Phân lập tuyển chọn vi khuẩn bacillus spp ứng dụng bảo quản nông sản

Nghiên cứu các củ lạc đó, thì phát hiện có những loài vi khuẩn và nấm có khả năng hoặc ức chế sự hình thành các Aflatoxinhoặc biến đổi những Aflatoxin được sản sinh ra thành những chất í

Đồ án tốt nghiệp

i

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ,ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH .Error! Bookmark not

defined TÓM TẮT CÔNG TRÌNH .Error! Bookmark

not defined.

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined.

1.1 Nấm Aspergillus flavus Error! Bookmark not defined.

1.1.1 Hình thái Error! Bookmark not defined.

1.1.2 Sinh thái Error! Bookmark not defined.

1.1.3 Thành tế bào Error! Bookmark not defined.

1.2 Độc tố aflatoxin Error! Bookmark not defined.

1.2.1 Lịch sử phát hiện aflatoxin Error! Bookmark not defined.

1.2.2 Các loài có khả năng sinh độc tố Error! Bookmark not defined.

1.2.3 Cơ chất và môi trường Error! Bookmark not defined.

1.2.4 Cấu trúc và tính chất của aflatoxin Error! Bookmark not defined.

1.2.5 Cơ chế gây độc của aflatoxin Error! Bookmark not defined.

1.2.6 Độc tính của aflatoxin Error! Bookmark not defined.

1.2.7 Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin Error! Bookmark not defined.

Đồ án tốt nghiệp

1.2.8 Tình hình nhiễm độc aflatoxin Error! Bookmark not defined.

1.3 Các phương pháp phát hiện aflatoxin Error! Bookmark not defined.

1.3.1 Phương pháp phát quang sinh học (Hamed K.Abass và cộng sự, 2004)

Error! Bookmark not defined.

1.3.2 Phát hiện bằng đường lý - hoá học Error! Bookmark not defined.

1.3.3 Các phương pháp định lượng Error! Bookmark not defined.

1.4 Phương pháp khử nhiễm aflatoxin Error! Bookmark not defined.

1.4.1 Phương pháp vật lý học Error! Bookmark not defined.

1.4.2 Phương pháp hóa học Error! Bookmark not defined.

1.4.3 Phương pháp sinh học: Error! Bookmark not defined.

3 MỤC TIÊU – PHƯƠNG PHÁP Error! Bookmark not defined.

4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined.

CHƯƠNG I: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3

2.1 Vật liệu – thiết bị – hóa chất 35

2.1.1 Vật liệu 35

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 35

2.1.3 Môi trường - Hóa chất 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.2.1 Mục tiêu: 37

2.2.2 Nội dung: 37

Đồ án tốt nghiệp

2.2.3 Bố trí thí nghiệm và phương pháp 37

CHƯƠNG II: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Phân lập nấm sinh aflatoxin từ sản phẩm nông nghiệp 51

3.1.1 Phân lập nấm từ sản phẩm nông nghiệp và khảo sát đặc điểm hình thái 51

3.1.2 Khảo sát hình thái nấm phân lập trên môi trường phân biệt AFPA 53

3.1.3 Khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng nấm phân lập 54

3.1.4 Định tính aflatoxin bằng phương pháp HPLC 55

3.2.Phân lập vi khuẩn Bacillus spp từ các nguồn nông sản dễ nhiễm mốc và đất trồng Error! Bookmark not defined 3.3 Tuyển chọn vi khuẩn tổng hợp hợp chất kháng nấm sinh aflatoxinError! Bookmark not defined 3.3.1 Khảo sát vi khuẩn có khả năng kháng nấm khi đồng nuôi cấy với nấm sinh aflatoxin 57

3.3.2 Chọn lọc chủng có khả năng tổng hợp chất kháng nấm mạnh nhất 59

3.3.3 Phương pháp đối kháng sử dụng dịch nuôi cấy có tơ nấm làm chất cảm ứng 59

3.4 Khảo sát đặc điểm của VK chọn lọc và xác định sản phẩm trao đổi chất kháng nấm 62

3.4.1 Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hóa và khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng VK chọn lọc 62

3.4.2 Xác định tác nhân đối kháng nấm mốc 65

3.5 Khảo sát khả năng sử dụng sản phẩm trao đổi chất chủng CS1b trong bảo quản hạt bằng phương pháp tạo màng bao 69

KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 73

Đồ án tốt nghiệp

1 Kết luận 73

2 Kiến nghị 74

5 TÀI LIỆU THAM KHẢO VÀ PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined.

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

PHỤ LỤC 77

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC VIẾT TẮT

AFPA: Aspergillus flavus and parasiticus agar

EA: Ethyl Acetat

NA: Nutrient agar

NB: Nutrient broth

MT: Môi trường

PDA: Potato dextrose agar

HPLC: High ferformane thin layer chromatography

TLC: Thin layer chromatographi

UV: Ultraviolet

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

TRANGBảng 1.1: Một số loài nấm mốc có khả năng sinh Aflatoxin 7

Bảng 1.2: Ảnh hưởng của chủng Asp flavus và các điều kiện nuôi cấy để sản sinh

ra Aflatoxin 10

Bảng 1.3: Ảnh hưởng của các đường hexose khác nhau lên lượng Aflatoxin sinh ra.

11

Bảng 1.4: Tính chất hóa lý của một số aflatoxin 14

Bảng 1.5: Ảnh hưởng của Aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý

ở vật nuôi 16

Bảng 1.6: Giới hạn aflatoxin ở một số nuớc theo tiêu chuẩn của FDA 18 Bảng 1.7: Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên

liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam 19

Bảng 1.8: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học 34 Bảng 2.1: Thành phần dung dịch được sử dụng để làm màng bao đậu phộng 48

Bảng 3.1: Khả năng sinh aflatoxin của các nấm mốc phân lập trên sản phẩm nông

nghiệp 55

Bảng 3.2: Tỉ lệ đối kháng trực tiếp của các chủng vi khuẩn với các chủng nấm 57 Bảng 3.3: Tỉ lệ đối kháng (%) của 4 chủng vi khuẩn tuyển chọn đối với chủng nấm

CĐP1 theo cả 3 phương pháp 60

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.4: Đặc điểm nuôi cấy của vi khuẩn CSb1 62 Bảng 3.5: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch nuôi cấy CSb1 65 Bảng 3.6: Kết quả phân tích định tính các chất có trong các dung dịch trích ly 66 Bảng 3.7: Khả năng ức chế nấm mốc và vi khuẩn phát triển trên hạt đậu phộng

được bao màng chitosan và sản phẩm trao đổi chất CS1b 69

Hình 1.2: Nấm mốc Asp.flavus trên hạt đậu phộng 5

Hình 1.3: Cấu tạo của Aflatoxin 13 Hình 1.4: Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan 15

Hình 2.1: Sơ đồ chi tiết phân lập vi nấm sinh aflatoxin từ hạt đậu phộng, đậu nành,

cà phê hư hỏng, khảo sát khả năng sinh aflatoxin của chúng 38

Hình 2.2: Sơ đồ phân lập vi khuẩn Bacillus spp từ các nguồn hạt 41

Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm sàng lọc tuyển chọn VK đối kháng nấm mốc sinh

aflatoxin 43

Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm VK chọn lọc và xác định sản

phẩm trao đổi chất có hoạt tính kháng nấm 46

Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng bằng màng bao

kháng nấm 48

Hình 3.1: Mẫu hạt nuôi cấy trên môi trường WA 51 Hình 3.2: Các chủng nấm phân lập trên PDA 53

Hình 3.3: Kết quả chạy sắc ký bản mỏng (TLC) của các chủng vi nấm phân lập

phát hiện phát huỳnh quang khi chiếu tia UV 254 nm 54

Hình 3.4: Kết quả định tính aflatoxin bằng phương pháp HPLC 55

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.5: Kết quả khẳng định khả năng sinh tính aflatoxin bằng phương pháp tái

nhiễm 56

Hình 3.6 : Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp đối với các nấm sinh aflatoxin 59

Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng của 4 chủng vi khuẩn đối với nấm CĐP1 61

Hình 3.8: Kết quả đối kháng của VK CS1b với nấm mốc CĐP1 sau 72 giờ 62

Hình 3.9: Hình thái vi khuẩn CS1b 64

Hình 3.10: Khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng CS1b sau 48 giờ ủ 65

Hình 3.11: Khảo sát đối kháng của cao ethyl acetate đối với sự phát triển nấm mốc. 68

Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng nấm mốc CĐP1 của dịch nuôi cấy cảm ứng ly tâm, cao ethyl acetate trong DMSO và bản thân DMSO 68

Hình 3.12: Kết quả coating đậu phộng ngày thứ 10 72

Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus tạo ra, là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc

cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thưgan…), gây quái thai, gây đột biến, thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tửvong Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất

độc nguy hiểm nhất Mặc dù sự hiện diện của Asp flavus không phải lúc nào cũng

gắn liền với việc tồn tại aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng nó cũng thể hiệnnguy cơ lớn về việc có thể nhiễmaflatoxin

Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thườngcao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa trong khi các phương tiệnthu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo thoáng mát làđiều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm vàthức ăn chăn nuôi

Do đó việc kiểm soát dư lượng aflatoxin là cần thiết và quan trọng Giới hạn về mứcnhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn của an toàn vệ sinh thực phẩm.Bảo quản nông sản bằng áp dụng các chất chống mốc hóa học có thể ảnh hưởng xấulên sức khỏe người tiêu dùng Để áp dụng “bảo quản sinh học”, các sản phẩm traođổi chất vi sinh vật thường được áp dụng Đó là lý do chúng tôi đã chọn nghiên cứu

về: “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp ứng dụng bảo quản nông sản”.

2 Mục đích nghiên cứu

- Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật trong bảo quản nông sản (bảo quảnsinh học)

3 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp từ nông sản có khả năng đối kháng nấm

mốc sinh aflatoxin để ứng dụng trong bảo quản nông sản

4 Nội dung nghiên cứu

i) Phân lập vi nấm sinh aflatoxin từ hạt nông sản sau thu hoạch như hạt đậuphộng, hạt đậu nành và hạt cà phê, khảo sát khả năng sinh aflatoxin của cácchủng nấm phân lập

ii) Phân lập vi khuẩn Bacillus spp từ các nguồn trên bị nhiễm nấm mốc

iii) Khảo sát khả năng đối kháng của các Vi khuẩn Bacillus spp với các nấm

sinh aflatoxin, chọn lọc chủng Vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh nhất.iv) Khảo sát các đặc điểm nuôi cấy của chủng Vi khuẩn chọn lọc và xác địnhsản phẩm trao đổi chất của Vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm

v) Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của Vi khuẩn có hoạt tính kháng nấmtrong bảo quản hạt

5 Phương pháp nghiên cứu

a Phương pháp luận

Có nhiều phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn đối vớinấm sinh aflatoxin Trong đó, hai phương pháp tối ưu đã được sử dụng là phươngpháp đồng nuôi cấy ly tâm và phương pháp sử dụng tơ nấm làm chất cảm ứng Tuynhiên, môi trường đồng nuôi cấy và môi trường sử dụng tơ nấm làm chất cảm ứngchứa nhiều chất dinh dưỡng, ảnh hưởng đến khả năng kháng nấm trong điều kiện in

vivonên cần xác định tác nhân đối kháng để loại bỏ môi trường dinh dưỡng mà vẫn

giữ được khả năng đối kháng cao nhất

b Phương pháp xử lý số liệu

- Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị

- Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lí số liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Nấm Aspergillus flavus

1.1.1 Hình thái

Loài Aspergillus flavus rất dễ nhận biết bởi màu vàng hơi lục và dạng ít nhiều vón

cục của tán Ở đỉnh các cuống bào tử đính mọc thẳng đứng, có vách sần sùi, hìnhthành những đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thuôn dài Các thểchai hoặc đính trực tiếp vào đầu mang bào tử đính (thể bình một lớp) hoặc qua mộtlớp thể bình trung gian (thể bình 2 lớp); đôi khi cả hai kiểu đồng thời tồn tại

Hình 1.1: Hình thái nấm mốc Asp.flavus.

Các bào tử có kích thước khá lớn (đường kính từ 5-7μm) hình cầu, màu vàng nâu

đến hơi lục, hơi sần sùi Đôi khi người ta chỉ coi là thuộc loài Asp.flavus những loài nấm có cuống bào tử đính xù xì và hai lớp thể bình, còn ở loài Asp parasiticus thì

cuống bào tử đính nhẵn và thể bình một lớp

1.1.2 Sinh thái

Asp flavus được xem là loài được phân bố khắp mọi nơi: dưới đất, trên các chất

hữu cơ, và các loại hạt nhất là các hạt có dầu Từ lâu, người ta đã phát hiện sự cómặt của nó ở dưới đất, dù là trong rừng, ở vùng than bùn, vùng đất hoang sa mạcSahara, hoặc trong đất cày cấy, đất mùn, hệ rễ cà chua, hoặc hệ rễ lúa mì Người tacòn coi nó là có thể nhanh chóng xâm nhập lại đất đã khử trùng bằng hơi nước Đấtđai vùng nhiệt đới chứa nhiều loài này hơn nhiều so với đất đai vùng ôn đới Nóthường gặp trên lúa mì, bột, trên các chế phẩm bột sống, trong bánh mì

Ngô gạo cũng như các sản phẩm từ ngô gạo thường chứa loài này Nó có rất nhiềutrên sợi bông và nhất là trên hạt bông, nó xâm nhập vào hạt qua các điểm hợp hoặc

nhờ những chỗ hủy hoại do côn trùng gây ra Ngoài ra người ta còn thấy nó trên:hạt và khô dầu tương, củi dừa, sắn, nhân hạt ca cao, quả cà phê, quả hồ đào Brazin,thuốc lá, hạt lúa miến, hạt hướng dương, hạt thông, kê, ớt hạt tiêu đỏ, củ cải đường,quả lê, giăm bông, dồi thịt và nhiều thức ăn khác Sự có mặt của các loài này trongcác thức ăn phức hợp của gia súc, ngay khi nuôi không có ngô lạc, trên cỏ khô giasúc cũng vậy Nếu có điều kiện thuận lợi, nó sinh sôi này nở rất nhiều; trên lúa mìtồn trữ trong kho kín có độ ẩm 15,2 % đến 17% bào tử của nó chiếm từ 50-100%tổng số bào tử có mặt, nhiều đến nỗi trên mặt kho đóng vón lại thành một lớp vỏcứng sâu tới 0.6m Nó cũng thường có mặt trên ngô bẹ khi độ ẩm vượt quá 15,5%

Nấm mốc độc Asp flavus gặp nhiều ở các loại lương thực, thực phẩm khác nhau,

nhưng các loại hạt có dầu (đặc biệt là lạc) thích hợp nhất cho sự phát triển của nó,

và cũng ở lạc độc tố Aflatoxin hình thành mạnh nhất Người ta nghiên cứu hơn1.000 mẫu lạc thí nghiệm thì thấy lạc hạt có 3,3% số củ là rất độc - 1kg chứa trên

0,25mg Aflatoxin B1 (độc tố chủ yếu của Asp flavus) và 21,7% số củ độc vừa, 75%

số củ không độc Còn trên khô lạc: 42% số mẫu là rất độc, 49,3% độc vừa và chỉ có8,7% là không độc Như vậy chất độc tích lũy lại trong khô lạc là do sự chế biến,

hoặc do Asp flavus phát triển mạnh lên.

Bào tử của nấm Asp.flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong nước, trong

đất Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trên lương thực,thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng Vì phạm vi kýchủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại này thường rất khó khăn

Nấm Asp flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương thực như: lúa, ngô, sắn, trên

một số loại hạt làm thực phẩm như: lạc, đậu, vừng, trên thực phẩm như: các sảnphẩm chế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng, đậu đỗ, và thậm chí cả trên hoa quả tươi bị dậpnhư: thanh long, nhãn, xoài, vải Trong quá trình xâm nhiễm, sinh trưởng phát triển,chúng tiết ra độc tố Aflatoxin

Hình 1.2: Nấm mốc Asp.flavus trên hạt đậu phộng.

Gạo và lạc là nguồn lương thực, thực phẩm rất cần thiết và quan trong đối với conngười Song nếu gạo và lạc không đảm bảo an toàn thì đây lại là nguồn lây nhiễmcho con người những căn bệnh hiểm nghèo, đặc biệt là ung thư gan Đứng trên góc

độ an toàn thực phẩm các nhà khoa học đều cho rằng tác nhân gây ngộ độc thựcphẩm lớn nhất trong gạo và lạc là nấm mốc

Lạc và các sản phẩm từ lạc chắn chắc là nơi phát triển ưa thích nhất của Asp.flavus.

Không phải chỉ có duy nhất loài này, nhiều loài nấm khác thường đi kèm với nó,trong số này một số lớn loài cũng được xem là độc với súc vật: một số loài

Fusarium trong đó có F monoliforme, các loài Rhizopus, các loài Penicillium citrinum, P purpurogenum.

Lạc là một loại hạt có nước: 7,4%, protein: 28%, lipid: 44,5%, glucid: 15% Các

nhà khoa học cũng đã phân lập được ở trong lạc có một loài nấm độc Asp.flavus và

thấy rằng các trường hợp ngộ độc trước đây đều liên quan đến nấm mốc độc đó.Nấm mốc độc này cũng có gặp ở trong một số ngũ cốc khác nhưng với lạc có thể làmôi trường thuận lợi nhất cho nó phát triển Nấm mốc khi xâm nhập vào trong lạcchúng phát triển làm cho lạc bị mốc xanh hoặc mốc vàng Đặc biệt nấm mốc nàysinh ra độc tố Aflatoxin

Trong gạo có chứa các thành phần hoá học như ở gạo tám glucid: 82,2%, protein:6,6%, nước: 10%, lipid: 1,0%, chất khoáng: 0,4%, vitamin B1: 0,08% Do đó đây làmột môi trường rất thuận lợi cho nấm mốc xâm nhập và phát triển khi biện phápbảo quản không hiệu quả So với thóc, gạo không còn lớp vỏ trấu để bảo vệ, cácchất dinh dưỡng ở lớp ngoài của gạo lại nhiều nên rất dễ bị nấm mốc phá hoại Đặc

biệt ở nước có khí hậu nóng ẩm, đây là một điều kiện tốt để cho nấm mốc sinhtrưởng gây ảnh hưởng đến chất lượng của gạo.Các nhà khoa học đã phân lập đượcnhiều loài nấm mốc trên gạo, trong mỗi loài có nhiều chủng, nhưng có hai loài hay

này là Aflatoxin do vi nấm Asp flavus và Asp parasiticus Aflatoxin có 4 dẫn xuất

quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2.Giữa 4 loại trên thì Aflatoxin B1 chiếmnhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổbiến nhất (Nabil Saad, 2004)

Năm 1961, các công trình nghiên cứu công nhận rằng Aflatoxin được sinh ra bởi

nấm Asp flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u gan của động vật.Trên động

vật thủy sản, những nghiên cứu đầu tiên về độc tố Aflatoxin trên cá hồi được thựchiện bởi Ashley và các cộng sự

Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố Aflatoxin.Các nhà khoa họccũng đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin

1.2.2 Các loài có khả năng sinh độc tố

Aflatoxin được sản sinh chủ yếu từ 2 chủng nấm quen thuộc là chủng Asp flavus và Asp parasiticus.Ngoài ra còn có một số loài khác cũng có khả năng sinh Aflatoxin nhưng yếu hơn như Asp.nomius (C.P Kurtzman và cộng sự, 1987) và Asp Bombycis (S.W Peterson và cộng sự, 2001).

(Nguồn: Phạm Hoàng Thái,2007)

Không phải tất cả các chủng Aspergillus flavus được khảo sát đều sinh ra độc tố

Aflatoxin, chỉ có 73% có khả năng sinh Aflatoxin, trong đó có 23% sản sinhAflatoxin ở mức cao nhất Một số tác giả ghi nhận được nhiều biến đổi quan trọng

về mặt sinh độc tố tùy theo cơ chất, từ đó đã phân lập chủng Asp flavus và tùy theo

nguồn gốc địa lý: trong số 284 mẫu phân lập từ gạo ở Mỹ có 94% số chủng sinh độc

tố, 86% đối với các mẫu phân lập từ lạc, và 71% cũng được phân lập từ lạc như ởIxraen Các chủng gốc vùng nhiệt đới có nhiều loài sinh độc tố hơn vùng ôn đới Ngoài ra, số lượng Aflatoxin sản sinh ra cũng thay đổi rất nhiều tùy theo các chủng,người ta đã tìm thấy điều này khi nuôi cấy chúng để so sánh trên cùng một cơ chất

và trong những điều kiện như nhau Người ta đã ghi lại những mức sản sinh từ mộtvài mg/kg đến 100, 200, 500, 1000 và thậm chí gần 2000 mg/kg cơ chất.Gần đâyhơn, ngoài việc định lượng tổng số Aflatoxin, người ta còn quan tâm xác định tỷ lệriêng phần của các Aflatoxin đã biết Nói chung, Aflatoxin B1 được tạo ra nhiềunhất trong cả thiên nhiên lẫn trong nuôi cấy, rồi đến Aflatoxin G1, sau đó làAflatoxin B2, còn về G2 và các chất khác tỷ lệ thấy khá thấp

Người ta đã thử nhận dạng các chủng sinh độc tố và các chủng không sinh độc tốqua những đặc điểm hình thái Một số người cho rằng các chủng sinh độc tố bao giờcũng có đầu bào tử đính màu xanh lục, ngay cả ở các giống nuôi cấy lâu ngày, thểbình hai lớp, cuống bào tử đính có vách có gai, ở những chủng sinh độc tố có sựphình to một số phần của sợi nấm tạo thành những cục nhỏ, những dị thường đặctrưng cho các dòng sản sinh Aflatoxin Tuy nhiên, thường rất khó thăm dò biết mộtcách chắc chắn những chủng có sinh Aflatoxin và những chủng không sinhAflatoxin ngoài cách dùng con đường sinh học và hóa học

Một số chủng sinh độc tố có thể mất khả năng đó qua nhiều lần cấy truyền liên tiếptrên các môi trường tổng hợp Thế nhưng tính độc của một chủng tăng lên khi cấytruyền liên tiếp trên những môi trường tự nhiên thích hợp

Một số loài nấm mốc khác cũng có khả năng sinh Aflatoxin với lượng rất ít như

loài: Penicillium puberulum Bai, các chủng thuộc Aspergillus như Aspergillus tamariikita, Aspergillus niger tiegh, Aspergillus ostiamis wehmen, Aspergillus ruper Tuy nhiên cũng còn nhiều tranh cãi vì trong quá trình phát triển, Asp flavus thường lẫn với nhiều loài nấm khác, đặc biệt là với Penicillium rubrum stoll và khi

đó có thể nhầm Aflatoxin là do Penicillium sản sinh ra Trong một số trường hợp,

cũng có thể nhầm lẫn với độc tố Sterigmatoxistin và Avecsin vì có cấu tạo hóa họcgần giống với Aflatoxin

1.2.3 Cơ chất và môi trường

Khả năng sinh độc tố của các chủng Asp flavus và Asp parasiticus rất khác nhau.

Điều đó phụ thuộc vào các yếu tố như chủng nấm mốc, các cơ chất, các yếu tố nhiệt

độ, độ ẩm của cơ chất và môi trường

Các chủng phát triển trên hạt có dầu và nhất là trên lạc và những sản phẩm từ lạcđược ghi nhận sinh đôc tố nhiều hơn các chủng phân lập từ sản phẩm ngũ cốc ở cácnước thuộc địa Các chủng phân lập từ thịt ôi, bánh mì, các thực phẩm bột sốnghoặc pho mát ô nhiễm tự nhiên thường không hoặc ít sinh độc tố.Ngược lại, gầnmột phần ba số chủng phân lập từ gia vị có sản sinh Aflatoxin

Tính độc của một số chủng được giảm độc tính nếu sau này các chất độc của chúngđược những vi sinh vật khác chuyển hóa thành những chất dẫn xuất không hoạt

động Chính vì vậy ở Texas, người ta rất ngạc nhiên khi thấy lạc có vỏ nhiễm Asp flavus rất nặng nhưng lại có độ độc thấp Nghiên cứu các củ lạc đó, thì phát hiện có

những loài vi khuẩn và nấm có khả năng hoặc ức chế sự hình thành các Aflatoxinhoặc biến đổi những Aflatoxin được sản sinh ra thành những chất ít độc hơn Người

ta đã dựa trên hiện tượng này để tìm tòi một biện pháp sinh học nhằm tẩy độc cácsản vật đã bị hư hỏng

Sản lượng Aflatoxin thường tỷ lệ với trọng lượng hệ sợi nấm tạo thành khi nuôicấy: khi số lượng hệ sợi nấm đạt trị số tối ưu thì sản lượng đó lớn nhất, nhưng nógiảm sút rất nhanh chóng bắt đầu từ lúc hệ sợi nấm tự phân giải: sự phân giải nàytương ứng với sự phân hủy các Aflatoxin, được đẩy mạnh khi thông khí tốt và lắcmạnh các bình nuôi cấy

Nhìn chung, sự sản xuất Aflatoxin, trong điều kiện nuôi cấy thông thường, bắt đầu

từ lúc hình thành các cơ quan mang bào tử đính của Asp flavus, nó tăng dần cho

đến giai đoạn sinh bào tử mạnh mẽ, tức là khoảng ngày thứ 6 rồi giảm sút

Nhiều yếu tố vật lý và dinh dưỡng khác cũng ảnh hưởng đến hàm lượng Aflatoxinđược sinh ra trong điều kiện nuôi cấy và điều kiện tự nhiên.Những biến thiên vềnhiệt độ có thể thấy trong thiên nhiên, với nhiêt độ ở các đỉnh cao là 45-500C chothấy không thuận lợi cho việc sản sinh Aflatoxin bằng nhiệt độ ổn định ở 250C.Hàm lượng nước của cơ chất có vai trò trong việc sản sinh Aflatoxin, gắn liền với

sự phát triển tương đối của Asp flavus, ở 320C trên lạc có hàm lượng nước trongkhoảng 15 và 30% Aflatoxin hình thành sau 2 ngày Như vậy, trong điều kiện nhiệt

đới, nếu Asp.flavus phát triển trên lạc không có Aflatoxin thì 48h sau có thể phát

hiện được Aflatoxin Trên gạo có hàm lượng nước 24-26% hoặc trên ngô 19-24%,Aflatoxin cũng hình thành nhanh chóng như vậy nếu nhiệt độ khá ấm

Giá trị pH ban đầu có ảnh hưởng rất ít đến sự hình thành Aflatoxin.Giá trị pH thích

hợp để Asp.flavus sinh độc tố aflatoxin ở giá trị pH giữa 4-5 Hàm lượng khí cacbonic tăng lên trong khí quyển làm hạn chế sự sinh trưởng của Asp flavus do đó

giảm lượng Aflatoxin sinh ra, giảm hàm lượng oxi và tăng hàm lượng nitơ trong khíquyển hàm lượng Aflatoxin cũng giảm Các Aflatoxin được xem là nhạy cảm vớiánh sáng, nhưng thực tế chúng nhạy cảm với tia tử ngoại

Người ta đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu về tầm quan trọng của các yếu tốdinh dưỡng khác nhau lên sản lượng Aflatoxin thể hiện qua các điều kiện nuôi cấykhác nhau

Bảng 1.2: Ảnh hưởng của chủng Asp flavus và các điều kiện nuôi cấy để sản sinh

ra Aflatoxin

Chủng Môi trường nuôi cấy Tổng

lượngAflatoxin(mg/l hoặcmg/kg)

Ghi chú: ATCC, NRRL : ký hiệu của bộ sưu tập chủng chuẩn

(Nguồn: Phạm Hoàng Thái, 2007)

Nguồn Cacbon : Nhiều tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm các đường

hexose vào môi trường nuôi cấy chất khoáng lên hàm lượng Aflatoxin do A flavus

sinh ra và ghi nhận các đường glucose, fructose, manose thuận lợi cho sự tổng hợpAflatoxin

Bảng 1.3: Ảnh hưởng của các đường hexose khác nhau lên lượng Aflatoxin sinh ra.

Các ion kim loại: Sự có mặt của Zn, catmi, Mg hoặc Fe kích thích sự sản sinhAflatoxin, Co, Cr, Ca, Mn chỉ có ít hiệu lực Thêm 3,9 μmol Bari acetate thì sự tạothành Aflatoxin bị ức chế

Các chất khác: khi Asp flavus phát triển trên hạt lúa mì, lượng Aflatoxin tạo ra ở

giai đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn ở giai đoạn phôi nhũ Ngoài ra, người ta thấyviệc thêm lipid (chiết từ mầm lúa mì bằng pentan) vào một cơ chất gồm mầm lúa mì

đã loại bỏ lipid có hiệu quả tốt đến việc sản sinh Aflatoxin Ảnh hưởng có lợi củacác acid béo đến việc hình thành độc tố được nhiều người công nhận, làm cho người

ta nghĩ rằng chúng có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp các Aflatoxin;việc phân hủy sinh học của chúng đưa đến sự hình thành các tiền sản phẩm tham giavào vòng chuyển hóa sinh tổng hợp Aflatoxin Thêm dimetylsulfoxide (DMSO) vàomôi trường nuôi cấy sẽ làm nồng độ Aflatoxin hoặc tăng lên chút ít hoặc giảm sútnhiều Ở đây có lẽ là một tác động chuyển hóa qua lại hơn là một phản ứng hóa họcgiữa DMSO và các Aflatoxin

1.2.4 Cấu trúc và tính chất của Aflatoxin

Các Aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật Hiện nay người ta đã tìmthấy khoảng 18 loại aflatoxin khác nhau, tuy nhiên có 4 loại chính thường gặp nhấtgồm 4 hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản phẩm trao đổi chất tạo bởi

nấm Asp.s flavus và Asp parasiticus, được đặt tên là B1, B2, G1, G2.

Bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng.B là chữ viết tắt củaBlue (màu xanh nước biển) và chữ G là chữ viết tắt của Green (màu xanh lá cây).Các sắc kí đồ lớp mỏng alumin, thu được từ nước chiết bằng clorofrom : metanol(98.5 : 1.5) được tách bằng hệ thống clorofrom : cacbon tetraclorua : nước : metanol(2 : 2.5 : 1 : 3) đã phát hiện hai vết huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại: một vếthuỳnh quang xanh tím, đó là aflatoxin B1, một vết khác có Rf thấp hơn và huỳnhquang màu lục, đó là aflatoxin G1 Aflatoxin G1 có cấu trúc rất gần với cấu trúcaflatoxin B1: nó có hai chức lacton, còn aflatoxin B1 chỉ có một Bằng cách khử nốiđôi cách trong nhân hidrofuran tận cùng của dihidroaflatoxin B1 và G1 ta thu đượchai sản phẩm độc khác là aflatoxin B2 và G2 So với aflatoxin B1, độc tính củachúng đối với vịt con kém hơn từ 60 đến 100 lần; như vậy chúng sẽ không độc, nếukhông có các khả năng mất hidrat chuyển thành aflatoxin B1 rất độc

Hình 1.3: Cấu tạo của Aflatoxin

Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hoá và gọi là Aflatoxin M1 vàAflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk) Aflatoxin M1 có huỳnh quang xanhtím, aflatoxin M2 có Rf thấp hơn và huỳnh quang tím Aflatoxin M1 là hidroxi – 4aflatoxin B1, và aflatoxin M2 là hidroxi – 4aflatoxin B2

Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hoá và gọi là Aflatoxin M1 vàAflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk) Aflatoxin M1 có huỳnh quang xanhtím, aflatoxin M2 có Rf thấp hơn và huỳnh quang tím Aflatoxin M1 là hidroxi – 4aflatoxin B1, và aflatoxin M2 là hidroxi – 4aflatoxin B2

Các aflatoxin tan trong methanol, acetone và chloroform, không tan trong dung môikhông phân cực Aflatoxin tương đối không ổn định khi tiếp xúc với ánhsáng, đặc biêt là khi tiếp xúc với tia cực tím, các tác nhân oxy hóa, trong các dungmôi phân cực hay trong các dung dịch có pH nhỏ hơn 3 hay lớn hơn 10 Aflatoxin

có nhiệt độ nóng chảy từ 2370C (G1) đến 2990C (M1), như ng không bị phá hủytrong điều kiện nấu ăn bình thường Có thể phân hủy hoàn toàn chúng bằng nồi hấptiệt trùng có bổ sung thêm ammoniac hoặc xử lý băng chất tẩy rữa

Điểm nóngchảy (0C)

(Nguồn: Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).

Ngoài 6 loại aflatoxin chủ yếu trên, người ta còn phát hiện một số loại aflatoxinkhác, người ta đã đề nghị gọi các hợp chất đó là flavatoxin hoặc flavacuramin:

− Aflatoxin P1: là một sản phẩm trao đổi chất, là dẫn xuất fenolic của aflatoxin B1 Người ta đã phân lập được chúng trên cột ambeclit XAD – 2 (Rohm và Haas).Trọnglượng phân tử của nó, xác định bằng khối phổ là 2.8.Sản phẩm này là kết quả sựkhửmetyl của aflatoxin B1

− Aflatoxin 3B hay toxin B3: một chất có Rf thấp, phân lập từ bình nuôi cấy A.flavus, dạng tinh thể, màu vàng kim, độ độc kémaflatoxin B1 từ 40 đến 50 lần

− Aflatoxin B3 ( được Siubblefield và đồng sự phân lập) còn gọi là porositicol:nhân xiclopenten tận cùng của aflatoxin B1 được thay thế bằng một chuỗi bênetanol, do đó chất này là 6 –metoxi -7 - (2 ’ – hidroxictyl) difurocumarin

1.2.5 Cơ chế gây độc của Aflatoxin

Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào.Sự liên kết này gây ứcchế enzym polymerase của RNA.Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp RNA và

ức chế polymerase t-RNA.Đây là nguyên nhân gây hạn chế sự tổng hợp proteintrong tế bào

Người ta cũng đã chứng minh rằng vòng α,β -lacton không bão hòa có trong phân tửaflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung thư và cũng chính vòng lactonnày gây ức chế tổng hợp DNA trong nhân tế bào, do đó nó làm rối loạn tăng trưởngbình thường của tế bào

Để có thể gây độc với tế bào gan cũng như tạo khối u, Aflatoxin phải trải qua mộtquá trình biến đổi sinh học phức tạp, tạo thành dạng 2,3 – dihydrodiol (aflatoxin B1– dhd) ở trong gan Theo Neal và cộng sự (1981), hợp chất này là nguyên nhân gâyhủy hoại gan rất nhanh.Nhóm dialdehyd phản ứng với nhóm amin của protein đểtạo thành kiềm ship (Shiff’s base), gây ức chế sinh sinh tổng hợp DNA và gâynhiễm độc cấp tính.(Hình 1.4)

Hình 1.4: Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan (Cliford và

Rces,1967 trích dẫn bởi bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003)

1.2.6 Độc tính của Aflatoxin

Theo Dương Thanh Liêm (2002), Aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ thểcon người và động vật Những tác hại đó như sau:

• Gây tổn thương tế bào gan: tất cả các trường hợp xác nhận sự ngộ độcAflatoxin đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều hưhại nặng Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tíchtrên gan có khác nhau Biểu hiện chung là: ban đầu gan biến thành màu vàngtươi, mật sưng Sau đó gan sưng to lên, mật căng phồng và bắt đầu nổi mụtnhỏ trên bề mặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử màutrắng Sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể

• Thận cũng bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nênkhó khăn Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng

• Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡngtrong thức ăn Đôi khi cũng thấy tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấythức ăn

• Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể

Do đó khi nhiễm Aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thường,

có thể gây tử vong cho thú

• Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản

• Làm giảm sự thèm ăn đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mấtmùi thức ăn

• Làm thay đổi thành phần dinh dưỡng có trong thức ăn, giá trị dinh dưỡng bị

hạ thấp, làm vật nuôi chậm phát triển

• Làm giảm thấp sự sinh trưởng và giá trị kinh tế của vật nuôi Hậu quả cuốicùng là có thể gây chết cho vật nuôi

Bảng 1.5: Ảnh hưởng của Aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý

ở vật nuôi (Allcroff, 1969 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003)

Loại gia súc Lượng

Aflatoxintrong thức ănhàng ngày

Thời kỳ nuôidưỡng (tuần)

Tổn thươnggan

Ảnh hưởng tớiphát triển vàhiệu quả thứcăn

Đồ án tốt nghiệp

(mg/kg)Lợn

(20 – 70kg)

0.140.280.41

121212

Trung bìnhNhẹ Nhẹ

Bình thường.Giảm sút Giảm sút.Lợn

Gà tây

(1ngày tuổi)

triển và giảmtrọng lượng

Gà tây

(1ngày tuổi)

0.20.420.5

777

NhẹNhẹNặng

Giảm trọnglượng trong 3tuần.Vịt

(7 ngày tuổi)

hình nhiễmAflatoxin

Giảm trọnglượng, chết50%.Bê

(4 ngày tuổi)

lượng từ 0 – 3tháng

sữa AflatoxinM1 có mặttrong sữa

17

Đồ án tốt nghiệp

1.2.7 Giới hạn mức cho phép độc tố Aflatoxin

Trước thực trạng nhiễm Aflatoxin trên lương thực, thực phẩm ở mức độ caocũng như tính độc của Aflatoxin đối với động vật kinh tế và ảnh hưởng của nó đốivới sức khỏe con người, nhiều quốc gia trên thế giới đã có những quy định giới hạnAflatoxin nhiễm trong lương thực, thực phẩm

Bảng 1.6: Giới hạn aflatoxin ở một số nuớc theo tiêu chuẩn của FDA.

Nước Giới hạn Aflatoxin cho

phép

Loại thức ăn

ăn cho gia súc, gia cầm ở tất

cả các giai đoạn khác nhau.20ppb Hàm lượng tối đa cho phép

trong thức ăn cho gia súc,gia cầm hoặc trong nguyênliệu bột ngô

người

bao gồm tổng số tất cả cácloại độc tố aflatoxin B1, B2,G1, G2

Bảng 1.7: Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên

liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam (Tài liệu của Vụ KHKT và CLSP Bộ Nôngnghiệp và PTNT)

Nguyên liệu Lượng Aflatoxin B1

tối đa (ppb)

Tổng số Aflatoxin B1 + B2 +

G1 + G2 (ppb)

2010020

150100100100203050

1020

5020050

1.2.8 Tình hình nhiễm độc Aflatoxin

Aflatoxin có mặt trong rất nhiều sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là các loại hạt códầu như lạc, đậu tương và ngô (Blaney, 1985 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê ThịNgọc, 2003) Ở vùng Đông Nam Á và ở Úc, tỷ lệ nhiễm aflatoxin trong sản phẩmnông nghiệp là rất đáng kể

Nhiễm aflatoxin là do điều kiện bảo quản kém, việc xâm nhập của sâu mọt trongbảo quản cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự lây lan và phát triển nhanh chóng của

Asp flavus Trong điều kiện thuận lợi, Asp.flavuscó thể tăng nhanh chỉ sau 3 – 7

ngày bảo quản

Nhiễm độc aflatoxin ở lợn là một vấn đề quan trọng, gây thiệt hại khá lớncho ngành chăn nuôi Tại miền Bắc Carolina – Mỹ, theo nghiên cứu của Smith(1976) trong số 94 trường hợp phát hiện aflatoxin có trong thức ăn chăn nuôi thì cóđến 83 trường hợp gây ngộ độc ở lợn, 7 trường hợp ở bò và 4 trường hợp ở gia cầm.Hàm lư ợng aflatoxin trung bình có trong thức ăn chăn nuôi là 389 ppb và ở ngônguyên liệu làm thức ăn là 518 ppb (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị NgọcDiệp, 2003).

Ở khu vực Đông Nam Á, theo nhận xét của Ginting (1985) và Widiastut (1988),ngô và thức ăn cho gia cầm nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên tới 200 ppb

Ở Úc, theo Barry J Balaney, trong 161 mẫu thức ăn cho gia cầm được phân tích thì

có 13 mẫu chứa aflatoxin, trong đó có 4 mẫu nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên đến

50 ppb (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003)

1.3 Các phương pháp phát hiện Aflatoxin

Phát hiện được sự có mặt của Aflatoxin trong thức ăn là điều rất quan trọng Nhiềuphương pháp phát hiện Aflatoxin đã được đưa ra, tất cả đều rất đáng chú ý và có thể

bổ sung cho nhau

1.3.1 Phương pháp phát quang sinh học(Hamed K.Abass và cộng sự,

2004)

1.3.1.1 Phương pháp phát huỳnh quang (Blue Fluorescence): sự hiện diện của

aflatoxin trong môi trường chứa β-Cyclodextrin.

- Sự phát huỳnh quang màu xanh của chủng chứng aflatoxin được sử dụng cho

phương pháp định tính chủng sản xuất độc tố aflatoxin từ nấm Aspergillus

trên môi trường thích hợp Một số phương pháp sử dụng môi trường rắn nhưPDA, CCA, các phương pháp khác sử dụng môi trường lỏng bao gồm môitrường có khả năng sản xuất aflatoxin (APA) và môi trường corn steep liquor

đã phát triển một phương pháp huỳnh quang đơn giản cho các độc tốaflatoxin trong việc sử dụng chủng trong môi trường rắn

- Với kỹ thuật của Cotty, aflatoxin được định lượng trong một ống chứa mẫubằng cách đo huỳnh quang trong một mật độ Phương pháp phân lập và côlập mẫu cũng được tiến hành.

- Filtenborg và Frisvad đã tiến hành cấy trong môi trường GY, trong đó có

glucose và cao nấm men dùng để nuôi cấy Aspergillusspp tạo aflatoxin Một

miếng nhỏ cắt từ môi trường thạch và trực tiếp đặt lên tấm TLC Sau khi pháttriển ở dung môi thích hợp, điểm aflatoxin được phát hiện dưới ánh sang tiacực tím ở bước sóng dài

- Yabe và cộng sự (1987) sử dụng môi trường GY như một phương pháp đơngiản để sàng lọc các loài sản xuất aflatoxin bằng tia cực tím Nó có thể pháthiện việc sản xuất độc tố aflatoxin bởi các bào tử nhỏ chỉ có ở 36 giờ vànhiều bào tử có thể tìm thấy trên các đĩa

- Tia cực tím cũng có thể được sử dụng như một phương pháp cho việc nhanhchóng xác định chủng sản sinh aflatoxin

- Các chủng sản xuất aflatoxin độc lập được tìm thấy là các điểm màu xámhoặc đen trong các bức ảnh chụp ở bước sóng tia cực tím, trong khi cácchủng không sản xuất aflatoxin là các điểm màu trắng Aflatoxin B1 và G1hấp thụ mạnh ánh sang tia cực tím

1.3.1.2 Phương pháp tăng cường màu huỳnh quang bằng Cyclodextrin

- Sự phát quang màu xanh của aflatoxin B1 dưới tia UV xuất hiện trong môitrường lỏng và rắn và sự phát quang được tăng cường đáng kể bằng cách xử

lý với chất hỗ trợ phát quang khác nhau như iot và cyclodextrin Davis vàDiener (1979) đã phát triển một chuỗi hình ảnh phát quang (PFM) sử dụngiot để tăng cường khả năng phát quang của aflatoxin để sử dụng trong HPLC.Sau đó Lemke và cộng sự (1988) đã thực hiện một thí nghiệm nhỏ đơn giản

để phát hiện chủng chứa aflatoxin bằng cách nuôi cấy trong môi trườngCoconut Cream Agar trong 3-10 ngày bằng cách sử dụng chuỗi PFM với iot.Kết quả của thí nghiệm này đã được kiểm chứng bởi TLC và HPLC PMFđược đưa ra với độ nhạy gấp 100 lần để phát hiện aflatoxin có chứa dẫn xuấtiot tốt hơn so với việc không có dẫn xuất

- Các phát quang của các độc tố aflatoxin B1 và G1 cũng được cải thiện đáng

kể khi tăng cường cyclodextrin (CD)

- Các đĩa được bổ sung CD được cải thiện khả năng phát quang bằng nhiềuphương pháp khác nhau để phát hiện aflatoxin và mycotoxin

- Những phương pháp này bao gồm sắc ký lỏng trong đó CD được thêm vàohoặc làm chất rửa cột hoặc các dẫn xuất aflatoxin thô được sàng lọc bằngphương pháp định lượng cho việc phân tích huỳnh quang (Wilson và cộng

sự, 2002 Fente và cộng sự,2009) cho thấy rằng việc thêm β-Cyclodextrinvào môi trường một cách thích hợp giúp tăng cường việc tạo aflatoxin bởi

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus bởi ánh sang huỳnh quang ở

bước sóng 365 nm Có thể tăng cường sự phát quang của aflatoxin bằng cáchbiến đổi trước khi qua cột với Trifluoro-Acetic Acid (TFA) trong HPLC

1.3.1.3 Phương pháp Yellow Pigment (Thuốc nhuộm vàng)

- Sản phẩm tạo màu vàng cam ởAspergillus flavus có chứa aflatoxin đầu tiên

được xác định bởi Wiseman và cộng sự (1967) bởi vì họ tác động vào sựđịnh lượng mức độ hấp thụ của aflatoxin Họ phát triển phương pháp để loại

bỏ sắc tố từ dịch chiết bằng cách xử lý với CuCO3 không tan Việc sản xuất

sắc tố vàng của A.flavuscũng đã được Arseculeratne và cộng sự (1969) báo

cáo, người ta đã quan sát thấy rằng sản xuất sắc tố đáng chú ý bởi ngày thứ 2

ở các chủng trên môi trường CCA (coconut agar) Lin và Dianese (1976) lànhững người đầu tiên kết hợp việc sản xuất sắc tố vàng với aflatoxin trong

A.flavus được phát hiện bởi huỳnh quang màu xanh của aflatoxin trong môi

trường Các sắc tố màu vàng đã được quan sát sớm hơn so với màu xanhhuỳnh quang và không quan sát thấy ở các chủng không sinh aflatoxin Sắc

tố màu vàng đã được tiết vào môi trường nhưng nó dễ dàng nhìn thấy trênmặt sau của các chủng được nuôi cấy trên môi trường trong suốt như môitrường PDA

- Lin và Dianese (1976) báo cáo rằng mức độ sắc tố màu vàng đó là tỷ lệ thuậnvới màu xanh huỳnh quang trong tất cả các đĩa đã được kiểm tra Tuy nhiênDavis và cộng sự (1987) đã kết luận rằng sắc tố màu vàng không phải là yếu

tố dự báo đáng tin cậy của aflatoxin trong tất cả môi trường Kết luận nàyđược khẳng định bởi Gupta và Gopa (2002) đã được xác định sự khác biệtgiữa các môi trường

1.3.1.4 Phương pháp sử dụng hơi Ammonium Hydroxide gây ra sự biến đổi màu

sắc

- Saito và Machida (1999) đã giới thiệu một phương pháp mới để nhanh chóng

xác định chủng sinh aflatoxin và các chủng không sinh aflatoxin của Asp flavus và Asp parasiticus Phương pháp này phát triển dựa trên kinh nghiệm

và đã được xác nhận bằng cách thử nghiệm trên 120 chủng Asp flavus và Asp.parasiticus.

- Đối với phương pháp này, một chủng thuần được nuôi cấy tại tâm của đĩapetri chứa môi trường trong suốt như PDA Các đĩa được đảo ngược và đượcthêm vào 1-2 giọt dung dịch amoni hydroxit ở nắp đĩa Mặt dưới của cácchủng nhanh chóng đổi sang màu mận đỏ sau khi phía dưới của đĩa petri đãđược đảo ngược trên nắp chứa amoni hydroxit Về cơ bản, không xảy ra sựthay đổi màu sắc ở các chủng không sản sinh độc tố aflatoxin

- Saito và Machida (1999) đã quan sát sự thay đổi màu sắc khi nuôi cấy cácchủng trong môi trường yeast extract – sucrose và coconut media, có sự thayđổi màu yếu hơn môi trường PDA và sự thay đổi màu sắc trên môi trườngglucose – muối vô cơ, ưu tiên sản xuất aflatoxin Tuy nhiên, không có sựthay đổi màu sắc khi quan sát trên môi trường pepton – muối vô cơ và môitrường Czapek

- Theo điều tra các cơ sở hóa sinh của Saito và Machida, kiểm tra bằng cách

sử dụng methanol để trích xuất chất màu từ chủng đông khô của Asp flavus

có chứa aflatoxin được nuôi cấy trên môi trường PDA Các chiết xuất chứasắc tố vàng, có lẽ sắc tố vàng giống như là cơ sở của thử nghiệm các chủng

chứa aflatoxin của Lin và Dianese (1976) Những sắc tố mận đỏ trộn chungvới dung dịch amoni hydroxit hoặc các dung dịch khác như sodium hydroxit,hydoxit kali, natri carbonat, natri bicarbonate Bổ sung một lượng dư acid đểchuyển đổi màu sắc thành vàng chỉ ra rằng sắc tố đóng vai trò như chất chỉthị pH Các chức năng chỉ thị pH có thể nhân rộng trong điều kiện thửnghiệm Saito và Machida bằng cách thay thế các giọt dung dịch amonihydroxit với vài giọt acetic và một lần nữa đảo ngược đĩa petri chứa

Asp.flavus Mặt dưới của các chủng từ mận đỏ trở lại màu vàng hoặc màu

xám Đó có thể là chu kỳ của các chủng qua nhiều thay đổi màu sắc giốngnhư một chỉ thị pH độc lập

- Tổng cộng có 14 sắc tố màu vàng được tinh chế từ chiết xuất methanol của

các chủng Asp flavus sinh aflatoxin Cách thanh lọc sắc tố bằng sắc ký lớp

mỏng được thực hiện bởi sự thay đổi màu sắc trên khi tiếp xúc với hơi amonihydroxit Cấu trúc của bảy sắc tố được xác định bằng phương pháp quangphổ và sắc ký Chúng bao gồm norsicolonnic acid, averatin, averafin,versicolorin C,versicolorin A, versicolorin A herniacetal và nidurufin Tất cảlần lượt từ vàng đến đỏ, khoảng pH từ 6,5 trở lên ngoại trừ norsicolonnicacid chuyển từ đỏ sang tím Tất cả những sắc tố này là anthraquinone trunggian trên con đường sinh tổng hợp aflatoxin (Bhatnagar và cộng sự, 2003;Sinz và Shier, 1991) trừ nidurufin là một sản phẩm phụ được biết đến củacác con đường ở một số loài

- Bảy sắc tố xác định cấu thành phần lớn trong tổng số sắc tố vàng trong chiết

xuất của các chủng Asp.flavus sinh aflatoxin.Khi chiết suất được chuẩn bị một các giống hệt nhau từ các chủng Asp flavus không chứa aflatoxin và

kiểm tra bởi sắc ký lỏng cao áp – bằng cách sử dụng phương pháp của McCormick và cộng sự (1988) phát hiện không có sắc tố vàng mặc dù họ đãphát hiện dễ dàng trong các chiết xuất của các chủng chứa aflatoxin

1.3.1.5 Phương pháp Cyclodextrin kết hợp với Ammonium Hydroxide Vapor

- Abbas và cộng sự (2004) đã chứng minh rằng 3 cách để kiểm tra các chủng

có sinh aflatoxin được mô tả ở trên có thể được thực hiện trên cùng đĩa petri

và vẫn cho phép lấy mẫu bằng 2 phương pháp phân tích, trong 1 phươngpháp β-Cyclodextrin được đưa vào môi trường PDA (β- Cyclodextrin –PDA, 0.3% wt/vol) trong đĩa petri 9cm Các chủng được nuôi cấy tại 28oCđến 35oC trong 4-7 ngày trong bóng tối Mặt dưới của các chủng dược kiểmtra dưới ánh sáng tự nhiên cho sắc tố màu vàng trong môi trường (Gupta vàGopal, 2002; Lin vad Dianese, 1976) Việc tạo ra aflatoxin cũng được nhậnbiết bằng ánh sáng huỳnh quang màu xanh ở bước sóng 365 nm của tia UV

- Một miếng thạch nhỏ được đặt trên tấm TLC và được lấy ra sau 10 giây.Những đốm mày được để khô và tấm TLC được để trong chloroform : aceton(93:7) (vol/vol) trong điều kiện hơi bão hòa Aflatoxin B1, B2, G1, G2 vàtrực tiếp phát hiện dưới bước sóng dài của tia UV bằng huỳnh quang củachúng Khoảng 10 miếng thạch (10-1 gram) được cân và đặt trong lọ nhựa,được chiết với 70% methanol trong 30 phút trên máy lắc ở tốc dộ cao vàđược ly tâm Phần nổi là sự hiện diện của aflatoxin được thử bằng ELISA kit,sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lớp mỏng…

- Cuối cùng đĩa petri được lật ngược và thêm 0.5 ml – 25% - 27% ammoniumhydroxit trên nắp Việc tạo ra aflatoxin được phát hiện như sự thay đổi màusắc ở mặt dưới các chủng từ màu vàng sang đỏ mận

1.3.1.6 Phương pháp "ELISA test":

- Dựa trên nguyên tắc kháng thể kháng nguyên phát hiện aflatoxin (và các độc

tố khác) thông qua những phương tiện phát hiện nhanh, rẻ, dễ thựchiện, sử dụng kháng thể để "bắt" (có lựa chọn) độc tố đặc biệt đã đượctách chiết từ hạt hay các thành phần của thức ăn Sau khi chiết, sẽ sử dụng

bộ kiểm tra và thêm chất chỉ định màu Cường độ màu sắc sẽ chỉ định có độc

tố hay không

1.3.2 Phát hiện bằng đường lý - hoá học

Ta có thể nhận biết sự có mặt Afltoxin một cách dễ dàng nhờ một số tính chất củachúng:

− Khử nitrat bạc ammoniac, molipdat và natri tungstate

− Trong môi trường pecloric, tạo với cacbonzon thành hợp chất cộng có màu tímđặc trưng, cũng chức năng này phản ứng yếu với vanilin trong môi trường xút38%

− Ngưng tụ với phenol trong môi trường sunfuric và acid sunfuric cũng có vết hình

dẻ quạt

− Dễ bị phân hủy trong môi trường kiềm

− Phản ứng với di-O-anizidin-tetrazolium clorua để tạo thành các hợp chất xanh –tím với các aflatoxin B1, B2 và nâu với aflatoxin G2

1.3.2.1 Chiết xuất và tinh chế nước chiết

Phần lớn các phương pháp chiết xuất và tinh chế đều dựa trên tính chất cácAflatoxin tan trong một số dung môi hữu cơ như cloroform, metanol, etanol,axeton, benzen…và không tan trong một số dung môi béo như hexan, ete dầu hỏa,ete etylic

1.3.2.2 Tách bằng sắc ký

❖ Sắc ký giấy

Việc tách bằng phương pháp sắc ký đầu tiên được thực hiện trên sắc ký giấy vàtriển khai bằng hệ thống benzen: toluen: xiclohexan: etanol: nước Các phươngpháp được khuyên dùng là những phương pháp cổ điển, dùng2 hệ thống dung môi:

− Hệ thống 1 gồm butanol: axit acetic: nước (20: 19: 1)

Với dung môi 2, việc làm bão hòa và chạy sắc ký thực hiện với cùng 1 pha và lầnlượt kéo dài 1 giờ và 3 giờ 30 phút Hệ thống dung môi này được sử dụng nhiều.

Dù là dung môi nào, người ta cũng sấy ở 1000C trong vòng 20 phút

❖ Sắc ký cột: loại sắc ký này thường được sử dụng Tùy theo trường hợp mà người

ta dùng:

− Cột alumin− Cột gel silic với chất tách là cloroform và 5% hỗn hợp cloroform

metanol-− Cột axit silixic với chất tách là hỗn hợp cloroform: etanol (99: 1)

− Cột xenluloza với chất tách là hỗn hợp hexan: cloroform (1: 1)

❖ Sắc ký lớp mỏng:

- Phương pháp sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượngaflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960 Người ta sử dụng các bảnmỏng được tráng bởi silicagel để xác định aflatoxin Đây là phương phápđược dùng thường xuyên nhất Có thể triển khai trong nhiều hỗn hợp khácnhau, thông thường nhất là:

− Cloroform: metanol (99: 1), (98: 2), (97: 3), (95: 5), (93:7)

− Cloroform: axeton (90: 10), (85: 15)

− Cloroform: axeton: etanol (89: 10: 1)

− Cloroform: axeton: 2-propanol (850: 125: 25), (825: 150: 25)

− Metanol: nước: ete (3: 1: 96)

− Benzen: etanol: nước (46: 35: 19)

−Nước: aceton: chloroform (1.5:12:88)

- Thời gian triển khai thay đổi từ 45 phút hay 2 đến 3 giờ Người ta thườngkhuyên nên hoạt hóa bằng nhiệt vì việc chuyển dịch dung môi ở nhiệt độthấp chậm hơn Rõ ràng là Rf của các Aflatoxin khác nhau biến đổi tùy theođiều kiện làm sắc ký Đối với sắc ký lớp mỏng, người ta thường dùngalumin, bột xenluloza hoặc gel poliamit làm giá

- Một điểm rất quan trọng nữa là các lớp mỏng phải thật sự bão hòa trướctrong bình, nơi sắc ký sẽ triển khai Sự bão hòa này phải đủ lâu để được hoàntoàn, nhưng không được kéo dài quá vì có thể gây ra những nhiễu loạn quantrọng trong việc chuyển dịch các thành phần cấu tạo của các mẫu.

- Giá đỡ sắc ký thường là những tấm kính 200 x 200 mm, nhưng nhữngphương pháp đơn giản hóa khuyên dùng những phiến kính thường để làmtiêu bản hiển vi (26 x 76 mm) hay những giá đỡ mềm như tấm phim Khi làmsắc ký, một số hợp chất có thể tương tự Aflatoxin; để tránh xác định nhầm,nên sử dụng một hệ thống 2 chiều Hệ thống này giúp dễ thấy sự khác biệtgiữa các Aflatoxin B1 và G1 (do có trị số Rf thường rất gần nhau)

- Hệ dung môi gồm nước: aceton: chloroform (1.5:12:88 v/v) được đánh giá

có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất Các bản mỏngsau khi phát triển sắc

ký được đưa vào bởi đèn tử ngoại (UV) 365mm Các vết mẫu phân tíchtạomàu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây Và có độ dài Rf được sosánh vớicác vết của aflatoxin tiêu chuẩn Phương pháp này có thể được xácđịnh lượng từ (3 – 4).10-4 microgram (0.3 – 0.4mg)

- Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc vào người phân tích Khi sosánhgiữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả từ 20-30%

- Hội hóa học phân tích (A.O.A.C-1980) đã lưu ý tới phương pháp phân tíchđịnh lượng sử dụng TLC Phương pháp này được mở rộng thành chươngtrình phân tích mẫu của tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới Các kết quảcủa chương trình phân tích trên đã chứng nhận sự chính xác của phân tíchbằng TLC vì sai số rất cao

Khẳng định sự có mặt của aflatoxin

- Một số chất được tách ra từ mẫu đôi khi dễ nhầm lẫn với aflatoxin, dẫn đến sựkhẳng định sai lệch Phương pháp khẳng định sự có mặt của aflatoxin trực tiếp thựchiện trên bản sắc kí Dựa vào sự biến đổi của aflatoxin thành các đồng phân có màu