạo nên độ cứng cápcho nấm Linh chi (Upton và cộng sự, 2000)

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm Linh chi trên thế giới và Việt

Nam

Linh chi đã được dùng cách đây hàng ngàn năm và đã được chọn lọc thànhnhững chủng thương phẩm, trồng nhiều ở các nước Châu Á như Nhật Bản, TrungQuốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam…

Năm 1997 sản lượng Linh chi được thống kê trên thế giới như sau: 4.300tấn trong đó Trung Quốc sản xuất đã là 3.000 tấn Hàn Quốc là nước sản xuất Linhchi nhiều thứ hai trên thế giới sau Trung Quốc, sản lượng của Hàn Quốc năm

1998 là

1307 tấn

Hơn 90 thương hiệu của các sản phẩm Gerdonama lucidum đã được đăng kí

và bán trên thị trường quốc tế (Lin S, 2000) Tiêu thụ trên toàn thế giới hiện nayước tính khoảng vài ngàn tấn và thị trường đang phát triển nhanh chóng Mặc dùkhông có những dữ liệu gần đây công bố liên quan đến tổng giá trị các sản phẩmLinh chi trên thế giới nhưng năm 1995, tổng giá trị ước tính hàng năm được đưa ra

Gerdonama lucidum được sản xuất từ các bộ phận khác nhau của nấm, hiện đang

có sẵn trên thị trường (Chang và Buswell, 2008)

Tại Việt Nam, nấm Linh chi thương phẩm được trồng đầu tiên năm 1987 tại

“Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu Tp.HCM” Sau đó, phong tràotrồng nấm Linh chi dần dần lan rộng khắp cả nước Sau 25 năm, sản lượng Linhchi của cả nước ước chừng 50 tấn/ năm Trong đó, Trung tâm đã là 30 tấn, còn 20tấn còn lại là do các trang trại hoặc các hộ nông dân của các tỉnh trồng

Hiện nay trên thị trường cả nước và nhất là thành phố Hồ Chí Minh bày báncác sản phẩm được chế biến từ Linh chi và nhiều nhất là tai nấm Linh chi Linhchi có nhiều chủng loại, giá bán thị trường tùy thuộc vào chất lượng và giá trị sửdụng của nấm, hiện nay giá nấm cao nhất là nấm có nguồn gốc Hàn Quốc Bêncạnh đó, việc tiêu thụ Linh chi ở Việt Nam tương đối khó do phải bảo đảm chấtlượng và giá thành còn cao so với thu nhập kinh tế của người dân Việt Nam nênphong trào trồng Linh chi ở Việt Nam không được mạnh so với các nước trong khuvực

1.1.5 Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2005)

Tương tự như bất kì loại vật nuôi hay cây trồng nào khác, nấm cũng có thể bịrất nhiều bệnh Trong hầu hết các trường hợp, bệnh làm giảm sản lượng và chấtlượng nấm, nghiêm trọng hơn là gây thất thu cho người trồng Bệnh có thể xảy ra

ở bất kì giai đoạn nào của quá trình nuôi trồng nấm và có 2 dạng chủ yếu là bệnhsinh lý và bệnh nhiễm

Bệnh sinh lý là do sợi tơ nấm rất mỏng manh và yếu ớt nên dễ bị tác độngcủa các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, pH, oxy và cả độ ẩm của môitrường Thường tơ yếu dần đến khi sức đề kháng giảm, dễ nhiễm bệnh và chết.Bệnh nhiễm với yếu tố gây bệnh rất đa dạng đa số là các nhóm vi sinh vậtnhư vi khuẩn, nấm mốc, nấm nhầy… Trong đó, vi khuẩn và nấm mốc có tốc độsinh sản nhanh, đặc biệt bào tử nấm mốc phát tán rộng nên khả năng lây nhiễm củachúng thường nhiều hơn Các tác nhân này ảnh hưởng gián tiếp đến sinh trưởng vàphát triển của nấm, bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng, sống kí sinh hút dinh dưỡng

không tạo thành hoặc dị dạng, năng suất giảm Bên cạnh đó, cơ chất dùng nuôi cấy hoặc trồng nấm cũng có thể là thức ăn cho nhiều loại vi sinh vật khác.

Đối với nhiễm bịch phôi có thể gặp mốc cam Neuroora.sp, đây là mốc hoại

sinh, xuất hiện giai đoạn đầu sau cấy giống Mốc tăng trưởng nhanh sinh tơ ănđầy bịch phôi, tơ có màu vàng hoặc hồng Sau đó xuất hiện khối thịt nấm màu camqua miệng bịch hoặc vết rách trên bịch Bệnh lây lan nhanh nên cần cô lập và dậpngay nguồn bệnh

Tác nhân gây bệnh khác có thể gặp trong nuôi trồng là nấm nhầy

Exomycetes Nguyên nhân do vệ sinh kém, nơi trồng ẩm ướt, nhà trồng hoặc dàn

kệ bằng gỗ hay nguyên liệu xử lý không tốt Bệnh biểu hiện dạng bọt trắng hayđục sữa, nhưng phổ biến vẫn là những vết lan thành hình rễ cây màu trắng hoặcvàng Thể sinh sản gồm các túi mang bào tử Bệnh làm giảm chất lượng nấm vàcạnh tranh một phần thức ăn, nhưng nấm vẫn có thể tạo tai và phát triển bìnhthường

Ngoài ra, nấm có thể bị bệnh mốc xanh gây ra bởi loài Trichoderma, là một

vấn đề nghiêm trọng cho những người trồng nấm trên toàn thế giới, bao gồm

Croatia (Hatvani L và cộng sự, 2012) Nhiều chủng nấm Trichoderma được phân

lập xem như là tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm nút trắng (Agaricus biorus sp.)

và nấm sò (Pleurotus ostreatus) nhiễm mốc xanh ở Croatia Một nghiên cứu

công bố loài Trichoderma longibrachiatum là tác nhân gây bệnh nấm mốc xanh

làm thiệt hại đáng kể trong sản xuất nấm trồng, bao gồm nấm nút trắng (Agaricusbiorus sp.) và nấm sò (Pleurotus ostreatus) (Kredics và cộng sự, 2010) Đây là nấmmốc kí sinh và khả năng gây hại rất lớn, thậm chí trên cả tai nấm (Linh chi) (LêDuy Thắng, 2005)

Theo A K Mukherjee và cộng sự (2014) khi nghiên cứu tiềm năng kiểm

soát sinh học của các chủng Trichoderma phân lập trên nấm hoang dã và vỏ cây cũng cho thấy chủng Trichoderma harzianum CICR-G được phân lập và xem là

một tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi ngoài tự nhiên

A B C

Hình 1.3 Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm: A: Nấm mốc cam Neurospora

sp nhiễm trên miệng bọc phôi trồng nấm; B: Nấm nhầy Exomycetes sp nhiễm trên phôi trổng nấm tạo; C: Nấm Trichoderma sp kí sinh trên tai nấm Linh chi.

Trong nuôi trồng, nhiều khi xuất hiện những nấm ngoài ý muốn, gọi là nấmdại Nấm dại thực ra là một trong những loài nấm lớn Chúng có sẵn trong nguyênliệu, do không khử trùng hoặc khử trùng không đúng quy cách, bào tử của nhữngnấm này tồn tại và phát sinh trở lại trên cơ chất trồng nấm Bào tử nấm dại cũng cóthể xâm nhập vào qui trình trồng nấm ở một giai đoạn nào đó Chúng phát triển vàcạnh tranh thức ăn với nấm trồng, kết quả làm sản lượng giảm và đôi khi cản trở sự

phát sinh quả thể của nấm trồng Thường gặp nhất là loài Coprinus (nấm đậu ).

Quả thể nấm tương tự nấm rơm, tai nấm lúc non dạng búp, trưởng thành có dạng

dù, nhưng mau tàn, mũ nhanh chóng chảy rữa ra thành dịch nước đen, nên còn cótên gọi nấm mực hoặc hắc thủ… Nấm phát triển tốt trên cơ chất có nhiều urê, pHthấp và độ ẩm cao, là một trong những đối tượng cạnh tranh với nấm rơm và một sốloài nấm trồng khác

Ngoài Coprinus, nhiều loài nấm phá hoại gỗ khác, như Schizophyllum commun, Trametes sp., Poria sp., Hypoxylon sp.… Các loài này chủ yếu cạnh

tranh về thức ăn với nấm trồng và thường xuất hiện khi trồng với gỗ khúc…

Bảng 1.1 Một số loài nấm mốc thường gặp trong nuôi trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2001) S

1.2 Giới thiệu về nấm Trichoderma

1.2.1 Phân loại

Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho việc

định danh, phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loạivẫn chưa được biết đầy đủ Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào

sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh

sản bào tử vô tính Năm 1801, Persoon đã xác định Trichoderma thuộc phân loại:

Giới: Fungi Ngành:

Ascomycota Lớp:

Sordariomycetes Bộ:

HypocrealesHọ: Hypocreaceae

Chi: Trichoderma

Hình 1.4 Hình thái nấm Trichoderma harzianum

( h ttp: //www.my cob an k.o rg/ )

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Sợi nấm của Trichoderma có tốc độ phát triển rất nhanh, chúng có thể

đạt đường kính khuẩn lạc từ 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy Trên môi trường PGAban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vànghoặc lục trắng Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch

của môi trường PGA hóa vàng (Bùi Xuân Đồng, 1982).

Sợi nấm Trichoderma không màu, có vách ngăn, cành bào tử không màu,

cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối trònmang các bào tử đính ở đỉnh Bào tử thường có màu xanh, hình t ròn, eliphoặc hình oval tùy từng loài Đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5µm

Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà

Trichoderma harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp

chất dinh dưỡng Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng

sống sót của Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng

nên Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học (Gary

J Samuels, 2004)

1.2.3 Đặc điểm sinh lí, sinh hóa (Gary J Samuels,

2004)

Nấm Trichoderma phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận

nhiệt đới, chúng hiện diện trong đất, trên rễ cây hay sống trên xác bã hữu cơ hay kí

sinh trên những loại nấm khác Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở

trong đất có độ pH từ 2,5 đến 9,5 Phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5 Nhiệt độ để

Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 – 300C Một vài dòng phát triển tốt ở

350C Một số ít phát triển được ở 400C Hình thái khuẩn lạc và bào tử của

Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau Ở 350C chúng tạo ranhững khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường,

ở 370C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy

Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic

(enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là 2enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối

kháng với Trichoderma Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nẩy

mầm Tuy nhiên cơ chế của tác động này chưa được nghiên cứu nhiều

1.2.4 Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng (Gary J Samuels, 2004; Gary E Harman và cộng sự, 2005)

Nấm Trichoderma đã được biết đến từ những năm 1920 là yếu tố kiểm soát chống lại mậm bệnh gây hại cây trồng Chi Trichoderma có khả năng đối kháng

nhiều loại nấm gây bệnh thực vật Các cơ chế chính để kiểm soát nấm hại đượcbiết đến bao gồm tính kí sinh nấm (giao thao sợi nấm, tiết enzyme phân hủy vách

tế bào), tiết kháng sinh kháng nấm, cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian sống

Cho đến nay, nấm Trichoderma được sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại nấm Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytis spp và Fusarium spp.…gây bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam

quýt, sầu riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như lúa, hồ tiêu, bắp, đậu, càrốt, cà chua…(Susanne Zeilinger và Markus Omann, 2007)

a Kí sinh nấm

Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế Weidling (1932) đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma kí sinh nấm gây bệnh và đặt tên

cho hiện tượng đó là “giao thoa sợi nấm”

Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” là hiện tượng tấn công trực tiếp củanấm này lên một nấm khác Nó là một quá trình rất phức tạp bao gồm các bướcchính sau: đầu tiên là nhận biết sự có mặt của nấm bệnh, sau đó là quá trình tấncông, xuyên qua thành tế bào và cuối cùng giết chết nấm bệnh Một số chi tiết

của cơ chế này ở Trichoderma đã được nghiên cứu và làm sáng tỏ.

Để giải thích rõ hiện tượng “giao thoa sợi nấm” chúng ta có thể chia quá

trình tấn công của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh làm 3 giai đoạn.

Giai đoạn 1: Bước đầu tấn công nấm bệnh

Tương tác đầu tiên là tơ nấm Trichoderma hướng về tơ nấm kí chủ Hiện tượng này là đặc tính hướng hóa của Trichoderma (Elad và cộng sự, 1983) Sau khi tơ nấm Trichoderma đã đến tơ nấm kí chủ, chúng có xu hướng tiếp xúc và

cuộn quanh tơ nấm kí chủ, ép chặt sợi nấm và phát triển song song với nấm kí chủ

Kết thúc giai đoạn đầu, nấm Trichoderma bước qua giai đoạn 2 là tiết enzyme.

Giai đoạn 2: Giai đoạn tiết enzyme phá hủy vách tế bào

Trichoderma có thể kí sinh trên các loài nấm khác nhau, mọc trên sợi nấm

nhờ tiết ra các enzyme phân giải (như enzyme cellulase, chitinase,Glucanase…) biến, phá huỷ thành tế bào nấm bệnh (Elad và cộng sự, 1983 )

Kết quả của những hoạt động phối hợp nhiều nhân tố này đã tạo thànhnhững lỗ thủng tại vị trí giác bám trên sợi nấm bệnh

Giai đoạn 3: Tấn công vào tế bào chất và tiêu diệt nấm bệnh

Các sợi nấm Trichoderma xuyên qua lỗ thủng vào khoang trong của nấm

bệnh, phá huỷ chất nguyên sinh nấm chủ và sinh trưởng trong đó.Sự phá hủy cácchất nguyên sinh của nấm bệnh làm cho chúng bị teo lại và chết đi

Hình 1.5 Trichoderma kí sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở cây họ đậu

(Nấm Trichoderma (màu vàng) tấn công nấm Pythium (màu xanh))

(Hubbard và cộng sự, 1983)

b Tiết kháng sinh

Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp

xúc và kí sinh đã làm cho nấm bệnh chết Tuy nhiên, ở những điểm không có sự

tiếp xúc của nấm Trichoderma nhưng nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là do tác động của chất kháng sinh peptaibols từ nấm Trichoderma sinh ra

gây độc cho nấm gây bệnh (Susanne Zeilinger và Markus Omann, 2007)

Hình 1.6 Trichoderma tiết enzyme chitinase và kháng sinh peptaibols phân hủy

vách tế bào nấm bệnh (Susanne Zeilinger và cộng sự)

Mendoza-Mendoza (2003) chỉ ra rằng những chủng T virens đột biến

mất khả năng kí sinh nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh cho

hiệu quả kiểm soát sinh học chống lại R solani và hạch nấm của S sclerotiorum

tương đương với chủng tự nhiên Kết quả này đã chỉ ra rằng kí sinh không là cơchế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể Sự sinh kháng sinh cũng

là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma Nó là một trong

những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học Những kháng sinh này có thể ứcchế mạnh sự sinh trưởng của những vi sinh vật khác

Chất kháng sinh peptaibols là một chuỗi các oligopeptides của 12-22amino acid có chứa nhiều α -aminoisobutyric acid, N-acetylated tại N-terminus và chứa một amino alcohol (Phenol hoặc Trypol) tại C-terminus

do T polysporum , hazianum, koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp

enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗtrợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh, vàkích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh (Francesco Vinale và cộng sự, 2008)

Francesco Vinale và cộng sự (2008), đã khảo sát khả năng đối kháng

của Trichoderma từ việc tiết kháng sinh để ức chế sự phát triển của các chủng nấm bệnh Ông sử dụng chất kháng sinh được tiết ra từ T hazianum bổ sung vào

môi trường nuôi cấy của chủng Penicilium ultimum Kết quả cho thấy ở đĩa (1) môi trường có chứa kháng sinh thì nấm Pythium ultimum bị ức chế không phát

triển được Trong khi đó đĩa (2) môi trường không chứa kháng sinh thì nấm

Pythium ultimum phát triển rất mạnh và không bị ức chế.

Hình 1.7 Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh

được tiết ra từ Trichoderma hazianum ( Francesco Vinale và cộng sự, 2008)

c Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian

sống:

Không chỉ có cơ chế kí sinh, sự sinh kháng sinh hay tiết enzyme là hiệuquả trong kiểm soát sinh học mà cơ chế cạnh tranh cũng được coi là cơ chế có ýnghĩa hết sức quan trọng vì sự thiếu dinh dưỡng là nguyên nhân gây chết phổ biếnđối với vi sinh vật Cơ chế này có thể được xem là sự đối kháng gián tiếp, đượcứng dụng nhiều và hiệu quả trong kiểm soát sinh học các bệnh do nấm (Gary E.Harman và cộng sự, 2005)

Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn cacbon, nitơ và yếu tố tăng trưởng khác với nấm bệnh Nấm Botrysis spp và Sclerotina spp g â y b ệ n h c h o c

â y b ằ n g c á c h x â m n h ậ p v ào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng

làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khỏe Nấm Trichoderma có khả

năng cạnh tranh, cũng sử dụng những mô già và mô chết của cây làm nguồn

dinh dưỡng, bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp và Sclerotina spp Sivan và Chet (1989),

đã chứng minh rằng sự cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T.

đế kiểm soát nấm bệnh Fusarium oxysporum.

Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium spp do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Pythium spp (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Pythium spp bằng cách sử dụng dịch tiết đó vì thế mà các bào tử Pythium spp không thể nảy mầm Trichoderma

còn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm củamầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầmbệnh

Bên cạnh đó, Trichoderma cũng tác động trực tiếp lên vùng rễ như loại

bỏ mầ m bệnh, làm tăng sự sinh trưởng và phát triển của rễ hoặc từ những

điểm mà Trichoderma tác động đến sẽ kích thích cây trồng tăng sản xuất các

enzym bảo vệ và các hợp chất kháng sinh nhờ đó giúp cây đề kháng tốt với mầmbệnh

1.2.5 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma trên thế giới và ở Việt Nam

Trên thế giới, những sản phẩm có chứa Trichoderma rất được quan tâm đưavào ứng dụng đối kháng với nấm bệnh gây hại trên một số cây trồng

Một số sản phẩm thương mại của nấm Trichoderma được sản xuất ở

các thị trường Châu Á, Châu Âu, và Hoa Kỳ để sử dụng trên một loạt các loạicây trồng Các dạng được sử dụng hiệu quả như bào tử, sợi nấm và bào tử váchdày (bào tử hậu) được sản xuất dưới một trong hai trạng thái rắn hoặc chất lỏng

lên men.(Harman và Cs, 2004) Sản phẩm Trichoderma 2000 (Israel) chứa nấm Trichoderma harzianum sử dụng trong phòng chống nấm Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfssi, Pythium spp Sản phẩm T22 và T22HB, Bio-Trek (USA) chứa nấm Trichoderma Harzianum trong phòng chống nấm Rhizoctonia spp., Sclerotium spp., Fusarium spp và một số loại nấm khác Sản phẩm Ecofit (Ấn Độ) chứa nấm Trichoderma viride trong phòng chống nấm Fusarium, Pythium , Rhizoctonia, Phytophthora spp trên cây bông vải, cây hướng dương, thuốc lá và

bệnh gây hại trên rễ cây trồng trong nhà kính Ngoài ra, còn có rất nhiều sản phẩm

chứa nấm Trichoderma ở nhiều nước trên Thế giới được ứng dụng trong phòng

chống nhiều loại bệnh do nấm gây ra trên cây trồng (CABI, 2001)

Ở Việt Nam, nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma

của nhiều đơn vị khác nhau đã và đang góp phần hạn chế các loại nấm bệnh trênnhiều loại cây trồng khác nhau như hồ tiêu, ca cao, cà chua, dưa hấu dưa leo, camquýt…

Các kết quả nghiên cứu và ứng dụng sử dụng nấm Trichoderma chủ yếu là dạng rải (thành phẩm sau khi đã trộn nấm Trichoderma với phân hữu cơ, ủ với xác

bã thực vật) hoặc tưới, phun xịt (dạng lỏng, bào tử nấm) để phòng và trừ một sốbệnh trên cây trồng do nấm gây ra

Năm 2005, Đinh Mạnh Hiệp và cộng sự bước đầu đã hoàn tất việc khảo sát

sự phân bố các chủng nấm Trichoderma tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh

miền Đông Nam Bộ Đồng thời nhóm nghiên cứu này cũng đã nghiên cứu sâu về

hoạt tính đối kháng của vi nấm Trichoderma đã phân lập đối với các loài nấm gây bệnh cây trồng phổ biến như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfssi, Phytophthora primulae và thử nghiệm ứng dụng chế phẩm Trichoderma tại một số nơi như xã

Bầu Lâm (Huyện Xuyên Mộc, Tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu), trạm bảo vệ thực vật LongKhánh…đã thu được một số kết quả ban đầu khá tốt

Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM đưa ra thị trường sản phẩm phân

bón BIMA dạng rải và dạng phun chứa nấm đối kháng Trichoderma trong phòng

trị bệnh trên cây cà phê, hồ tiêu, cây ăn trái, rau mau…và ủ chất hữu cơ, phụ phẩmnông nghiệp như rơm rạ, vỏ cà phê đạt những hiệu quả nhất định Nhóm nghiên

cứu Đại học Cần Thơ đã phối hợp các chủng nấm Trichoderma thành các sản

phẩm phòng trị hiệu quả theo từng nhóm đối tượng gây bệnh như: Tricô - ĐHCT

có khả năng phòng trị hiệu quả bệnh thối rễ trên cây ăn trái, rau màu do

Rizhoctonia spp và Fusarium spp gây ra; Tricô - Lúa Von phòng trị bệnh lúa Von

do F moniliforme; Tri cô - Phytoph trị bệnh do Phytophthora spp trên cây sầu riêng, hồ tiêu, cao su…; Tri cô - Khóm trị được bệnh do nấm Phytopphthora spp.

và Fusarium spp gây hại trên khóm ( Dương Minh và Cs, 2010).

Sử dụng nấm Trichoderma bảo vệ cây trồng khỏi các tác nhân gây bệnh sẽ

giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa học để tiêu diệt nấm gây bệnh, giảm thiểu sửdụng phân bón hóa học, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường.Việc sử dụngnấm đối kháng đóng vai trò là một tác nhân sinh học bảo vệ cây trồng còn là biệnpháp an toàn và hiệu quả, làm tăng năng xuất cây trồng, giữ được phẩm chất nôngsản

1.3 Giới thiệu với nấm Aspergillus

1.3.1 Phân loại

Aspergillus có khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên, trong đó

có các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,… có giá trị sử

dụng trong sản xuất enzyme, rượu, axit hữu cơ,…

Vị trí phân loại :

Giới: NấmNgành: Ascomycota Lớp: EurotiomycetesBộ: EurotialesHọ: Trichocomaceae

Chi: Aspergillus

1.3.2 Đặc điểm hình thái

Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, không màu, màu nhạt, một số trườnghợp trở nên nâu hay màu sẫm Bào tử trần không có vách ngăn, khác nhau về hìnhdạng, kích thước, màu sắc ở các loài khác nhau

Giống nấm này rất đặc biệt do chúng có hệ bào tử đính Bào tử đính pháttriển từ thành tế bào dày ở bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc Nó tạo thành sợicuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là túi Xungquanh túi là một hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tử hay thểbình Từ bộ cuống đính bào tử ngoài cùng, bào tử được sinh ra, gọi là bào tử đính.Không có một giống nấm sợi nào khác ngoài giống nấm này có hệ bào tử đính

tương tự (Nguyễn Đức Lượng, 2006).

Hình 1.8 Hệ bào tử đính của giống nấm sợi Aspergillus

A- Túi; B- Bộ cuống đính bào tử đầu tiên; C- Bộ cuống đính bào tử thứ hai; D- Bào tử đính; E- Sợi cuống; F- Tế bào gốc (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Một đại diện là nhóm Aspergillus niger khi nuôi cấy trên môi trường thạch

PDA ở 250C cho khuẩn lạc ban đầu màu trắng, sau nhanh chóng chuyển sang màuđen với việc tạo vô số bào tử đính, mặt trái khuẩn lạc màu hơi vàng nhạt và khi

trưởng thành có thể tạo đường rãnh phóng xạ trên bề mặt thạch Aspergillus niger

có bào tử đính trưởng thành hình cầu, phần lớn có kích thước 4,0 - 5,0µm, màunâu, hơi đen và có gai Túi và sợi cuống thường có màu nâu bóng (Bùi XuânĐồng, 1984; Nguyễn Đức Lượng, 2006)

1.3.3 Đặc điểm sinh lý, hóa sinh

Nấm Aspergillus có mặt khắp nơi trong tự nhiên, rất nhiều trong các vùng

khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Chúng phân bố rộng rãi và dễ thích nghi vìchúng có thể hình thành khuẩn lạc trên nhiều nguồn cơ chất khác nhau Nghiêncứu của Andrea Astoreca và cộng sự cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sự sinh

trưởng của Aspergillus niger, Aspergillus awamori khoảng 25 - 300C Wainwright

và cộng sự đã chỉ ra rằng, pH thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm Aspergillus awamori là khoảng 5,0 – 7,0 Độ pH quá acid (khoảng 2 – 3) sẽ ngăn cản sự tạo

thành bào tử, dẫn đến hệ sợi bị phân tán khi nuôi cấy chìm (Bùi Xuân Đồng,1982)

Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về enzyme của nấm Aspergillus niger,

gồm amylase, amyloglucosidase, cellulase, lactase, invertase, pectinase… Ngoài ra

chitinase của nấm này cũng được đề cập đến trong Hội nghị Quốc tế về

Aspergillus tại Nertheland vào tháng 3 năm 2010 Theo Takashi và cộng sự (2002), nhiệt độ thích hợp để Aspergillus sp tổng hợp chitinase có hoạt tính cao

nhất là 370C “Nguồn: The 7 th International Aspergillus Meeting (2010)”.

Vấn đề độc tố của Aspergillus niger cũng được đề cập đến, phần lớn chúng

không có hại, không tạo mycotoxin, nhưng một số có thể tạo độc tố gây hại đến

động vật và con người Sự an toàn của Aspergillus niger được đề cập đến trong

nhiều bài báo của các tác giả Schuster và cộng sự (2002), Van Dijck và cộng sự(2003), Blumenthal (2004), Olemsp.ka - Beer và cộng sự (2006), theo thông tintóm tắt từ những bài báo của các tác giả này, khoảng 3 – 10% các chủng

Aspergillus niger có khả năng sinh ra độc tố ochratoxin A trong những điều kiện

nuôi cấy xác định (Zofia Olempska - Beer, 2008)

1.3.4 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Aspergillus trên thế giới và ở Việt Nam

Các loài nấm thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ chất tự

nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp, ở nhiều vùng địa lý trên thế giới,được nghiên cứu và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau Đặc biệt loài

Aspergillus oryzae đã được dùng rộng rãi trong công nghệ lên men truyền thống để

chế biến thực phẩm ở nhiều nước Châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, NhậtBản…

Hiện nay, công nghệ sinh học sử dụng một số loài thuộc chi Aspergillus chủ yếu là các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae trong công nghiệp sản xuất

enzyme (α-amylase, pectinase, protease, cellulase), trong công nghệ chế biến thựcphẩm, trong công nghệ sản xuất một số acid hữu cơ như acid citric, acidgluconic…

Một số loài có khả năng tạo ra các chất kháng sinh như Aspergillus candidus tạo thành candidulin, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamatti tạo thành

acid kojic có tác dụng ức chế đối với một số vi khuẩn Trong đó đã thực sự được

dùng trong công nghiệp dược phẩm chỉ có loài Aspergillus fumigatus để sản xuất

fumagilin làm thuốc chữa lị amip Đặc biệt đáng chú ý là các loài tạo thành các

độc tố gây ung thư gan như các loài Aspergillus flavus, Aspergillus paraticus tạo thành aflatoxin, Aspergillus versicolor tạo thành sterigmatocystin.

Ở Việt Nam, nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các loài Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae có hoạt tính α-amylase và

glucoamylase cao để thủy phân tinh bột sắn (N.B.Ngà và N.L.Dũng, 1984);

Nghiên cứu thu nhận và sử dụng enzyme protease từ Aspergillus oryzae trong sản

xuất nước chấm (Q.V.Thịnh, 1977), để khử lông da súc vật (L.V.Nhương và Cs.,

1977); nghiên cứu sử dụng sinh khối một số chủng thuộc loài Aspergillus niger để

nâng cao chất lượng thức ăn chăn nuôi (N.L.Dũng và Cs, 1984); nghiên cứu khả

năng sinh tổng hợp acid citric của một số chủng thuộc loài Aspergillus niger

(N.T.Hương và N.L.Dũng, 1984); nghiên cứu hoạt tính phân giải phosphate khó

tan và cellulose của Aspergillus japonicus (P.V.Ty và Đ.T.Lương, 1998); nghiên

cứu hệ vi nấm đối kháng với các vi khuẩn kháng kháng sinh ở Việt Nam, trong đó

có 14 loài thuộc chi Aspergillus có hoạt tính này (Bùi Xuân Đồng và Cs, 1978)…

(Trích dẫn bởi Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn, 2000)

1.4 Bệnh do nấm Rhizoctonia spp gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas,

2005)

Ở Việt Nam có nhiều bệnh do nấm Rhizoctonia gây ra Một số loài phát

triển, xâm nhiễm, gây bệnh trên thân cây và bề mặt lá trong điều kiện thời tiết ấm,

mưa hoặc ẩm độ cao Nấm Rhizoctonia thường gây bệnh ở rễ, phần thân sát mặt

đất ở cây non và trên bắp, thân và lá ở cây trưởng thành Một số triệu chứng

thường gặp do Rhizoctonia gây ra bao gồm: thối rễ, lở cổ rễ cây non, teo thắt thân,