Tận dụng bã chưng cất hốn hợp lên men rơm rạ thành bioethanol làm nguồn dinh dưỡng thay thế bột ngô chuyên dụng trong quá trình sản xuất bioethanol theo công nghệ thủy phân và lên men đồng thời

HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẬN DỤNG BÃ CHƯNG CẤT HỐN HỢP LÊN MEN RƠM RẠ THÀNH BIOETHANOL LÀM NGUỒN DINH DƯỠNG THAY THẾ BỘT NGÔ CHUYÊN DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BIOETHANOL THEO CÔNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TẬN DỤNG BÃ CHƯNG CẤT HỐN HỢP LÊN MEN RƠM RẠ THÀNH BIOETHANOL LÀM NGUỒN

DINH DƯỠNG THAY THẾ BỘT NGÔ

CHUYÊN DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH

SẢN XUẤT BIOETHANOL THEO CÔNG NGHỆ THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : T.S NGUYỄN ĐÌNH QUÂN Sinh viên thực hiện : THÁI THỊ THÙY TRANG MSSV: 1051110165 Lớp: 10DSH02

TP Hồ Chí Minh, 2014

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, có sự hỗ trợ từGiáo viên hướng dẫn là TS Nguyễn Đình Quân Các nội dung nghiên cứu và kếtquả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ côngtrình nghiên cứu nào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việcphân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau cóghi trong phần tài liệu tham khảo Ngoài ra, đề tài còn sử dụng một số nhận xét,đánh giá cũng như số liệu của các tác giả, cơ quan tổ chức khác, và cũng được thểhiện trong phần tài liệu tham khảo

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệmtrước Hội đồng, cũng như kết quả luận văn của mình

Thái Thị Thùy Trang

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN

Trong suốt bốn năm học tập và rèn luyện tại trường, luận văn tốt ngiệp là sảnphẩm đúc kết lại quá trình nghiên cứu và thực hành của sinh viên Chính vì vậynhững kiến thức mà em đã tiếp thu được là nền tảng vững chắc giúp em hoàn thànhluận văn này Em xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học - Thựcphẩm - Môi trường, bộ môn Công nghệ sinh học trường đại học Công Nghệ T.p HồChí Minh đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ em trong thời gian qua

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS Nguyễn Đình Quân là người đãđưa em tới hướng nghiên cứu, đồng thời giúp đỡ về kiến thức cũng như tạo điềukiện để em hoàn thành tốt luận văn này

Em cũng xin cảm ơn chị Trần Phước Nhật Uyên, chị Vũ Lê Vân Khánh, anhPhạm Đình Đông đã nhiệt tình giúp đỡ em

Em cũng xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn là chỗ dựa vững chắc trong họctập và là nguồn động lực rất lớn để em phấn đấu

Vì thời gian có hạn, kinh nghiệm lẫn kiến thức chuyên môn còn thiếu và dođiều kiện khách quan nên trong quá trình làm luận văn còn nhiều thiếu sót Vì vậy

em kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của Thầy cô cùng các bạn để em cóthế khắc phục những sai sót nhằm hoàn thiện hơn bài luận văn tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn và gởi lời chúc thành công đến tất cả mọi người

Thái Thị Thùy Trang

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

TÓM TẮT LUẬN VĂN 1

MỞ ĐẦU 2

Đặt vấn đề 2

Lý do chọn đề tài và nhiệm vụ của luận văn 3

Lý do chọn đề tài: 3

Nhiệm vụ nghiên cứu của luận văn 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Nguyên liệu lignocellulose 5

1.2 Enzyme cellulase 7

1.3 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 9

1.3.1 Hình thái và cấu tạo nấm men 10

1.3.2 Sinh trưởng của nấm men 11

1.4 Quá trình sản xuất ethanol từ rơm rạ 13

1.4.1 Quy trình chung 13

1.4.2 Quy trình thực hiện 13

1.4.2.1 Tiền xử lý: 13

1.4.2.2 Thủy phân: 16

1.4.2.3 Lên men 18

2.4.2.4 Chưng cất: 22

1.5 Đối tượng của luận văn 23

1.5.1 Đặt vấn đề 23

1.5.2 Bã lên men (SSF Residue) [15] 24

1.5.3 Corn steep liquor (CSL) 25

1.6 Các kỹ thuật chìa khóa cho quá trình lên men 26

1.6.1 Thủy phân và lên men đồng thời (SSF).[20] 26

1.6.2 Nhập liệu nhiều lần theo đợt .26

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 28

2.1 Chuẩn bị nguyên liệu cho quá trình thí nghiệm 29

Đồ án tốt nghiệp

2.1.1 Rơm rạ 29

Hình 2.4 Máy cắt tinh 29

2.1.2 Nguồn dinh dưỡng bã lên men 31

2.1.3 Hoá chất sử dụng 32

4.1.3.1 Enzyme cellulase: 33

4.1.3.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 33

2.1.3.3 Corn steep liquor (CSL): 34

2.2 Tiến hành thí nghiệm 34

2.2.1 Định lượng Nitơ tổng bằng phân tích C H N.[21] 34

2.2.2 Phân tích thành phần sơ sợi .36

2.2.2.1 Hóa chất và dụng cụ sử dụng: 36

2.2.2.2 Cách tiến hành: 36

2.2.3 Phân tích hàm lượng Nitơ hòa tan bằng phương pháp Sorensen .38

2.2.4 Thủy phân và lên men đồng thời .39

2.2.5.1 Nhân giống nấm men Saccharomyces cerevisiae 40

2.2.5.1.1 Nhân giống men sử dụng bã SSF làm nguồn dinh dưỡng: 40

2.2.5.1.2 Sử dụng dịch nước SSF làm môi trường và nguồn dinh dưỡng cho quá trình nhân giống men: 42

2.2.5.1.3 Nhân giống men sử dụng CSL làm nguồn dinh dưỡng: 42

2.2.5.2 Thủy phân và lên men đồng thời .42

2.2.5.2.1 Sử dụng bã SSF làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho quá trình SSF: 45

2.2.5.2.2 Sử dụng dịch nước SSF làm môi trường và nguồn dinh dưỡng cho quá trình SFF: 46

2.2.5.2.3 Sử dụng CSL làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho quá trình SSF: 46

2.2.5.2.4 Quá trình SSF không sử dụng dinh dưỡng bổ sung: 46

2.2.5.3 Quá trình SSF ở quy mô mini-pilot: 47

Đồ án tốt nghiệp

2.2.5.3.1 Sử dụng bã SSF làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho quá trình

SSF: 47

2.2.5.3.2 Sử dụng dịch nước SSF làm môi trường và nguồn dinh dưỡng cho quá trình SSF: 48

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50

3.1 Kết quả phân tích thành phần của rơm .50

3.1.1 Thành phần rơm khô trước nổ hơi 50

3.1.2 Thành phần rơm rạ sau nổ hơi 51

3.1.3 Thành phần rơm rạ sau tiền xử lý 52

3.2 Kết quả phân tích xơ sợi các nguồn dinh dưỡng .53

3.3 Kết quả phân tích đạm các nguồn dinh dưỡng .54

3.3.1 Kết quả phân tích mẫu bằng máy phân tích nguyên tố CHN 54

3.3.2 Kết quả phân tích bằng phương pháp chuẩn độ formol (Sorensen) 55

3.4 Kết quả nhân giống men: 56

3.5 Kết quả thủy phân và lên men đồng thời: 57

3.6 Kết quả SFF ở thiết bị mini-pilot: 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

Kết luận 61

Kết luận về thành phần rơm rạ trước và sau tiền xử lý .61

Kết luận về kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng có trong nguồn dinh dưỡng .61

Kết luận về kết quả thủy phân và lên men đồng thời .61

Kiến nghị 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 1

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của rơm rạ 6

Bảng 1.2 Tỉ lệ các thành phần trong rơm rạ 6

Bảng 1.3 Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấm men được lạnh đông khô. .10

Bảng 1.4 Các thành phần hóa học trong nấm men đông khô[9] 10

Bảng 1.5 Kết quả phân tích hàm lượng nitơ trong bã lên men bằng thực nghiệm: 24 Bảng 1.6 Thành phần của CSL (%KL)[16 ] 25

Bảng 4.1 : Hóa chất sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm .32

Bảng 2.2 Kết quả thí nghiệm trong bã SSF 39

Bảng 2.3 Kết quả thí nghiệm trong CSL 39

Bảng 2.4 Tỉ lê thành phần cơ chất cho 1 lần lên men 44

Bảng 2.5 Thành phần cho quá trình SSF 45

Bảng 2.6 Thành phần cho quá trình SSF 46

Bảng 2.7 Thành phần cho quá trình SSF 46

Bảng 2.8 Thành phần cho quá trình SSF 46

Bảng 2.9 thành phần cho quá trình SFF 47

Bảng 2.10 Khối lượng rơm nhập liệu 48

Bảng 2.11 Khối lượng rơm nhập liệu 48

Bảng 2.12 Khối lượng rơm nhập liệu 49

Bảng 3.1 Thành phần xơ sợi của rơm rạ theo Hồ Tráng Sỹ [26] 50

Bảng 3.2 Thành phần xơ sợi có trong các nguồn dinh dưỡng .53

Bảng 3.3 Kết quả phân tích nitơ tổng .54

Bảng 5.4 Kết quả phân tích hàm lượng acid amin .55

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc của lignocellulose 5

Hình 1.2 Cấu trúc của tế bào và thành tế bào của thảo mộc .7

Hình 1.3 Sơ đồ các bước thủy phân cellulose bởi enzyme cellulase 9

Hình 1.4 Nấm men Sacchromyces cerevisiae dưới dạng bột khô .10

Hình 1.5 Cấu trúc rơm rạ sau tiền xử lý .14

Hình 1.6 Quy trình sản xuất ethanol từ rơm rạ của hệ thống Pilot 23

Hình 1.7 Bột ngô (CSL) 25

Hình 2.1 Rơm thô 29

Hình 2.2 Rơm sau tiền xử lý 29

Hình 2.3 Máy cắt thô 29

Hình 2.4 Máy cắt tinh 29

Hình 2.5 Thiết bị nổ hơi 30

Hình 2.6 Rơm sau nổ hơi 30

Hình 2.7 Rơm được ngâm kiềm 30

Hình 2.8 Thiết bị lọc ép 30

Hình 2.9 Rơm rạ sau tiền xử lý 31

Hình 2.10 Bã rắn sau khi sấy 32

Hình 2.11 Bã rắn sau khi nghiền 32

Hình 2.12 Enzyme Cellulase 33

Hình 2.13 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 33

Hình 2.14 Corn steep liquor (CSL) 34

Hình 2.15 Viên nang 35

Hình 2.16 Cân điện tử 35

Hình 2.17 Cân điện tử hình 35

Hình 2.18 Máy phân tích C H N 35

Hình 2.19 Dịch kích hoạt men giống 41

Hình 2.20 Thiết bị tiệt trùng 41

Đồ án tốt nghiệp

41

41

Hình 2.21 Tủ lắc 41

Hình 2.22 Máy quang phổ kế 41

Hình 2.23 Thiết bị ly tâm .42

Hình 4.24 Máy đo độ ẩm 43

Hình 2.25 Các erlen chứa rơm trước khi tiệt trùng 44

Hình 2.26 Bình thủy phân và lên men đồng thời 45

Hình 2.27 Lấy mẫu sau mỗi lần nhập liệu 48

Hình 3.1 Thành phần xơ sợi của rơm khô 50

Hình 5.2 Thành phần xơ sợi của rơm sau nổ hơi .51

Hình 3.3 Thành phần rơm sau tiền xử lý .52

Hình 3.4 Sự phát triển của con men trong quá trình nhân giống:(1) 0,1% bã SSF; (2) 200ml dịch nước SSF; (3) 0,1% CSL 56

Hình 3.5 Nồng độ ethanol trong quá trình SSF theo thời gian:(1) 8% rơm+ 0,15% bã SSF; (2) 8% rơm + dịch nước SSF; (3) 8% rơm + 0,1% CSL; (4) 8% rơm 57

Hình 3.6 Hiệu suất của quá trình SSF theo thời gian:(1) 8% rơm+ 0,15% bã SSF; (2) 8% rơm + dịch nước SSF; (3) 8% rơm + 0,1% CSL; (4) 8% rơm 58

Hình 3.7 Nồng độ ethanol trong quá trình SSF theo thời gian:(1) 16% rơm+ 0,15% bã SSF; (2) 16% rơm + dịch nước SSF .59

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.8 Hiệu suất của quá trình SSF theo thời gian:(1) 16% rơm+ 0,15% bã SSF; (2) 16% rơm + dịch nước SSF 60

có thể sản suất được từ nguồn cellulose thực vật như rơm rạ.

Rơm rạ chiếm tỉ lệ lớn trong phụ phẩm nông nghiệp ở Việt Nam Với thànhphần chứa hơn 40% cellulose, rơm rạ là nguồn nguyên liệu thích hợp cho quá trìnhsản xuất ethanol Trong quá trình lên men ethanol từ rơm rạ, nấm men cần nguồndinh dưỡng bổ sung để sinh sản và sinh trưởng tốt Nguồn dinh dưỡng đang sửdụng hiện nay là bột ngô chuyên dụng (CSL) cho kết quả rất tốt Nhưng sau quátrình lên men, lượng bã thải thường được thải bỏ hoặc sử dụng làm phân bón chocây trồng Luận văn này nghiên cứu khả năng sử dụng bã thải của quá trình lênmen và thủy phân đồng thời để thay thế cho CSL làm nguồn dinh dưỡng bổ sungtrong quá trình lên men rơm rạ thành ethanol

Bã lên men sau khi lấy từ quá trình chưng cất được để lắng chia làm 2 phần

bã rắn và bã lỏng Bã rắn sấy để giảm độ ẩm xuống dưới 10%, nghiền mịn và tiếnhành phân tích hàm lượng dinh dưỡng (Nitơ, protein) Sau đó tiến hành thủy phân

và lên men đồng thời rơm sử dụng nguồn dinh dưỡng là bã rắn, bã lỏng rồi so sánhvới kết quả khi sử dụng nguồn dinh dưỡng là CSL

Hàm lượng nitơ tổng trong bã lên men là 3,97 % (CSL là 8,42%), hàm lươngnitơ amin tự do là 2,42 g/l (CSL là 3,64 g/l)

Kết quả thủy phân và lên men đồng thời cho thấy rằng, bã lên men hoàn toàn

có thể thay thế CSL làm nguồn dinh dưỡng cho nấm men sinh trưởng và phát triển

650 triệu tấn Thu hoạch 1kg hạt lúa thu được tương ứng 1 - 1,5 kg rơm (Maiorella,1985) Ước tính 650 - 975 triệu tấn rơm rạ được sản xuất mỗi năm trên toàn thế giới

và phần lớn chúng được dùng làm thức ăn cho gia súc và phần còn lại là lãng phí

Nước ta là một nước nông nghiệp với sản lượng gạo hằng năm trên 35 triệutấn Đồng bằng Sông hồng, khu vực trung du và đồng bằng Sông cửu long là 3 khuvực sản xuất lúa gạo chính của nước ta Từ đó có thể thấy sản lượng rơm rạ trên cảnước hằng năm là rất lớn và tập trung Việc giá dầu mỏ tăng lên từng ngày cùng vớitình trạng ô nhiễm môi trường đang dần trở thành một thách thức lớn cho việc sửdụng nhiên liệu trong tương lai Nguồn rơm rạ dồi dào nhưng những ứng dụng lạihạn chế Sự lãng phí nguồn năng lượng cùng với ô nhiễm môi trường do việc sửdụng rơm rạ không đúng cách như hiện nay đang dần trở thành mối quan tâm củanhiều nhà khoa học và quản lý

Ethanol được đánh giá là nguồn cung cấp nhiên liệu tốt cho tương lai vì conngười có khả năng sản xuất với sản lượng lớn, không gây ô nhiễm môi trường và cóthể thay thế được hoàn toàn cho xăng Ethanol hoàn toàn có thể sản suất được từnguồn cellulose thực vật như rơm rạ Theo đánh giá sơ bộ, lượng rơm rạ hằng nămtrên cả nước nếu được chuyển thành ethanol hoàn toàn có khả năng thay thế toàn bộnhu cầu xăng dầu cả nước như hiện nay

Để quá trình lên men đạt hiệu suất cao, vi sinh vật cần được nuôi cấy vàđược cung cấp nguồn dinh dưỡng thích hợp cho việc sinh sản Tuy nhiên, cácnguyên liệu biomass nguồn gốc lignocelluloses thường không có đủ hàm lượng nitơcần thiết cho quá trình tạo protein trong chuỗi sinh sản của vi sinh vật (nấm men)

Vì vậy, cần phải có một nguồn bổ sung từ bên ngoài

Nguồn dinh dưỡng đang sử dụng hiện nay tại pilot trường đại học BáchKhoa T.p Hồ Chí Minh là bột ngô chuyên dụng (CSL), đây là nguyên liệu khôngphải lúc nào cũng có sẵn tại địa phương, và có giá trị cao trong công nghệ vi sinh.Trong khi đó bã thải quá trình SSF chứa rất nhiều xác nấm men, và các hợp chấtcarbohydrate nhưng hiện nay chỉ mới được cân nhắc sử dụng làm phân bón hoặc

đổ thải ra môi trường Nếu chúng ta có thể thay CSL bằng bã thải SSF thì quá trìnhsản xuất bioethanol từ rơm rạ sẽ càng bền vững hơn vì bớt phụ thuộc vào nguyênliệu bên ngoài, giảm lượng bã thải, nâng cao hiệu quả sản xuất qua việc tận dụngnhững thành phần có trong bã thải SSF

Trên cơ sở đó, mục tiêu luận văn là nghiên cứu khả năng sử dụng bã thải lênmen để thay thế cho CSL làm nguồn dinh dưỡng bổ sung trong quá trình lên menrơm rạ thành ethanol

Lý do chọn đề tài và nhiệm vụ của luận văn

Lý do chọn đề tài:

Trong những nghiên cứu trước, quá trình lên men sản xuất cồn từ rơm rạ sửdụng nguồn dinh dưỡng là bột ngô chuyên dụng ( tên gọi thương mại là CSL - Cornsteep liquor) Nguồn dinh dưỡng này mang lại hiệu quả khá tốt, tuy nhiên, do nhậpkhẩu từ Pháp và giá thành khá đắt đỏ, hơn nữa lượng bã thải sau chưng cất thườngchỉ được sử dụng làm phân bón hoặc thải ra ngoài môi trường gây lãng phí

Sau khi chưng cất thì xem như hỗn hợp đã được tiệt trùng, việc dùng nó làmnguồn dinh dưỡng sẽ giảm thiểu được việc xử lý có nghĩa là sẽ sử dụng trực tiếpnguồn dinh dưỡng này Bên cạnh đó trong bã thải còn có thành phần cellulose chưalên men và xác con yeast, khi sử dụng sẽ tận dụng nguồn cellulose, còn xác conyeast sẽ là nguồn dinh dưỡng bổ sung cho con men trong các mẽ lên men sau Việctận dụng bã sau lên men này sẽ tận thu được lượng ethanol còn trong bã, hơn nữa sẽgiảm thiểu được khối lượng và thể tích chất thải ra môi trường

Tuy nhiên bã thải có hai phần bã rắn và bã lỏng, nên luận văn sẽ nghiên cứuviệc sử dụng bã lỏng để thay thế cho nguồn dinh dưỡng và nước mất, bên cạnh đó

sẽ nghiên cứu việc sữ dụng bã thải rắn làm nguồn dinh dưỡng thay thế CSL trong

quá trình thủy phân và lên men đồng thời.

Nhiệm vụ nghiên cứu của luận văn

Nghiên cứu các thành phần dinh dưỡng (Nitơ, protein) trong bã lên men, CSL

Nghiên cứu thành phần rơm rạ trước và sau quá trình thủy phân và lên menđồng thời (SSF)

Khảo sát quá trình thủy phân và lên men đồng thời ethanol từ rơm rạ sử dụngcác nguồn dinh dưỡng khác nhau (CSL, bã rắn, bã lỏng)

Nghiên cứu vai trò của bã rắn, bã lỏng (bã lên men) làm nguồn dinh dưỡngthay thế bột ngô chuyên dụng trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguyên liệu lignocellulose

Lignocellulose là vật liệu biomass phổ biến nhất trên trái đất Lignocellulose

có trong phế phẩm nông nghiệp, trong sản phẩm phụ công của công nghiệp sản xuấtgiấy… Do đó lignocellulose là một nguồn nguyên liệu to lớn cho việc sản xuấtbioethanol Rơm rạ là một dạng vật liệu lignocellulose

Thành phần chính của vật liệu lignocellulose là cellulose, hemicellulose,lignin, các chất trích ly và tro Trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính

và được bao bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose vàkết dính như lignin Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau tạo thànhliên kết cộng hóa trị với nhau Các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose,galactose, và acid 4-O- methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin [4]

Hình 1.1 Cấu trúc của lignocellulose

Đối với các loại thực vật dạng thân gỗ thường chứa khoảng 40% - 60%cellulose, 20% - 40% hemicellulose và 10% - 25% lignin Tuy nhiên đối với thựcvật dạng thảo mộc hàm lượng lignin thường thấp hơn 20% Thành phần trong rơm

rạ được nghiên cứu và trình bày bởi nhiều tác giả [5] Ở mỗi điều kiện phát triển vàgiống khác nhau thì thành phần trong rơm rạ cũng khác nhau Nhìn chung thànhphần rơm rạ được trình bày bởi một số tác giả như sau:

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của rơm rạ

Cũng giống như động vật, cơ thể thực vật cũng được xây dựng từ các tế bào

Do không được bảo vệ bằng cơ chế phản xạ và miễn dịch, tế bào thực vật được bảo

vệ kỹ trong lớp vỏ rắn chắc Về cấu trúc, các tế bào thực vật được sắp xếp đặc khít

và liên kết với nhau rất bền vững Rắn chắc là yếu tố tạo nên sự bền vững của thựcvật trong tự nhiên Khi tế bào thực vật chết đi, khối lượng khô của tế bào chủ yếutập trung ở thành tế bào

Các sợi này được gắn lại với nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi,với Trong lignocelluloses các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản Các vi sợinày được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấncông của ezyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân [6]

Hình 1.2 Cấu trúc của tế bào và thành tế bào của thảo mộc.

1.2 Enzyme cellulase

Enzyme cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axitamin, các axit amin được nối với nhau bởi lien kết peptid –CO-NH- Ngoài ra,trong cấu trúc còn có những phần phụ khác Cấu trúc hoàn chỉnh của các loạienzyme nhóm endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệcellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôinày xuất phát từ trung tâm xác tác và được gắn them vùng glycosil hóa, cuối đuôi làvùng gắn kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain) Vùng này có vai tròtạo liên kết với cellulose tinh thể Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tươngquan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực củaenzyme này đối với cellulose [7]

Cellulase hoạt động ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4-5 Nhiệt

độ tối ưu từ 40-500 C Hoạt tính cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 800C trong 10-15phút

Enzyme cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg Ngoài ra, cellulase còn bị ức chế bởi các

ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ Trọng lượng của enzymecellulase thay đổi từ 30 -110 KDa (Begunin, 1990; Gilkes và cộng sự, 1991).

Enzyme cellulase được thu nhận từ các nguồn khác nhau như động vật, thựcvật và vi sinh vật Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi

sinh vật Các chủng vi sinh vật thường sử dụng như: nấm mốc Aspergillus niger, xạ khuẩn Actinomyces griseus, vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus pumilis…

Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase đượcchia thành ba loại: 1,4- -D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) ; 1,4- -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) ; -D-glucoside glucohydrolase (EC3.2.1.21)

Từ những nghiên cứu riêng lẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tácđộng tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều nhà khoa học đều đưa ra kếtluận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose đểtạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Theo Erikson và cộng tác viên (1980), cơchế tác động hiệp đồng của 3 loại cellulase như sau: đầu tiên endoglucanase tácđộng vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4-glucosid và tạo

ra các đầu mạch tự do Tiếp đó exoglucanase tấn công cắt ra từng đoạn cellobiose từđầu mạch được tạo thành Kết quả tác động của endoglucanase và exoglucanase tạo

ra các celloligosaccharit mạch ngắn, cellobiose, glucose β-glucosidase thủy phântiếp và tạo thành glucose

Hình 1.3 Sơ đồ các bước thủy phân cellulose bởi enzyme cellulase

1.3 Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae thuộc:

- Bộ: Endomycetales

- Họ: Saccharomycetaceae

Saccharomyces có khoảng 40 loài và các loài trong giống này được biết nhiều

do chúng được ứng dụng trong làm nổi bánh, bia, rượu Chúng hiện diện nhiềutrong sản phẩm có đường, đất, trái cây chín, phấn hoa Nấm men cấu tạo gồm vỏ

tế bào thành phần là carbohydrat, lipid, protein dầy khoảng 0,5 µm, màng tế bào

chất, tế bào chất và nhân S cerevisiae thường có cấu tạo hình elip, đường kính lớn

từ 5-10nm và đường kính nhỏ từ 1-7nm, tế bào gia tăng kích thước theo độ tuổi.Thể tích tế bào đơn bội là 29 mm3 và tế bào lưỡng bội là 55 mm3 Các tế bào củanấm men mang cấu trúc và chức năng của eukaryote bậc cao, được sử dụng như làmột mô hình hữu ích đại diện cho các tế bào eukaryote Các thành phần cấu trúc vàhóa học của tế bào được được minh họa theo bảng 2.3 và bảng 2.4[8]

Bảng 1.3 Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấm men được lạnh đông khô.

Phần

Bảng 1.4 Các thành phần hóa học trong nấm men đông khô[9]

Thành phần Cacbon Hydro Oxy Nito Phospho Magie KaliPhần trăm

khối lượng

khô (%)

Hình 1.4 Nấm men Sacchromyces cerevisiae dưới dạng bột khô.

1.3.1 Hình thái và cấu tạo nấm men

Nấm men có nhiều hình dạng khác nhau: hình cầu, hình trứng hoặc hìnhovan Nấm men có thể thay đổi hình dáng và kích thước trong các giai đoạn pháttriển và điều kiện môi trường xung quanh Hình thái của chúng không thay đổi chỉ ởcác giống nuôi cấy khi còn trẻ trong các môi trường dinh dưỡng tiêu chuẩn

Kích thước tế bào nấm men cũng rất khác nhau, điều đó phụ thuộc vào cácchủng nấm men và điều kiện nuôi cấy, thường là (2,5 - 4,5µm) x (10,5 - 20µm), thểtích tế bào chiếm khoảng từ 50 - 5000µm

Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, tế bào cơ bản giống như ở thực vật, động vật So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hóa nhẩyvọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn.

Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm (chiếm 25% khối lượng khô của tếbào) Đa số nấm men có thành tế bào cấu tạo bởi glucan và mannan Một số tế bàonấm men chứa kitin và mannan Trong thành tế bào nấm men còn chứa 10% protein(tính theo khối lượng khô), trong số protein này có một phần là các enzyme Trênthành tế bào còn thấy có một lượng nhỏ lipid[14]

Nhân tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa 17 đôi nhiễm sắc

thể DNA trong tế bào nấm men đơn bội có khối lượng phân tử là 1 x 1010 Da (1 Da

= 1,67 x 10-24 g), so với khối lượng phân tử của DNA vi khuẩn Escherichia coli thì

lớn hơn 10 lần nhưng so với DNA của người thì nhỏ hơn 100 lần [10]

1.3.2 Sinh trưởng của nấm men

Thuật ngữ sinh trưởng đối với vi sinh vật bao hàm 2 ý nghĩa: sinh sản vàphát triển Nấm men có 2 hình thức sinh sản: hữu tính (bằng bào tử) và vô tính(bằng nảy chồi hoặc phân cắt tế bào) Tùy theo điều kiện nuôi cấy mà tế bào nấmmen sẽ sinh sản theo cách cách sinh sản vô tính hay hữu tính.[11]

Nảy chồi là phương pháp sinh sản phổ biến nhất ở nấm men Ở điều kiệnthuận lợi nấm men sinh sôi nảy nở nhanh, quan sát dưới kính hiển vi thấy hầu hếtcác tế bào nấm men nào cũng có chồi Khi chồi xuất hiện các enzyme thủy phân sẽphân giải phần polysaccharide của thành tế bào cho chồi chui ra khỏi tế bào mẹ.Vật chất mới được tổng hợp sẽ được huy động đến chồi và làm chồi phình to dầnlên, khi đó sẽ xuất hiện một vách ngăn giữa chồi và thành tế bào mẹ Thành phầncủa vách ngăn cũng tương tự như thành tế bào Khi tế bào chồi tách khỏi tế bào mẹ

ở chổ tách ra còn giữ lại một vết sẹo của chồi, trên tế bào con cũng mang một vếtsẹo Các vết sẹo này có thể nhìn thấy rõ khi xử lý bằng thuốc nhuộm nhưcalcafluor hoặc primulin rồi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang Dưới kínhhiển vi điện tử càng có thể thấy rất rõ hơn

Nấm men có khả năng đồng hóa hoàn toàn đường glucose, fructose vàmannose Ngoài ra tùy thuộc vào giống, nấm men còn có thể đồng hóa hoàn toànhoặc một phần đường galactose Đường disaccharide thì nấm men đồng hóa rất tốtmaltose và saccharose, đồng hóa hoàn toàn hoặc một phần đường lactose, riêngmelibiose chỉ lên men được khi có enzyme melibiase Các polysaccharide thì cầnđược phân hủy hoàn toàn nấm men mới sử dụng được.

Nấm men có thể tự tổng hợp các acid amin Tuy nhiên nếu cho các acid aminvào môi trường thì quá trình sinh sản và phát triển của tế bào sẽ nhanh hơn Dễđồng hóa hơn cả là ion amon NH4+ và amoniac NH3 với lượng sử dụng lớn nhất là

20 - 35 mg nitơ/109 tế bào Nguồn nitơ được coi là tốt nhất và được đồng hóa hoàntoàn là ure

Trong môi trường dinh dưỡng cần phải có một lượng nhất định các chấtkhoáng để đảm bảo cho tế bào phát triển như phospho, kali, natri, magie, kẽm

Đa số các chủng nấm men đang ở giai đoạn nhân giống cần đến các vitaminnhư isositol, canxi pantothenat, thiamin và đặc biệt là biotin Nồng độ của vitamin

có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển là 0,01 - 1,10 mg/l

1.4 Quá trình sản xuất ethanol từ rơm rạ

Tóm lại quá trình tiền xử lý nhằm:

Tăng vùng vô định hình của cellulose

Tăng kích thước lỗ xốp trong cấu trúc sợi biomass.

Phá vỡ sự bao bọc của lignin và hemicellulose với cellulose

Tránh thất thoát cellulose hay tạo ra những sản phẩm phụ trong quá trình thủy phân và lên men

Hình 1.5 Cấu trúc rơm rạ sau tiền xử lý.

Các phương pháp tiền xử lý có thể chia thành một số nhóm:

Phương pháp vật lý: cắt, xay, nhiệt phân

Phương pháp lý hóa: nổ hơi, nổ sợi kết hợp kiềm, nổ khí CO2

Phương pháp hóa học: xử lý bằng ozone, thủy phân môi trường acid, thủyphân môi trường kiềm, oxy hóa khử lignin

Phương pháp sinh học

Phương pháp xung điện trường

Cấu trúc tinh thể của cellulose: cellulose tự nhiên hình thành cấu trúc tinh

thể chống lại được sự tấn công của enzyme Trong một bài báo của mình, Fan et al

ước tính rằng tỉ lệ cellulose tinh thể là 50-90% Tuy nhiên, không có sự liên quangiữa mức độ tinh thể của cellulose và khả năng phân hủy enzyme đối với rơm rạ.[12]

Sự bao bọc của lignin quanh cellulose: lignin cùng với hemicellulose tạo thành cấu trúc mô vững chắc cực kì Những mô được bền hóa với lignin tương tự

như nhựa được gia cố bằng sợi, trong đó lignin đóng vai trò kết dính những sợicellulose Trong thiên nhiên, lignin bảo vệ cellulose khỏi những tác động của môitrường và khí hậu Lignin là yếu tố ngăn cản sự tấn công của enzyme đến celluloseđược công nhận nhiều nhất Nhà nghiên cứu cho rằng khả năng thủy phân củaenzyme tăng khi 40-50% lignin bị tách Tuy nhiên, phải thừa nhận rằng, không cónghiên cứu nào tiến hành loại bỏ lignin mà không kèm theo sự phân hủyhemicellulose Ngay cả trong phương pháp tiền xử lý nguyên liệu bằng kiềm ở nhiệt

độ thấp, loại bỏ được 70% lignin thì cũng có 5% hemicellulose bị hòa tan

Các phương pháp xử lý cơ học:

Các phương pháp thuộc nhóm này không sử dụng hóa chất trong quá trình xử

lý Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao,

xử lý thủy nhiệt và nổ hơi Trong đó phương pháp nổ hơi là phương pháp quantrọng nhất, đã được phát triển, áp dụng trên quy mô pilot và được sử dụng trong đềtài nghiên cứu này

Các phương pháp tiền xử lý hóa học:

Sử dụng tác động của hóa chất trong quá trình xử lý Gồm có các quá trìnhchính:

Với acid: gồm các phương pháp xử lý với acid loãng, bơm hơi nước có acid

và nổ hơi có acid Trong đó, acid sulfuric đã được nghiên cứu kĩ lưỡng nhất, hiểnnhiên vì nó rẻ và hiệu quả Tuy nhiên, vấn đề gặp phải trong xử lý axit là thiết bịphải chịu được ăn mòn cao và lượng thạch cao (CaSO4) sinh ra nhiều từ quá trìnhtrung hòa acid với CaOH

Với kiềm: đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan, chủ yếu là về xút hoặc xút

cùng các hóa chất khác Tuy nhiên, nhiều nhà khoa học cho rằng, dựa trên chi phíhóa chất, thì vôi tôi là hóa chất thích hợp Detroy et al cho thấy rằng amonia lỏng cóphần hiệu quả trong việc tăng khả năng thủy phân bã rắn, nhưng ethylenediamine cóthể còn hiệu quả hơn [12]

Ngoài ra còn có những phương pháp như xử lý với dung môi hữu cơ: dùngdung môi như ethanol, methanol, acetone để hòa tan lignin; xử lý bằng khí SO2,khí

CO2, NH3 … Các quy trình này hiện nay chỉ được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm.

1.4.2.2 Thủy phân:

Phản ứng: (C6H10O5)n + nH2O (C6H12O6)n

Mục đích: Phá vỡ mạch carbon, giải phóng các loại đường phục vụ lên men.Quá trình thủy phân có hai hướng:

Thủy phân acid: là công nghệ được sử dụng từ khá lâu, acid loãng được sử

dụng trong môi trường nhiệt độ cao, áp suất cao hoặc acid đặc trong môi trườngnhiệt độ thấp hơn, áp suất thường Thủy phân dưới tác dụng của acid là quá trình cóthể gây độc hại cho sản phẩm sau thủy phân cũng như môi trường lên men, ăn mònthiết bị

Thủy phân enzyme: Cellulase là loại enzyme được dùng phổ biến nhất và có

tầm quan trọng rất lớn trong công nghệ biomass hiện nay Cellulase được sản xuất

từ nấm mốc, vi khuẩn hoặc sinh vật đơn bào, có khả năng phân hủy cả cellulose vàhemicellulose [13]

Các yếu tố ảnh hưởng quá trình thủy phân: [14]

Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu :

Cấu trúc tự nhiên của lignocellulose tạo ra nhiều cản trở đến quá trình tấncông của các tác nhân thủy phân Ngay cả quá trình thủy phân cellulose tinh khiết,tốc độ thủy phân cũng giảm theo thời gian Tốc độ phản ứng giảm dần theo thờigian vì một số lý do sau: sự ức chế enzyme do sản phẩm, sự giảm của các phần cơchất dễ thủy phân, enzyme bị bất hoạt hoặc bị giữ lại trong các lỗ xốp của cellulose

Hiệu suất quá trình thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tính chất của nguồnnguyên liệu Một cách tổng quát, gỗ mềm thường khó thủy phân hơn gỗ cứng Cấutrúc của nguyên liệu và cơ chế tác động của enzyme và cơ chất là hai yếu tố chínhlàm hạn chế hiệu suất quá trình thủy phân

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Giống như nhiều phản ứng enzyme khác, phản ứng thủy phân cellulose bằngenzyme cellulase chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ Tốc độ phản ứng thủy phân tăng

theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định, tốc độ phản ứng sẽ giảm dần vàđến mức triệt tiêu Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt để biểu thị ảnh hưởng củanhiệt độ đến tốc độ phản ứng Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme caonhất được gọi là nhiệt độ tối ưu Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ

Ảnh hưởng của pH

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme vàđặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnhđến phản ứng của enzyme Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính Tuynhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở môi trường acid yếu Một số enzyme kháclại hoạt động mạnh ở cả pH kiềm và acid Đối với enzyme cellulase, khoảng pHthích hợp là 4-5, trong đó tốt nhất là 4.8

Nồng độ enzyme

Khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ phản ứng tăng theo đường thẳng Tuynhiên, khi nồng độ enzyme đạt đến một ngưỡng nào đó, nồng độ cơ chất sẽ trởthành yếu tố hạn chế tốc độ phản ứng Khi đó, tốc độ phản ứng sẽ không tăng nữa

mà là một đường nằm ngang

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất :

Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng enzyme tăng, vì sẽ có nhiều cơchất va chạm với enzyme tiến hành phản ứng Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, cácenzyme bị bão hòa cơ chất Vì vậy, tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng sẽkhông thay đổi đáng kể

Ảnh hưởng của các chất kìm hãm:

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong cácphản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thayđổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng Các chất gâykìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phần tử vô cơ, các chất hữu

cơ và cả protein Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trìnhtrao đổi ở tế bào sinh vật

Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc khôngthuận nghịch Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữaenzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được cân bằng

Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúccủa cơ chất Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch Chúng có khảnăng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme Khi đó chúng sẽ chiếm vị trí của

cơ chất trong trung tâm hoạt động và vì vậy, cơ chất không còn cơ hội tiếp cận vớitrung tâm này Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm hoạt độnglàm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất Kết quả là hoạt động củaenzyme sẽ giảm

Chất kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạtđộng của enzyme mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme Kết quả

sự kết hợp này, chất kìm hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzymetheo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác Vì thế các chất kìm hãm làm giảmhoạt động của enzyme Các chất kìm hãm không cạnh tranh thường gồm hai loại:kìm hãm do sản phẩm phản ứng và kìm hãm do thừa cơ chất

1.4.2.3 Lên men

Phương trình chuyển hóa tổng quát:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2Quá trình lên men gồm 2 giai đoạn:

Đường phân glucose thành acid pyruvic (CH3COCOOH) và NADH2

Lên men thật sự 2CH3COCOOH CH3CHO + NADH2

Giai đoạn lên men diễn ra 2 phản ứng:

2CH3COCOOH CH3CHO + CO2CH3CHO + NADH2 CH3CH2OH + NAD

Ở giai đoạn này đường glucose được nấm men chuyển hóa thành ethanoltrong môi trường kị khí

Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men:

Nhiệt độ:

Mỗi vi sinh vật đều có một nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng Đốivới nấm men saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm khoảng 28-320C, ở nhiệt độ cao,hoạt tính nấm men giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm vi sinh vật như vikhuẩn lactic và nấm men hoang dại Ở nhiệt độ 300C nấm men hoang dại phát triểnnhanh hơn saccharomyces 2-3 lần, còn ở nhiệt độ 380C chúng phát triển nhanh hơn6-8 lần Mặt khác khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều sản phẩm phụ như ester,aldehyde và tổn thất ethanol theo CO2 sẽ tăng

pH:

Nồng độ ion H+ trong môi trường lên men ảnh hưởng đến hoạt động củanấm men Chúng có khả năng làm thay đổi diện tích lớp vỏ tế bào, làm tăng haygiảm mức độ thẩm thấu chất dinh dưỡng theo chiều hướng của quá trình lên men.Mỗi vi sinh nhất định chỉ có thể hoạt động tốt trong một trạng thái, trạng thái nàyphụ thuộc vào pH của môi trường

Trong điều kiện lên men ethanol, pH tối ưu để tạo ethanol là 4.5-5.0 Nếu pHthấp khoảng 3.0-4.0 nấm men còn hoạt động được và vi khuẩn bị ức chế pH hơicao hơn thì sẽ tạo ra sản phẩm có độ chua thấp, sản phẩm dễ bị nhiễm khuẩn và cácsản phẩm phụ trong quá trình lên men sẽ tạo nhiều hơn, lên men có hiệu suất thấp

Nồng độ của dịch lên men:

Nếu nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn tới làm tăng áp suất và làm mất cânbằng trạng thái sinh lý nấm men Kết quả là ethanol nhiều sẽ ức chế không nhữngcác tạp chất mà cả nấm men Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn hao nguồnnguyên liệu và phải kéo dài thời gian lên men Nếu nồng độ đường của dịch lên

men thấp thì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men và làm nấm men không đủ chấtdinh dưỡng để phát triển Thông thường, nồng độ dịch đường được giới hạn ở 22%khối lượng hoặc ít hơn (nếu cao hơn thành tế bào có thể bị vỡ).

Thời gian:

Thời gian cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của sảnphẩm Thời gian lên men phụ thuộc các yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng độ đường,chủng nấm men, Thời gian lên men bắt đầu từ lúc cấy nấm men vào môi trườnglên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trường lên men cụ thể

và mục đích lên men mà ta dừng quá trình lên men

Trong giai đoạn đầu lên men phải cho dịch đường tiếp xúc với oxy Lúc nàynấm men cần oxy để tích lũy lượng sinh khối cần thiết cho lên men Tiếp theo, đểchuyển hóa glucose thành ethanol, nấm men phải được phát triển trong môi trườngyếm khí hoàn toàn Vì trong môi trường này, sự hô hấp của nấm men bị ức chế vàcần thiết thì nấm men bị ức chế và bắt đầu phải tìm năng lượng cần thiết bằng conđường lên men Để áp dụng năng lượng cần thiết thì nấm men cần phân hủy mộtlượng đường lớn và đường sẽ chuyển hóa thành ethanol và CO2 Đó là nguyên nhânmuốn có ethanol nhiều thì không được thoáng khí môi trường Nếu có oxy thì tronggiai đoạn này rượu sẽ tiếp tục chuyển hóa thành axit acetic làm chua sản phẩm

Nồng độ CO2 trong môi trường:

CO2 được hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường Một phần sẽtồn tại trong môi trường; một phần tách lên bề mặt môi trường; phần còn lại tích tụlại thành một lớp ngăn cách giữa không khí và môi trường CO2 tích tụ lại trong môitrường chỉ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men, nhưng không thể làm cho khảnăng lên men của nấm men yếu đi

Trong môi trường có hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra ngoài,dẫn đến ức chế sinh sản của nấm men và sự lên men có hiệu suất thấp CO2 nằmtrong khoảng không giữa bề mặt môi trường và không khí có tác dụng kiêm chế sựphát triển của những vi sinh vật hiếu khí gây hại Do vậy các thùng lên men phải cónút đặc biệt chỉ cho CO2 bay ra mà không cho không khí vào

Hàm lượng giống nấm men

Nấm men là nhân tố tạo ra quá trình lên men, chuyển hóa đường thànhethanol và khí CO2 Mỗi loài nấm men có khả năng lên men khác nhau Cùng loạinấm men, nhưng ở những điều kiện khác nhau thì khả năng lên men khác nhau vàsản phẩm của quá trình lên men cũng khác nhau

Các loại nấm men[14] Nấm men tiến hành lên men đường tạo thành ethanol Một số loại nấm men thường được sử dụng trong quá trình lên men ethanol:

Saccharomyces cerevisiae: được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm

như làm bánh mì, sản xuất rượu bia Saccharomyces cerevisiae có thể lên menđường 6 (glucose) hiệu quả nhưng không lên men đường 5 (xylose) Saccharomycescerevisiae được sử dụng phổ biến cho lên men glucose vì những ưu điểm như: chịuđược nồng độ ethanol cao, ít sản phẩm phụ, tốc độ lên men cao trong môi trường

acid, chịu được acid acetic Trong luận văn chỉ sử dụng một lọai lấm men này.

Pichia stipitis: không được sử dụng trong sản xuất bia rượu vì khả năng hạn

chế trong môi trường hiếm khí, tuy nhiên khả năng lên men trực tiếp đường xylosethành ethanol được cho là hiệu quả nhất trong các loại men hiên nay Xylose là mộtloại đường có trữ lượng thứ hai trong tự nhiên, được thủy phân từ lignocellulose cónguồn gốc từ gỗ và phụ phẩm nông nghiệp

Dinh dưỡng cho nấm men [14]

Trong quá trình lên men, cần có nguồn dinh dưỡng làm thức ăn cho con men.Nhiệm vụ của dinh dưỡng là cung cấp hàm lượng nitơ hữu cơ có trong acid amin vàvitamin, muối khoáng cho con men trong quá trình sinh trưởng và sinh sản của nó

Các loại nguồn dinh dưỡng cần thiết cho nấm men:

Dinh dưỡng cacbon: các chất hữu cơ khác nhau như các loại đường và dẫnxuất, các rượu, axit hữu cơ, axit amin,…có thể là nguồn dinh dưỡng cacbon cho nấm men

Nguồn nitơ cần thiết cho tế bào nấm men là các hợp chất hữu cơ và vô cơ cósẵn trong môi trường Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muốiamoni của axit vô cơ cũng như hữu cơ Nguồn nitơ các nguồn nitơ hữu cơ thường là

hỗn hợp các axit amin, các peptit, các nucleotit… Trong thực tế người ta hay dùngcao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc…) làmnguồn hữu cơ.

Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ: các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinhvật nói chung, trong đó có nấm men, phospho được quan tâm trước hết, sau đó làkali, magiê, lưu huỳnh… Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng như mangan, đồng, sắt,kẽm,…cũng rất cần để quá trình sinh lý của nấm men xãy ra bình thường

Dinh dưỡng các chất sinh trưỡng: những chất kích thích sinh trưởng là cácvitamin, các bazơ purin và pyrimidin Trong công nghiệp thường dùng các nguồnvitamin là cao ngô, cao nấm men, nước chiết cám,…

Một số loại dinh dưỡng phổ biến cho lên men:

CSL (Corn Steep Liquor): là sản phẩm được trích từ tinh bột ngô, thành phầnchính xấp xỉ 50% là nước CSL cung cấp lượng nitơ thông qua các protein, acidamin và các dinh dưỡng khác như đường, muối khoáng, vitamin, acid hữu cơ,enzyme CSL còn được dùng làm thức ăn gia súc do chứa ít chất béo, chất xơ

DAP (Diammonium Phosphate): có công thức hóa học (NH4)2HPO4, với1g/L DAP sẽ cung cấp khoảng 258mg/L Nitơ cho lên men DAP chủ yếu được sửdụng trong quá trình lên men rượu

YNB (Yeast Nitrogen Bases): thành phần chủ yếu từ các muối potassiumphosphate, magnesium sulfate, podium chloride, calcium chloride và các vitamin.YNB thường được dùng kết hợp với ammonium sulfate để tạo môi trường lên men

Quy trình sản xuất thực tế tại trung tâm Biomass ĐH Bách khoa Tp Hồ Chí Minh.[15]

Hình 1.6 Quy trình sản xuất ethanol từ rơm rạ của hệ thống Pilot

1.5 Đối tượng của luận văn

1.5.1 Đặt vấn đề

Để quá trình lên men đạt hiệu suất cao, vi sinh cần được nuôi cấy và đượccung cấp nguồn dinh dưỡng thích hợp cho việc sinh sản Tuy nhiên, các nguyênliệu biomass nguồn gốc lignocelluloses thường không có đủ hàm lượng nitơ cầnthiết cho quá trình tạo protein trong chuỗi sinh sản của vi sinh vật (nấm men) Vìvậy, cần phải có một nguồn bổ sung từ bên ngoài

Nguồn dinh dưỡng phổ biến trong công nghệ vi sinh hiện nay là bột ngôchuyên sụng (CSL) chế biến từ việc nghiền ướt ngô thành tinh bột mịn Nguồn dinhdưỡng này tuy thông thường, nhưng hiện nay chủ yếu là nhập khẩu từ nước ngoài.Thêm vào đó, nếu sản xuất cồn sinh học từ biomass được tiến hành ở quy mô côngnghiệp, thì lượng dinh dưỡng này trở nên rất lớn và chi phí không nhỏ, cũng nhưlàm giảm ý nghĩa của chiến lược an ninh lương thực

Trong khi đó, có rất nhiều nguồn nitơ dinh dưỡng khác tận dụng từ nguồnphụ phẩm hoặc phế phẩm của quá trình chế biến thực phẩm hứa hẹn thay thế chobột ngô Một số nguồn dinh dưỡng thay thế được xem xét và tiến hành nghiên cứubao gồm bã đậu nành từ công nghiệp sản xuất sữa đậu nành và đậu phụ, vỏ khoaitây, hèm bia, bã nước mắm … là những phụ phẩm hoặc phế phẩm của sản xuất thựcphẩm, có thành phần protein cao Trong luận văn này, bã lên men được chọn làmnguồn dinh dưỡng bổ sung cho quá trình lên men.

Sau khi thực hiện quá trình lên men, nấm nem sẽ chết đi nhưng xác của nóvẫn tồn tại trong bã lên men, do đó hàm lượng protein, Nitơ từ xác của nấm menvẫn còn lưu lại trong bã lên men và có thể sử dụng hàm lượng dinh dưỡng này chonhững lần lên men tiếp theo

1.5.2 Bã lên men (SSF Residue) [15]

Xét trên quy mô pilot thực nghiệm, mỗi mẻ lên men sau khi chưng cất sẽ thuđược khoảng 480 kg bã, trong đó thành phần rắn chiếm khoảng 11% Thông thườnglượng bã này sẽ được thải ra môi trường Đó là một sự lãng phí lớn nếu không tậndụng được các nguồn dinh dưỡng còn lại trong bã lên men

Hiện nay chưa có nghiên cứu chính thức nào để xác định thành phần các hợpchất có trong bã lên men rơm rạ nên luận văn sử dụng một số phương pháp đơn giảnnhư phân tích hàm lượng nitơ amin tự do và phân tích hàm lượng nitơ tổng để xácđịnh hàm lượng protein có trong bã lên men

Bảng 1.5 Kết quả phân tích hàm lượng nitơ trong bã lên men bằng thực nghiệm:

Nitơ tổng wt,% Nitơ amin hòa tan, g/l

Kết quả sơ bộ trên cho thấy bã lên men có thể thay thế được CSL làm dinhdưỡng bổ sung cho nấm men

1.5.3 Corn steep liquor (CSL)

Đây là chế phẩm được sản xuất từ ngô, có màu vàng tươi, mùi thơm đặctrưng và có tính acid Là một loại thực phẩm giàu năng lượng, cung cấp protein vàkhoáng chất cho sinh vật Thành phần gồm chất béo, chất xơ, silica và acid lactic từ20-25%

Trong quá trình thủy phân lên men đồng thời thì sau khi enzyme cellulase cắt

mạch rơm ra thì đồng thời nấm men Saccharomyces cerevisiae đường phân glucose

thành acid pyruvic (CH3COCOOH) và NADH2 Ở giai đoạn này đường glucoseđược nấm men chuyển hóa thành ethanol trong môi trường kị khí Nhưng trong quátrình thủy phân lên men đồng thời thì không có nguồn bổ sung protein làm nguồn

dinh dưỡng cho nấm men Saccharomyces cerevisiae nên trong quá trình này ta phải

bổ sung nguồn dinh dưỡng Luận văn này nghiên cứu tìm ra nguồn dinh dưỡng mớithay thế cho CSL.

1.6 Các kỹ thuật chìa khóa cho quá trình lên men.

1.6.1 Thủy phân và lên men đồng thời (SSF).[20]

Quá trình thủy phân và lên men đồng thời (còn gọi là quá trình đường hóa vàlên men đồng thời), khi đó lượng glucose được sinh ra lập tức được nấm mem sửdụng để len men thành ethanol Quá trình được thực hiện trong cùng một thiết bị.Thời gian thực hiện mỗi mẻ khoảng 5-6 ngày

Thủy phân và lên men đồng thời là một kỹ thuật quan trọng vì:

Glucose tạo thành trong quá trình thủy phân được tiêu thụ ngay lậptức bởi nấm men Vì vậy, lượng cellobiose và glucose tích tụ trong hệ thống là rất

ít Điều này sẽ giải quyết vấn đề ức chế enzyme, nhờ đó tốc độ tạo glucose sẽ đượctăng đáng kể, lượng enzyme cần dùng cũng nhỏ đi

Thiết bị cần cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời cũng ít hơn

số thiết bị cần cho phương pháp truyền thống vì cả quá trình thủy phân và lên menđược tiến hành trong cùng một thiết bị Điều này giúp giảm vốn đầu tư

Việc ethanol tạo thành trong suốt quá trình sẽ làm giảm khả năng pháttriển của những vi sinh vật tạp nhiễm, glucose được lên men ngay lập tức Vì vậy,điều kiện vô trùng được đòi hỏi ít hơn

Chính vì những ưu điểm trên mà quá trình SSF được nghiên cứu và ứngdụng rộng rãi trên thế gới với các nguồn nguyên liệu khác nhau Tuy nhiên, nhữngbất lợi cần được xem xét với quá trình SSF bao gồm:

Nhiệt độ không tương hợp của sự thủy phân và lên men

Sự ảnh hưởng của ethanol đối với vi sinh vật

Sự ức chế enzyme của ethanol

1.6.2 Nhập liệu nhiều lần theo đợt.

Vì sao phải nhập liệu nhiều lần theo đơt:

Lượng rơm tối đa cho mỗi mẻ lên men (tỷ lệ rắn/lỏng) là có giới hạn

Nồng độ rơm tối đa của rơm là 80g/l, nếu nhập liệu nhiều lần thì nồng độ rơm tạimỗi thời điểm khoảng 20-25g/l.

Nồng độ ethanol sau khi lên men thực hiện nhập liệu nhiều lần cao hơn so với nhậpliệu một lần

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

Sơ đồ lên men trong luận văn:

Cho 0,1% nấm mengiống, lắc đều nhiệt

35 0C, 8 giờ

Ly tâm

Nấm men Saccharomyces

cerevisiaeNước lọc

Lấy mẫu chạy

HPLC

Thủy phân lênmen đồng thời(SSF)

Nổ hơi

(puffing )

Rơm rạ (cắtnhỏ 1-2cm)

Hình 2.1 Rơm thô

Rơm ạ được cho qua máy cắt thô S

2.1 Chuẩn bị nguyên liệu cho quá trình thí nghiệm

2.1.1 Rơm rạ

Rơm sử dụng trong nghiên cứu là rơm thuộc giống lúa “Trâu Nằm” lấy từ xãThái Mỹ, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh Rơm rạ được bảo quản trong điềukiện khô ráo, độ ẩm <12% trong vòng 6 tháng

Hình 2.2 Rơm sau tiền xử lý

r au khi cho qua máy cắt thô chiều dàirơm khoảng 3-4 cm

Hình 2.3 Máy cắt thô Hình 2.4 Máy cắt tinh