Điều tra thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, nghiên cứu nuôi trồng loài Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes)

MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nấm Đông trùng hạ thảo (còn gọi là Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo Đông trùng) là các loài nấm ký sinh trên sâu non hoặc nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loại côn trùng. Sâu non, sâu trưởng thành của một số loài côn trùng nằm dưới đất hoặc ở trên mặt đất bị nấm ký sinh, xâm nhiễm và sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết. Mùa đông, giai đoạn này nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao đã hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu. Vì mùa đông nấm tồn tại ở dạng hệ sợi trên sâu, mùa hạ mọc thành cây nấm nên có tên là đông trùng hạ thảo. Nấm Đông trùng hạ thảo là loài nấm được đánh giá cao về giá trị dược liệu, nhờ có hợp chất cordycepin trong thành phần hoá học của thể quả nấm. Đây là hợp chất có khả năng ức chế hoạt động của quá trình sinh tổng hợp mới của các tế bào ung thư. Tác dụng kìm hãm của các tế bào ung thư vú, ung thư phổi, ung thư máu cũng được nhiều nhà khoa học như: Yoo et al., (2004) [107]; Ahn et al., (2000) [48] đã nghiên cứu và phát hiện. Theo y học cổ truyền Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị các chứng rối loạn lipit máu, rối loạn nhịp tim, viêm thận mạn tính, cao huyết áp, ung thư phổi, thiểu năng sinh dục và viêm gan B mạn tính. Nấm Đông trùng hạ thảo đã được Nan et al., (2001) [89] chứng minh có hiệu quả chữa trị bệnh rối loạn chức năng gan. Ngoài ra nấm này còn có tác dụng chống viêm và kìm hãm sự oxy hoá của lipit và lipoprotein. Không chỉ vậy loài nấm Đông trùng hạ thảo còn được phát hiện có hàm lượng dinh dưỡng cao: giàu các vitamin A, vitamin B6, vitamin B12, vitamin B3, vitamin B1… và có hàm lượng protein khá cao, nhiều nguyên tố khoáng như Zn, Se, Cu... Như vậy giá trị của loài nấm Đông trùng hạ thảo là vô cùng quý giá. Được thiên nhiên ưu đãi về điều kiện tự nhiên cùng với hệ động thực vật phong phú, Vườn Quốc gia Hoàng Liên còn có nguồn dược liệu vô cùng quý giá như: Tam thất hoang, nấm Linh chi, Ba kích cùng nhiều loài thảo dược quý khác đã góp phần xây dựng Sa Pa trở thành điểm du lịch nghỉ dưỡng, chữa bệnh yêu thích của du khách trong và ngoài nước. Tuy nhiên những sản vật của địa phương mới chỉ dừng lại ở việc khai thác, thu hái từ rừng, một phần nhỏ do nhân dân nuôi trồng mà chưa có nhiều sản phẩm khoa học công nghệ cao phục vụ khách du lịch và đóng góp đáng kể cho ngân sách địa phương. Bằng các nghiên cứu chuyên đề các nhà khoa học bước đầu phát hiện Vườn Quốc gia Hoàng Liên có các loài nấm Đông trùng hạ thảo phân bố tự nhiên, trong đó có loài “Bông tuyết Đông trùng hạ thảo - Isaria tenuipes” được phát hiện, nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong y học… loài này chứa hàm lượng một số hoạt chất (Adenosine, Cordycepin…) cao và giá trị nó mang lại vô cùng lớn với việc điều trị ung thư, tiểu đường và một số bệnh lý khác. Tuy nhiên khu hệ nấm ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên còn chưa có nhiều nghiên cứu. Những hiểu biết về đa dạng thành phần loài, đặc điểm sinh học và giá trị sử dụng còn đang rất hạn chế. Với mong muốn được đóng góp vào việc xây dựng danh mục nguồn gen các loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, bảo tồn đa dạng sinh học và đề xuất biện pháp sử dụng bền vững, nhân nuôi nguồn dược liệu quý bằng phương pháp nhân tạo. Mở ra một hướng đi mới trong việc phát triển kinh tế, xã hội của tỉnh Lào Cai, tạo sản phẩm du lịch đặc trưng mang thương hiệu Đông trùng hạ thảo Sa Pa. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “Điều tra thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, nghiên cứu nuôi trồng loài Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) đặt ra là rất cần thiết, có ý nghĩa cả về lý luận và thực tiễn. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu chung Xác định được thành phần, tính đa dạng các loài thuộc nhóm nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên và cơ sở khoa học trong việc nuôi trồng loài nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes). 2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định được thành phần loài nhóm nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên. - Xác định được tính đa dạng và đặc điểm sinh học của các loài nấm ĐTHT thu được tại VQG Hoàng Liên. - Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng loài nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo.

- 

 -HOÀNG QUỐC BẢO

ĐIỀU TRA THÀNH PHẦN LOÀI NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO TẠI VƯỜN QUỐC GIA HOÀNG LIÊN VÀ NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG

LOÀI ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BÔNG TUYẾT (ISARIA TENUIPES)

LUẬN ÁN TIẾN SỸ LÂM NGHIỆP

CHUYÊN NGHÀNH ĐÀO TẠO : QUẢN LÝ TÀI NGUYÊN RỪNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : GS.TS PHẠM QUANG THU

HÀ NỘI - NĂM 2018

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC KÝ HIỆU xix

DANH MỤC CÁC BẢNG xx

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ xxi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 5

1.1 Hệ thống của giới Nấm 5

1.2 Hình thái và cấu trúc sợi nấm 13

1.2.1 Sợ nấm 13

1.2.2 Quả thể 14

1.2.3 Quả thể đệm 14

1.2.4 Nang nấm 14

1.2.5 Bào tử nấm 15

1.3 Nấm ký sinh côn trùng 15

1.3.1 Khái niệm 15

1.3.2 Chu trình sống và lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 16

1 4 Tình hình nghiên cứu về nhóm nấm Đông trùng hạ thảo trên thế giới 20

1.4.1 Nghiên cứu về phân loại, thành phần loài nhóm nấm Đông trùng hạ thảo 20

1.4.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học cuả nhóm nấm Đông trùng hạ thảo .23

1.4.3 Nghiên cứu về giá trị dược liệu của nhóm nấm Đông trùng hạ thảo 25

1.4.4 Nghiên cứu về nuôi cấy sinh khối hệ sợi và nuôi trồng thể quả

đệm trên giá thể nhân tạo 29

1.5 Nghiên cứu về nhóm nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam 31

1.5.1 Nghiên cứu về thành phần loài các loài nấm ký sinh côn trùng và nhóm nấm Đông trùng hạ thảo 31

1.5.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học và giá trị dược liệu nấm Đông trùng hạ thảo 37

1.5.3 Nghiên cứu về nuôi trồng 38

1.6 Đặc điểm tự nhiên khu vực nghiên cứu 40

1.6.1 Vị trí địa lý 40

1.6.2 Địa hình, địa mạo 41

1.6.3 Địa chất và thổ nhưỡng 42

1.6.4 Khí hậu, thủy văn 43

1.6.5 Thực vật 44

1.6.6 Động vật 45

Chương 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .47

2.1 Nội dung nghiên cứu 47

2.1.1 Thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên 47 2.1.2 Xác định các chỉ số đa dạng các loài nấm Đông trùng hạ thảo 47

2.1.3 Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo 47

2.1.4 Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết trên giá thể nhân tạo 47

2.2 Vật liệu nghiên cứu 48

2.3 Phương pháp nghiên cứu 48

2.3.1 Các bước nghiên cứu 48

2.3.2 Phương pháp điều tra thu mẫu nấm Đông trùng hạ thảo ở Vườn

Quốc gia Hoàng Liên và giám định mẫu thu được 49

2.3.3 Phương pháp xác định các chỉ số đa dạng các loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên 51

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo 54

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 59

2.4 Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo 59

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 60

3.1 Thành phần loài nấm ĐTHT tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên 60

3.2 Đánh giá đa dạng sinh học và phân bố các loài nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên 90

3.2.1 Đa dạng về thành phần loài, tần suất xuất hiện 90

3.2.2 Đa dạng về phân bố 92

3.2.3 Đa dạng về ký chủ 106

3.2.4 Đa dạng về giá trị sử dụng và giá trị dược liệu 107

3.3 Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo 109

3.3.1 Nghiên cứu môi trường thích hợp tạo giống gốc 109

3.3.2 Nghiên cứu nuôi trồng thể quả đệm trên giá thể lỏng 111

3.3.3 Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể rắn 119

3.3.4 Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả đệm trên giá thể nhộng tằm .123

3.4 Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo 127

3.4.1 Hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm I tenuipes trên giá thể lỏng .128

3.4.2 Hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm I tenuipes trên giá thể rắn129 3.4.3 Hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm I tenuipes trên giá thể nhộng

tằm 130

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 133

Kết luận 133

Khuyến nghị 134

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 135

TÀI LIỆU THAM KHẢO 136

Tài liệu tiếng Việt 136

Tài liệu tiếng nước ngoài 142

PHỤ LỤC 150

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC KÝ HIỆU

Potato Dextrose AgarPeptone Yeast Extract GlucoseCarrot extract Sucrose AgarMalt Extract Agar

Vườn Quốc giaKhoảng sai dịXác suất kiểm tra của F

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Số lượng loài và giống của một số bộ Nấm Việt Nam so sánh với

Trung Quốc và Thế giới 11

Bảng 1.2 Thành phần sinh hoá và nguyên tố khoáng trong nấm Đông trùng hạ thảo Isaria tenuipes 24

Bảng 1.3 Thành phần acid amin trong nấm Đông trùng hạ thảo I tenuipes 24

Bảng 1.4 Thành phần vitamin trong nấm Đông trùng hạ thảo I tenuipes 25

Bảng 3.1: Thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo ở Vườn quốc gia Hoàng Liên - Lào Cai 60

Bảng 3.2: Tính đa dạng về thành phần loài và tần xuất xuất hiện của các loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn quốc gia Hoàng Liên 90

Bảng 3.3 Phân bố nấm ĐTHT theo sinh cảnh 92

Bảng 3.4 Phân bố nấm ĐTHT theo đai độ cao 97

Bảng 3.5 Phân bố nấm ĐTHT theo độ tàn che 101

Bảng 3.6 Tổng hợp số lượng nấm ĐTHT phân bố theo thời gian 103

Bảng 3.7 Tổng hợp số lượng, tỷ lệ thành phần Bộ côn trùng ký chủ của các loài nấm ĐTHT thu được tại VQG Hoàng Liên 106

Bảng 3.8 Giá trị sử dụng của các loài nấm ĐTHT thu được tại VQG Hoàng Liên 107

Bảng 3.9 Kết quả sinh trưởng, phát triển của giống nấm gốc trên môi trường dịch thể 110

Bảng 3.10: Kết quả nuôi trồng thể quả đệm nấm I tenuipes trên giá thể lỏng .112

Bảng 3.11: Kết quả nuôi trồng thể quả đệm ở nhiệt độ không khí khác nhau .115

Bảng 3.12: Kết quả nuôi trồng thể quả đệm ở môi trường có pH khác nhau117 Bảng 3.13: Sinh trưởng của hệ sợi nấm ở các tốc độ lắc khác nhau 119

Bảng 3.14 : Kết quả nghiên cứu nuôi trồng nấm I tenuipes trên giá thể rắn121 Bảng 3.15: Kết quả nuôi trồng nấm I tenuipes ở các công thức giá thể nhộng tằm .124

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 17Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 19Hình 1.3 Sơ đồ các kiểu khí hậu ở huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai 44

Hình 3.2 (a) Nấm B bassiana ký sinh trên bọ cánh cứng, (b) Bào tử vô tính nấm B bassiana, (c) Hệ sợi nấm B bassiana trên môi trường PDA 67 Hình 3.3 (a) Nhộng bị nấm Beauveria sp nov ký sinh; (b) Bào tử vô tính;

(c) Thể đệm hình thành trong nuôi cây thuần khiết trên môi trường PDA 70

Hình 3.4 Thể quả đệm C cardinalis 71 Hình 3.5 (a) Thể quả đệm C.militaris, (b) Túi bào tử nấm C.militaris chứa các bào tử đứt đoạn, (c) Hệ sợi nấm C.militaris trong nuôi cấy thuần khiết 73 Hình 3.6 Thể quả đệm C pseudomilitaris 74 Hình 3.7 (a) Thể quả đệm C takaomontana (giai đoạn hữu tính) và I tenuipes (giai đoạn vô tính); (b) Bào tử túi C takaomontana; (c) Bào tử vô tính của I tenuipes; (c) Hệ sợ I tenuipes trên môi trường PDA 75 Hình 3.8 (a)Thể quả đệm nấm I cateniannulatus; (b) Bào tử vô tính nấm

I cateniannulatus 77 Hình 3.9 (a) Thể đệm I tenuipes; (b) Bào tử vô tính (c) Thể đệm hình thành

trong nuôi cấy thuần khiết trên môi trường PDA 78

Hình 3.10 Thể đệm Isaria sp.nov.; (b)Bào tử vô tính; (c) (c) Hệ sợi chủng

Hình 3.15 Thể quả đệm O myrmecophila 86

Hình 3.16 (a) Thể quả đệm O.nutans; (b) Túi bào tử nấm O.nutans chứa các bào tử túi đứt đoạn; (c) Thể quả đệm O.nutans hình thành trong nuôi cấy thuần khiết trên môi trường PDA 88

Hình 3.17 (a) Nấm O oxycephala ký sinh trên ong; (b) Hệ sợi nấm O oxycephala trong nuôi cấy thuần khiết 89

Hình 3.18 (a) Thể quả đệm O sphaecocephala; (b) Túi bào tử O sphaecocephala; (c) Thể quả đệm O sphaecocephala trong nuôi cấy thuần khiết trên môi trường PDA 90

Hình 3.19 A - Giống nấm công thức CT1; B - Giống nấm công thức CT2111 Hình 3.20 Thể quả đệm của nấm I tenuipes từ nguồn giống nấm gốc khác nhau 111

Hình 3.21: Thể quả đệm của nấm I tenuipes được nuôi trên các giá thể lỏng A - Thể quả nấm xuất hiện bào tử; B - Thể quả nấm đang phân hủy 113

Hình 3.22: Thể quả đệm của nấm I tenuipes được nuôi trên giá thể lỏng 114

Hình 3.23: Thể quả đệm khi nuôi ở nhiệt độ không khí khác nhau 116

Hình 3.24: Thể quả đệm khi nuôi ở các môi trường có pH khác nhau 118

Hình 3.25 Giống nấm I tenuipes A: Tốc độ lắc 150 vòng/phút; B: Tốc độ lắc 110 vòng/phút 120

Hình 3.26: Thể quả đệm nuôi trồng trên giá thể rắn 123

Hình 3.27: Nấm được nhiễm bằng phương thức tiêm giống vào nhộng 126

Hình 3.28: Nấm được nhiễm bằng phương thức phun giống vào nhộng 126

Hình 3.29: Nấm I tenuipes được nhiễm bằng phương thức phun giống vào sâu non tuổi 5 126

Hình 3.30 Thể quả đệm tươi (A)và khô (B) nấm I tenuipes 132

Biểu đồ 3.1 Số lượng nấm ĐTHT phân bố theo thời gian 105

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nấm Đông trùng hạ thảo (còn gọi là Đông trùng thảo, Trùng thảohay Hạ thảo Đông trùng) là các loài nấm ký sinh trên sâu non hoặc nhộnghoặc sâu trưởng thành của một số loại côn trùng Sâu non, sâu trưởng thànhcủa một số loài côn trùng nằm dưới đất hoặc ở trên mặt đất bị nấm ký sinh,xâm nhiễm và sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm chocôn trùng chết Mùa đông, giai đoạn này nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp,nấm ký sinh ở dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao

đã hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vàothân sâu Vì mùa đông nấm tồn tại ở dạng hệ sợi trên sâu, mùa hạ mọcthành cây nấm nên có tên là đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo làloài nấm được đánh giá cao về giá trị dược liệu, nhờ có hợp chấtcordycepin trong thành phần hoá học của thể quả nấm Đây là hợp chất cókhả năng ức chế hoạt động của quá trình sinh tổng hợp mới của các tế bàoung thư Tác dụng kìm hãm của các tế bào ung thư vú, ung thư phổi, ung

thư máu cũng được nhiều nhà khoa học như: Yoo et al., (2004) [107]; Ahn

et al., (2000) [48] đã nghiên cứu và phát hiện Theo y học cổ truyền Trung

Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị các chứng rối loạnlipit máu, rối loạn nhịp tim, viêm thận mạn tính, cao huyết áp, ung thưphổi, thiểu năng sinh dục và viêm gan B mạn tính Nấm Đông trùng hạ thảo

đã được Nan et al., (2001) [89] chứng minh có hiệu quả chữa trị bệnh rối

loạn chức năng gan Ngoài ra nấm này còn có tác dụng chống viêm và kìmhãm sự oxy hoá của lipit và lipoprotein Không chỉ vậy loài nấm Đôngtrùng hạ thảo còn được phát hiện có hàm lượng dinh dưỡng cao: giàu cácvitamin A, vitamin B6, vitamin B12, vitamin B3, vitamin B1… và có hàmlượng protein khá cao, nhiều nguyên tố khoáng như Zn, Se, Cu Như vậygiá trị của loài nấm Đông trùng hạ thảo là vô cùng quý giá

Được thiên nhiên ưu đãi về điều kiện tự nhiên cùng với hệ động thựcvật phong phú, Vườn Quốc gia Hoàng Liên còn có nguồn dược liệu vôcùng quý giá như: Tam thất hoang, nấm Linh chi, Ba kích cùng nhiều loàithảo dược quý khác đã góp phần xây dựng Sa Pa trở thành điểm du lịchnghỉ dưỡng, chữa bệnh yêu thích của du khách trong và ngoài nước Tuynhiên những sản vật của địa phương mới chỉ dừng lại ở việc khai thác, thuhái từ rừng, một phần nhỏ do nhân dân nuôi trồng mà chưa có nhiều sảnphẩm khoa học công nghệ cao phục vụ khách du lịch và đóng góp đáng kểcho ngân sách địa phương Bằng các nghiên cứu chuyên đề các nhà khoahọc bước đầu phát hiện Vườn Quốc gia Hoàng Liên có các loài nấm Đông

trùng hạ thảo phân bố tự nhiên, trong đó có loài “Bông tuyết Đông trùng

hạ thảo - Isaria tenuipes” được phát hiện, nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi

trong y học… loài này chứa hàm lượng một số hoạt chất (Adenosine,Cordycepin…) cao và giá trị nó mang lại vô cùng lớn với việc điều trị ungthư, tiểu đường và một số bệnh lý khác Tuy nhiên khu hệ nấm ở VườnQuốc gia Hoàng Liên còn chưa có nhiều nghiên cứu Những hiểu biết về đadạng thành phần loài, đặc điểm sinh học và giá trị sử dụng còn đang rất hạnchế

Với mong muốn được đóng góp vào việc xây dựng danh mục nguồngen các loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, bảotồn đa dạng sinh học và đề xuất biện pháp sử dụng bền vững, nhân nuôinguồn dược liệu quý bằng phương pháp nhân tạo Mở ra một hướng đi mớitrong việc phát triển kinh tế, xã hội của tỉnh Lào Cai, tạo sản phẩm du lịchđặc trưng mang thương hiệu Đông trùng hạ thảo Sa Pa Xuất phát từ những

lý do trên, đề tài: “Điều tra thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo tại

Vườn Quốc gia Hoàng Liên, nghiên cứu nuôi trồng loài Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) đặt ra là rất cần thiết, có ý nghĩa cả về lý

luận và thực tiễn

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được tính đa dạng và đặc điểm sinh học của các loài nấm

ĐTHT thu được tại VQG Hoàng Liên

- Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng loài nấm ĐTHT bông tuyết

(Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo.

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

Giới hạn đối tượng nghiên cứu

- Nhóm Nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên

- Nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes).

Giới hạn địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu được giới hạn trong phạm vi VQG HoàngLiên, tỉnh Lào Cai

- Phân lập và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo tại phòng thí

nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng - Viện Khoa học Lâmnghiệp Việt Nam (phường Đức Thắng, quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội)

4 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và đóng góp mới của luận án

4.1 Ý nghĩa khoa học

Đóng góp các dữ liệu khoa học về thành phần loài, tính đa dạng và

đặc điểm sinh học của nhóm nấm Đông trùng hạ thảo; góp phần xây dựng

luận cứ khoa học cho việc nuôi trồng thành công thể quả đệm loài nấm

Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo.

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu của luận án xác định được thành phần loài

nhóm nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai.

- Xác định được cơ sở khoa học và xây dựng hướng dẫn kỹ thuật

nuôi trồng thành công loài nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria

tenuipes) trên giá thể nhân tạo.

4.3 Những đóng góp mới của luận án

- Lần đầu tiên xác định được danh mục gồm 18 loài thuộc 3 họ

Clavicipitaceae, Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae tại VQG Hoàng Liên, trong đó ghi nhận 2 mẫu nấm mới là Beaveria sp và Isaria sp Mô tả

chi tiết đặc điểm hình dạng, sinh thái và các chỉ số đa dạng sinh học củacác loài nấm thu thập được

- Nghiên cứu nuôi trồng thành công thể quả đệm trên giá thể nhântạo: giá thể rắn, giá thể lỏng và trên nhộng tằm Nhiễm nấm vào sâu nonnhộng tằm ở tuổi 5 (trước khi hóa nhộng) cho kết quả tốt nhất

5 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

- Đề tài tiến hành điều tra thực địa từ năm 2015 đến năm 2017, mỗinăm điều tra làm 4 đợt, gồm các tháng 4, 6, 8 và tháng 10

- Nghiên cứu về giám định nấm Đông trùng hạ thảo bằng kỹ thuậtADN; phân lập, xây dựng nguồn gen các loài nấm Đông trùng hạ thảo;

Nghiên cứu nuôi trồng thể quả loài Isaria tenuipes trên giá thể nhân tạo tại

Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng - Viện Khoa học Lâm nghiệp ViệtNam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Hệ thống của giới Nấm

Quan điểm nghiên cứu của các nhà Nấm học từ trước đến nay, Nấm

(Fungi) là một nhóm sinh vật có nhân chính thức, đa nguyên, bao gồm Protozoa Fungi, Chromista Fungi và Eufungi (Nấm chính thức)

(Takhtajan, 1973 [31]; Trịnh Tam Kiệt, 1980 [12]) Những năm trở lại đây

hệ thống của một số nhóm nấm đã có những thay đổi, cụ thể: Ở Nấm nang

(Ascomycota) việc phân chia các bậc taxon thấp hơn như lớp, lớp phụ.

Nhóm bộ hầu như ít có sức thuyết phục, mà được chia trực tiếp thành 46 bộ

(Kikuchi et al., 2004) [73] Đối với nhóm Nấm bất toàn (Fungi imperfecti, Deuteromyces) không được thừa nhận về mặt hệ thống tự nhiên, vì vậy taxon cơ bản là chi (genus) được sử dụng để sắp xếp các nhóm nấm (Bùi

Xuân Đồng, 1977 [4]; Trịnh Tam Kiệt, 1980 [14]; Trịnh Tam Kiệt, 2014[15])

Thời cổ đại, thế giới sinh vật được chia ra thành Động vật và Thựcvật bởi Aristot (384-322 trước Công nguyên) Sau này trong hệ thống phânchia của mình Carl Von Linne (1707-1778) gọi là giới thực vật

(Vegetabilia) và giới động vật (Animalia) Trong khi một số nhóm sinh vật

bậc thấp như: vi khuẩn, virut, nấm được xếp vào giới thực vật, dù cơ sởkhoa học là chưa đầy đủ Vì vậy, Haeckel (1886) đã đề nghị tách nhóm

Protista ra khỏi hai giới Động vật và Thực vật (Trịnh Tam Kiệt, 1980)

[14]

Đến giữa thế kỷ 20, các nhà khoa học đã chia thế giới hữu sinh

thành 4 giới (Monera, Protoctista, Pliantae và Animalia) (Copeland, 1956) [56] Năm 1968, Magulis đã đề xướng học thuyết phát sinh, cộng sinh Đến năm 1969, Whittaker đã đưa ra hệ thống 5 giới (Monera, Protista, Plantae, Fungi và Animalia) (R H Whittaker, 1969) [104].

Nhưng chỉ 4 năm sau các nhà nấm học lại gộp thành 4 giới (Mychota = Monera, Animalia, Mycetalia = Fungi, Vegetabila = Plantae)

(Takhtajan, 1973) [31] Các hệ thống này có ưu điểm là khi phân chiathế giới sinh vật ra làm nhiều giới thì đã nêu lên được sự khác nhau cănbản nhất về bản chất của chúng

Trong tác phẩm “Systema mycologicum”, cha đẻ của hệ thống

Nấm đã tách Nấm thành một giới riêng là điều hợp lý (Elias Fries,

1794-1878) [61] Giới nấm (Mycetoidem Fries) gồm những sinh vật có nhân thực, có màng rắn chắc được tạo thành từ kitin, xenluloza, hay không

có màng, dinh dưỡng chủ yếu bằng kiểu hấp thụ, một số ít nuốt thức ăn;thường sống bám và sinh trưởng không có giới hạn, sinh sản và phát tánbằng bào tử Đặc biệt, những kết quả nghiên cứu mới như: có bộ máyhấp thụ ánh sáng mặc dù không đi kèm với sự tổng hợp hydratcacbon, sựhình thành các sản phẩm trao đổi chất gần với động vật, sự tồn tại nhiềutrung tâm điều khiển tính thấm của màng, sự phát triển cá thể trải quanhiều pha sợi nấm, đã được nhiều tác giả ủng hộ

Mặc dù việc phân chia các nhóm Nấm đã được hoàn chỉnh dần theolịch sử phát triển của Nấm học nhưng vẫn còn gặp nhiều khó khăn TheoLinne, nấm chỉ được chia thành 10 chi với 86 loài (Trịnh Tam Kiệt, 1980)[14] Sau này, chúng ở bậc taxon cao hơn Sau đó, Elias Fries chia nấm

thành 4 lớp nguyên thuỷ Hymenomycetes, Gasteromycetes, Hyphomycetes

và Coniomycetes, trong đó Hymenomycetes, theo ông bao gồm cả Ascomycetes có lớp sinh sản (hymenium) Hệ thống của Elias Fries, dù

được các tác giả sau này hoàn chỉnh, nhưng về cơ bản, hệ thống này vẫnmang tính chất nhân tạo (Schaffer, 1975) [98]

Nấm nhầy được De Bary (1884) xếp sang giới Động vật với tên

Mycetozoa và nhận được sự đồng thuận của nhiều nhà nghiên cứu Tuy

nhiên, phần đông các nhà Thực vật lại xếp chúng trong giới Thực vật với

tên khoa học Myxomycetes Link (1883) và tách biệt với Nấm Quan điểm

này gần đây còn được nhiều nhà Nấm học thừa nhận và họ tách Nấm nhầy

ra khỏi hệ thống của mình (Bessey, 1950 [55,]; Kreisel, 1969 [80];Schaffer, 1975 [98] ) Sau này, những nghiên cứu của Martin (1960-1961)

đã làm rõ được bản chất nấm của Myxomycetes và được một số nhà Nấm

học thừa nhận trong hệ thống của mình như (Alexopoulos, 1966) [49] Đặcđiểm chung của các ngành nấm nhầy là đều có cơ thể dinh dưỡng dạng thể

nhầy (plasmodium) và hình thành bào tử có màng xenluloza Tuy nhiên, chúng có sự khác nhau rất lớn, cụ thể: ở Myxomycetes có thể nhầy thực (Eupiasmodium) thì ở Acrasiomycetes có thể nhầy giả do các tế bào nhầy riêng rẽ tập hợp lại thành (Pseudoplasmodium) và ở Labyrinthulomycetes

là thể nhầy mạng lưới (Filoplasmodium) Riêng Nấm nhầy nội ký sinh

Plasmodiophoromycetes trước kia được để trong Myxomycetes vì có cơ

thể trần và dạng chuyển động là amíp có roi, điều mà một vài tác giả hiệnđại còn chấp nhận

Thể nhầy của nấm nhầy có hai giai đoạn là thể nhầy 1n và thể nhầy 2n,màng của bào tử lại có thành phần chủ yếu là kitin và hàng loạt đặc điểm

riêng biệt khác nên phần lớn các tác giả đã xếp sang Phycomycetes sensu

lato (Alexopoulos, 1966) [49] Nhiều tác giả cho rằng đây là một nhómnấm hoàn toàn tách biệt với các nhóm còn lại

Đối với nấm thật (Eumycetes), được coi là một ngành của giới Thực vật Plantae sensu lato và dựa vào cấu trúc cơ thể được chia thành các lớp

Archimycetes, Phycomycetes (gồm những nấm sợi có cấu trúc dạng hợp

bào), Ascomycetes, Basidiomycetes và Deuteromycetes dạng sợi đa bào có

vách ngăn ngang hay đơn bào có dạng nấm men Một số khác gộp

Archimycetes vào Phycomycetes (Takhtajan, 1973 [31]; Trịnh Tam Kiệt,

1980 [14]) Những nghiên cứu sau này về nhóm Mastigomycetes hay

Mastigomycotina gồm những nấm không những khác nhau về kiểu đính

mà còn về số lượng và cấu trúc của roi Oomycetes và

Hyphochytridiomycetes là những nấm có những đặc điểm hết sức khác biệt

với Chytridiomycetes và toàn bộ các nhóm nấm khác Ở Oomycetes, màng

tế bào có cấu trúc từ xenluloza, giai đoạn chuyển động có hai roi, trong đó

một roi phủ lông, còn ở Hyphochytridiomycetes lại có màng chứa cả

xenluloza và kitin, giai đoạn chuyển động chỉ có một roi phủ lông đính ởphía trước Chúng khác biệt với những cơ thể có nhân thực còn lại là có cấutrúc ti thể dạng ống, về khối lượng ribosom ARN, về hệ men thủy phâncũng như về phản ứng đối với thuốc diệt nấm Chính vì vậy, nhiều nhà

Nấm học đã tách Oomycetes thành nhóm nấm riêng biệt, thậm chí không

thừa nhận bản chất nấm của chúng, và tách thành một lớp của Tảo vàng

(Kreisel, 1964) [80] Đối với Hyphochytridiomycetes mặc dù mới được tách ra khỏi Chytridiomycetes nhưng chúng hoàn toàn tách biệt với

Oomycetes cũng như các nhóm nấm khác và cần được làm sáng tỏ hơn nữa

về mặt di truyền Nấm lông Trichomycetes từ lâu được coi như nhóm nấm

không rõ về vị trí phân loại (Alexonpoulos, 1966) [49] đã được một số tác

giả xếp vào Zygomycetes vì cùng có kiểu sinh sản tiếp hợp giao (Zygogamie) Chúng có cấu trúc cơ thể khác biệt, có màng tế bào bằng

galactosamin, galactoza trùng hợp và hàng loạt đặc điểm riêng biệt khác

với Zygomycetes cũng như các nhóm nấm khác và dường như có quan hệ với Acrasiomycetes Những nấm còn lại hầu hết có màng tế bào bằng kitin

được phần lớn các nhà Nấm học gọi là Nấm chính thức (Eufungi); chúnggồm các nấm có giai đoạn chuyển động bằng một roi không phủ lông dính

ở phía sau ở Chytridiomcetes và các nấm hoàn toàn mất giai đoạn chuyển động như Zygomycetes, Endomycetes, Ascomycetes và Basidiomycetes Trong các nhóm nấm này, vị trí của Endomycetes, Taphrinales trong

Hemiascomycetes sensu lato và Uredinales cũng như một số nấm có dạng

nấm men của Basidiomycetes đang còn có nhiều ý kiến khác nhau; một số nhà Nấm học khác xem chúng như là những nhóm thuộc Ascomycetes và

Basidiomycetes theo quan điểm cổ truyền (Bessey., E A 1950) [59] Về

sau, một số tác giả muốn tách chúng thành một nhóm riêng biệt, tương

đương với Ascomycetes và Basidiomycetes là Endomycetes và gồm các bộ

Endomycetes, Sporobolomycetales, TorulopsidaleSy Taphrinales,

Exobasidiales, Ustilaginnales (Takhtajan, 1973) [31] Rõ ràng các nấm

men chính thức Endomycetes khác với các nấm thật còn lại ở cấu trúc

màng tế bào từ manan và glucan, ở dạng sống, ở phương thức sinh sản vôtính (nảy chồi hay chia đôi cơ thể) và đặc biệt ở sinh sản hữu tính, không

có cơ quan sinh sản cũng như sợi sinh nang mà chỉ có sự giao phối hai tếbào, hai sợi dinh dưỡng hay tự giao và số lượng bào tử hình thành hầu như

bất định Các nấm còn lại của Endomycetes lại có màng kitin-manan, có hệ sợi hai nhân (dicaryon) và một số hình thành lớp sinh sản (hymenium) do các nang (ascus) hay đảm (basidie) xếp dạng bờ rào hình thành Hơn nữa,

những kết quả nghiên cứu được trình bày trong Hội nghị Thực vật học lần

thứ 12 (1975) về hình thái, tế bào và di truyền học của Ustilaginales cũng

có quan điểm về vị trí của chúng bên cạnh Uredinales trong

Basidiomycetes, từ chối việc xếp chúng vào Endomycetes ở trên hay nâng

lên thành một ngành mới Ustomycota (Moore, 1972) [87] Dù sao, vị trí

của những nhóm nấm này cũng cần được xem xét kỹ lưỡng hơn dưới góc

độ của những nghiên cứu hiện đại

Nấm bất toàn (Fungi imperfecti) bao gồm những nấm đơn bào

dạng nấm men hoặc dạng sợi có vách ngăn chính thức nhưng chưa tìm thấy sinh sản hữu tính hay cả sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính Từ trước đến nay, người ta vẫn sử dụng hệ thống phân loại của Saccardo

để xếp chúng thành dạng lớp Deutermycetes hay Fungi imperfecti gồm

các dạng bộ sau (Saccardo, 1880-1886) [94]:

- Sphaeropsidales có cuống conidie tập hợp thành thể gối.

- Molanconiales có cuống conidie tập hợp thành thế gối.

- Moniiales hay Hyphales có cuống conidie đính đơn độc trên sợi nấm

hay tập hợp thành bó

- Agonomycetaies hay Mycetaiia sterilia chỉ có sợi nấm.

Hệ thống này đã được nhiều tác giả khác bổ sung và có ý nghĩa lớntrong định loại nhóm nấm này Nhưng một chi nấm bất toàn có thể tương

đương với một chi nấm nang hoặc nấm đảm (như Aspergillus Michili và Eurolitum Link) hay lại tương ứng với một số tên chi nấm nang hoặc nấm đảm (như Septorria và Mycossphaerella Johans, Leptosphaeria Cé et De

Not.) Ngược lại, một chi nấm nang hay nấm đảm có dạng bào tử tương

ứng với một số chi nấm bất toàn (như Mycossphaerella Johans có dạng bảo

từ của Septoria Sacc.; Ascochyla Lib.; Cercospora Fries; Cercosporella Sacc.; Ramularia (Ưng Cds.) Bên cạnh đó, chưa kể đến một loài nấm

nang, nấm đảm hay nấm bất toàn có thể có nhiều loại bào tử vô tính trongđời sống của mình

Tuy nhiên, một loài nấm bất toàn trong nuôi cấy dịch thể hình thành

bào tử vô tính trên sợi nấm và phải xếp vào bộ Hyphales trong trường hợp này lại tạo nên thể gối của Melanconiales hay thể giỏ của Sphaerpsidaies

khi nuôi cấy trong những điều kiện dinh dưỡng thuận lợi hơn (Takhtajan,

1973 [31]; Kiet., 1998 [80]) Vì vậy, một mặt vẫn nên sử dụng các hệ thống

vốn có về Fungi imperfecti để định loại chúng, mặt khác tiếp tục nghiên

cứu để sắp xếp nhóm nấm này về đúng với hệ thống tự nhiên

Việt Nam là một trong những nước nằm trong khu vực giàu có vềgiới động thực vật và giới nấm, tuy nhiên còn chưa được nghiên cứu mộtcách đầy đủ so với động, thực vật bậc cao Các công bố, xuất bản chuyênkhảo về nấm còn hạn chế Tính đến năm 2013, có khoảng 3.000 loài nấm

đã được ghi nhận cho lãnh thổ Việt Nam, trong số đó có 1.821 taxa nấm

lớn (Macro Fungi) thuộc 458 chi, 140 họ, 49 bộ của các ngành nấm

Myxomycota, Glomeromycota, Ascomycota và Basidiomycota đã được ghinhận Nếu so sánh một số nhóm nấm lớn đã được công bố tại Việt Nam vớinấm lớm của Trung Quốc và thế giới được nêu ra tại bảng 1.1 (Trịnh Tam

Kiệt, 2014) [15].

Bảng 1.1 Số lượng loài và giống của một số bộ Nấm Việt Nam so sánh với

Trung Quốc và Thế giới

Taxa

Số lượng loài/số lượng giống ở Việt Nam

Số lượng loài/số lượng giống ở Trung Quốc

Số lượng loài/số lượng giống trên thế giới

Chi Nectria (Fr.) Fr., 1849 (9 loài)

Họ Bionectriaceae Samuels & Rossman 1999

Chi Bionectria Speg 1919 (2 loài)

Họ Ophiocordycipitaceae G.H Sung, J.M Sung,

Hywel-Jones & Spatafora,2007

Chi Ophiocordyceps Petch 1931 (13 loài)

Họ Cordycipitaceae Kreisel ex G.H Sung, J.M Sung,

Hywel-Jones & spatafora 2007

Chi Cordyceps (Fr.) Link, 1833 (9 loài)

Họ Clavicipitaceae O.E Erikss 1982

Chi Metacordyceps G.H Sung, J.M Sung,

Hywel-Jones

& Spatafora 2007 (2 loài)

Chi Elaphocordyceps G.H Sung & Spatafora 2007 (1 loài) Chi Hypocrella Sacc (1878) (9 loài)

Chi Nigrocornus Ryley Langdon 2003 (1 loài) Chi Epichloe (Fr.) Tul &c Tui., 1865 (2 loài)

Anamorphe Cordyceps:

Chi Akanthomyces Lebert (4858) (2 loài) Chi Aschersonia Mont (1848) (12 loài) Chi Isaria Pers 1974 (7 loài)

Chi Metarhium Sorokin 1879 (2 loài) Chi Gibellula Cavara 1894 (2 loài) Chi Beauveria Vuill 1912 (3 loài) Chi Conoideocrella D Johnson, G.H Sung, Hywel-

Jones & Spatafora 2009 (2 loài)

Chi Hirsutella Pat 1892 (1 loài) Chi Hymenostilbe Petch 1931 (1 loài)

Chi Nomuraea Maubl 1903 (1 loài) Chi Hypomyces (Fr.) Tul & c Tul 1860 (3 loài) Chi Circinotrichum Nees., 1861 (1 loài)

Chi Moelleriella Bres (2008) (3 loài) Chi Torrubiella Boud (1885) (2 loài) Chi Paecilomyces Bainier 1907 (1 loài) Chi Purpureocillium Luangsa-ard, Hywel-

Jones,Houbraken & Samson 2011 (1 loài)

1.2 Hình thái và cấu trúc sợi nấm

1.2.1 Sợ nấm

Hình ống phân nhánh, chiều dài sinh trưởng vô hạn nhưng đườngkính thường trong phạm vi 1-30µm, bên trong chứa nguyên sinh chất làhình dạng đặc trưng của sợi nấm (hypha) Phần lớn sợi nấm có dạng trongsuốt, ở một số nấm sợi nấm mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ

Đầu sợi có hình viên trụ, còn gọi là vùng kéo dài (extension zone).Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng có thành tế bào phát triểnnhanh chóng Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh trưởngthêm được nữa Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào.Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kế cấu gấp nếp hay xoặnlại, người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể(lomasome)

Thành tế bào (cell wall) của nấm có thành phần hóa học khác nhau,đây là một tiêu chí quan trọng khi định loại nấm Màng nguyên sinh chấtthì thành phần ít thay đổi ở các loài nấm sợi, có khác nhau với dạng nấmmen Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗthủng, trong nhân có hạch nhân (nucleolus) Trong tế bào nấm còn có các

cơ quan giống như trong tế bào các sinh vật có nhân thực khác như ty thể,mạng nội chất, dịch bào hay không bào, thể ribô, bào nang

Phần ngọn có thể tách với phần bên dưới bằng một không bào, lúcđầu nhỏ nhưng về sau kết hợp lại với nhau để lớn dần, tạo nên áp lực dồn tếbào chất về phía đỉnh ngọn sợi nấm Sợi nấm không ngừng phân nhánh,vào giai đoạn cuối của sự phát triển khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng giữacác khuẩn ty với nhau, làm cho cả khuẩn lạc là một hệ thống liên thông mậtthiết với nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ

hệ sợi nấm Hình thái, kích thước màu sắc, bề mặt của khuẩn lạc…có ýnghĩa nhất định trong việc định tên nấm

1.2.3 Quả thể đệm

Thể quả đệm (Stroma/stromata): Là các thể đệm giống như sợi nấm,các khối sợi nhỏ tạo thành thể quả đệm, chúng được hình thành bởi nhiềusợi nấm Các thể mang bảo tử (thể quả) được hình thành trên thể quả đệm

(Kirk at al., 2001) [75].

1.2.4 Nang nấm

Nang là một khoang kín mà bào tử hình thành bên trong nó Nang có

thể được tạo thành từ một tế bào duy nhất hoặc có thể là đa bào Nang bào

tử có thể sản sinh ra bào tử thông qua nguyên phân, nhưng đối với nhiều loại nấm, nang bào tử là địa điểm diễn ra giảm phân và sản sinh ra các bào

tử đơn bội khác biệt về mặt di truyền

Ở nấm lớp sinh sản thường nằm ở đáy nang hay trên bề mặt các nangquả Chúng thường sắp xếp thành dạng bờ rào, được tạo thành từ nang, sợinang hoặc sợi bên Sợi nang có nguồn gốc từ sợi đơn bội 1n, thường nằmxen kẽ giữa các nang, thường có kích thước nhỏ hơn nang Sợi bên thườngthấy ở phần cổ của một số nang quả hình chai, thường ngắn hơn nhiều so

với sợi nang và chỉ làm nhiệm vụ bảo vệ (Trịnh Tam Kiệt., 2014) [15].

1.2.5 Bào tử nấm

Giới Nấm (Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn dị

dưỡng có thành tế bào bằng kitin Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các

sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium), một

số nấm khác lại phát triển dưới dạng đơn bào Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) của nấm thường là qua bào tử, được tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt hay quả thể Một số loài mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc biệt và nhân lên qua hình thức sinh sản sinh dưỡng.

Bào từ hữu tính: Bao gồm bào tử nang được hình thành trong nang

và bào tử đảm được hình thành trên đảm với những phần đế trên đó đảmbào tử đính, còn được gọi là tiểu bính Bào tử hữu tính rất khác nhau vềkích thước, hình dạng, màu sắc, lỗ nảy mầm Ở phần lớn nấm bào tử hayđảm bào tử của chúng đơn bào nhưng ở một số nấm khác nang hay đảmbào tử hình thành vách ngăn và trở nên đa bào Bào tử nang hay bào tử đảmcủa phần lớn nấm chỉ có một lớp màng, tuy nhiên có loại có cấu trúc bào tửhai lớp màng Ở một sốnấm bào tử hữu tính có thể nảy mầm cho bào tử thứsinh giống như bào tử ban đầu về hình dạng, kích thước, cũng có khi trởthành các bào tử bụi sau khi nảy mầm

Bào tử vô tính: Một số lượng lớn nấm hình thành các dạng bào tử vôtính trên nang quả hay thể quả Thường gặp chúng ở dạng bào tử bụi,chúng có thể hình thành trên mặt mũ hay trên lớp sinh sản của thể sinh sản

Một số loài hình thành bào tử áo, có màng dày, kích thước lớn (Trịnh Tam

Nấm ký sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm (Evans., 1988) [59]:

- Ký sinh trong tức là nấm ký sinh trong các nội quan, khoang cơ thểcủa côn trùng ký chủ

- Ký sinh ngoài tức là nấm phát triển trên lớp cuticun vỏ cơ thể củacôn trùng và gây nên bệnh hại cho ký chủ

- Nấm mọc trên côn trùng tức là nấm đã được trực tiếp hoặc gián tiếpchứng minh chúng ký sinh trên côn trùng

- Cộng sinh có nghĩa là cả nấm và côn trùng cùng mang lại lợi íchcho nhau trong mối quan hệ cùng chung sống.

Nấm còn được chia ra thành nhóm ký sinh sơ cấp (Primarypathogen) và nhóm ký sinh thứ cấp (Secondary pathogen) Nấm ký sinh sơcấp thường nhiễm vào ký chủ côn trùng khoẻ mạnh, gây bệnh và sau đógiết chết côn trùng Trong khi đó, nấm ký sinh thứ cấp chỉ có thể ký sinhtrên những côn trùng yếu hoặc bị thương Các mầm bệnh ký sinh trên côntrùng trưởng thành hoặc côn trùng bị bệnh được gọi là ký sinh cơ hội hoặc

ký sinh không chuyên tính, loại ký sinh này có thể nhiễm vào ký chủ thôngqua sự xâm nhập qua lớp cuticun vỏ cơ thể côn trùng Như vậy, nấm kýsinh côn trùng được dùng để mô tả hiện tượng nấm ký sinh trên hoặc trong

ký chủ côn trùng

1.3.2 Chu trình sống và lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng quacon đường hô hấp, tiêu hóa hoặc qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn làqua lớp vỏ cuticun của chúng Tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấmvào bề mặt cơ thể vật chủ Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, khi

đủ điều kiện ẩm độ bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thểcôn trùng qua lớp vỏ cuticun Khi nấm xâm nhiễm vào bên trong, nấm mọckhắp cơ thể của côn trùng và sản xuất các độc tố trong đó để tăng tốc độgiết chết côn trùng hoặc ngăn chặn sự cạnh tranh của các loài vi sinh vậtkhác Chu trình sống và lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng được minhhọa tại hình 1.1

Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính:

1 - Giai đoạn xâm nhập:

Giai đoạn này được tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoànthành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khimọc mầm phát sinh mầm bệnh, nó giải phóng các enzyme ngoại bào tươngứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủylớp vỏ này như Protease, chitinase, aminopept, carboxypeptidase A, esterase,

N - axetylglucosaminidase, cenlulase Các enzyme này được tạo ra một cáchnhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậm chíngay cả trong một loài

Enzyme protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, thamgia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính làprotein) Lipase, cenlulase và các enzyme khác cũng là những enzyme cóvai trò không kém phần quan trọng Nhưng quan trọng nhất là enzymephân hủy protein (protease) và enzyme phân huỷ kitin (chitinase) củacôn trùng Hai enzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côntrùng của nấm ký sinh côn trùng (Tạ Kim Chỉnh, 1994) [2]

2 - Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng:

Giai đoạn này được tính từ khi nấm hoàn thành quá trình xâmnhiễm vào cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết Đây là giai đoạnsống ký sinh của nấm Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp tục phát

triển, hình thành rất nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợi nấm được hình thànhtrong cơ thể, nó phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bàomáu và làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn bộ các bộ phận nội quan bịxâm nhập Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp.Hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tácnhân kích thích bên ngoài Kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soáthoạt động sống và dẫn đến chết (Phạm Văn Lầm, 2000) [18].

3 - Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết

Đây là giai đoạn sống hoại sinh của nấm ký sinh Xác côn trùng chết

là nguồn dinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật Thông thường, các bộphận bên trong cơ thể côn trùng sẽ bị phân hủy bởi vi khuẩn hoại sinh Trên

bề mặt ngoài của cơ thể côn trùng, các nấm hoại sinh như Aspergillus spp., Penicillium spp và Fusarium spp định cư ở lớp biểu bì và cạnh tranh với

vi khuẩn ở bên trong cơ thể côn trùng Do nấm côn trùng có khả năng sảnxuất ra các chất có hoạt tính như thuốc kháng sinh ức chế hoạt động của vikhuẩn và nấm hoại sinh khác nên chúng có thể cạnh tranh với các sinh vậtnày để tồn tại và phát triển, làm cho xác vật chủ không bị phân hủy

Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bêntrong cơ thể côn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử

Ở giai đoạn xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng, nấm sử dụngcác enzyme ngoại bào để phân hủy lớp vỏ cuticun Khác với giai đoạn này,

ở giai đoạn nấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộtác động cơ học Sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bềmặt cơ thể vật chủ Nhiều côn trùng bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợinấm và các bào tử, vì vậy mà rất khó hoặc không thể xác định các vật chủ

Đặc điểm cơ thể côn trùng bị chết do nấm côn trùng không bao giờ

bị thối, nhũn mà thường vẫn giữ nguyên hình dạng như khi còn sống Toàn

bộ bên trong cơ thể sâu chết chứa đầy sợi nấm Sau đó, các sợi nấm nàymọc ra ngoài qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể sâu

Đây là đặc điểm rất đặc trưng để phân biệt sâu chết do nấm côn trùng vớisâu chết do virus, vi khuẩn gây bệnh.

Thomas và Read (2007) [102] đã đưa ra sơ đồ xâm nhiễm của nấm

ký sinh côn trùng vào cơ thể vật chủ (hình 1.2)

Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Chu kỳ phát triển của nấm ký sinh côn trùng, như nấm Beaueria bassiana và Metarhizium anisopliae gồm các giai đoạn: Bào tử đính tiếp

xúc với tầng cuticun của lớp vỏ vật chủ Bào tử nảy mầm và sinh sản hìnhthành vòi và giác bám (cấu trúc cơ quan xâm nhập)

Sự xâm nhập của bào tử đính là sự tổ hợp của sức ép cơ học và sựtác động của enzyme phân giải tầng cuticun Quá trình sinh trưởng bêntrong xoang máu cơ thể vật chủ và sự sinh sản của bào tử đính làm vật chủchết Tầng cuticun của vỏ cơ thể vật chủ là tầng chống chịu đầu tiên trongviệc bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm của nấm và nó có vai trò quyết địnhtính chuyên hóa đặc hiệu của nấm Nếu nấm phá vỡ được tầng cuticun thì

sự xâm nhiễm thành công, sau đó phụ thuộc vào khả năng chiến thắng đượcphản ứng miễn dịch bẩm sinh ở côn trùng của nấm

Nấm ký sinh thường để lại những dấu hiệu trên cơ thể vật chủ haylàm cho tập tính sống của chúng bị thay đổi Những cá thể sâu hại bị nhiễmnấm thường có các vệt chấm đen xuất hiện trên bề mặt, có thể tại nơi bào tử

nấm bám vào và mọc mầm xâm nhiễm vào bên trong cơ thể vật chủ Nơi

xâm nhập của nấm Beauveria bassiana thường có vệt chấm đen hình dạng

bất định Khi bị bệnh do nấm, sâu hại ngừng hoạt động khoảng 2 đến 3ngày trước thời điểm phát triển hoàn toàn của nấm ở trong cơ thể vật chủ

Nếu bị bệnh do nấm Beauveria thì sâu hại sẽ ngừng hoạt động khoảng 7

ngày trước khi chết Những cá thể sâu hại bị nhiễm bệnh nấm côn trùngthường có màu hồng nhạt Một số loài nấm có thể làm cho sâu bệnh trở nên

có màu vàng nhạt, xanh lá cây hoặc nâu Cơ thể sâu bị bệnh trở nên hóa

cứng Một số loài thuộc chi Cordyceps ký sinh có thể ảnh hưởng đến hành

vi của vật chủ sâu bọ Cordyceps unilateralis gây bệnh trên kiến và khiến

chúng leo lên cây rồi bám ở đó trước khi chết, đảm bảo phát tán tối đa bào

tử từ thể quả mọc ra ngoài cơ thể côn trùng đã chết (Phạm Văn Lầm, 2000)[18]

1 4 Tình hình nghiên cứu về nhóm nấm Đông trùng hạ thảo trên thế giới 1.4.1 Nghiên cứu về phân loại, thành phần loài nhóm nấm Đông trùng

hạ thảo

Nhóm nấm Đông trùng hạ thảo là các loài nấm thuộc lớp phụ nấmtúi Hypocreomycetidae, bộ Hypocreales gồm các họ Hyporeaceae,Nectraceace, Bionectriaceae, Cordycipitaceae và Clavicipitaceae

Ghi nhận đầu tiên về nấm Đông trùng hạ thảo được thực hiện tạiTrung Quốc vào năm 620 sau Công nguyên tức Triều đại nhà Tạng (năm

618 - 907 sau Công nguyên) Tiếp sau đó có nhiều công trình được xuấtbản với nội dung về loài nấm Đông trùng hạ thảo này của các học giả xứTây Tạng từ thế kỷ 15 đến thế kỷ thứ 18, trong đó có công trình đầu tiênđược cho là có cơ sở khoa học tin cậy nhất mô tả về nấm Đông trùng hạthảo của Wu-Yiluo vào năm 1757, trong cuốn sách Dược điển, dưới Triềuđại Qing Theo sau các học giả xứ Tây Tạng, việc phát hiện ra giá trị củaĐông trùng hạ thảo thuộc về những người dân sinh sông trên núi Hymalaya

ở Tây Tạng cũ và Nepal, trong quá trình chăn nuôi họ quan sát thấy rằngnhững chú bò gặm cỏ bao gồm cả cây nấm này đã trở nên cuồng nhiệt, bòđực luôn tìm và theo sát bò cái.

Đối với các nước phương Tây, nấm Đông trùng hạ thảo cũng đượcbiết đến từ những thập niên đầu thế kỷ thứ 18 Xuất bản đầu tiên về loàinấm này do một linh mục người Pháp có tên là Perennin Jean Baptiste duHalde kể về những điều mà ông chứng kiến một vị thuốc thần bí chữa bệnhcho các vua, quan thuộc vương triều của Trung Quốc Những bức minh họacủa ông đã lôi cuốn sự quan tâm về khoa học và đã lóe lên một quan niệmmới là sử dụng nấm Đông trùng hạ thảo trong phòng trừ sâu hại Cho đếnnăm 1843, Đức cha Berkeley đã xuất bản kết quả nghiên cứu của mình vềnấm Đông trùng hạ thảo tại tạp chí Y học New York và đặt tên nấm là

Sphaeria sinensis Đến năm 1878, tên này mới được gọi là Cordyceps sinensis Pier Andrea Saccardo (1878) [94] Tên này được kéo dài đến năm

2007, khi sử dụng phương pháp sinh học phân tử để sửa đổi phân loại của

hai họ Cordycipitaceae và Clavicipitaceae kết quả là tạo ra tên gọi cho một

họ mới là Ophiocordycipitaceae và việc chuyển một số loài Cordyceps sang chi Ophiocodyceps (Sung et al., 2007) [98].

Nhóm nấm ĐTHT có giá trị dược liệu được xác định khoảng 700loài Dựa trên đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm về cấu trúc phân tử,các loài nấm trên được xếp trong 162 đơn vị phân loại, bao gồm các chi

chủ yếu là: Cordyceps, Elaphocordyceps, Metacordyceps và Ophiocordyceps thuộc 2 họ Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae (Sung et al., 2007) [101].

Chi Isaria bao gồm các loài nấm ký sinh côn trùng phân bố khá rộng

và thường gặp, dễ dàng thu thập Isaria là giai đoạn sinh sản vô tính (giai đoạn hình thành bào tử đính) của chi Cordyceps Các nghiên cứu trước đây

đã xem xét Isaria farinose và Paecilomyces variotii là những loài thuộc chi Isaria Pers ex Fr do chúng có những đặc điểm tương tự nhau trong cấu

trúc cuống sinh bào tử nên đã đề xuất Isaria nên được sử dụng cho tất cả các loài Paecilomyces Dựa trên sự phân nhánh của cuống bào tử đính, thể bình, cấu trúc thể bình và bào tử, Samson đã chia chi Paecilomyces thành hai phần là Paecilomyces sect Paecilomyces và Paecilomyces sect Isariodea (Samson và cộng sự, 1974 [96]) Trong đó tất cả các loài nấm ký sinh côn trùng thuộc chi Isaria có đặc điểm thể bình dạng chai thon nhọn

và bào tử dạng chuỗi được xếp vào phân chi Paecilomyces sect Isariodea.

Do đó, nhiều nghiên cứu đã đưa ra các tên loài trùng hợp giữa hai chi như

loài Isaria japonica Yasuda hoặc Isaria tenuipes (= Paecilomyces tenuipes (Peck.) Samson) và Isaria sinclairii (Berk.) Llond (= Paecilomyces cicadae (Miquel) Samson) Đến năm 2007, nghiên cứu của Sung đã xếp Isaria thuộc ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae (Sung., 2007) [101]

Khi nghiên cứu phả hệ trên chi nấm Isaria Luangsard đã sử dụng

vùng trình tự ITS rDNA và gen mã hóa -tubulin để định danh và đánh giátính đa dạng di truyền các loài nấm này thu thập tại Thái Lan Tiếp đó,

nhóm tác giả mở rộng nghiên cứu thêm với các mẫu thuộc Paecilomyces (Luangsard và cộng sự, 2004 [81]) Kết quả thu được cho thấy Isarioidea là một nhánh đa huyết thống (multiphyly) thuộc Paecilomyces

Isaria tenuipes là một loài nấm dược liệu được nuôi trồng và sử dụng lâu đời ở Hàn Quốc Hình dạng nấm có thể mọc riêng lẻ hay thành cụm

nhóm Có thể mọc thẳng hoặc đột xuất nhánh, và có thể dài lên 45 mm,thân cây nấm chủ yếu là màu vàng chanh và bên trên có bột màu trắng hoặckem phủ đầy synnema, rất dễ phát tán trong không khí nhờ gió nên thườngđược gọi là Đông trùng hạ thảo bông tuyết Loài

Isaria tenuipes (Peck)Samson có hai tên đồng nghĩa là Isaria Japonica Yasuda và Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson, trong đó Isaria tenuipes (Peck) Samson là dạng vô tính của Cordyceps takaomontana Yakush & Kumaz (Fukatsu et al., 1997) [61]

1.4.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học cuả nhóm nấm Đông trùng hạ thảo

Các hoạt chất sinh học có trong Isaria đã được nghiên cứu ứng dụng

ở nhiều nước trên thế giới Sano đã phát hiện trong các chất trao đổi tách

chiết từ Isaria sinclairii có cơ chế ức chế miễn dịch để tổng hợp bất đối xứng ISP-I (Myriocin, Thermozymocidin) (Sano et al., 1995) [97] Tách

chiết hệ sợi nấm từ bề mặt trong nhân nuôi lỏng đã tìm thấy hai enzym

Chitinaese bằng phương pháp sắc ký DEAE Bio-Gel (Kawachi et al., 2001)

Isarfelin một loại peptide có khả năng ức chế sinh trưởng của nấm

bệnh Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum và sâu cắn gié Leucania separata đã được phát hiện và nghiên cứu trên nấm Isaria felina (Guo et al., 2005) [62].

Hợp chất mới chống oxy hóa pseudo-di-peptide và tiền chất của nó

được chiết xuất từ I japonica đã được phát hiện năm 2005 (Sakakura và cộng sự, 2005) [95] Chất này đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian

có nguồn gốc từ thiên nhiên tại Nhật Bản và có tên là ‘Hanasanagitake’.Cấu trúc pseudo-di-peptide được xác định là (R)-3, 4-diguanidinobutanoyl-(S)-DOPA và (R)- 3, 4-diguanidinobutanoyl-(S)-tyrosine bằng phân tíchquang phổ, tổng hợp hóa học và chuyển đổi enzym

Trong sinh khối nấm I tenuipes chứa Paecilomycine A, B và C là

các hoạt chất có hoạt tính sinh học cao Một số thành phần sinh hoá,nguyên tố khoáng, acid amin và các vitamin trong sinh khối (biomass) của

nấm Đông trùng hạ thảo Isaria tenuipes đã được xác định như sau (Kikuchi

et al., 2004) [73] :

Bảng 1.2 Thành phần sinh hoá và nguyên tố khoáng trong nấm Đông

trùng hạ thảo Isaria tenuipes

Bảng 1.4 Thành phần vitamin trong nấm Đông trùng hạ thảo I tenuipes

STT Acid amin Đơn vị tính Hàm lượng

Lý Thời Trần Dược tính theo Đông y là vị ngọt, tính ấm, hơi độc, nó nhậpvào kinh Phế và kinh Thận Nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trịthành công các chứng rối loạn lipit máu, viêm phế quản mạn, hen phế quản,viêm thận mạn tính, suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dịứng, viêm gan B mạn tính, ung thư phổi và thiểu năng sinh dục Tại Việnnghiên cứu nội tiết Thượng Hải (Trung Quốc), Nấm Đông trùng hạ thảo đãđược dùng để chữa liệt dương có hiệu quả tốt

Lần đầu tiên, y học phương Tây đã công nhận tính năng bổ dưỡng

của một loại nấm có tên là Cordyceps, được người Trung Quốc phát hiện

cách đây 1.500 năm Chiết xuất từ thảo mộc này có thể giúp người trungniên lấy lại sự cân đối sau nhiều năm phải ngồi nhiều do công việc Phátbiểu tại một hội thảo của hiệp hội Sinh lý học Mỹ, các nhà khoa học thuộc

trung tâm Pharmanex, California, đã khẳng định nấm Cordyceps có thể

nâng cao sức luyện tập, khả năng chịu đựng và làm giảm mệt mỏi ở nhữngngười trong độ tuổi 40 - 70 Nhóm đã phát triển một loại thuốc có tên là

CordyMax chứa chiết xuất của nấm Cordyceps được thử nghiệm trên 131

người tình nguyện trong 12 tuần và cho kết quả khả quan

Theo y học truyền thống của Trung Hoa, dạng thể quả đệm của nấm

I tenuipes có giá trị cao về mặt dược liệu do các tác dụng về dược lý và

sinh học của chúng Các hoạt chất Ergosterol peroxide và

Acetoxyscirpenediol tách chiết từ nấm I tenuipes nuôi cấy nhân tạo có khả

năng ức chế các dòng tế bào ung thư ở người như tế bào khối u dạ dày, tếbào ung thư gan, tế bào ung thư ruột kết - ruột thẳng Nan và cộng sự(2001) [88] đã phân lập được hai hợp chất ergosterol peroxyt (5alpha,8alpha-epidioxy-24(R)-metylacolexta-6,22-dien-3beta-ol) vàaxetoxyscirpendiol (4beta-axetoxyscirpene-3alpha,15-diol) khác từ

P.tenuipes có tác dụng tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày, ung thư gan, hiệu

quả được xác định gấp 4-6,6 lần hoạt chất cisplatin hiện đang được sử dụngtrong điều trị ung thư

Một hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học có giá trị dược liệu chứatrong thể quả đệm ở giai đoạn hữu tính và ở giai đoạn vô tính của loài nấm

I tenuipes này là 4-acetyl-12,13-epoxyl-9-trichothecene-3,15-diol Đây là

hợp chất đang được dùng để điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là bệnh máutrắng ở các nước trên thế giới, đặc biệt được sử dụng rộng rãi ở Hàn Quốc.Tác dụng điều trị ung thư của hợp chất hóa học này không chỉ có tác dụnglàm chết tế bào ung thư mà còn ức thế quá trình sinh tổng hợp protein, vì

vậy quá trình điều trị đã đạt được hiệu quả cao (Pae et al., 2003) [90] Một

số chất có hoạt tính sinh học thuộc các nhóm cordycerpin, xterol,xiclopeptit… từ thể quả đệm của nấm cũng có tác dụng điều trị giảm đau

N6-(2-Một trong các ứng dụng quan trọng của các loài nấm ký sinh côn

trùng là phòng trừ sinh học Trên thế giới chi nấm Isaria đã được sử dụng

để phòng trừ sâu hại cây trồng như các loài I javanica, I fariosa và I fumosorosea Ở Thái Lan loại nấm I fariosa đã được sử dụng để phòng trừ sâu hại cây trồng rất thành công Nấm ký sinh côn trùng thuộc chi Isaria là

một loại nấm phát triển nhanh, có số lượng bào tử nhiều, dễ phân lập Loài

nấm I javanica được đánh giá là rất có triển vọng trong việc ứng dụng để

phòng trừ sâu hại cây trồng Loài nấm này đã được nghiên cứu và ứng dụngvào phòng trừ một số đối tượng sâu hại (thuộc bộ Lepidoptera, Diptera,Coleoptera, Hymenoptera…) ở một số nước trên thế giới như Trung Quốc,Hoa Kỳ, Brazin và cho kết quả rất tốt

Nghiên cứu khả năng phát triển và lây nhiễm của nấm I fumosoroseus đối với bọ phấn trắng Trialeurodes vaporariorum trên đĩa petri, Avery kết luận bào tử nấm I fumosoroseus lây nhiễm lên thiếu trùng

tuổi 4 làm cho tỷ lệ lột xác sang trưởng thành ít hơn ở điều kiện 16L : 8D

so với 24L Tỷ lệ lột xác thành trưởng thành của thiếu trùng ruồi trắng phụ

thuộc vào tốc độ lây nhiễm nấm và chế độ chiếu sáng (Avery et al., 2009)

[52]

Kết quả nghiên cứu của Meyer và cộng sự đã chỉ ra rằng nấm I fumosorosea Wize (Ifr) (Paecilomyces fumosoroseus) (Hypocreales:

Cordycipitaceae) là tác nhân kiểm soát quan trọng đối với rầy chổng cánh

Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae), một véc tơ truyền bệnh greening trên cây có múi tại Florida, Mỹ (Meyer và cộng sự, 2008) [85].

Cyclosporine là loại thuốc chống thải hồi trong cấy ghép cơ quan (ghép tạng) được sản xuất từ nấm Tolyplocadium inflatum, là giai đoạn vô tính của nấm Cordyceps subsessilis Các nghiên cứu cũng công bố rằng,

cordycepin hoạt chất chính có trong ĐTHT và các chất có hoạt tính sinh

học khác cũng được sản xuất từ một số loài nấm côn trùng (Hung et al., 2009) [68]; Rukachaisirikul et al., 2004 [92]; Kittakoop et al, 1999 [76]).

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại thuốc hóa học phun trên

bọ phấn (Bemisia tabaci) và ve bét (Tetranychus urticae) hại bông đến sự

nảy mầm của bào tử và sinh trưởng của sợi nấm trong ống nghiệm cho thấy,tất cả các loại thuốc trừ sâu thí nghiệm đều ức chế nảy mầm của bào tử và sựtăng trưởng sợi nấm đáng kể Azocyclotin đã được chứng minh là có độctính cao sau đó đến Pyridaben, Acetamiprid và Propargite trong khi

Buprofezin là độc nhất I fumosorosea rất nhạy cảm với thuốc trừ sâu ở liều

lượng khuyến cáo, tỷ lệ nảy mầm của bào tử dao động từ 0% đến 75%

(Amjad et al., 2012) [50]

Nghiên cứu, đánh giá khả năng tương thích của nấm I fumosorosea

và ong kí sinh Lysiphlebus testaceipes đối với rầy nâu hại cam quýt tại Florida, Mỹ David và cộng sự đã cho thấy sử dụng đơn lẻ nấm I fumosorosea trong vòng hai tuần đầu tỷ lệ chết của rầy không sai khác

so với đối chứng Tuy nhiên, sau đó rệp có hiện tượng nhiễm bệnh Haitác nhân này có khả năng tương thích với nhau vì vậy có thể kết hợp

trong kiểm soát rệp nâu hại cam quýt (David và cộng sự, 2012) [60].

Kết quả nghiên cứu của Avery và cộng sự xác định khả năng tương thích của nấm I fumosorosea với các hóa chất nông nghiệp được sử dụng

để kiếm soát rầy chổng cánh Diaphorina citri Sự tăng trưởng của I fumosorosea trong phòng giảm ít nhất với các loại hóa chất có nguồn gốc

từ dầu mỏ và lớn nhất với các hóa chất từ dầu thực vật và borax Do đó

không nên trộn I fumosorosea với các sản phẩm trên (Avery và cộng sự,

cho các doanh nghiệp và người nuôi trồng nấm Tại Thái Lan, Wongsa vàđồng tác giả (2005) đã nghiên cứu phân lập và sự sinh trưởng của hệ sợi và

hình thành bào tử chồi của nấm Cordyceps unilateralis ký sinh kiến Môi

trường PDA (Potato Dextrose Agar), PYEG (Peptone Yeast ExtractGlucose), CSA (Carrot extract Sucrose Agar) và môi trường MEA (MaltExtract Agar) được dùng để phân lập và nuôi cấy hệ sợi

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm đến khả năng nảy mầm

của bào tử I fumosorosea cho thấy, sự nảy mầm yếu trong điều kiện có ánh

sáng, độ ẩm 43% và nhiệt độ 28oC và ổn định trong điều kiện không có ánhsáng hoặc ánh sáng luân phiên, độ ẩm 98% và nhiệt độ 15oC, mô phỏng khíhậu ôn đới Sự nảy mầm giảm khi nhiệt độ tăng cao và có khả năng tồn tại

ở nhiệt độ 45- 50oC, độ ẩm 33% trong 160 giờ (Bouamama et al., 2010)

- 30 mg/l FeSO4.7H2O và 6 - 12 mg/l CuSO4.5H2O tạo ra sắc tố nâu lớnnhất Khi bổ sung 25ml/l Polyethylene glycol (200 MW) - chất xúc tác quátrình sinh bào tử, giảm sự hình thành sợi nấm sinh dưỡng thì nồng độbào tử đính chìm đạt tối đa là 1,0 (±0,2) x 1012 tế bào/l sau 120 giờ nuôicấy Sinh khối thu được chủ yếu là bào tử đính chìm chiếm hơn 60%

g/l) + nước gạo ninh nhừ (200 g/l) + nấm men (5 g/l) Giai đoạn nhân nuôi

trên môi trường rắn, I farinosa phát triển tốt nhất với môi trường bột đậu

nành + ngô vỡ (ngâm nước 60 phút) và gạo nguyên kích thước dài 7 mm ×

dày 2 mm (ninh 8 - 10 phút với nước); đối với I fumosorosea cả gạo vỡ 3

mm dài × 2 mm dày (ngâm nước 40 phút) và gạo nguyên (ninh 8 - 10 phút

với nước) đều cho kết quả tốt nhất về khả năng phát sinh bào tử , (Mascarin

và cộng sự 2010) [84]

Khả năng nhân sinh khối của I tenuipes trên các môi trường khác

nhau đã được quan tâm nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới Khi nhân

sinh khối I tenuipes các điều kiện nuôi như nguồn dinh dưỡng cacbon,

khoáng, nitơ và độ pH ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển của nấm.Nguồn dinh dưỡng tối ưu cho nhân sinh khối là đường glucose, meatpeptone hoặc tryptone và K2HPO4 hoặc MgSO4, PH = 6

Theo Ji và cộng sự dạng bào tử vô tính I tenuipes đã được nuôi cấy

trên môi trường có chứa nhộng tằm, kết quả cho thấy tỷ lệ sống cao nhấtđạt 97,6% trên các giống tằm được thử nghiệm Khối lượng tươi của bào tử

vô tính I tenuipes khác nhau tùy theo từng mùa, dao động từ 1,44 - 0,94 g Đạt cao nhất khi nuôi cấy vào mùa xuân Bào tử vô tính của I tenuipes sản

xuất trên nhộng là màu trắng hoặc màu trắng sữa và tương tự về hình dạng

và màu sắc thể quả đệm thu thập trong tự nhiên (Ji và cộng sự, 2011) [70]

Thành phần môi trường nuôi cấy nấm luôn là đề tài để các nhà khoahọc nghiên cứu tìm ra môi trường thích hợp nhất phù hợp với mục đíchnuôi cấy Thành phần trong 1 lít môi trường: 50g glucose, 1,84g NH4NO3,0,39g KH2PO4, 1,42g Na2HPO4.12H2O, 0,60g MgSO4.7H2O, 0,1mg KCl,2mg MnSO4.H2O, 10mg CoCl2.6H2O, 2mg Na2MoO4.2H2O, 20mgZnSO4.7H2O, 3mg CuSO4.5H2O, 2mg FeSO4.7H2O và 60mg EDTA.Trong thành phần này KH2PO4 phosphate làm ảnh hưởng đến sinh khối củanấm tuy nhiên lại có khả năng kích thích làm tăng số lượng thể quả đệm