So sánh mối liên hệ di truyền giữa các chủng neisessria meningitidis (não mô cầu) ở khu vực phía nam bằng phương pháp điện di trong trườg xung điện (PFGE)

Đồ án tốt nghiệp 1.1 Đặt vấn đề CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU Neisseria meningitidis còn gọi là vi khuẩn não mô cầu là một trong những tác nhận hàng đầu gây ra hai thể bệnh viêm màng não

Đồ án tốt nghiệp

i

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Nội dung nghiên cứu 2

1.3 Phương pháp nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tình hình nhiễm Neisseria meningitidis 4

2.1.1 Tình hình nhiễm N meningitidis trên thế giới 4

2.1.2 Tình hình nhiễm N meningitidis tại Việt Nam 7

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Neisseria meningitidis 9

2.2.1 Phân loại N.meningitidis 9

2.2.2 Hình thái N meningitidis 9

2.2.3 Tính chất nuôi cấy 10

2.2.4 Đặc điểm sinh hóa 11

2.2.5 Đặc điểm dịch tễ 11

2.2.6 Cơ chế và khả năng gây bệnh 13

2.2.6.1 Vật chủ và con đường lây nhiễm 13

2.2.6.2 Các yếu tố độc lực 13

2.2.6.3 Cơ chế gây bệnh 15

2.2.7 Biểu hiện lâm sàng 17

2.2.7.1 Viêm họng 17

2.2.7.2 Nhiễm trùng huyết 17

2.2.7.3 Viêm màng não 19

2.2.8 Điều trị 20

2.2.9 Phòng ngừa 20

2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử phân loại N meningitidis 22

Đồ án tốt nghiệp

2.4 Kỹ thuật PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis): kỹ thuật điện di trong

trường xung điện hay điện di trong trường điện thay đổi .27

2.4.1 Nguyên tắc chung của PFGE 27

2.4.2 Quy trình PFGE 29

2.4.3 So sánh kỹ thuật PFGE với các phương pháp phân loại sinh học phân tử khác thường được sử dụng trong nghiên cứu .33

2.4.3.1 Ưu điểm 33

2.4.3.2 Nhược điểm: 33

2.4.4 Ứng dụng của PFGE trong nghiên cứu dịch tễ học Neisseria meningitidis 34

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 39

3.2 Đối tượng nghiên cứu 39

3.3 Vật liệu - sinh phẩm - môi trường - thiết bị 41

3.3.1 Vật liệu 41

3.3.2 Sinh phẩm - hóa chất 41

3.3.3 Môi trường sử dụng 42

3.3.4 Thiết bị 42

3.4 Phương pháp nghiên cứu 44

3.4.1 Quy trình thực hiện 44

3.4.2 Mô tả quy trình 45

3.4.2.1 Hoạt hóa chủng vi khuẩn và tiến hành định danh sơ bộ bằng phương pháp truyền thống 45

3.4.2.2 Thí nghiệm thực hiện test quy trình PFGE cải tiến 45

3.4.2.3 Thí nghiệm trên các chủng 51

3.4.2.4 Tìm ra mối liên hệ di tryền giữa các chủng 51

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

4.1 Kết quả khảo sát hình thái các chủng vi khuẩn thí nghiệm 52

4.2 Kết quả định danh 52

Đồ án tốt nghiệp

4.2.1 Nhuộm gram 52

4.2.2 Thử nghiệm Catalase 53

4.2.3 Thử nghiệm Oxidase 54

4.2.4 Thử nghiệm phân giải các loại đường 54

4.3 Kết quả kiểm tra quy trình PFGE trên chủng 12 – 705 DK .56

4.4 Kết quả điện di của 17 chủng để xây dựng mối liên hệ di truyền 57

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

5.1 Kết luận 66

5.2 Kiến nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism

A baumannii : Acinetobacter baumannii

BA : Blood Agar

Bp : Base pairs

CA : Chocolate Agar

CD : Chủng dịch

CFU : Colony Forming Units

CLB : Cell Lysis Buffer

CSB : Cell Suspension Buffer

CSF : Kit for collection of cerebrospinal fluidCTA : Cystine Trypticase Agar

DNA : Deoxyribonucleoic Acid

DK : Đông khô

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr : Ethidium Bromide

ESBL : Extended spectrum beta-lactamase

Kb : Kilo base pairs

LOS : Lipooligosaccharide

MLST : Multilocus Sequence Typing

MLEE : Multilocus enzyme electrophoresis

NAD : Nicotine Adenine Dinudeotide

N meningitidis : Neisseria meningitidis

OMP : Outer Membrane Protein

PCR : Polymerase Chain Reaction

PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis

PS : Polysaccharide

RNA : Ribonucleic acid

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

Đồ án tốt nghiệp

S typhi : Salmonella typhi

S aureus : Staphylococcus aureus

µl : Microliter

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Phân bố của các phân nhóm N meningitidis gây dịch trên toàn thế giới 5

Hình 2.2 Vành đai viêm màng não ở châu Phi 6

Hình 2.3 Tiêu bản nhuộm dịch não tủy (A) và vi khuẩn N meningitidis sau khi nhuộm Gram (X100) từ khuẩn lạc (B) 10

Hình 2.4 Hình thái khuẩn lạc N meningitidis trên môi trường BA và CA 11

Hình 2.5 Các protein bề mặt và thành phần màng ngoài của N meningitides 14

Hình 2.6 Quá trình xâm nhiễm của N meningitidis 16

Hình 2.7 Một số phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 24

Hình 2.8 Các bước thực hiện quy trình PFGE 29

Hình 2.9 Khả năng di động của phân tử DNA trong trường xung điện 31

Hình 3.1 Sơ đồ thực hiện quy trình PFGE xác định mối liên hệ di truyền 44

Hình 3.2 Các bước của quy trình PFGE chuẩn 45

Hình 4.1 Khuẩn lạc sau khi cấy qua đêm trên môi trường CA và BA từ chủng 12-705DK 52

Hình 4.2 Kết quả nhuộm Gram 53

Hình 4.3 Kết quả thử nghiệm Catalase 53

Hình 4.4 Kết quả thử nghiệm Oxidase 54

Hình 4.5 Kết quả thử nghiệm 4 loại đường sau 24 giờ 54

Hình 4.6 Kết quả chạy điện di PFGE trên chủng N meningitidis (12-705 DK) 57

Hình 4.7 Kết quả chạy điện di PFGE trên 17 chủng N meningitides 58

Hình 4.8 Kết quả phân tích mối liên hệ di truyền của 17 chủng vi khuẩn N meningitidis 64

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Liều lượng sử dụng kháng sinh dự phòng 22

Bảng 2.2 Một số enzym cắt hạn chế được dung cho kỹ thuật PFGE 30

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn tương đồng về kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE 33

Bảng 2.4 Minh hoạ các chủng vi sinh vật được phân tích dựa trên kết quả PFGE thu được từ các đoạn nhiễm sắc thể 38

Bảng 3.1 Danh sách 17 chủng vi khuẩn N meningitidis thực hiện trong đề tài 39

Bảng 3.2 So sánh các thông số thay đổi giữa PFGE theo WHO và cải tiến 45

Bảng 3.3 Mô tả các bước thực hiện quy trình PFGE cải tiến 46

Bảng 4.1 Kết quả test sinh hóa trên 17 chủng thí nghiệm 55

Bảng 4.2 Số băng của 17 chủng N meningitidis được cắt bởi NheI từ kết quả PFGE ở hình 4.7 59

Bảng 4.3 Số băng khảo sát được từ kết quả điện di PFGE 61

Bảng 4.4 Các chủng khảo sát theo serogroup 62

Bảng 4.5 Biến động di truyền trên 17 chủng N meningitidis 63

Đồ án tốt nghiệp

1.1 Đặt vấn đề

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Neisseria meningitidis (còn gọi là vi khuẩn não mô cầu) là một trong những

tác nhận hàng đầu gây ra hai thể bệnh viêm màng não mủ và nhiễm trùng huyếtnghiêm trọng trên toàn thế giới [9] Bệnh có những triệu chứng, biểu hiện và lây lanrất phức tạp Ngay cả khi bệnh được chẩn đoán sớm và điều trị đầy đủ thì tỉ lệ tửvong vẫn chiếm 5 - 10% Bệnh phát triển mạnh mẽ nhất là vào mùa đông và trẻ em

dưới 5 tuổi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất với tỷ lệ tử vong chiếm từ 20 – 50% N meningitidis ký sinh ở nhiều cơ quan trên cơ thể người như các niêm mạc mũi hầu,

họng, đường hô hấp, hệ thần kinh, máu, khớp, màng tim, đường niệu và sinh dục[1], [13], [14]

N meningitidis có thể truyền từ người sang người theo dịch tiết qua đường hô

hấp vì thế rất dễ lây lan và có khả năng phát triển thành dịch cao, đặc biệt là ởnhững nơi tập trung đông người Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, hàngnăm có khoảng 300.000 – 500.000 trường hợp bệnh nhiễm não mô cầu [14] TạiViệt Nam, tính từ năm 2011 đến tháng 8 năm 2013, trung bình mỗi năm có 150trường hợp mắc bệnh do não mô cầu với tỷ lệ tử vong khoảng 3,3% (theo số liệucủa viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh) Trong năm 2014, theo Tổng cục thống

kê, cả nước có 24 trường hợp mắc bệnh viêm màng não do não mô cầu gây ra, trong

đó 3 trường hợp tử vong [18]

Mười ba nhóm huyết thanh của N meningitidis đã được ghi nhận, dựa trên cấu

trúc vỏ polysaccharide khác nhau, tuy nhiên chỉ có 6 nhóm huyết thanh có khả nănggây dịch: A, B, C, X, Y và W – 135 Hiện nay, cách điều trị hữu hiệu nhất đối với

N meningitidis là dùng kháng sinh, tuy nhiên N meningitidis được biết đến là rất

nhạy cảm với các loại thuốc kháng sinh được sử dụng để điều trị và dự phòng.Chính vì thế, cần có những nghiên cứu dịch tễ nhằm đưa ra đánh giá, cảnh báo vàkịp thời về diễn biến của bệnh

N meningitidis rất đa dạng và phức tạp về mặt di truyền nhưng các nghiên cứu

trong nước về dịch tễ học của vi khuẩn này còn khá ít Bên cạnh việc chẩn đoán và

giám sát thường niên thì việc quan tâm đến dịch tễ học phân tử của chủng trongvùng dịch có ý nghĩa hết sức quan trọng Nhằm phục vụ công tác phòng chống dịch,xác định nguồn gốc, thực hiện các thử nghiệm vắc-xin, nghiên cứu sự biến đổi ditruyền và mối liên quan giữa các chủng trong vùng dịch, giữa các chủng của các vụ

dịch trước để có biện pháp ứng phó kịp thời, đề tài “So sánh mối liên hệ di truyền

giữa các chủng Neisessria meningitidis (Não mô cầu) ở khu vực phía Nam bằng

phương pháp điện di trong trường xung điện (PFGE)” được thực hiện.

1.2 Mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu

- So sánh mối liên hệ di truyền giữa các chủng N meningitidis ở khu vực phía

Nam bằng phương pháp điện di trong trường xung điện

1.2.2 Nội dung nghiên cứu

- Thực hiện PFGE trên 17 chủng đã được phân lập và định danh N meningitidis theo quy trình cải tiến.

- Phân tích kết quả điện di, so sánh và xây dựng mối liên hệ di truyền giữa các

chủng N meningitidis.

1.3 Phương pháp nghiên cứu

Hiện nay, một trong những phương pháp được áp dụng rộng rãi để phân tích

mối quan hệ giữa các chủng vi khuẩn N meningitidis là điện di trong trường xung

điện PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) Bằng phương pháp này, mối liên hệ

di truyền của các chủng vi khuẩn sẽ được xác định Tại Việt Nam, có rất ít nghiên

cứu đánh giá về mối liên hệ di truyền của các chủng vi khuẩn N meningitidis Vì

vậy, trong nghiên cứu này, ứng dụng phương pháp PFGE để đánh giá mối liên hệ di

truyền của các chủng vi khuẩn N meningitidis đã được thu nhận và phân lập.

Mối liên hệ di truyền của một số chủng vi khuẩn N meningitidis được xác

định bằng phương pháp PFGE tại Phòng xét nghiệm Vi Khuẩn Hô Hấp, thuộc Khoa

Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur Tp.HCM Quy trình thực hiện dựa theo tiêu chuẩncủa WHO và theo nghiên cứu của Nguyễn Thúy Nga, “Hoàn thiện quy trình điện di

trong trường xung điện (PFGE) trên các chủng N meningitidis”, năm 2014 Quy

trình được thực hiện như sau: Các chủng vi khuẩn được cấy lên môi trường BA/CA,

ủ ấm 37oC, 19 - 24 giờ, CO2 5% Sau 24 giờ, quan sát khuẩn lạc, tiến hành địnhdanh sơ bộ bằng phương pháp truyền thống, chọn khuẩn lạc thuần, sau đó tiến hànhtạo huyền phù tế bào bằng dung dịch Cell Suspension Buffer Tiếp tục hòa vi khuẩnvào thạch agarose 1% có bổ sung Proteinase K, rồi cho vào những plugs, kết quảtạo ra các plugs nhỏ có chứa toàn bộ tế bào vi khuẩn Vi khuẩn được cố định trongcác plugs sẽ chịu tác dụng của Protein K và dung dịch Cell Lysis Buffer, ly giải tếbào qua đêm để giải phóng toàn bộ DNA, tiếp theo DNA này sẽ bị phân cắt tại

những vị trí đặc hiệu bởi enzyme giới hạn NheI Các plugs chứa DNA sau khi đã

được phân cắt được đặt vào những giếng tương ứng trong khuôn thạch agarose vàtiến hành điện di Trong đó, bộ điện di được đặt với dòng điện có điện thế 160V,cường độ 140mA, chạy trong vòng 24 giờ với ba pha : 2,2 giây – 8 giờ, 10 giây – 8giờ, 35 giây – 8 giờ Mẫu DNA sau điện di được nhuộm bằng Ethidiumbromide,chụp ảnh và phân tích kết quả dựa trên tiêu chuẩn của Tenover và cs (1995)

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nhiễm Neisseria meningitidis

2.1.1 Tình hình nhiễm N meningitidis trên thế giới

Bệnh viêm màng não do N meningitidis được mô tả lần đầu tiên bởi

Vieusseus vào năm 1804 trong một trận dịch xảy ra ở vùng lân cận Geneva (ThụySĩ) với 33 ca tử vong và ở New England vào năm 1806 [17] Năm 1884, nhà bệnh

lý học người Ý Marchiafava và Celli lần đầu tiên mô tả hình dạng của N meningitidis trong dịch não tủy Năm 1887, Anton Weichselbaum là người đầu tiên

phân lập vi khuẩn từ dịch não tủy của 6 trong 8 bệnh nhân viêm màng não và xácđịnh đây là nguyên nhân gây ra bệnh [47]

Hàng năm, theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới có khoảng 300.000 đến500.000 trường hợp viêm màng não do não mô cầu Tỷ suất bệnh mắc hàng năm làtừ 1 - 2 trên 100.000 dân cho những trường hợp rải rác ,từ 5 - 10 trên 100.000 dâncho những vùng có dịch nhỏ và từ 10 cho đến trên 100.000 dân khi xảy ra những vụdịch lớn hay đại dịch [53]

Sự phân bố của N meningitidis trên thế giới theo nhóm huyết thanh thay đổi

tùy theo khu vực địa lý (hình 2.1) Dịch não mô cầu xảy ra tại các khu vực trên thếgiới gây ra do các nhóm huyết thanh khác nhau: nhóm A và C thường gây bệnh ởChâu Á và Châu Phi, với nhóm A gây bệnh chủ yếu ở Châu Á Nhóm B và C gâybệnh phần lớn tại Châu Âu, Châu Mỹ Nhóm C gây một số vụ dịch tại Canada, Mỹ(1992 - 1993) và Tây Ban Nha (1995 - 1997) Nhóm B gây dịch nhiều hơn tại TânTây Lan với 500 trường hợp hàng năm Nhóm W - 135 gây bệnh cho vài trămngười đi hành hương ở Á Rập Saudi vào năm 2000 - 2001, gây dịch ở Burkina Faso(Châu Phi) làm chết 1500 người trong số 3000 người mắc bệnh vào năm 2002 [46],[54], [55]

Hình 2.1 Phân bố của các phân nhóm N meningitidis gây dịch trên toàn thế giới

Nguồn: Tổ chức Y tế thế giới – WHOChâu Phi được biết đến với tên gọi “vành đai viêm màng não” (meningitisbelt), chạy dài từ phía tây Senegal cho đến phía đông Ethiopia (Hình 2.2) với dân sốkhoảng 300 triệu người, là nơi có tần suất dịch N meningitidis cao Dịch dễ xảy ra

là do khu vực này có khí hậu đặc biệt: trong mùa khô, giữa tháng 6 và 12, gió bụicùng với bệnh nhiễm trùng đường hô hấp do khí hậu lạnh ban đêm khiến miễn dịchtại chỗ ở họng giảm và làm tăng nguy cơ viêm màng não [22] Tập quán xã hộicũng góp phần làm cho bệnh lan truyền dễ dàng hơn: điều kiện nhà ở đông đúc, chậtchội và sự di cư của phần lớn người dân trong các chuyến đi hành hương hoặc đichợ truyền thống ở địa phương Nhóm hay gây bệnh viêm màng não ở Châu Phi lànhóm A, C và W - 135 Nhóm A được biết đến với tỷ lệ mắc cao nhất của bệnhviêm màng não, gây ra bệnh dịch rất lớn, đặc biệt là ở Châu Phi, cận Sahara [22],[30], [51] Trong phần lớn các vụ dịch ở Châu Phi, tỷ suất tấn công từ 100 - 800trên 100.000 dân và những quốc gia chịu ảnh hưởng nặng nề nhất là Burkina Faso,Chad, Ethiopia và Niger Vào năm 1996 - 1997, dịch viêm màng não lớn nhất tronglịch sử Châu Phi xảy ra với hơn 250.000 trường hợp và 25.000 tử vong [54]

Hình 2.2 Vành đai viêm màng não ở châu Phi

Nguồn: Tổ chức Y tế thế giới - WHOTheo hệ thống tăng cường giám sát bệnh não mô cầu, từ 1/1/2013 –12/5/2013 tại “vành đai viêm màng não” có 9.249 trường hợp nghi ngờ nhiễm và

857 trường hợp tử vong do viêm màng não, chiếm tỷ lệ 9,3% [52]

Dịch viêm màng não cũng được xác định xảy ra ở Guinea với 404 trường hợpnghi ngờ nhiễm trong đó có 38 trường hợp tử vong và ở phía Nam Sudan với 196

trường hợp nhiễm trong đó có 13 trường hợp tử vong Ngoài ra, dịch bệnh do N meningitidis còn được ghi nhận ở Benin, Burkina Fasco và Nigeria xảy ra trong thời

1995, Saudi Arabia năm 1987, Yemen 1988) [55] Các dịch lớn nhất có nguồn gốc

ở miền bắc Trung Quốc, lan rộng về phía nam và sau đó trên toàn cầu, được gây ra

bởi nhóm huyết thanh A [14], [41], [44] Một trong những dòng này lan rộng đếntiểu lục địa Ấn Độ vào năm 1983 đến năm 1987 Từ năm 1987 đến 1996, chúng điqua khu vực Trung Đông gây ra đại dịch cho khách hành hương tại Mecca Năm

1985, Bhutan cũng đã xảy ra viêm màng não với 247 trường hợp, trong đó 41trường hợp tử vong được báo cáo giữa tháng 9 năm 1985 và tháng 1986 Trong

1982 - 1984, 1475 trường hợp xảy ra ở thung lũng Kathmandu, Nepal với tỷ lệ tửvong cao nhất và tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ dưới một tuổi Nhiều dịch viêm màng não do

N meningitidis đã được ghi nhận trong năm 1966 và năm 1985 tại Delhi và Areas

[16], [47]

Năm 2005, bệnh tăng đột ngột tại Delhi, Ấn Độ và các quốc gia láng giềng củabang Uttar Pradesh và Haryana Tính đến ngày 17 tháng 06 năm 2005, 429 trườnghợp có nguy cơ bệnh viêm màng não đã được báo cáo tại Delhi trong đó 128 trường

hợp đã cho thấy nhiễm N meningitidis [47].

Ngày nay, mặc dù có kháng sinh điều trị hữu hiệu và vắc xin có thể giúpphòng ngừa được phần lớn các trường hợp bệnh, những vụ dịch (đặc biệt dịch xảy

ra tại Châu Phi, Tân Tây Lan, Singapore) và những thể bệnh nặng gây ra do loại vitrùng này vẫn còn là một trong những vấn đề quan trọng hàng đầu của y tế thế giới

2.1.2 Tình hình nhiễm N meningitidis tại Việt Nam

Ở Việt Nam, dịch bệnh viêm màng não gây ra phổ biến bởi vi khuẩn N meningitidis serogroup A, B và C Vào năm 1939 - 1940 tại miền Bắc, có một vụ dịch lớn gây nhiễm trùng huyết và viêm màng não do N meningitidis lan từ Trung

Quốc sang Sau năm 1941, miền Bắc vẫn còn thấy một số những vụ dịch nhỏ Ởmiền Nam, dịch viêm màng não xảy ra vào năm 1973 trong một trại tân binh Năm

1977 - 1978, một trận dịch lớn đã xảy ra trên nhiều tỉnh thành phía Nam, gây do não

mô cầu nhóm C Ngoài các vụ dịch quan trọng nói trên, bệnh xảy ra lẻ tẻ, tuy cókhuynh hướng gia tăng vào các thời điểm như các tháng lạnh ở miền Bắc và cáctháng 6, 7, 8 tại các tỉnh phía Nam [54]

Theo số liệu của Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương, tỷ lệ mắc bệnh từ 1991

-2000 ở Việt Nam là 2,3 trên 100.000 dân và là bệnh xếp thứ 6 trong 10 bệnhtruyền nhiễm có tỷ lệ chết cao nhất (0,03 trên 100.000 dân) [55]

Theo Cục Y tế dự phòng, giai đoạn từ năm 2001 - 2011, trung bình ghi nhận

650 trường hợp mắc bệnh viêm màng não do N meningitidis gây ra, chủ yếu ở các

tỉnh khu vực miền Bắc Năm 2011 ghi nhận 305 trường hợp mắc và 4 trường hợp tửvong Bệnh xảy ra chủ yếu vào mùa xuân [63], [64]

Cuối tháng 12 năm 2011, bệnh nhiễm N meningitidis khởi phát tại công ty

Fukukawa (Khu chế xuất Tân Thuận, Quận 7, TP.HCM) Đến tháng 02 năm 2012,bệnh nhiễm não mô cầu đã xuất hiện ở 10 quận, huyện của TP.HCM, gồm các quận:

7, 8, 9, 10, Tân Bình, Tân Phú, Bình Tân, Gò Vấp và các huyện Bình Chánh, CủChi [54], [56], [57]

Trong năm 2014, theo Tổng cục thống kê, cả nước có 24 trường hợp mắc bệnh

viêm màng não do N meningitidis gây ra, trong đó 3 trường hợp tử vong [57] Số ca

mắc bệnh so với năm 2013 tăng lên 4 ca nhưng so với trung bình 3 năm (2011 2013) thì giảm 86,8%

-Theo Bộ Y tế, từ đầu năm 2015 đến nay cả nước ghi nhận 24 ca bệnh viêmmàng não do não mô cầu, 2 người tử vong, tăng 16 ca so với cùng kỳ năm ngoái.Trong đó riêng tháng 4, cả nước ghi nhận 11 ca viêm màng não do não mô cầu, 2 ca

tử vong [61]

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Neisseria meningitidis

2.2.1 Phân loại N.meningitidis

Về phân loại khoa học, N.meningitidis được xếp loại vào:

Loài: Neisseria meningitidis

N meningitidis được xếp loại theo hệ thống phân týp huyết thanh, dựa trên sự

khác biệt cấu trúc của nang polysaccharide (nhóm huyết thanh), protein màng ngoàichủ yếu OMP (týp huyết thanh), protein màng ngoài khác (phụ týp huyết thanh) vàlipo-oligosaccharide (týp miễn dịch) [12], [20]

N meningitidis được chia thành 13 nhóm huyết thanh là: A, B, C, H, I, K, L,

M, X, Y, Z, 29E và W135, 20 týp huyết thanh, 10 phụ týp huyết thanh và 13 týpmiễn dịch [54]

2.2.2 Hình thái N meningitidis

N meningitidis là song cầu Gram âm, có vỏ polysaccharide, ái khí, không di

động, không tạo thành nha bào, đường kính 0,6 x 0,8µm, có thể thấy ở các dạng đơnđộc hoặc song cầu hình hạt cà phê úp mặt khuyết vào nhau hoặc đứng riêng từngđôi cũng có thể tụ lại thành đám

Quan sát phết nhuộm bệnh phẩm cho thấy chúng nằm trong hoặc ngoài bạch

cầu đa nhân Các vi khuẩn N meningitidis hầu hết đều có vỏ nang [1],[54].

A B

Hình 2.3 Tiêu bản nhuộm dịch não tủy (A) và vi khuẩn N meningitidis sau

khi nhuộm Gram (X100) từ khuẩn lạc (B)

2.2.3 Tính chất nuôi cấy

N meningitidis là một loại vi khuẩn khó mọc, chúng chỉ có thể mọc trên môi

trường giàu chất dinh dưỡng như thạch 5% máu cừu (blood agar) hay thạch máu

N meningitidis có tính nhạy cảm với nhiệt độ lạnh và khô, do chúng tự ly giải rất nhanh Khi ở ngoài cơ thể, N meningitidis sống được 3 - 4 giờ và bị tiêu diệt

chóng ủ trong bình nến [48]

Đối với bệnh phẩm là dịch tỵ hầu cần thiết dùng môi trường thạch máu chín có

bổ sung kháng sinh: Vancomycin để ức chế các vi khuẩn Gram dương, Colistin đểức chế các vi khuẩn Gram âm và Nystatin để ức chế các loại vi nấm khác nhằmsàng lọc các dòng Neisseria

Trên môi trường thạch máu và thạch chocolate, khuẩn lạc N meningitidis tròn,

lồi, nhẵn, ẩm ướt, óng ánh và có màu hơi xám, không có mùi đặc trưng Sau 24 giờnuôi cấy, khuẩn lạc có đường kính khoảng 0,8 – 1 mm, không gây tan máu, để lâu

khuẩn lạc có màu xám đục, nhầy hơn do tự ly giải và có thể làm màu môi trường ở dưới vùng vi khuẩn mọc đậm hơn.

BA CA

Hình 2.4 Hình thái khuẩn lạc N meningitidis trên môi trường BA và CA

2.2.4 Đặc điểm sinh hóa

Các phản ứng sinh hóa đặc trưng bao gồm: oxidase và catalase dương tính.Lên men đường glucose, maltose, tạo môi trường acid và đổi màu Cystine TrypticAgar (CTA) từ đỏ sang vàng, không lên men đường sucrose, lactose [48]

2.2.5 Đặc điểm dịch tễ

Bệnh não mô cầu phổ biến toàn thế giới, thành từng ca rải rác hay những vụdịch nhỏ ở làng, xã, tập thể, cơ quan, nhưng cũng cũng có thể thành những vụ dịchlớn Mặc dù có kháng sinh và cả vaccine có hiệu quả, não mô cầu vẫn là mộtnguyên nhân gây viêm màng não và nhiễm trùng nặng hàng đầu trên thế giới, gây tửvong nhanh chóng cho một người trước đó còn khoẻ mạnh bình thường

Não mô cầu là tác nhân gây bệnh duy nhất trong số những vi khuẩn gây viêm

màng não có thể gây thành dịch bên cạnh những ca rải rác Dịch do N meningitidis

xảy ra tại các khu vực trên thế giới do 5 nhóm huyết thanh A, B, C, Y và W - 135gây ra với 90% các trường hợp mắc Nhóm A, B và C chiếm phần lớn các trường

hợp bệnh do N meningitidis trên toàn thế giới Trong đó, nhóm A và C thường gây

bệnh ở Châu Á và Châu Phi, nhóm B và C gây bệnh phần lớn tại Châu Âu, Châu

do nhóm W - 135 gây ra Dịch bệnh viêm màng não do N meningitidis gia tăng từ 1

- 3 trên 100.000 trường hợp ở các nước phát triển đến 10 - 25 trên 100.000 trườnghợp ở các nước đang phát triển Sự khác biệt về tỷ lệ tấn công phản ánh sự khác biệt

về tính chất gây bệnh của các chủng N meningitidis và cho thấy khả năng xuất hiện

bệnh tỷ lệ thuận với điều kiện kinh tế, xã hội và môi trường [47]

N meningitidis có khả năng gây dịch lớn hoặc các trường hợp bệnh lẻ tẻ.

Nhóm A thường gây bệnh dịch lớn, xảy ra theo chu kỳ khoảng 20 - 30 năm hoặcdịch nhỏ có chu kỳ 8 - 12 năm Chẳng hạn như trong thế chiến thứ I và thứ II đều đãxảy ra dịch não mô cầu bên trong cũng như bên ngoài quân đội Nhóm B và Cthường gây các trường hợp riêng lẻ, vẫn có khả năng gây nên các trận dịch Một nửa

số trường hợp nhiễm N meningitidis xảy ra ở trẻ em dưới 1 tuổi là do nhóm B gây

ra Nhóm C thường xảy ra ở vị thành niên Nhóm Y chỉ gây dịch riêng lẻ và chủ yếu

ở lứa tuổi thành niên [47], [53] Tuổi dễ mắc bệnh nhất là trẻ em từ 6 tháng đến 3tuổi hoặc thanh thiếu niên từ 14 - 20 tuổi và tỷ lệ bệnh thấp ở người trên 20 tuổi.Không có sự khác biệt rõ rệt về giới tính, tuy ở nam giới thường được ghi nhận mắcbệnh viêm màng não và nhiễm trùng huyết nhiều hơn ở nữ giới [54]

Những trường hợp đầu tiên của dịch viêm màng não do não mô cầu thườngxẩy ra do những tiếp xúc trong gia đình hơn là từ cộng đồng Tỷ lệ lây nhiễm chongười thứ hai là 400 - 1000 trên 100.000 thành viên trong gia đình Lây lan ở trườnghọc cũng được ghi nhận, nhưng tỷ lệ chỉ 2 - 4 trên 100.000 Trong các vụ dịch ởlàng Đại học, tỷ lê lây lan cao nhất ở những sinh viên ở cư xá Những trường hợp

lây đa số xẩy ra trong vòng 2 tuần kể từ khi có trường hợp mắc bệnh đầu tiên,nhưng cũng có trường hợp kéo dài đến vài tháng sau [65].

Thời điểm bệnh xảy ra tại các nước khí hậu ôn đới thường vào mùa đông vàđầu mùa xuân, thấp nhất là giữa mùa hè Tại các vùng nhiệt đới, bệnh gia tăng khi

có sự thay đổi thời tiết, khí hậu, thí dụ như vào lúc cuối mùa khô, đầu mùa mưa.Dịch não mô cầu còn được nhận xét có nhiều nguy cơ bộc phát vào các thời giancon người tập trung đông đúc thí dụ như mùa khai trường, đợt tuyển quân Bệnhhay xảy ra và lan rộng tại các tập thể đông đúc ở thành thị hơn là nông thôn Thí dụnhư nhà trẻ, trường học, ký túc xá, đặc biệt là trại lính, nhất là ở những tập thể mớiđược thành lập, cá nhân sống chật chội, thiếu vệ sinh [48], [53]

2.2.6 Cơ chế và khả năng gây bệnh

2.2.6.1 Vật chủ và con đường lây nhiễm

N meningitidis là vi khuẩn cư trú tại vùng họng mũi của người và lây truyền

theo các giọt nước nhỏ bài tiết qua đường hô hấp của bệnh nhân hay người lành

mang mầm bệnh Ngoài khả năng gây bệnh, N meningitidis cũng là một mối nguy

cơ tiềm ẩn, trong một nghiên cứu, N meningitidis phân lập được từ mũi họng của 8

- 20% cá thể lành mạnh [23] Người lành mang N meningitidis là yếu tố lây truyền

mạnh hơn đối với những người đang mắc bệnh Khi bệnh xảy ra lẻ tẻ, tỷ lệ mang vikhuẩn này ở những người tiếp xúc gần gũi tăng 40% và tại những nơi đông dân cư,đặc biệt trong các doanh trại quân đội hay các trận dịch lớn thì tỷ lệ này có thể lênđến 60 - 80%

Con người là ký chủ duy nhất của N.meningitidis và hiện nay chưa phát hiện

có ký chủ truyền bệnh nào khác Thời gian ủ bệnh chính xác thường không xác định

rõ và đã được ước tính trung bình từ 2 - 10 ngày, thông thường từ 3 - 4 ngày

2.2.6.2 Các yếu tố độc lực

N meningitidis là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên người, chứa các yếu tố

độc lực tạo nên các cơ chế gây bệnh của vi khuẩn trên vật chủ bao gồm: pili, vỏpolysaccharide, protein phân cắt kháng thể IgA và nội độc tố lipopolysaccharide[62]

Hình 2.5 Các protein bề mặt và thành phần màng ngoài của N meningitidis

[62]

này bao bọc bên ngoài tế bào vi khuẩn, bảo vệ chúng khỏi hiện tượng thực bàocủa cơ thể vật chủ, tăng khả năng xâm nhập và tồn tại của vi khuẩn trong máu vàhệ thần kinh trung ương

 Pili: có vai trò quan trọng, tạo khả năng bám của vi khuẩn lên các tế bàoniêm mạc mũi họng, giúp vi khuẩn vượt qua hàng rào máu não đi vào hệ thầnkinh trung ương và tồn tại gây bệnh

trong những yếu tố quyết định khả năng gây độc của vi khuẩn Đồng thời,lipooligosacchride cũng kích thích giải phóng TNF - alpha làm tổn thương tế bàochủ, cảm ứng cho sự hình thành của các cytokine khác nhau gây tổn thương nội

mô mạch máu, dẫn đến hoại tử và tổn thương nghiêm trọng ở nhiều cơ quan vàhệ thống

meningitidis đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra độc lực của vi khuẩn.

Trong đó, porB có khả năng chèn vào bên trong màng tế bào chủ gây chết tế bào,

nhiễm trùng và giúp vi khuẩn xâm nhập vào bên trong cơ thể vật chủ

điều kiện cho vi khuẩn bám dính vào các tế bào biểu mô và bạch cầu trung tính

2.2.6.3 Cơ chế gây bệnh

Cơ chế gây bệnh của N meningitidis trải qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Vi khuẩn cố định lên và xuyên qua màng nhày hầu họng

Bệnh thường khởi phát do vật chủ (người) mang một loại vi khuẩn đường mũihọng và vi khuẩn này mang đặc điểm có khả năng xuyên qua màng nhầy Để có thể

cố định được lên màng nhầy, các vi khuẩn phải có cơ chế tiết ra những proteasegiúp chúng phân giải được các phân tử thuộc cơ chế bảo vệ bởi hệ miễn nhiễm vậtchủ hoặc cắt đứt các liên kết phân tử của lớp tế bào biểu mô màng nhầy hầu họng.Sau khi bám lên được, vi khuẩn phải xuyên niêm mạc để xâm nhập vào máu vậtchủ Hai yếu tố giúp chúng thực hiện là nhung mao và protein vỏ Các nhung maogiúp chúng gắn kết với các thụ thể trên tế bào biểu mô màng nhầy tại những nơi sẽhình thành túi thực bào để xuyên qua màng nhầy Các protein vỏ có khả năng kết

hợp với protein vận chuyển kháng thể IgA, tạo thành phức hợp protein vỏ - protein

vận chuyển, có thể đi xuyên qua hàng rào tế bào biểu mô [3], [4]

Hình 2.6 Quá trình xâm nhiễm của N meningitidis.

Nguồn: David Stephens et al, 2007,J The Lancet, 369: 2196-2210

Trong đó, A: N meningitidis xâm nhập vào bề mặt niêm mạc hầu họng.

B: Giai đoạn đính màng

C: Hình thành tập đoàn

D: Xâm chiếm và định cư ở vùng hầu họng

Giai đoạn 2: Vi khuẩn tăng sinh trong máu

Vi khuẩn tiếp tục du nhập vào máu, để sống sót và nhân lên về số lượng,chúng tiếp tục chống đỡ với một cơ chế bảo vệ nữa của vật chủ là khả năng thựcbào của bạch cầu trung tính và hoạt động diệt khuẩn của hệ bổ thể Chính vỏcapsule và protein trên bề mặt capsule của vi khuẩn giúp chúng vượt qua hàng ràomiễn nhiễm của vật chủ Vì thế, hầu hết các vi khuẩn có độc lực cao và có thể sốngsót trong cơ thể vật chủ đều có capsule

Giai đoạn 3: Vi khuẩn xâm nhập màng não

Vi khuẩn sống sót trong máu và không ngừng nhân lên về số lượng, nhưng đểvượt qua hàng rào máu não và xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương thì điều kiện

những vi khuẩn có nhung mao sẽ chuyển sang pha biến đổi với hình thái khôngnhung mao hay vi khuẩn liên kết với bạch cầu đơn nhân để bước qua hàng rào máu

não, xâm nhập hệ thần kinh trung ương Khi vi khuẩn vào được dịch não tủy, cơ chếbảo vệ của vật chủ không đủ để khống chế chúng Tại đây chúng kích thích miễndịch, tạo đáp ứng viêm trong khoang dưới nhện (dịch não tủy) và màng não Nhữngphân tử chính gây nên hiện tượng trên là lipopolysaccharide (thành phần cấu tạochủ yếu của vi khuẩn Gram âm), peptidoglycan (thành phần cấu tạo chủ yếu của vikhuẩn Gram dương), DNA của vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn…Sau khi khơi màocủa các thành phần vi khuẩn, các chất trung gian gây viêm được tiết vào hệ thầnkinh trung ương sẽ làm thay đổi tính thấm của hàng rào máu não.

2.2.7 Biểu hiện lâm sàng

Thông thường, bệnh nhân có triệu chứng hô hấp trước khi có bệnh cảnh nhiễmtrùng huyết hay viêm màng não, 99% biểu hiện của nhiễm não mô cầu là nhiễmtrùng huyết, viêm màng não mủ hay phối hợp cả hai

2.2.7.1 Viêm họng

Viêm họng do N meningitidis khó chẩn đoán vì phân lập được vi trùng từ cổ

họng cũng không xác định được đó chính là nguyên nhân gây bệnh Thật vậy, phần

lớn người mang N meningitidis ở họng mũi là người lành mang trùng Nhiều tác giả

đã ghi nhận thực sự có bệnh viêm họng mũi do não mô cầu Bệnh xảy ra hàng loạtkhi đang thời gian có dịch, đa số không có triệu chứng lâm sàng rõ hoặc có thể sổmũi, viêm họng đỏ tuy hạch amiđan không to và không có hạch cổ

2.2.7.2 Nhiễm trùng huyết

Nhiễm trùng huyết do N meningitidis có nhiều hình thức thay đổi, từ thể tối

cấp diễn tiến trong vòng vài giờ đến những bệnh âm ỉ kéo dài nhiều ngày hoặc đôikhi nhiều tháng [52]

 Nhiễm trùng huyết thế cấp

N meningitidis có thể gây nhiễm trùng huyết kèm theo viêm màng não mủ

hoặc không; do đó, cần khảo sát dịch não tủy các bệnh nhân nhiễm trùng huyết do

N meningitidis để chẩn đoán kịp thời thể bệnh có phối hợp này Tỷ lệ bệnh nhân

nhiễm trùng huyết cấp nhưng không kèm viêm màng não mủ chiếm khoảng 30 35%

-Khởi bệnh thường đột ngột, tuy trong nhiều trường hợp bệnh nhân có tìnhtrạng tương tự như bị cảm cúm trước đó: mệt nhọc, đau họng, ho, nhức đầu… Tiếp

khớp, đau cơ đặc biệt đau nhiều ở sống lưng và hai chân Bệnh nhân có mạchnhanh, thở nhanh và có thể có huyết áp thấp tuy sốc thực sự hiếm xảy ra trừ khi rơivào thể tối cấp

Biểu hiện rõ ràng nhất là tử ban, xuất hiện trong khoảng 75% các trường hợp,trong vòng một hai ngày sau sốt Tử ban cần được quan sát dưới nguồn ánh sáng tốt

và có đặc điểm: màu đỏ hoặc tím thẫm, bờ không tròn đều, kích thước thay đổi từ 1– 2 mm đến vài cm, bề mặt bằng phẳng không gồ lên mặt da, có khi có hoại tử vùngtrung tâm Vị trí tử ban phân bổ khắp người, song thấy nhiều nhất ở vùng náchhông, quanh khớp (khuỷu, gối, cổ chân) Đôi khi tử ban có dạng bóng nước (nốtphỏng) hoặc tràn rộng lớn như hình bản đồ

Khi tử ban lan tràn nhanh chóng về số lượng hoặc phát triển kích thước cầnlưu ý bệnh đang diễn tiến đến thể tối cấp Tuy nhiên không có tử ban không cónghĩa là bệnh diễn tiến nhẹ Ngoài ra, hầu hết trường hợp có xuất huyết niêm mạcmắt, tuy xuất huyết các nơi khác (như xuất huyết tiêu hoá) hiếm xảy ra Dấu hiệukhác: lách to, nốt herpes ở khoé miệng

 Nhiễm trùng huyết tối cấp

Còn được gọi là hội chứng Waterhouse - Friderichsen, xảy ra với tỉ lệ khoảng

10 - 20% các trường hợp nhiễm trùng huyết do N meningitidis Đây là bệnh nhiễm

trùng huyết não mô cầu rất cấp tính, diễn tiến nhanh chóng đến tình trạng suy tuầnhoàn, sốc phổi và gây tử vong, có thể chỉ trong vòng vài giờ

Bệnh nhân khởi đầu có các triệu chứng tương tự như nhiễm trùng huyết cấpnhưng các dấu hiệu tiên lượng nặng xuất hiện rầm rộ và đầy đủ trong vòng 12 giờđầu tiên của bệnh:

 Tử ban xuất hiện sớm và lan ra nhanh chóng

tăng (dưới 10 mm giờ đầu)

Bệnh nhân thường có biểu hiện co mạch toàn thân ngay trong giai đoạn tiềnsốc nên tím tái rất nặng và giá lạnh tứ chi Những trường hợp bệnh nhân hồi phục

có thể bị bội nhiễm hoặc bị mất ngón tay, ngón chân do hoại tử Thời gian lành lặncho các sang thương này chậm và có thể cần phải ghép da

 Nhiễm trùng huyết mạn tính

Đây là hình thức hiếm thấy của nhiễm trùng huyết do não mô cầu với diễn tiếnkéo dài nhiều tuần, hoặc nhiều tháng và có đặc điểm là sốt, rét run, nổi đỏ da nhiềuhình thức, viêm khớp hay đau các khớp

Trường hợp điển hình các triệu chứng của bệnh thường tái đi tái lại cáchkhoảng vài ngày, giữa thời gian nói trên tổng trạng bệnh nhân vẫn bảo tồn Vi trùngcũng hiện diện trong máu từng lúc, do đó cần phải cấy máu rất nhiều lần mới có thểchẩn đoán xác định được bệnh

Thời gian bệnh kéo dài từ bốn đến tám tuần, tuy có thể kéo dài đến hơn 10tuần nếu có biến chứng Trường hợp không phát hiện được bệnh sớm để điều trị sẽdiễn tiến đến các tổn thương khu trú như viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêmthận, viêm tinh hoàn, viêm kết mạc mắt Cơ chế bệnh sinh của thể bệnh này không

rõ Có giả thuyết cho là do phản ứng siêu nhạy cảm

2.2.7.3 Viêm màng não

Viêm màng não do N meningitidis hay gặp xảy ra tiên phát ở trẻ từ 6 tháng

đến 10 tuổi Triệu chứng lúc khởi bệnh khó phân biệt với những trường hợp nhiễmtrùng toàn thân, tuy nhiên trên một số bệnh nhân, bên cạnh biểu hiện nhiễm trùnghuyết và tử ban, dấu hiệu viêm màng não nổi bật với độ nặng gia tăng dần như sốt,

ói, nhức đầu, mê sảng

So sánh với các loại viêm màng não mủ gây do những vi trùng khác như phế

cầu, Haemophilus influenzae, biểu hiện thần kinh khu trú và co giật rất hiếm thấy

trên viêm màng não do N meningitidis Dấu hiệu mê sảng nếu xảy ra sớm trên bệnh

nhân, có thể báo hiệu đã có áp-xe não ở thùy thái dương hoặc viêm não

Khoảng 20 - 40% số trường hợp, viêm màng não do N meningitidis không có

triệu chứng lâm sàng của nhiễm trùng huyết rõ rệt, chẩn đoán cần dựa vào xét

nghiệm phân lập N meningitidis trong dịch não tủy.

Trên thực tế lâm sàng, những yếu tố sau đây gợi ý tác nhân gây bệnh là N meningitidis trên một bệnh nhân có biểu hiện viêm màng não:

đã được chứng minh là có hiệu quả trên bệnh viêm màng não não mô cầu [59]

2.2.9 Phòng ngừa

Các nguyên tắc phòng bệnh chung đối với não mô cầu thường là:

họng bằng các dung dịch sát khuẩn mũi họng thông thường

và người tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân [2].

Có thể tiến hành dự phòng bằng thuốc đối với những người tiếp xúc trực tiếpvới bệnh nhân đã được chẩn đoán chắc chắn nhiễm não mô cầu, bao gồm các trườnghợp như:

một nhà, cùng khu nhà trọ, cùng phòng làm việc…) trong vòng 7 ngày trước khibệnh nhân có biểu hiện triệu chứng

bệnh qua đường hô hấp như: nói chuyện với bệnh nhân, tiếp xúc với dịch tiếtđường hô hấp của bệnh nhân…)

azithromycin với liều lượng khác nhau

Bảng 2.1 Liều lượng sử dụng kháng sinh dự phòng.

2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử phân loại N meningitidis

Các kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu N meningitidis ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam Mỗi một kỹ thuật đều

có những ưu điểm và hạn chế riêng do vậy cần lựa chọn những phương pháp phânloại phụ thuộc vào các câu hỏi về dịch tễ học và về di truyền quần thể sinh vật đangđược điều tra, đồng thời phù hợp với điều kiện trang thiết bị thực tiễn và đáp ứngnhu cầu của nghiên cứu

 Ribotyping

Là phương pháp định loại phổ biến sử dụng DNA nhiễm sắc thể và một đoạn

dò của ARN Do tất cả các chủng vi khuẩn có một hay nhiều RNA thông tin phân

bố quanh nhiễm sắc thể, trình tự các operon này có tính bảo tồn cao Do vậy vikhuẩn sẽ được định loại bằng việc sử dụng các đoạn dò hướng trực tiếp tới trình tựDNA mã hóa các RNA thông tin này [11], [35] Trong nghiên cứu dịch tễ học,

ribotyping là kỹ thuật rất hữu ích trong việc xác định các chủng vi khuẩn gram âm sinh ESBL là căn nguyên gây ra các vụ dịch trên toàn thế giới [11], [27], [34].

 Kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài giới hạn (Restriction Fragment LengthPolymorphism - RFLP)

Nguyên lý: DNA nhiễm sắc thể hay các plasmid của vi khuẩn sẽ được cắtbằng các enzym giới hạn thành những đoạn DNA Các đoạn DNA sẽ được phântách bằng điện di trên thạch, chuyển lên màng nitrocellulose, sau đó các đoạn cắtnày sẽ được lai ghép với một đoạn DNA dò đặc hiệu đã được đánh dấu phóng xạ.Những đoạn DNA có trình tự axit nucleic bổ xung phù hợp sẽ gắn với đoạn dò vàđược phân biệt dựa vào sự khác nhau về số lượng và kích thước của các phân đoạnDNA [8], [41]

 Kỹ thuật điện di xung trường (PFGE)

Kỹ thuật được sử dụng để phân loại và xác định nguồn gốc của các loại vikhuẩn Kỹ thuật này sử dụng những enzym giới hạn phù hợp để cắt DNA nhiễm sắcthể thành những phân đoạn không đều (10 đến 30 vạch DNA), các phân đoạn DNAnày sẽ được điện di để phân tách các phân đoạn từ 1kb đến 1000kb Quá trình phântích dựa trên sự so sánh các đoạn DNA của các chủng vi khuẩn để xác định mối liênquan và nguồn gốc của các chủng vi khuẩn ở các vùng và thời gian khác nhau [42].Hiện nay PFGE được coi là một trong các tiêu chuẩn vàng trong phân loại cũng nhưxác định nguồn gốc vi khuẩn [25], [27], [35]

Hình 2.7 Một số phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử.

Nguồn: Daniel J,Methods for analysis of the Intestinal Microflora [69].

 Multilocus enzyme electrophoresis – MLEE

MLEE là một phương pháp phân loại xác định độ linh động của các enzymchuyển hóa trong gel agarose hoặc gel polyacrylamide Những biến đổi trong tính diđộng của một enzyme cho các chủng khác nhau của cùng một loài trong điều kiệnnày có thể được quy cho isozyme hoặc allozymes Những thay đổi trong tính diđộng của các enzym được gây ra bởi sự khác biệt do amin thay thế acid trong chuỗipolypeptide

 Kỹ thuật Multilocus Sequence Typing - MLST

Kỹ thuật Multilocus sequence typing (MLST) được đánh giá kỹ thuật tốt nhất

để phân loại kiểu gen của nhiều loại vi khuẩn như: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae và S aureus [17], [18], [27] Ví dụ: Bartual và cộng sự

đã sử dụng kỹ thuật này để phân loại các chủng A baumannii dựa vào các trình tự

gen có độ dài từ 305 đến 513bp tại các vùng bảo tồn (conserved regions) của 7 loại

gen: gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi, và rpoD [9].

 Kỹ thuật giải trình tự gen

Đây là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để giải trình tự các gen kháng khángsinh, đặc biệt là phân tích các plasmid mang gen kháng kháng sinh 33 của vi khuẩn.Đây là phương pháp chính xác nhất để xác định các đặc tính kháng kháng sinh của

vi khuẩn Tính đến nay đã có hơn 800 plasmid của vi khuẩn đã được giải trình tựgen [66] Các nhà khoa học đã chứng minh tính kháng quinolone có liên quan đến

các điểm đột biến trên gen GyrA, GyrB, ParC trên DNA của vi khuẩn S.typhi [12],

[38] Hiện nay, đã có nhiều bước đột phá trong kỹ thuật giải trình tự gen như kỹthuật “next-generation sequencing” cho phép giải trình tự toàn bộ hệ gen của vikhuẩn một cách nhanh chóng trong một lần giải mã so với hệ thống giải mã trình tự

cũ (chỉ giải mã được 35-700bp)

Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng cho mục đích dịch tễ học để điều tradịch bùng phát, lây lan sinh vật và để kiểm tra cấu trúc di truyền quần thể của sinhvật nhằm hiểu rõ hơn về sự thay đổi và tiến hóa của các chủng vi khuẩn

Trong một so sánh của năm phương pháp phân loại phân tử cho các chủng N.meningitidis nhóm B, PFGE, MLEE và ribotyping cho 100% tỷ lệ của tất cả cácchủng hiện tại có thể được phân loại nhưng các chỉ số phân biệt về tính đa dạng ditruyền của các chủng ở mỗi kỹ thuật là khác nhau, ribotyping 98,8%, với 99,4%MLEE và PFGE 99,7% [42] Mặc dù, ribotyping là phương pháp phân loại tốt, rấthữu ích cho các nghiên cứu dịch tễ dài hạn, nhưng lại là phương pháp ít hiệu quảhơn khi so sánh với PFGE [39]

MLEE được sử dụng để nghiên cứu quần thể di truyền học và dịch tễ học của

nhiều loài vi khuẩn trong đó, 107 chủng N meningitidis được phân lập ở Anh từ các

trường hợp lâm sàng Sự đa dạng di truyền của quần thể trên được ước tính là 0,7;với nhóm B (0,707) cho mức độ đa dạng di truyền cao hơn nhóm C (0,605) [6] Hạnchế của kỹ thuật này phản ánh những biến đổi di truyền rất chậm nên MLEE phùhợp cho dài hạn và dịch tễ toàn cầu MLEE là một kỹ thuật phân biệt chỉ số kiểu

gen gián tiếp và đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa

N meningitidis [6], [13], [15], [32].

MLEE chỉ phát hiện ra những alen với sự khác biệt trong mã hóa chuỗi gendẫn đến thay đổi tính di dộng điện di, trong khi với MLST phát hiện trực tiếp cácalen dựa trên sự khác biệt trình tự nucleotide MLST cho phép so sánh các kết quảtừ các phòng thí nghiệm khác nhau mà không cần phải trao đổi chủng hoặc thambiến trong kỹ thuật điện di Vì vậy, nó phù hợp với việc xây dựng dữ liệu toàn cầu

mà có thể truy cập bởi các phòng thí nghiệm khác nhau để so sánh kết quả Mặc dùMLST cũng có thể trở thành “tiêu chuẩn vàng” để nghiên cứu về sự tiến hóa lâu dài

và dịch tễ học toàn cầu của N meningitidis, nhưng nó không nhạy cảm với vi tiến

hóa Vì vậy, phương pháp phân loại như PFGE nhạy cảm với vi tiến hóa được sửdụng để phát hiện những khác biệt nhỏ giữa các chủng liên quan [30], [45]

Trình tự DNA vẫn là phương pháp nhạy nhất của phát hiện tính đa hình trongmột gen Trình tự bộ gen đầy đủ có thể được sử dụng để xác định các yếu tố chưađược ghi nhận như là mục tiêu có thể cho các nghiên cứu dịch tễ học So sánh trình

tự gen như một cách phân loại là không khả thi hiện nay ở hầu hết các phòng thínghiệm Phương pháp giải trình tự cần phải được đơn giản hóa và tự động Điều nàytạo thành một nhiệm vụ to lớn mà đòi hỏi sự hợp tác quốc gia và quốc tế

Cơ cấu di truyền của N meningitides rất phức tạp Có mười ba nhóm huyết

thanh được ghi nhận nhưng sáu nhóm A, B, C, X, Y và W - 135 rất quan trọng vềmặt lâm sàng [37] Trong đó tỉ lệ biến thể di truyền của nhóm A thấp hơn so vớinhóm B và C, cấu trúc về mặt di truyền của nhóm A tương đối đồng nhất và các bảnsao tồn tạị trong một thời gian dài Đáng chú ý là với hai nhóm B, C thì các bản saophát triển mạnh, nhưng theo thời gian thì các chủng này bị phá vỡ bởi sự tái tổ hợp[30]

Đối với các chủng nhóm huyết thanh A, các kỹ thuật như Ribotyping, RFLP,PFGE phù hợp cho việc xác định các vi biến đổi để phân biệt và tìm ra mối quan hệgiữa các chủng lưu hành trọng một vị trí địa lý Tuy nhiên, đối với các chủng thuộcnhóm huyết thanh B và C, cấu trúc di truyền đa dạng hóa tương đối nhanh chóng

nên các kỹ thuật trên trên cũng được áp dụng trong tình hình dịch bộc phát Phươngpháp định lượng như MLEE và MLST thích hợp cho việc đánh giá dài hạn và dịch

tễ học toàn cầu

Việc định danh và mô tả yếu tố dịch tễ bằng phương pháp sinh học phân tử

những chủng N meningitidis phân lập xảy ra theo thời gian, không gian là hết sức

quan trọng, giúp xác định nguồn gốc và cách lây truyền Nhiều kỹ thuật sinh họcphân tử được sử dụng, từ kỹ thuật đơn giản như định phage, định danh dựa trênhuyết thanh, cho tới kỹ thuật sinh học phân tử phức tạp, đòi hỏi trình độ, phươngtiện máy móc hiện đại được nêu trên và một số kỹ thuật khác như phân tíchplasmid, ribosom, kỹ thuật phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ plymerase), kỹ thuậtphân tích đa hình các đoạn enzyme khuyếch đại RAPD, AFLP (Amplified FragmentLength Polymorphism PCR) Song, kỹ thuật sinh học phân tử được chọn lựa nhiềunhất hiện nay để so sánh mối di truyền giữa các chủng trong cùng một loài về sinhhọc phân tử là kỹ thuật PFGE

2.4 Kỹ thuật PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis): kỹ thuật điện di trong trường xung điện hay điện di trong trường điện thay đổi.

2.4.1 Nguyên tắc chung của PFGE

Nguyên lý của kỹ thuật này là phân tách DNA trên nhiễm sắc thể bằng cácenzym giới hạn để tạo ra các đoạn DNA với các kích cỡ khác nhau làm cơ sở tạonên các kiểu hình DNA khác nhau bằng điện di gel agarose Kỹ thuật PFGE có khảnăng tách những đoạn DNA có kích thước rất lớn (50 kb – 12 Mb) thành nhữngđoạn có kích thước nhỏ dựa trên nguyên tắc đổi hướng định kỳ điện trường xungtrong quá trình điện di PFGE là kỹ thuật có hiệu lực phân biệt, khả năng lặp lại cao

và thường được chọn lựa cho nhiều nghiên cứu dịch tễ học phân tử, các vụ dịch docác tác nhân gây bệnh gây ra Kỹ thuật này lần đầu tiên được Schwartz và Cantor(1984) giới thiệu Tuy nhiên sau đó đã có nhiều tác giả mô tả lại kỹ thuật này, tuy

có sai khác ít nhiều nhưng cơ sở lý thuyết của các phương pháp này là như nhau:mục đích của kỹ thuật này là tăng khả năng di động của các mảnh DNA có kíchthước lớn trong điện trường, do đó các thành phần gel và đệm hầu như không thay

đổi theo các phương pháp điện di thông thường Tuy nhiên theo phương pháp thôngthường thì sự điện di liên quan đến sự di động của các mảnh DNA có kích thướckhác nhau trên gel agarose trong một trường điện không đổi Kết quả ở đây là phân

tử lớn khó di động hơn phân tử nhỏ qua mắt xích agarose, tạo ra sự tách biệt trongtrường điện di Trong trường hợp PFGE lực làm thay đổi khả năng di động lại làtrường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh DNA có kích thước khác nhauthay đổi hướng di động Như vậy kết quả là các mảnh có kích thước khác nhau sẽ

có khả năng di động khác nhau Kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm[59]

Tiếp theo các mô tả của Schwartz và Cantor, Smith và Codemine (1990) đãđề cập đến sự di chuyển của các mảnh DNA khác nhau là hàm số tuyến tính vớikích thước của chúng trên cơ sở đó có thể điều chỉnh các xung điện và điện trường.Tuy nhiên các nhân tố khác cũng có mối tương tác lẫn nhau và ảnh hưởng đến khảnăng di động của DNA như: nhiệt độ, điện thế, nồng độ agarose cũng như nồng độion trong đệm [60]

2.4.2 Quy trình PFGE

Hình 2.8 Các bước thực hiện quy trình PFGE.

PFGE được xem là "tiêu chuẩn vàng - gold standard" trong lựa chọn cácphương pháp sinh học phân tử dùng để nghiên cứu dịch tễ học Trong kỹ thuật này,các chủng vi khuẩn nghiên cứu được nuôi cấy trong môi trường lỏng hoặc môitrường thạch, sau đó sẽ hòa vi khuẩn vào thạch agarose lỏng rồi đổ vào nhữngkhuôn nhỏ, kết quả miếng thạch sau khi đổ được cắt tạo ra các plugs nhỏ có chứatoàn bộ tế bào vi khuẩn Vi khuẩn được cố định trong thạch sẽ chịu tác dụng củaenzyme ly giải tế bào để giải phóng toàn bộ DNA, tiếp theo DNA này sẽ bị phân cắttại những vị trí đặc hiệu bởi enzyme giới hạn Các plugs chứa DNA sau khi đã đượcphân cắt được đặt vào những giếng tương ứng trong khuôn thạch agarose và tiếnhành điện di Trong đó, bộ điện di được đặt với dòng điện thay đổi ở các khoảngđược xác định trước sao cho điện trường phải cho phép các đoạn DNA có kíchthước lớn khoảng 10 - 500 kb phân tách rời được với nhau Mẫu DNA sau điện di

sẽ được nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang như ethidium bromide và quan sátdưới đèn cực tím (UV light) Kết quả DNA trên thạch được chụp ảnh và phân tíchtheo tiêu chuẩn của Tenover và cs, 1995.

Các băng được tạo ra từ các chủng N meningitidis bởi các enzyme cắt giới

hạn và độ phân giải của các băng còn lại bằng xung điện di gel trường (PFGE) Cácdải băng của kỹ thuật này nhanh chóng tạo ra các mối quan hệ vô tính giữa cácchủng khác nhau của viêm màng não được điều tra [23]

Bảng 2.2 Một số enzym cắt hạn chế được dùng cho kỹ thuật PFGE E

Not1 cho 34 băng khác nhau giữa 4 và 130 kbp, NheI cho16 băng từ 5 đến 400 kbp, Paci cho 14 băng từ 4 đến 400 kbp và SpeI cho 19 băng từ 6 - 300 kbp.

Tính toán dựa trên các dữ liệu khác cho rằng kích thước nhiễm sắc thể N meningitidis là 1.8 – 2 Mbp Nghiên cứu cho thấy các băng PFGE có thể được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa phân lập lâm sàng với hai enzyme cắt (SfiI và

NheI) Các băng do NheI đã có khả năng phân biệt lớn hơn, phân biệt 'chủng dịch

cũ' và 'chủng dịch mới' cùng một phân nhóm Các băng của mỗi chủng cho phép

phân tích toàn bộ nhiễm sắc thể của sinh vật NheI là enzyme cắt đặc hiệu cho N meningitidis có khả năng phân cắt tạo ra những khác biệt nhỏ nhất giữa các chủng

phân nhóm khác nhau được phân lập tại thời điểm khác nhau và vị trí địa lý [24].Theo phương pháp thông thường thì sự điện di liên quan đến sự di động củacác mảnh ADN có kích thước khác nhau trên gel agarose trong một trường điệnkhông đổi Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện những phân tử DNAkhác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạy được những quãngđường khác nhau sau một thời gian như nhau PFGE làm thay đổi khả năng di độngnhờ trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh DNA có kích thước khácnhau thay đổi hướng di động Sự di động khác nhau của DNA chủ yếu phụ thuộcvào kích thước chứ không phải do gel agarose như ở phương pháp điện di thôngthường

Hình 2.9 Khả năng di động của phân tử DNA trong trường xung điện [71].

Tenover và cộng sự đã đưa ra một hệ thống tiêu chuẩn để giải thích nhữngmẫu PFGE trong mối tương quan để xác định sự liên quan giữa các chủng vi khuẩnphân lập được Trong đó, những chủng vi khuẩn tạo ra các mẫu PFGE tương ứnggiống nhau được xem là có nguồn gốc từ một chủng

Mức độ tương đồng genome của các chủng vi khuẩn được chia thành các cấpđộ khi phân tích bằng PFGE:

- Không thể phân biệt được (không có sự khác biệt, Indistinguishable): thểhiện số băng trên gel như nhau và kích thướt các băng tương tự nhau Đây có thể làcùng 1 chủng gây bệnh và là chủng đại điện cho ổ dịch Những chủng này cũng cóthể không phân biệt được bằng các phương pháp khác.

- Liên hệ rất gần (closely related): những chủng có sự khác biệt rất nhỏ chỉvới 1 yếu tố di truyền phân tử như 1 điểm đột biến, mất đi hoặc chèn thêm vào 1đoạn DNA Khi phân tích PFGE, các chủng này thể hiện sự sai khác ở 2 - 3 băng.Những chủng này có thể là những chủng tham gia gây nên ổ dịch và có đặc điểmdịch tễ của bệnh tương đối giống nhau

- Có thể có liên hệ (possibly related): gồm những chủng có 2 điểm khác biệtvề di truyền phân tử độc lập, thể hiện có trên gel là có 4 - 6 băng khác nhau Nhữngchủng này có rất ít đặc điểm về dịch tễ với nhau như xa về vùng địa lý, đặc điểmkhí hậu,

- Không có liên hệ: có ít nhất 3 yếu tố di truyền phân tử độc lập khác nhau,thể hiện có ít nhất 7 băng khác nhau Các chủng này không có liên hệ với nhau vềđặc điểm dịch tễ của bệnh cũng như khả năng gây bệnh

Các chủng vi khuẩn được xếp vào các nhóm không thể phân biệt, liên hệ rấtgần và có thể có liên hệ thường có mức độ tương đồng trên 85% Vì vậy, tiêu chuẩnnày có thể áp dụng được đối các nghiên cứu ở địa phương nhỏ, trong đó sự khácbiệt về gen được xem là có giới hạn

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn tương đồng về kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE [21]

2.4.3 So sánh kỹ thuật PFGE với các phương pháp phân loại sinh học phân tử khác thường được sử dụng trong nghiên cứu.

• PFGE phân nhóm đã được áp dụng thành công để phân nhóm của nhiều loại

vi khuẩn gây bệnh và có phù hợp cao với độ liên quan dịch tễ học

• PFGE phân biệt rõ ràng hơn so với các phương pháp phân loại khác nhưribotyping hoặc multilocus sequence typing cho nhiều loại vi khuẩn

• PFGE trong các định dạng cơ bản tương tự có thể được áp dụng như mộtphương pháp chung cho phân nhóm của vi khuẩn Chỉ có những sự lựa chọn của cácenzyme và các điều kiện cho điện hạn chế cần phải được tối ưu hóa cho từng loài

• Không phân biệt được giữa các bands không liên quan

• Kết quả mẫu khác nhau chút ít giữa các kỹ thuật viên

• Mối quan hệ nên được sử dụng như một hướng dẫn, không phải biện phápphát sinh loài thực

• Một số chủng không thể được phát hiện bằng PFGE

Để nghiên cứu dịch tễ học phân tử hay xác định nguồn gốc của vi khuẩn, kỹthuật PFGE luôn được lựa chọn dựa trên nhiều ưu điểm, đồng thời cũng phụ thuộcvào thực tiễn và nghiên cứu phù hợp với dịch tễ học

Hiện nay, với sự giúp đỡ của máy tính và phần mềm phân tích kết quả điện ditrên thạch, PFGE có thể tạo ra ngân hàng số liệu về những mẫu phân tách ADN với