Xác định một số điều kiện nuôi cấy tối ưu nấm trichoderma harzianum để thu nhận enzyme chitinase

Đồ án tốt nghiệp 2.2.3.3 Môi trường sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase ...36 2.3 Phương pháp thí nghiệm ...38 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme ch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI

ƯU NẤM Trichoderma harzianum ĐỂ THU NHẬN

ENZYME CHITINASE

Ngành: Công nghệ sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện: Trần Đức Vinh MSSV: 1051110243 Lớp: 10DSH02

TP Hồ Chí Minh, 7/2014

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công nghệSinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố Hồ ChíMinh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt

4 năm đại học

Tôi xin bày tỏ lòng cám ơn chân thành cô Nguyễn Thị Hai, người đã nhiệt tình,tận tụy dẫn dắt, động viên, tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi những kiến thức chuyênngành để tôi có thể hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cám ơn đến thầy Thành, người đã nhiệt tình hỗ trợ về thiết bị, vật

tư giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp

Tôi cũng cám ơn các bạn ở phòng thí nghiệm và đặc biệt là những người bạn trongnhóm ESS đã động viên, giúp đỡ tôi

Và cuối cùng, hơn ai hết, con xin cám ơn ba và mẹ, người đã hết lòng lo lắng, vất

vả để tạo điều kiện cho con đi học đến hiện nay và thực hiện ước mơ của mình Con xincám ơn ba mẹ rất nhiều

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các nội dung nghiên cứu

và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì côngtrình nào trước đây Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoannày

Tp Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Trần Đức Vinh

Đồ án tốt nghiệp

i

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu về Trichoderma 4

1.1.1 Phân loại 5

1.1.2 Lịch sử phát triển 5

1.1.3 Đặc điểm chung của Trichoderma 6

1.1.3.1 Đặc điểm hình thái 6

1.1.3.2 Đặc điểm sinh trưởng 8

1.1.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma 9

1.1.4 Vai trò sinh thái 10

1.1.5 Tính ứng dụng của Trichoderma trên thế giới và Việt Nam 10

1.1.6 Ứng dụng của Trichoderma trong nông nghiệp 12

1.1.6.1 Bảo vệ thực vật 12

1.1.6.2 Cải thiện năng suất cây trồng 12

1.1.6.3 Trong xử lí môi trường 13

1.1.6.4 Trong công nghiệp thực phẩm 13

1.1.6.5 Bổ sung thức ăn cho chăn nuôi 14

1.2 Cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma spp 14

1.2.1 Cạnh tranh 14

1.2.2 Kí sinh 15

1.2.3 Bất hoạt enzyme của nấm bệnh 16

1.2.4 Tăng khả năng kháng của thực vật 16

1.3 Những nghiên cứu về enzyme chitinase 17

1.3.1 Giới thiệu về chitin 17

1.3.1.1 Cấu trúc và tính chất của chitin 17

Đồ án tốt nghiệp

1.3.1.2 Lịch sử phát hiện của chitin 18

1.3.1.3 Sự phân bố của chitin trong tự nhiên .19

1.3.1.4 Điều chế chitin 20

1.3.2 Giới thiệu về enzyme chitinase 20

1.3.2.1 Đặc điểm và sự phân bố 20

1.3.2.2 Cơ chế hoạt động của chitinase 22

1.3.2.3 Các nguồn thu nhận chitinase 23

1.3.2.4 Lịch sử nghiên cứu về chitinase 25

1.3.2.5 Ứng dụng của enzyme chitinase 26

1.3.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme chitinase và sự sinh tổng hợp enzyme chitinase từ vi sinh vật 28

1.3.2.7 Những nghiên cứu về tối ưu hóa điều kiện thu nhận enzyme chitinase từ Trichoderma harzianum ở Việt Nam và trên thế giới 30

1.4 Sơ lược về bệnh thán thư trên cây ớt và tác nhân gây bệnh Collectotrichum sp .32

1.4.1 Bệnh thán thư trên ớt 32

1.4.1.1 Triệu chứng 32

1.4.1.2 Nguyên nhân gây bệnh 33

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34

2.1 Thời gian và địa điểm 34

2.1.1 Thời gian 34

2.1.2 Địa điểm 34

2.2 Thiết bị- dụng cụ- vật liệu 34

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ 34

2.2.1.1 Thiết bị 34

2.2.1.2 Dụng cụ 34

2.2.2 Giống vi sinh vật sử dụng nghiên cứu 35

2.2.3 Môi trường sử dụng để nghiên cứu 35

2.2.3.1 Môi trường PDA 35

2.2.3.2 Môi trường định tính sự sinh tổng hợp chitinase 36

Đồ án tốt nghiệp

2.2.3.3 Môi trường sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase 36

2.3 Phương pháp thí nghiệm 38

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của Trichoderma 38

2.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma trên môi trường thạch PDA 38

2.3.1.2 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma trên môi trường thạch .38

2.3.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu 40

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma để sản xuất chitinase 41

2.3.4 Phương pháp thu nhận dịch môi trường chứa chitinase 42

2.3.5 Xác định hoạt tính enzyme chitinase bằng phương pháp DNS 42

2.3.6 Phương pháp tủa enzyme bằng cồn 45

2.3.7 Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 46

2.3.8 Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn cơ chất chitin đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 46

2.3.9 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 48

2.3.10 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 49

2.3.11 Khảo sát sự ảnh hưởng các nguồn đường và hàm lượng đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 51

2.3.12 Phương pháp thử nghiệm khả năng ức chế nấm bệnh Collectotrichum sp 52

2.3.13 Phương pháp xử lí số liệu 53

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 53

3.1 Kết quả khả năng phân giải chitin của Trichoderma harzianum trên môi trường thạch có cơ chất cảm ứng chitin 1% 53

3.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 55

3.3 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất chitin đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 60

Đồ án tốt nghiệp

3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của

Trichoderma harzianum 62

3.5 Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 65

3.6 Ảnh hưởng của nguồn đường bổ sung đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 67

3.7 Hiệu quả khống chế nấm gây bệnh thán thư ớt của chitinase thu từ Trichoderma harzianum .68

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72

4.1 Kết luận 72

4.2 Kiến nghị 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DNS Dinitrosalicylic acid GlacNac N-acetyl glucosaminekDa Kilo Dalton

MT Môi trường

NSC Ngày sau cấy

PDA Potato D-glucose agar

2 3.2 Hoạt tính của enzyme chitinase dưới sự ảnh môi

3 3.3 Hoạt tính của enzyme chitinase dưới sự ảnh hưởng

4 3.4 Hoạt tính của enzyme chitinase dưới sự ảnh hưởng

5 3.5 Hoạt tính của enzyme chitinase dưới sự ảnh hưởng

6 3.6 Hoạt tính của enzyme chitinase dưới sự ảnh hưởng

của nguồn dường và tỷ lệ đường bổ sung 74

7 3.7 Đường kính vòng melanin qua các ngày nuôi cấy ở 2

8 3.8 Tỉ lệ phần trăm tản nấm bị phân giải qua các ngày 80

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH

1 1.1 Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi

trường thạch dịch chiết khoai tây (PDA) 9

2 1.2 Sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma harzianum 10

3 1.3 Bào tử của Trichoderma harzianum quan sát dưới kính

4 1.4 Một số sản phẩm thương mại ứng dụng của

Trichoderma spp ở Việt Nam và trên thế giới. 14

6 1.6 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase 26

7 1.7 Quả ớt bình thường và quả ớt bị bệnh thán thư do

Vòng phân giải chitin của T harzianum trên môi

trường dinh dưỡng chứa chitin 1% sau 2 ngày nuôicấy

54

10 3.2 Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của hoạt tính chitinase

11 3.3 Môi trường A, B trước khi ủ và sau khi ủ 5 ngàyvới

Đồ án tốt nghiệp

12 3.4 Môi trường C, D trước khi ủ và sau khi ủ 5 ngày với

13 3.5 Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của hoạt tính chitinase

14 3.6 Biều đổ đường thể hiện sự biến đổi của hoạt tính

15 3.7 Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của chitinase theo pH

16 3.8 Mặt sau (a) và mặt trước (b) của tản nấm

Collectotrichum sp sau 3 ngày ủ với enzyme chitinase. 77

17 3.9 Mặt sau (c) và mặt trước (d) của tản nấm

Collectotrichum sp sau 6 ngày ủ với enzyme chitinase. 77

viii

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU1.Tính cấp thiết của đề tài

Trichoderma spp là tác nhân kiếm soát sinh học có hiệu quả, đã có nhiều

nghiên cứu cho thấy khả năng đối kháng của chúng với các loài nấm hại thực vậtbằng các cơ chế khác nhau Trong số đó, cơ chế sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cómột vai trò quan trọng, đặc biệt là hệ enzyme chitinase Đây là hệ enzyme có khảnăng phân hủy chitin- thành phần cấu tạo nên vách tế bào của đa số loài nấm hạicây trồng và kể cả côn trùng, từ đó ức chế sự phát triển của dịch bệnh Ngoài ra,chitinase còn nhiều ứng dụng có ý nghĩa khác như là dùng để xúc tác để tạo ra cáchợp chất có tác dụng giúp tăng sản xuất dịch nhầy, cải thiện khả năng bôi trơn khớp

để giảm triệu chứng của thoái hóa khớp, để tổng hợp các hợp chất

chitooligosaccharides… Trong các loài Trichoderma spp thì Trichoderma harzianum được chứng minh là có khả năng sinh tổng hợp chitinase tốt hơn cả.

(Theo M.H Et-Katatny, 2000)

Hiện nay, dân số ngày càng gia tăng một cách nhanh chóng, đi cùng là nhucầu về lương thực cũng gia tăng theo Song đối với khu vực khí hậu nhiệt đới giómùa như Việt Nam lại rất đa dạng về các loại nấm bệnh gây hại thực vật và chúngphát triển rất nhanh trong nhiệt độ và độ ẩm thuận lợi thế này, gây rất nhiều khókhăn cho việc trồng trọt và ảnh hưởng đến bảo quản sau thu hoạch Để bảo vệ năngsuất cây trồng và chất lượng nông sản sau thu hoạch, nông dân sử dụng các chấthóa học để ngăn cản sự tấn công của nấm bệnh Ngay cà khi dùng thuốc diệt nấmchuyên dụng thì hàng năm trên thế giới nấm bệnh thực vật vẫn gây ra thiệt hại 15%sản lượng thu hoạch Hơn nữa, khi sử dụng thuốc hóa học một cách chủ quan lạichính là con dao hai lưỡi, bởi các chất hóa học là nguy cơ tiềm tàng mà ngày naycác nhà khoa học phát hiện ra chính chúng gây ra các bệnh ung thư và một số bệnh

lý nguy hiểm khác

Để khắc phục vấn đề này, các nhà khoa học đã nghiên cứu một thời gian dài

và đã tìm ra được một chìa khóa thích hợp nhất Đó chính là những hợp chất sinh

Đồ án tốt nghiệp

học, thân thiện với môi trường cũng như không ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Và hợp chất sinh học có thể ứng dụng đó chính là enzyme chitinase, được sinh ra từmột số vi sinh vật nhất định

Xuất phát từ vấn đề trên, sinh viên quyết định thực hiện đề tài “Xác định

một số điều kiện nuôi cấy tối ưu nấm Trichoderma harzianum để thu nhận

enzyme chitinase.”

2 Mục đích nghiên cứu

Tìm ra được điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu nhận enzyme chitinase từ

Trichoderma harzianum.

3 Nội dung nghiên cứu

Định tính khả năng sinh tổng hợp chitinase từ chủng Trichoderma harzianum.

Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần môi trường, thời gian nuôi cấy đến sự

tổng hợp chitnase từ Trichoderma harzianum

Khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cơ chất cảm ứng, pH môi trường,nguồn đường bổ sung đến khả năng sinh hoạt tính enzyme chitinase

Hiệu quả khống chế nấm gây bệnh thán thư ớt của chitinase thu từ

4.2 Kết quả đạt được của đề tài

- Tìm ra được các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng Trichoderma harzianum sinh tổng hợp chitinase.

Đồ án tốt nghiệp

5 Kết cấu đồ án

- Chương 1: Tổng quan

- Chương 2: Vật liệu và phương pháp

- Chương 3: Kết quả và biện luận

- Chương 4: Kết luận và đề nghị

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về Trichoderma

Trichoderma là một trong số ít những vi nấm có lợi, điều này đã được chứng

minh và chúng đã được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học đối với những

nấm gây bệnh (Chet, 1987; Chet et al., 1998) Trichoderma có thể phát triển mạnh

trong các thảm thực vật

Trichoderma là một chi nấm hiện diện trong đất, chúng phát triển trên nhiều

loại cơ chất khác nhau (gỗ, các loài nấm khác…), nhiều loài trong chi này có khả

năng sống cộng sinh với cây Có thể nói Trichoderma là một trong số những loài vi

nấm được nuôi cấy thông dụng nhất Chúng được tìm thấy ở khắp nơi trừ những vĩ

độ cực Nam và cực Bắc Nấm Trichoderma phổ biến ở những khu rừng nhiệt đới

ẩm hay cận nhiệt đới, chúng hiện diện trên rễ cây, trong đất hay xác sinh vật đã

chết, xác bã hữu cơ hay kí sinh trên các loài nấm khác Mỗi dòng nấm Trichoderma

khác nhau sẽ yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Harman, 2000)

Khi cộng sinh với cây, Trichoderma sẽ giúp cây tránh được khỏi sự xâm hại

của các loài nấm gây bệnh khác bằng các cơ chế như tấn công, ký sinh và lấy chấtdinh dưỡng từ các loài nấm hại khác Và yếu tố quan trọng để giúp chúng có thểxâm nhập vào bên trong nấm hại chính là khả năng sinh tổng hợp các hệ enzymengoại bào

Lớp (Class): Sordari om y c etes

Phân lớp (Subclass): y p ocreH om y c etidae

Bộ (Order): y p ocrealesH

Họ (Family): y p ocreaceH a e

1.1.2 Lịch sử phát triển

Chủng nấm Trichoderma được phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm 1794,

vào thời điểm đầu tiên này ông đã mô tả được 3 loài:

1- Tricho d erma c a esi u m Pers. (1794)

2- Tricho d erma n i gre s cens Pers. (1794)

3- Tricho d erma v i ride var. viride Pers (1794)

Cho đến năm 1801, Persoon và Gray đã mô tả chi tiết được 7 loài

nấm Trichoderma đó là:

1- Tricho d erma c a esi u m Pers. (1794)

2- Tricho d erma n i gre s cens Pers. (1794)

3- Tricho d erma v i ride var viride Pers. (1794)

4- Tricho d erma a ure u m Pers. (1796)

Đồ án tốt nghiệp

5- Tricho d erma l a eve Pers. (1796)

6- Tricho d erma d ubi u m Pers. (1801)

7- Tricho d erma f u ligi n oides Pers. (1801)

Trong suốt 2 thế kỷ tiếp theo đến năm 1999 các nhà khoa học trên thế giới đãphát hiện thêm khoảng 90 loài

Từ năm 2000 trở lại đây đã phát hiện thêm khoảng 50 loài mới Cho đến

năm 2013, đã có trên 150 loài nấm Trichoderma được mô tả.

1.1.3 Đặc điểm chung của Trichoderma

1.1.3.1 Đặc điểm hình thái

Hình 1.1: Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trường thạch dịch

chiết khoai tây (PDA)

(Nguồn: h t tp:// w ww.l o ok f ordiagnosis.c o m)

Chủng nấm Trichoderma spp thuộc nhóm nấm bất toàn (là những nấm sinh

sản vô tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếpthành chuỗi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử), có khuẩn lạc màu lục khi

tăng trưởng có sự hiện diện của ánh sáng mặt trời Sợi nấm của Trichoderma phân

nhánh mạnh, thường hình thành ở dạng gần như vòng tròn đồng tâm Các sợi nấmthường mọc tạo góc với trục chính khoảng 90 độ

Đồ án tốt nghiệp

Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ởcuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn,không màu và liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy

Hình 1.2: Sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma harzianum

(Nguồn: h t tp://en wiki p edia.org/ w iki/Tri c hod e rm a ) Bào tử của nấm Trichoderma mịn, trơn láng có màu xanh lá cây hoặc màu

vàng Bào tử của hầu hết các loài có hình elip, 3-5 x 2-4 µm (L/W=1.3), bào tử hìnhcầu (L/W<1,3) rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3: Bào tử của Trichoderma harzianum quan sát dưới kính hiển vi quang học

x100

1.1.3.2 Đặc điểm sinh trưởng

Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp nguồn carbon và nitrogen Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được

là monosaccharide, disaccharide, polysaccharide… NH3 là nguồn đạm mà nấm

Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên thường có mặt trong môi trường nuôi cấy loài

nấm này, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường có nhiềudinh dưỡng Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinhtrưởng của Trichoderma Nhưng muối NaCl sẽ làm giảm sự sinh trưởng và phát

triển của một số loài Trichoderma, do đó trong môi trường nuôi cấy không nên có

sự có mặt của NaCl Nồng độ CO2 cũng ảnh hưởng phần nào đến sự sinh trưởng của

Trichoderma Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 300C [13], có một vài loài

Trichoderma tăng trưởng được ở 350C Một số ít phát triển tốt ở 400C (Samuels,

2000) Trichoderma phát triển tốt ở đất có độ pH từ 3,5 - 7,0 nhưng không thể phát

triển trong điều kiện pH < 3,5, phát triển tốt ở pH trung tính Các chủng

Trichoderma có tốc độ tăng trưởng nhanh, đường kính khuẩn lạc đạt trung bình 2

cm – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy (Bùi Xuân Đồng, 1982)

Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau Ví dụ Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong môi trường có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum

Đồ án tốt nghiệp

thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí

hậu ấm áp

Phần lớn các loài Trichoderma có tính cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều

kiện môi trường tự nhiên và nhân tạo dưới điều kiện tối sáng lẫn lộn hay bào tử xuấthiện trong điều kiện sáng Bào tử trên môi trường thạch agar dưới ánh sáng 85 Luxtrong 20 - 30 giây sẽ làm tăng hiệu quả nẩy mầm Đối với thể bào tử phialiconidiocảm ứng với ánh sáng nhất, chúng sẽ xuất hiện nhiều dưới ánh sáng ban ngày trongkhoảng 3 phút hoặc dưới tia cực tím ở 10 - 30 giây Một số tác giả đã công bố

Trichoderma hình thành bào tử nhiều nhất ở bước sóng từ 380 nm - 440 nm, và

không hình thành bào tử ở bước sóng dưới 254 nm và trên 1100 nm Các bào tửcảm quang bị hạn chế phát triển dưới sự có mặt của các hóa chất như: azaguanine,5-fluorouracil, actiomycin D, Cycloheximide, phenethyl alcohol và ethidumbromide,… các hóa chất này sẽ ngăn chặn sự hình thành của các hậu mô bào tử, đây

là một cấu trúc rất đặc biệt, có tiềm năng trong phòng trừ sinh học T hamatum, T hazianum, T viride và T virens ở trong cả môi trường lỏng và rắn có acide thích

hợp cho sự nảy mầm bào tử hơn là môi trường trung tính

1.1.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma

Weidling là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm trao đổi chất của

Trichoderma Weidling và Emerson đã phân lập được chất độc kết tinh từ sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma, đó là: gliotoxin (C13H14N2S2O4)

Chất độc thứ hai do Brian và Mc Growan công bố là virindin (C9H16O6),

được sản xuất từ T viride Dennis và Webstre ghi nhận Trichoderma spp., còn sinh

tổng hợp một sản phẩm trao đổi chất khác gliotoxin và virindin, đó là kháng sinh:

trichlorofore từ T viride và T polysporum, kháng sinh peptide từ T harzianum.

Bên cạnh sản phẩm trao đổi chất là chất độc và kháng sinh, Trichoderma còn

sinh tổng hợp được một số các enzyme có hoạt tính sinh học mạnh như: exo vàendoglucanse, cellobiose và chitinase

Đồ án tốt nghiệp

1.1.4 Vai trò sinh thái

Ngoài tự nhiên Trichoderma thể hiện rất rõ vai trò sinh thái của chúng như:

ức chế sự phát triển của các loài nấm bệnh nhờ cơ chế kí sinh, phân giải các nguồnchất thải hữu cơ như cellulose từ gỗ, lá,…

Theo Garret (1956), Trichoderma có được những khả năng trên là do các đặc

tính sau:

 Sinh trưởng mạnh và bào tử nảy mầm nhanh

 Có khả năng sinh tổng hợp enzyme phân giải cao

 Có khả năng tạo kháng sinh, chịu được cả kháng sinh

1.1.5 Tính ứng dụng của Trichoderma trên thế giới và Việt Nam

Nấm Trichoderma đã được biết đến từ những năm 1920 và được xem là yếu

tố kiểm soát sinh học chống lại mầm bệnh trên cây trồng Cho đến gần đây, các cơchế để kiểm soát đã được biết đến, bao gồm khả năng kí sinh, kháng nấm, cạnhtranh về dinh dưỡng, khả năng tiết enzyme phân hủy vách tế bào nấm bệnh Nấm

Trichoderma xâm chiếm các lớp biểu bì rễ, lớp vỏ bên ngoài và đồng thời giải phóng các phân tử chất có hoạt tính sinh học Trichoderma spp bắt đầu được ứng

dụng trong nông nghiêp để kiểm soát dịch bệnh Các nghiên cứu về tính kí sinhcũng đã chứng minh rằng loài nấm này tạo ra một hỗn hợp đa dạng các enzymekháng nấm, bao gồm: chitinase và β-1,3-glucanase Các enzyme này cùng với một

số enzyme khác, cùng với hợp chất kháng nấm hỗ trợ nhau trong quá trình chống lạicác loài nấm bệnh

Trên thế giới có một số sản phẩm nấm Trichoderma được đưa vào ứng dụng tính đối kháng nấm bệnh trên một số cây trồng Sản phẩm Trichoderma 2000 (Israel) chứa Trichoderma harzianum trong phòng chống nấm Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfssim Pythium Sản phẩm Trichopel (New Zealand) chứa nấm Trichoderma harzianum đối kháng với nhiều nấm bệnh Sản phẩm Ecofit (India) chứa nấm Trichoderma viride trong phòng chống nấm Fusarium, Pythium,

Đồ án tốt nghiệp

Rhizoctonia, Macrophomia, Phytophthora trên cây bông vải, thuốc lá, cao su, và nhiều loại rau Sản phẩm BINAB-T-WP (Thụy Điển) chứa 2 loại nấm Trichoderma harzianum và Trichoderma polysporum trong phòng chống các bệnh ở rễ cây.

Ngoài ra, còn có rất nhiều sản phẩm khác ở nhiều nước trên thế giới được ứng dụngrộng rãi trong phòng chống nhiều loại bệnh do nấm gây ra trên cây trồng (CABI,2001)

Ở Việt Nam, các tỉnh phía nam đang lưu hành khoảng 30 sản phẩm có chứa

Trichoderma của nhiều công ty khác nhau, các sản phẩm này đã và đang góp phần

hạn chế các nấm bệnh trên cây trồng như hồ tiêu, ca cao, cà chua, dua hấu, dưa leo,cam quýt (Quang Ngọc, 2009) Nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Cần Thơ đã phối

hợp các chủng nấm Trichoderma thành các sản phẩm phòng trừ bệnh hiệu quả theo

đối tượng như: Tricô-ĐHCT có khả năng phòng trừ bệnh thối rễ trên cây ăn trái, rau

màu do Fusarium; Tricô-Lúa Von phòng trừ bệnh lúa Von do Fusarium moniliforme; Tricô- Nấm Hồng trị bệnh do Phytophthora trên sầu riêng, tiêu, cao su, Tricô- Khóm trị bệnh do Phytophthora, Fusarium gây ra (Dương Minh và cộng

sự, 2010)

Hình 1.4: Một số sản phẩm thương mại ứng dụng của Trichoderma spp ở Việt

Nam và trên thế giới

Trichoderma spp được biết đến như là một tác nhân đối kháng lại với các nấm bệnh

của cây trồng và đã được ứng dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học cho cây trồngtrong nhà kính và ngoài ruộng, chúng có khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh

khác nhau như: Phytophthora spp., Rhizoctonia solani, Pythium spp., Slecrotium rofsii.

Một số loài Trichoderma được sử dụng phổ biến trong kiểm soát sinh học là

T koningii, T harzianum, T viride, T hamatum,

1.1.6.2 Cải thiện năng suất cây trồng

Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nảy mầm và ra hoa Đã có những công trình khoa học chứng minh rằng T harzianum và T koningiii kích thích

sự nảy mầm và tăng trường của cây Đối với các loài được trồng trong nhà kính, T harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lượng

hoa

Trichoderma đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cây trồng nhờ khả năng giúp

cây trồng tạo ra hệ rễ cứng cáp hơn Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng bắp

được bổ sung T harzianum T-22 hỗ sinh ở rễ thì cần lượng đạm ít hơn 40% so với

rễ không có T-22

Trichoderma cải thiện cấu trúc đất và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát

triển của vi sinh vật nốt sần cố định Nitơ trong đất, duy trì sự cân bằng của các visinh vật hữu ích trong đất, tăng độ phì nhiêu và dinh dưỡng cho cây trồng

Tăng sức đề kháng cho cây trồng, một số chủng T harzianum còn có thể

xâm nhập vào mô tế bào cây, làm tăng khả năng chống chịu bệnh của cây

Đồ án tốt nghiệp

Các chủng nấm Trichoderma spp.trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh

không những cung cấp một nguồn phân bón xanh, hiệu quả mà còn góp phần kiểmsoát các bệnh hại cây trồng và tạo ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên

1.1.6.3 Trong xử lí môi trường [17]

T harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng, đã

được chứng minh có khả năng phân giải hiệu quả ciliatin, glycophosphat và aminomethylphosphonic

T harzianum 2023 (Khoa sinh lý thực vật trường đại học California) có thể

phân giải DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen và pentachlorophenol

T harzianum CCT-4790 có thể phân giải 60% thuốc diệt cỏ Durion trong đất

sau 24 giờ, đây được xem như là một liệu pháp rất có tiềm năng trong việc xử lí cáchóa chất gây độc hại trong đất và trong đầm lầy

1.1.6.4 Trong công nghiệp thực phẩm

Enzyme của chủng Trichoderma longibrachiatum đã được khảo sát và cho

thấy có thể làm tăng hương vị của men rượu Đồng thời, các loại enzyme glucanase

và glucosidase được tiết ra có khả năng thủy phân các liên kết glycoside trong liênkết glycoside-terpen từ đó giải phóng các hợp chất terpen, tạo mùi thơm đặc trưngcho sản phẩm

Bột lúa mì để sản xuất bánh mì thường chứa đầy đủ hàm lượng β-amylasenhưng lại thiếu α-amylase, cho nên người ta phải bổ sung vào bột một lượng α-amylase nhất định có thể lấy từ đại mạch nảy mầm, vi khuẩn hay nấm Trong đónấm được xem là nguồn α-amylase phong phú và tốt nhất Các nhà khoa học đã

chuyển thành công gen mã hóa α-amylase từ Trichoderma vào nấm men bánh mì dưới sự kiểm soát của promoter ACT1 Bánh mì tạo ra có kích thước lớn hơn và ruột

bánh mì cũng mềm hơn, chậm cứng hơn làm kéo dài thời gian bảo quản

Đồ án tốt nghiệp

1.1.6.5 Bổ sung thức ăn cho chăn nuôi

Hiện nay trên thị trường có chế phẩm EconaseTM với các enzyme có nguồn gốc

từ Trichoderma reesei bổ sung vào thức ăn của gia súc, với các ưu điểm:

- Thành phần dinh dưỡng linh động hơn

- Sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền

- Dễ tiêu hóa

- Làm tăng giá trị năng lượng của ngũ cốc

- Giảm lương rác thải cho môi trường

Ngoài ra còn có chế phẩm AvizymeTM cũng chứa nhưng ưu điểm tương tựEconaseTM thích hợp cho gia cầm trong giai đoạn đẻ trứng PorzymeTM là thươnghiệu của một hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase, protease, amylase bổsung vào khẩu phần ăn của lợn con vừa thôi bú Tất cả enzyme này đều bắt nguồn

từ Trichoderma

1.2 Cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma spp [17]

Trichoderma spp Phát triển nhiều cơ chế để ngăn chặn sự tấn công của các

loài nấm khác và hỗ trợ cho cây và rễ cây phát triển Các cơ chế này bao gồm cạnh

tranh về không gian và dinh dưỡng (Elad et al., 1999), kí sinh (Haran et al., 1996; Lorito et al., 1996), sản sinh ra những hợp chất mang tính ức chế (Sivasithamparam

và Ghisalberi, 1998), bất hoạt các enzyme của tác nhân gây bệnh (Roco và Perez,2001) và tăng khả năng kháng của thực vật (Kapulnik và Chet, 2000)

1.2.1 Cạnh tranh

Các loài Trichoderma thường được xem là những đối thủ cạnh trạnh mạnh

mẽ (Samuels, 1996), chúng phát triển mạnh và nhanh chóng sử dụng các nguồn cơ

chất dinh dưỡng để ức chế khả năng phát triển của nấm bệnh, ví dụ như Fusarium spp (Papavizas, 1985) Những loài Trichoderma, có thể bổ sung trực tiếp vào đất,

hay xử lí với hạt giống sẽ phát triển theo sự sinh trưởng của hệ thống rễ của cây

được xử lí (Ahmad và Baker, 1987) Đất được xử lí với bào tử nấm T harzianum sẽ

Đồ án tốt nghiệp

lấn áp các nấm Fusarium oxysporum f sp vasinfectum và F oxysporum f sp melonis Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống được xem như là một cơ chế,

mặc dù nó không được chứng minh là hoạt động riêng rẽ (Silvan và Chet, 1989)

Ozbay và Newman (2004) đã chỉ ra rằng Rhizoctonia solani, Pythium ultimum và Chalara elegans bị ức chế mạnh mẽ bởi Trichoderma trong điều kiện in vitro Cả tác nhân gây bệnh và Trichoderma điều phát triển Các nhà nghiên cứu quan sát thấy rằng hoạt động ức chế của Trichoderma với nấm bệnh có liên quan đến nồng

độ và sự tích lũy CO2

1.2.2 Kí sinh

Cách thức tương tác và kí sinh sợi nấm của các loài Trichoderma với các tác nhân gây bệnh trong đất đã được biết đến từ lâu (Chet et al., 1981; Denis và Webster, 1971).Trichoderma phát triển hướng về sợi nấm của các nấm khác và

cuộn tròn lấy chúng, sau đó phân giải thành tế bào của mục tiêu bằng cách tiết ranhững enzyme phân giải khác nhau Quá trình kí sinh này giới hạn sự phát triển và

hoạt động của các tác nhân gây bệnh thực vật.Trichoderma tấn công vào hệ sợi nấm

của mục tiêu sau khi cuộn lấy chúng và xâm nhập vào bên trong thành tế bào vậtchủ nhờ hệ phân giải

Sự tương tác kí sinh này mang tính đặc hiệu, Trichoderma sẽ nhận diện tính

hiệu từ vật chủ, rồi bắt đầu cuộn lấy vật chủ và xâm nhập chúng (Denis và Webster,

1971; Sivan và Chet, 1989) Hệ eznyme của Trichoderma giúp phân giải thành tế

bào vật chủ như β-1,3-glucanase và các enzyme phân giải chitin, được xem là các

enzyme chủ chốt trong hoạt động kí sinh này (Elad et al., 1982 Cherif và

Benhamou, 1990)

Endochitinase (42-kDa), chitobiosidase (40-kDa) và

N-acetyl-b-D-glucosamidase (73-kDa) từ T atroviride chủng P1 và T virens chủng 41 được công

bố là có khả năng ức chế đáng kể sự nảy mầm của bào tử và sự kéo dài sợi nấm của

nhiều nấm bệnh khác như Botrytis cinerea, Fusarium spp., Alternaria spp., Ustilago avenae, Uncinula necator và hầu như đối với tất cả các nấm mà thành

Đồ án tốt nghiệp

phần thành tế bào có chứa chitin (Di Pietro et al., 1993, Lorito et al., 1993, 1994, 1996; Schrimbock et al., 1994).

Nhiều enzyme đã được thu nhận và tinh sạch, khả năng ức chế sự nảy mầm

bào tử và kéo dài sợi nấm của nấm bệnh đã được kiểm nghiệm in vitro (Lorito et al., 1998) Quan sát bởi kính hiển vi điện tử và kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rằng T harzianumvà T hamatum có khả năng kí sinh cà Sclerotium rolfsii và Rhizoctonia solani Nấm đối kháng tấn công tác nhân gây bệnh và tiết ra glucanase

và chitinase để thâm nhập vào bên trong thành tế bào vật chủ (Elad et al., 1983) Trichoderma có thể sản sinh cellulase, β-1,3-glucanase và chitinase để mà phân giải lớp glucan trong thành tế bào Pythium spp., chitin và glucan trong thành tế bào của Rhizoctonia solani (Harman et al., 1980).

1.2.3 Bất hoạt enzyme của nấm bệnh

Bất hoạt enzyme của nấm bệnh là một cơ chế kiểm soát khác của

Trichoderma Enzyme của Botrytis cinerea như là pectinase, cutinase, glucanase và

chitinase bị bất hoạt thông qua enzyme protease của chủng T39 tiết ra trên bề mặt

cây (Elad et al., 1999) Tác nhân gây bệnh thực vật Alternaria alternatacó thể tiết

enzyme endo-polygalacturonase và pectate lyase để phân giải các thành phần chứa

pectic của thành tế bào thực vật Sự hiện hiện diện của Trichoderma harzianum làm suy giảm 50% enzyme endo-polygalacturonase do nấm Alternaria alternata tiết ra

(Roco và Pertez, 2001)

Các loài Trichoderma khác hay các chủng phân lập khác thuộc mỗi loài có

thể khác nhau về khả năng kiểm soát sinh học Do đó, việc phân lập và khảo sát các

loài Trichoderma tử các vùng khác nhau là rất quan trọng để tìm ra một loài hay

chủng thích hợp

1.2.4 Tăng khả năng kháng của thực vật

Các chủng đặc trưng của nấm thuộc chi Trichoderma xâm nhập vào mô rễ,

sau đó bắt đầu làm một loạt các thay đổi và hình thái và hóa sinh trong cây, điều

này được xem như là phản ứng phòng vệ của cây Khi bón T harzianum vào rễ cây

Đồ án tốt nghiệp

đậu cho thấy rằng giảm được từ 25% - 100% mốc xám trên lá do Botrytis cinerea gây ra Các nhà khoa học đã sử dụng T harzianum T39 và chất benzothiadiazol để kiểm tra khả năng chống chịu Botrytis cinerea của cây cà chua, và thấy rằng chủng

T harzianum T39 ngăn cản sự phát triển của nấm bệnh ngay ở giai đoạn đầu và giảm đến 30% tổn thương cho cây (Audenaert et al., 1998).

Theo Yedidia et al (1999), thì sự kích hoạt hệ thống phòng vệ của cây có liên quan đến rễ cây được xử lí với T harzianum T-203 Những rễ được bổ sung

chủng T 203 cho thấy hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase, cellulase và perosidasecao hơn so với đối chứng không xử li trong 72 giờ Còn những cây dưa leo được xử

lí với 2,6- dichloroisonicotinic acid, một chất cảm ứng cho hệ thống phòng vệ củathực vật, cho thấy cũng có những phản ứng diễn ra nhưng không giống với khi xử lí

bằng T harzianum Theo Khan et al., (2001) thì T hamatum chủng 382 kích ứng

hệ thống kháng của cây cà chua đối với bệnh thối rễ và bạc lá do Phytophthora gây

ra

1.3 Những nghiên cứu về enzyme chitinase

1.3.1 Giới thiệu về chitin

1.3.1.1 Cấu trúc và tính chất của chitin

Hình 1.5: Cấu trúc phân tử của chitin

(Nguồn: h t tp://ac a dem i c.broo k lyn c uny.ed u /b i ology/bio 4 fv/page/ c hit i n.htm l)

Chitin là một trong những thành phần quan trọng cấu tạo nên vách tế bào củanhiều loài nấm bệnh thực vật cũng như lớp vỏ và biều bì của động vật chân đốt,động vật giáp xác, côn trùng và động vật thân mềm Chitin chiếm từ 22% đến 44%thành phần cấu thành vách tế bào của nấm bệnh, và nó rất cần thiết cho cấu trúc củasợi nấm (Peberdy, 1990) [17]

Chitin ở thể rắn, có cấu trúc bền nhờ vào các liên kết hidro ở trong và giữacác mạch Chitin không tan trong nước, cồn, acid hay kiềm loãng và các dung môithông thường khác Nó chỉ tan trong các dung dịch như HCl đậm đặc, HNO3 đậmđặc,…

Có 3 dạng chitin: α, β và γ Dạng α, có nhiều trong vỏ cua và tôm, biểu bìcủa côn trùng,… dạng này gồm các chuỗi đơn phân xuôi-ngược xen kẽ nhau, dạngsắp xếp này làm tăng tính bền của liên kết hidro, giúp cấu trúc ổn định hơn Dạng β,

có trong động vật thân mềm như mực, gồm các chuỗi đơn phân song song Trongkhi đó dạng γ gồm 2 sợi song song và một sợi song song xuôi-ngược Có thể chuyểnđổi từ dạng β sang α, sự chuyền đổi chỉ xảy ra theo một chiều Dạng γ có thểchuyển đổi thành α bằng cách xử lí với lithium thiocyanate

1.3.1.2 Lịch sử phát hiện của chitin [11]

Năm 1811, một nhà khoa học người Pháp chuyên nghiên cứu về lịch sử của

tự nhiên, Henri Braconnot, đã phát hiện ra một hợp chất hữu cơ trong nấm rơm vàđặt tên cho nó là “fungine”

Đồ án tốt nghiệp

Năm 1823, Odier tìm một chất tương tự thế trong côn trùng, thực vật và đặttên cho nó là “chitine”

Đồ án tốt nghiệp

chitin

Năm 1843, Lassaigne chứng minh có sự hiện diện của Nitơ trong phân tử

1.3.1.3 Sự phân bố của chitin trong tự nhiên [14]

Đối với prokaryote, chitin không hiện diện ở prokaryote mặc dù bản chất hóahọc nó cũng tương tự cấu trúc khung polysaccharide của peptidoglycan Gooday

(1995) đã công bố rằng chitin là một thành phần trong bào tử của Streptomyces.

Đối với vi nấm, hầu hết thành tế bào của vi nấm đều chứa chitin, chúngchiếm 22%- 40% (Muzzarelli, 1977) Sự có mặt của chitin cùng với một sốpolysaccharide khác được xem như là một dấu hiệu để phân loại nấm Các sợipolysaccharide có độ dài khác nhau phụ thuộc vào loài và vị trí tế bào (Gow vàGooday, 1983)

Đối với nguyên sinh vật, chitin hiện diện trong nang, thành tế bào của một sốcilliates, amoebae, chrysophytes, tảo và trong gai của tảo cát, dạng tinh khiết nhất

của chitin được phân lập từ loài tảo Thalassiosira fluvitalis (Bartnicki- Garcia và

Lippman, 1982)

Đối với động vật, chitin được tìm thấy trong thành phần cấu trúc của một ít

cơ quan, như trong các lớp da của động vật chân đốt, tuyến trùng và động vật thânmềm, và trong niêm mạc ruột, khung xương ngoài của côn trùng Phần xương ngoàicủa côn trùng chứa một lượng khá lớn phức hợp chitin- protein, trong khi vỏ củaloài giáp xác ngoài phức hợp chitin-protein còn có CaCO3 (Kramer vàMuthukrishnan, 1997)

Chitin trong tự nhiên tồn tại ở dạng acetyl hóa và deacetyl hóa cực kì ít Nấmmốc Absida coerulae được tìm thấy là có chitosan trong thành phần cấu tạo vách tế

bào (Muzzarelli et al., 1994)

1.3.1.4 Điều chế chitin

Chitin trong tự nhiên không tồn tại ở dạng tự do mà liên kết với các hợp chấtkhác như protein, khoáng chất, lipid và chất màu Để tách các chất này ra khỏichitin Hiện nay có rất nhiều phương pháp để tinh chế chitin, thường người ta tiếnhành theo các bước sau: loại protein, loại khoáng chất và tẩy màu

 Loại khoáng: trong thành phần vỏ tôm, cua thì loại khoáng chiếm nhiều nhất

là CaCO3, và để loại nó đi các nhà nghiên cứu đã sử dụng các tác nhân acidđậm đặc như: HCl, H2SO4, HNO3, CH3COOH,… Nhưng HCl được dùngnhiều hơn cả bởi nó có thể loại khoáng gần như triệt để và không gây cácphản ứng phụ đáng kể

 Loại protein: các chất hóa học được dùng để loại protein như: NaOH,NaHCO3, KOH, K2CO3,… Trong đó, NaOH được sử dụng thường nhất bởitính phổ biến của nó

 Tẩy màu: thường để tẩy màu người ta xử lí bột vỏ tôm, cua với các hợp chấtnhư Ethanol, Aceton hoặc dùng các chất có tính oxi hóa mạnh như H2O2,KMnO4,

1.3.2 Giới thiệu về enzyme chitinase

1.3.2.1 Đặc điểm và sự phân bố

Hệ enzyme thủy phân chitin (chitinase) thuộc nhóm enzyme thủy phân(Hydrolase) có khả năng thủy giải liên kết β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của haimonomer N-acetyl glucosamine trong mạch chitin

Trong tự nhiên, sự phân giải chitin chủ yếu được thực hiện bởi vi sinh vật,mặc dù rằng enzyme phân giải chitin có thể được tìm thấy trong cả thực vật, độngvật có xương sống và động vật không xương sống Chitinase được tìm thấy trongđường tiêu hóa của động vật có xương sống (Gooday, 1990), trong khi động vậtkhông xương sống cần chitinase để phân giải lớp biểu bì cũ Còn chitinase ở thựcvật lại là enzyme cảm ứng tiết ra để đáp trả sự tấn công của vi sinh vật, ví dụ như

thành tế bào của nấm bệnh thường cấu tạo bởi một lớp chitin [17] Hay là ở trongnộc độc của một số loài côn trùng cũng chứa một lượng chitinase để tạo thuận lợicho sự xâm nhập của chất độc vào cơ thể con mồi [16], [10]

Chitinase là enzyme phân hủy chitin- vốn là một trong những thành phầncủa vách tế bào nấm, côn trùng… trong tự nhiên có nhiều loài vi khuẩn, nấm có khảnăng sinh tổng hợp chitinase ngoại bào, nhưng được các nhà khoa học chú ý nhiều

nhất là Trichoderma.

Chitinase của vi nấm gồm có ba loại được công nhận dựa trên khả năng phângiải cơ chất chitin (Sahai và Manocha, 1993) Những enzyme phân giải chitin đó làexochitinase, endochitinase và N-acetylglucosaminidase Sự phối hợp của cácenzyme trên có thể thủy phân chitin thành dạng monomer là N-acetylglucosamine.Chitinase của vi nấm có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng từ 27-130 kDa [17]

Thành phần hệ enzyme chitinase của Trichoderma: Các loài Trichoderma sử

dụng hệ enzyme phân giải chitin cùng với enzyme β-1,3-glucanase để thủy phân

vách tế bào nấm bệnh và do đó làm giảm mức độ bệnh (Haran et al., 1995) Hệ enzyme phân giải chitin của T harzianum là phức hợp của 6 enzyme (Haran et al., 1995): hai β-1,4 N-acetylglucosaminidase (Chit 102 và Chit 73) và bốn endochitinase (chit 52, chit 42, chit 33 và chit 31) Các enzyme phân giải chitin được tổng hợp và tiết ra trong suốt quá trình phát triển của Trichoderma trong môi trường có chitin là nguồn cacbon duy nhất Chỉ có chit 20 được tiết nội bào với nồng độ thấp khi mà Trichoderma phát triển trên môi trường chứa glucose Sự phức hợp và đa dạng về hệ enzyme phân giải chitin của T harzianum liên quan đến sự bổ trợ của 6 enzyme trên, chúng cần thiết giúp cho T harzianum đối kháng với phổ rộng các nấm bệnh thực vật (Haran et al., 1995) [17]

Enzyme chitinase thô hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnhkhoảng 2 năm Chúng bị mất hoạt tính nhanh chóng ở 370C trong trường hợp không

có mặt cơ chất Chu kì bán hủy ở 370C là 40 ngày và ở 50C là 230 ngày [15]

Sự ổn định của enzyme chitinase sẽ cao hơn khi có mặt cơ chất là chitin.Enzyme chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số bất hoạt ở 200C là k= 0.145/h

1.3.2.2 Cơ chế hoạt động của chitinase [15], [12]

Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên vàtạo ra các đoạn oligosaccharides, trong đó, chiếm đa số là các diacetylchitiobiose(GlcNac)2, đã được nghiên cứu trên dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm

Hình 1.6:Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase

(Nguồn: h t tp: / /tai - lieu co m) 1.3.2.3 Các nguồn thu nhận chitinase

a) Chitinase từ vi khuẩn.

Vi khuẩn sinh tổng hợp chitinase nhằm mục đích đáp ứng nhu cầu dinhdưỡng Chúng thường tổng hợp nhiều loại chitinase để phân cắt các loại chitin đadạng trong tự nhiên

Chitinase được tìm thấy trong các vi khuẩn như: Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio và đặc biệt là Streptomyces.

Enzyme chitinase là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng Vì vậy, trongmôi trường nuôi cấy vi sinh vật người ta đều cho thêm vào nguồn cơ chất chitin, đểlàm chất cảm ứng cho khả năng sinh tổng hợp chitinase

b) Chitinase từ vi nấm

Chitinase cũng được tạo ra bởi các loại nấm sợi Các chủng nấm sợi cho

enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia,… đặc biệt là ở các loài nấm lớn như: Lycoperdon, Coprinus,…

Tương tự như ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm cũng đóng vai trò quantrọng về mặt dinh dưỡng nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quátrình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phầnchính của vách tế bào

c) Chitinase từ thực vật

Các thực vật bậc cao có khả năng tổng hợp chitinase nhu cao su (Heveabrasiliensis), thuốc là (Nicotiana spp.), lúa, lúa mì, lúa mạch (Hordeum vulgare), càrốt, khoai lang, đậu nành,… và một số loài tảo biển cũng có khả năng sinh tổng hợpchitinase Chitinase ở thực vật tồn tại ở các mô nhất định hoặc cơ quan sinh sảnnhư: hạt giống, củ, hoa và được cảm ứng bởi côn trùng và các tác nhân có hại trênthực vật Bên trong tế bào thực vật, chitinase nằm trong không bào cùng với cácenzyme chống bệnh khác Ví dụ như: endochitinase mang tính base trong lá đậu tậptrung trong không bào

d) Chitinase từ động vật

Ở động vật, chitinase tồn tại ở các mô, các tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóacủa nhiều động vật không xương như: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt.Đối với động vật có xương sống, chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dàycủa loài cá, lưỡng cư, bò sát, chim, thú ăn sâu bọ

Ngoài ra, enzyme chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròntrong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của loài chân đốt vào thời điểmthay vỏ, lột da Enzyme chitinase còn giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài trong quátrình tiến hóa hay lột xác

1.3.2.4 Lịch sử nghiên cứu về chitinase [17]

So với các enzyme khác như protease, cellulase, amylase, thì chitinase lại làmột enzyme được nghiên cứu chậm hơn và các công trình nghiên cứu về chúng cònkhá hạn chế Đối tượng nghiên cứu sớm nhất và nhiều nhất là xạ khuẩn

Streptomyces (L.R Berger và D.M Renolds, 1958; R.Grupta, R.K Saxena, P.

Chatuvedi và J.S Windi, 1995) Những nghiên cứu trên đối tượng này nhằm thuchitinase để phá vỡ vách tế bào nấm Năm 1978, P.A Carroad và R.A Tom có côngtrình nghiên cứu về phương pháp sinh học trong xử lý chất thải chứa chitin, và tiếp

đó là nghiên cứu của I.G Cosio, R.A Fisher, P.A (1982) đề cập đến quá trình sảnxuất enzyme nhằm xử lý chất thải chứa chitin

Về sau, những năm 1989, việc thu nhận chitinase được nghiên cứu trên các

đối tượng khác như: Serratia liquefaciens (S Joshi, Kozlowski) với hoạt tính enzyme chitinase là 15,1 (U/ml), Myrothecium verrucaria (P Vyas và M.V.

Deshpand) với hoạt tính là 2,0 (U/ml) và vẫn chủ yếu tìm hiểu ứng dụng củachitinase trong việc phá vỡ vách tế bào nấm

Trong những năm trở lại đây, nấm sợi Trichoderma dần trở thành đối tượng

nghiên cứu sản xuất chitinase phổ biến Năm 1991, C.J Ulhoa, J.F Peberdy nghiên

cứu sự điều hòa quá trình sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum Năm

1999, P.A Felse và T Panda nghiên cứu quá trình nuôi cấy chìm thu nhận

chitinase của Trichoderma harzianum trong bể lắc Năm 2003, Ashok Pandey và

cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp chitinase có tính kháng nấm

từ Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trường bán rắn Dường như Trichoderma là chi nấm đến nay được phát hiện là có hoạt tình chitinase khá cao,

ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt là trong bảo vệ thực vật

Vi khuẩn cũng là một đối tượng được nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợpchitinase Năm 1998, B Bhushan, G.S Hoondal nghiên cứu enzyme chitinase chịu

nhiệt từ Bacillus sp G-1 Và gần đây nhất, năm 2009, S.M Akir và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nuôi cấy thu nhận chitinase từ Bacillus licheniformis bằng

phương pháp bề mặt đáp ứng ( RSM) Ưu điểm của chitinase từ vi khuẩn là khảnăng bền nhiệt.

Trên đối tượng thực vật, cũng có một số nghiên cứu thu nhận chitinase Năm

2004, Isabela S Santos và cộng sự có công trình nghiên cứu về chitinase thu nhậntrên đối tượng thực vật (hạt cây Adenanthera pavonia L.) và cây họ đậuPhaseolumungo Kết quả cho thấy chitinase từ hạt cây Adenanthera pavonia L làloại enzyme bền nhiệt Tác giả Wen-chi Hou, Yaw-Huei Lin, Ying-Chou Chen(1998) nghiên cứu thu nhận chitinase chiết rút từ lá khoai lang

1.3.2.5 Ứng dụng của enzyme chitinase [26], [8], [3], [19]

b) Tổng hợp chitooligosaccharides

Hiện nay các hoạt tính sinh học của các chitooligosaccharides ngày càngđược nghiên cứu chuyên sâu Trong y học, người ta sử dụng các chitohexaose vàchitoheptaose làm tác nhân kháng ung thư

Enzyme chitinase thu nhận từ Vibrio alginolyticus được dùng để sản xuất

chitopentaose và chitotriose từ huyền phù chtiin (Murao và cộng sự, 1992)

c) Chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do vi nấm bằng enzyme chitinase

Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu sử dụng enzyme chitinase trongviệc chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do nấm gây ra Chitin hiện diện hầu hếttrong vách các loài nấm bệnh, ít nhất là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm

Do đó có thể đánh dấu chitin đặc hiệu cho vi nấm, tạo cơ sở cho một phương pháp

chuẩn đoán nhanh bệnh truyền nhiễm bằng chitinase từ Vibrio parahemolyticus,

enzyme này kết hợp chặt chẽ với chitin nên có thể dùng như một đầu dò trong việcchuẩn đoán với độ nhạy cao để nhận diện đặc hiệu các vách tế bào nấm hay các vếtchồi của nấm men

d) Kiểm soát muỗi và các côn trùng gây hại

Do cấu tạo lớp da của côn trùng phần lớn có chứa chitin, nên enzymechitinase được xem như là chiếc kìm sinh học, phá vỡ sự bền vững của lớp da thôngqua phân giải chitin, điều này làm giảm sức sống của côn trùng, từ đó tạo điều kiệncho các tác nhân kiểm soát côn trùng gây hại, qua đó giảm thiểu quy mô dịch bệnh

e) Ứng dụng trong việc thu nhận tế bào trần.

Phần lớn cấu tạo của tế bào vi nấm có thành tế bào cấu tạo từ chitin Do đó

hệ enzyme chitinase đặc biệt có hiệu quả trong trường hợp này, chúng giúp phá vỡthành tế bào vi nấm, tạo dạng tế bào trần, tạo thuận lợi cho quá trình nghiên cứu cácquá trình sinh học của vi nấm

Dahiya (2005) đã mô tả hiệu quả của enzyme chitinase thu nhận được từ

chủng Enterobacter sp NRG 4 trong việc tạo tế bào trần ở nấm Trichoderma reesei, Aspergillus Niger, Pleutotus florida…

f) Kiểm soát nấm bệnh trên cây trồng

Enzyme chitinase được dùng để ức chế sự phát triển của nấm, côn trùng vàđộng vật chân đốt gây hại thực vật Các loài nấm bệnh bị ức chế bởi chitinase như:

Fusarium, Gliocladium, Rhizoctonia, Ustilaigo, Botrytis, Slecrotium,… các loài côn trùng thuộc bộ cánh vảy Leppidoptera (sâu cải, thuốc lá)… bộ cánh cứng Coeoptera (bọ cánh cứng khoai tây, bọ vòi voi vỏ tròn, bọ cánh cứng đậu Mexico

và ấu trùng sống ở rễ bắp)… Bộ cánh đều Homoptera (rệp bông cải, rệp khoai tây,

rệp đỏ Califonia)…x` [9]

Người ta sử dụng enzyme chitinase như là một tác nhân kiểm soát sinh học

an toàn và dễ phân hủy thay cho thuốc trừ sâu sinh học

Theo Hirohi Ihui, thì enzyme chitinase luôn hiện diện trong cơ thể của thựcvật, chitinase là β-1,3-glucanase được tạo ra ở mô thực vật khi tế bào bị kích thíchbởi nấm bệnh có chưa chitin, từ đó phân giải vách tế nào nấm bệnh và ngăn chặn sựphát triển của dịch bệnh CHIT40, CHIT42 và CHIT72 có tác động lên kéo dài của

sợi nấm của nhiều nấm hại thực vật như: Fusarium spp., Alternaria spp., Ustilago avenae,… khi chúng được ủ với dịch enzyme [20]

g) Các chế phẩm mới: [21]

Ngày nay, các nhà khoa học đã kiến nghị sử dụng chitinase kết hợp với cáctác nhân kháng nấm (như: Amphotericin B, 5-flourocytosi, Griseofulvin,Allylamines,…)

Enzyme chitinase có thể giúp phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm

ở liều lượng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân, do khi có mặt chitinase thì sựxâm nhập của thuốc vào cơ thể nấm bệnh dễ dàng

1.3.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme chitinase và sự sinh tổng hợp enzyme chitinase từ vi sinh vật [5], [23]

b) Ảnh hưởng của pH:

Giá trị tối ưu của enzyme chitinase thường dao động trong khoảng 4-9 đốivới thực vật bậc cao và tảo, 4,8- 7,5 ở thú và 3,5- 8,0 ở vi sinh vật Chúng thườngthể hiện hoạt tính ở pH hơi acid, có tính ổn định tốt

pH tối ưu của enzyme chitinase còn phụ thuộc vào cơ chất sử dụng Đa sốcác nghiên cứu về chitinase chỉ ra khoàng pH tối ưu là 5,0 khi sử dụng các cơ chất

là bột chitin, pH thuộc khoảng kiềm yếu khi sử dụng cơ chất là glycol chitin Hoạttính của enzyme chitinase bị ức chế ở pH < 4,5, ngoại trừ chitinase trong dạ dàyđộng vật có xương sống thì vẫn có thể hoạt động ở pH= 3,0

Giá trị pH môi trường ban đầu có sự ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợpenzyme chitinase của vi sinh vật Tùy thuộc vào loài, các chủng vi sinh vật mà pHthích hợp dao động từ pH hơi acid đến pH hơi kiềm Theo Takashi và cộng sự