Nâng cao chất lượng sản phẩm sữa chua lên men bởi lactobacillus acidophilus giàu hoạt tính kháng oxy hóa

Sau 8 tuần theo dõi bảo quản ở nhiệt độ 10°c, sản phẩm sữa chua lên men bởi Lactobacillus acidophilus BK4 đạt tiêu chuẩn probiotic và có hoạt tính kháng oxy hóa cao.. 50 3.3 Lên men sữa

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô hướng dẫn, PGS TS Nguyễn Thúy Hương, Cô đã gọi mở ý tưởng để tôi định hướng và xây dựng đề tài nghiên cứu này Trong suốt thời gian thực hiện, Cô đã tận tình hướng dẫn, động viên tinh thần, giúp tôi vượt qua trở ngại để có thể hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô Khoa Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học Bách Khoa đã truyền dạy những kiến thức quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lọi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tại trường

Tôi cũng xin cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã chia sẻ tài liệu trong các lĩnh vực liên quan, cũng như đóng góp các ý kiến để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu Xin cảm ơn gia đình đã động viên và tạo điều kiện cho tôi trong thời gian tập trung vào luận văn này

Mặc dù đã có nhiều cố gắng cùng sự góp ý, giúp đỡ của Thầy Cô, tuy nhiên vói kiến thức còn hạn chế nên luận văn chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót Kính mong tiếp tục nhận được sự góp ý, nhận xét của Quý Thầy Cô và những người

có quan tâm để luận văn được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

Lương Ngọc Anh

TÓM TẮT LUÂN VĂN•

Sự rối loạn chuyển hóa do mất cân bằng oxy hóa là nguyên nhân của nhiều

bệnh lý trong cơ thể Lactobacillus acidophilus giúp giảm stress oxy hóa và thiết lập cân bằng hệ sinh thái YÌ sinh đường ruột Trong nghiên cứu này, Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 và BK4 đều sống sót trong môi trường pH 3, muối mật

0.3%, kháng khuẩn, khử cholesterol và sinh acid lactic Sinh khối và hoạt tính

kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus BK4 trong de Man - Rogosa - Sharpe (MRS) sucrose 6% được đại diện bằng phương trinh hồi quy theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm Điều kiện lên men tối ưu được xác định theo phương pháp Box

- Wilson gồm pH 5.1, nhiệt độ 36.6°c trong 40 giờ Sinh khối đạt 11.59 ± 0.09 log (CFU/ml) (tăng 6.4%), tổng năng lực khử đạt 0.55 ± 0.04 (tăng 37.8%) và khả năng khử 53.63% 1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl (DPPH) (tăng 12.02%) Sau 8 tuần theo dõi bảo quản ở nhiệt độ 10°c, sản phẩm sữa chua lên men bởi Lactobacillus acidophilus BK4 đạt tiêu chuẩn probiotic và có hoạt tính kháng oxy hóa cao

Từ khóa: Kháng oxy hóa, Lactobacillus acidophilus, Stress oxy hóa

Lactobacillus acidophilus BK4 in MRS The glucose content in this medium is

replaced by 6% sucrose solution, optimal fermentation conditions were determined

by experimental planning method and Box - Wilson method including pH 5.1,

temperature at 36.6°c and reaction time in 40 hours At this fermentation

conditions, the biomass obtained was 11.59 ± 0.09 log (CFU/ml) (6.4% increase)

Lactobacillus acidophilus BK4 showed that reducing power was 0.55 ± 0.04

(37.8% increase) and DPPH radical scavenging activities was 53.63% (12.02%

increase) Antioxidant of fermented milk by Lactobacilus acidophilus was

improved and maintained for 8 weeks at 10°c.

Key words: Antioxidant activity, Lactobacillus acidophilus, Stress oxidative

1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng luận văn này là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Thúy Hương Các số liệu, kết quả trong luận văn được trình bày trung thực và khách quan Luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu khoa học được đăng tải trên các tạp chí, hội nghị được đề cập trong phần tài liệu tham khảo

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018

Học viên thực hiện

Lương Ngọc Anh

MUC LUC• •

TÓM TẮT LUẬN VĂN i

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC CÁC BẢNG y DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ vii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TÔNG QUAN 3

1.1 Quá trình lên men và sản phẩm sữa chua 3

1.2 Giống Lactobacillus và Lactobacillus acidophilus 5

1.2.1 Vi khuẩn Lactobacillus 5

1.2.2 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 9

1.3 Quá trình oxy hóa và quá trình kháng oxy hóa trong cơ th ể 13

1.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 21

2.1 Địa điểm và thòi gian thực hiện 21

2.2 Đối tượng nghiên cứu 21

2.3 Vật liệu và hóa ch ấ t 21

2.3.1 Dụng cụ và thiết b ị 21

2.3.2 Hóa chất 22

2.3.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Khảo sát các đặc tính của Lactobacillus acidophilus 25

2.4.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối Lactobacillus acidophilus giàu hoạt tính kháng oxy hóa 30

2.4.3 Lên men sữa chua bởi chủng sàng lọc và đánh giá ổn định chất lượng sản phẩm sữa chua giàu hoạt tính kháng oxy hóa 33

2.5 Phương pháp phân tích và thu nhận kết q u ả 35

111

2.5.1 Phương pháp phân tích YĨ sinh 35

2.5.2 Phương pháp phân tích hóa sinh 36

2.5.3 Phương pháp thăm dò cảm quan 36

2.5.4 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 36

2.5.5 Phương pháp xử lý số liệu 36

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37

3.1 Khảo sát các đặc tính của Lactobacillus acidophilus 37

3.1.1 Đặc điểm sinh học của Lactobacillus acidophilus 37

3.1.2 Hoạt tính probiotic cơ bản của Lactobacillus acidophilus 39

3.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối Lactobacillus acidophilus giàu hoạt tính kháng oxy hóa 47

3.2.1 Sàng lọc yếu tố chính 48

3.2.2 Tối ưu hóa hai hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn và hoạt tính kháng oxy hóa 50

3.3 Lên men sữa chua bởi chủng vỉ khuẩn sàng lọc và đánh giá ổn định chất lượng sản phẩm sữa chua probiotic giàu hoạt tính kháng oxy hóa 55

3.3.1 Đánh khá các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm sữa chua Lactobacillus acidophilus 56

3.3.2 Đánh giá khả năng bảo toàn hoạt tính probiotic của Lactobacillus acidophilus trong sản phẩm sữa chua trong 8 tuần bảo quản 57

3.3.3 Đánh giá khả năng bảo toàn hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus trong sản phẩm sữa chua trong 8 tuần bảo quản 58

3.3.4 So sánh hoạt tính kháng oxy hóa trong sản phẩm với một số sản phẩm sữa chua probiotic trên thị trường Việt Nam 58

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

4.1 Kết luận 60

4.2 Kiến nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO V PHỤ LỤC xi

DANH MUC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Khả năng khử cholesterol của Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3

và BK4 sau 150 phút nuôi cấy 43

Bảng 3.2 Khả năng kháng khuẩn của Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 và

BK4 với các vi khuẩn chỉ thị 44

Bảng 3.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus BK4 trong môi

trường MRS có nồng độ sucrose 6%, 8% và 10% 49Bảng 3.4 Ma trận quy hoạch thực nghiệm hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Yi 50

Bảng 3.5 Bước chuyển động Si của các yếu tố hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Yi.,52 Bảng 3.6 Thí nghiệm theo hướng leo dốc hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Y ị 52

Bảng 3.7 Ma trận quy hoạch thực nghiệm của hàm mục tiêu hoạt tính kháng oxyhóa Y2 53

Bảng 3.8 Bước chuyển động Si của các yếu tố hàm mục tiêu hoạt tính kháng oxy

hóa Y2 54Bảng 3.9 Thí nghiệm theo hướng leo dốc hàm mục tiêu hoạt tính kháng oxy hóa Y2 55

Bảng 3.10 Các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm sữa chua Lactobacillus acidophilus 56

Bảng 3.11 Mật độ vi khuẩn, hoạt tính kháng khuẩn và khả năng khử cholesterol của

sản phẩm sữa chua trong 8 tuần theo dõi bảo quản ở nhiệt độ 10°c 57

Bảng 3.12 Hoạt tính kháng oxy hóa của sản phẩm sữa chua trong 8 tuần theo dõibảo quản ở nhiệt độ 10°c 58

Bảng 3.13 So sánh hoạt tính kháng oxy hóa giữa sản phẩm sữa chua Lactobacillus acidophilus BK4 và hai sản phẩm sữa chua probiotic thương mại 59

V

DANH MUC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Mối liên hệ giữa stress oxy hóa và bệnh tật 15Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 24Hình 2.2 Sơ đồ quy trình lên men sữa chua probiotic giàu hoạt tính kháng oxy hóa 33

Hình 3.1 Hĩnh thái đại thể (A), vi thể (B) của Lactobacillus acidophilus BK1 37 Hình 3.2 Hình thái đại thể (A), vi thể (B) của Lactobacillus acidophilus BK4 37 Hình 3.3 Vòng kháng khuẩn của Lactobacillus acidophilus BK4 với Escherichia coli ATCC 8739 (A) và Bacillus cereus ATCC 11778 (B) 44 Hình 3.4 Sản phẩm sữa chua Lactobacillus acidophilus BK4 56

DANH MUC CÁC ĐỒ THI• •

Đồ thị 3.1 Đường cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3

và BK4 trong môi trường MRS theo thời gian 39

Đồ thị 3.2 Khả năng chịu pH thấp của Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3

và BK4 trong môi trường SGJ theo thòi gian 40

Đồ thị 3.3 Khả năng chịu muối mật của Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3

và BK4 trong môi trường SIF theo thòi gian 42

Đồ thị 3.4 Khả năng sinh acid lactic của Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3

và BK4 trong môi trường MRS theo thời gian 45

Đồ thị 3.5 Hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3

và BK4 trong môi trường MRS theo phưong pháp tổng năng lực khử (A) và phươngpháp khử DPPH (B) 46

Đồ thị 3.6 Đường cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus BK4 trong môi trường MRS có nồng độ sucrose 6%, 8% và 10% 48

vu

DANH MUC CÁC KÍ HIẼU VÀ CHỮ VIẾT TẮT• •

DPPH 1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl

MỞ ĐÀU

Sữa là nguồn thực phẩm quý giá cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sức khỏe của con người Ngày 01/06/2001, Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) đã khởi xướng ngày Sữa thế giới nhằm khuyến khích tiêu thụ sữa hằng ngày như một phần của chế độ ăn uống lành mạnh Trong quá trình sử dụng, con người đã đa dạng hóa nhiều sản phẩm từ sữa như phô mai, bơ, kem, sữa lên men, và nâng cấp chúng từ sản phẩm truyền thống trở thành các sản phẩm hiện đại được sản xuất theo dây chuyền công nghiệp Trong đó, sữa chua là sản phẩm của quá trình lên men lactic của vi khuẩn lactic vói mục đích ban đầu là tăng cường hương vị và kéo dài thòi gian bảo quản sữa [1]

Các vi khuẩn lactic thông qua quá trình lên men sẽ nâng cao chất lượng cũng như số lượng các protein, chất béo, vitamin, khoáng chất trong sữa, giúp tăng cường

hệ thống miễn dịch, hỗ trợ hệ cơ xương, giúp hệ tiêu hóa hấp thu các dưỡng chất tốt nhất [2] Đặc biệt, những vi khuẩn lactic được công nhận là probiotic, khi bổ sung vào cơ thể sẽ cải thiện toàn diện sức khỏe của con người Các probiotic sẽ củng cố thành ruột, cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột, giảm các rối loạn liên quan đến đường tiêu hóa, tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa các bệnh dị ứng, nhiễm khuẩn, làm chậm quá trình phát triển của ung thư và hỗ trợ sức khỏe tim mạch [1]

Lactobacillus acidophilus là một trong những vi khuẩn lactic được thương mại hóa trong chế biến thực phẩm Các chủng Lactobacillus acidophilus đã được đưa vào

các sản phẩm sữa ở Mỹ và Đức vào những năm cuối của thập niên 1960 nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm [3] Ngoài những hoạt tính điển hình của một probiotic,

Lactobacillus acidophilus còn có khả năng sinh enzyme lactase, giúp giảm các triệu

chứng không dung nạp lactose trong sữa động vật và khả năng khử cholesterol trong máu [4]

Ngày nay, môi trường sống của con người càng trở nên ô nhiễm do các tác động trực tiếp của hóa chất, khói thuốc, bức xạ, hay gián tiếp thông qua thực phẩm, thậm chí do dùng một số dược phẩm chữa bệnh cũng trở thành những tác nhân gây stress oxy hóa cho cơ thể Trạng thái stress oxy hóa làm thoái hóa tế bào, gây ung thư và gây ra các bệnh lý trong cơ thể như viêm nhiễm các cơ quan, bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, thoái hóa mắt, và biểu hiện sớm nhất là hiện tượng lão hóa da

1

Việc tăng cường hoạt tính kháng oxy hóa trong thực phẩm hằng ngày là rất cần thiết

để hỗ trợ, tăng khả năng đáp ứng của cơ thể trước các tác động xấu từ môi trường

Năm 1993, các nghiên cứu trên vi khuẩn lactic đã phát hiện ra các chất có hoạt tính kháng oxy hóa, với khả năng ức chế hơn 70% hoạt động oxy hóa Những năm

gần đây, các thử nghiệm in-vitro và in-vivo sử dụng Lactobacillus acidophilus đã

cho thấy vai trò quan trọng của chúng trong hoạt động kháng oxy hóa của cơ thể bệnh nhân [5]

Một trong những giải pháp an toàn và mang tính chủ động trong việc giảm stress oxy hóa, cải thiện các bệnh lý trong cơ thể là sử dụng các thực phẩm có lọi, giàu hoạt tính kháng oxy hóa, giúp cân bằng hệ sinh thái vi sinh đường ruột Vì vậy, ngoài các công dụng về sữa chua đã được biết đến, thì việc sử dụng vi khuẩn probiotic và tăng hoạt tính kháng oxy hóa mở ra một hướng mới cho thị trường sữa lên men, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con người

Từ những lý do trên, đề tài “Nâng cao chất lượng sản phẩm sữa chua lên

men bởi Lactobacillus acidophilus giàu hoạt tính kháng oxy hóa” được thực hiện

vói mục tiêu nghiên cứu cơ bản về khả năng kháng oxy hóa của dòng vi khuẩn

probiotic, cụ thể là chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, từ đó thăm dò ứng

dụng, tạo ra dòng sản phẩm sữa chua có thêm hoạt tính sinh học về khả năng kháng oxy hóa

Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:

- Khảo sát các thông số giống Lactobacillus acidophilus như đặc tính sinh

học, hoạt tính probiotic và hoạt tính kháng oxy hóa

- Tối ưu hóa quá trình lên men phòng thí nghiệm đảm bảo hoạt tính

probiotic và hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus như

dinh dưỡng môi trường, pH môi trường, nhiệt độ lên men và thời gian lên men

- Lên men sữa chua probiotic giàu hoạt tính kháng oxy hóa và đánh giá ổn định chất lượng sản phẩm

Chương 1 TÔNG QUAN

1.1 Quá trình lên men và sản phẩm sữa chua

Các thực phẩm lên men đã được biết đến từ rất sớm trong quá trình phát triển của con người Rất khó để thiết lập nguồn gốc chính xác của việc sản xuất sản phẩm lên men, theo thời gian và theo các tiến bộ khoa học, các sản phẩm lên men dần được đánh giá an toàn để sử dụng

Năm 1990, Adams định nghĩa “lên men” là thuật ngữ dùng để mô tả hình thức trao đổi chất của vi sinh vật làm biến đổi họp chất hữu cơ, thường là các carbohydrate Quá trình lên men là một phương tiện để bảo quản thực phẩm với chi phí thấp Ví dụ như quá trình lên men sữa tạo phô mai có thòi gian bảo quản lâu hơn sữa không lên men, giảm thời gian chế biến thức ăn như đậu nành hay ngô lên men, so với sử dụng hạt thông thường Các đặc tính cảm quan của thực phẩm cũng được cải thiện và phong phú hơn Đôi khi, quá trình này còn loại bỏ hoặc giảm hàm lượng các chất không mong muốn như các yếu tố gây đầy hơi ữong đậu nành, các chất độc trong thức ăn và làm tăng chất lượng của thực phẩm [2]

Các thực phẩm lên men trên thị trường được chứng nhận an toàn (GRAS) cho người sử dụng, rất phong phú và đa dạng tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu sản xuất như lúa mỳ, lúa mạch, ngô, sắn, đậu nành, rau, cá, sữa, và vi sinh vật được sử dụng cho quá trình lên men Một số vi sinh vật thường dùng trong lên men như

Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum lên men tách vỏ hạt cà phê, cacao, Corynebacterium manihot lên men bột sắn thành gari, Aspergillus oryzae lên men đậu tương thành miso, Pediococcus cerevisiae lên men dưa chuột thành dưa muối, Aspergillus oryzae lên men đậu tương thành nước chấm, Acetobacter xylinum

lên men nước dừa thành thạch dừa, vi khuẩn lactic lên men các loại rau thành kim chi hay lên men sữa thành các sản phẩm sữa chua hay phô mai,

Các phương pháp lên men chính đã sử dụng trong vi sinh thực phẩm là lên men lactic và ethanol Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật như nấm men, nấm sợi và điển hình là vi khuẩn lactic (LAB) Mỗi LAB khác nhau có cơ chế lên men đường khác nhau Căn cứ vào sản phẩm lên men chia LAB thành hai nhóm Nhóm LAB lên men đồng hình phân giải đường

3

theo con đường đường phân EMP (Embden - Meyerhof - Pamas) cho sản phẩm chủ yếu là acid lactic chiếm 90% đến 98% Chỉ một phần nhỏ pyruvate được decacboxyl hóa và chuyển thành acid acetic, ethanol, aceton và C 02 [6] Mức độ tạo thành các sản phẩm phụ phụ thuộc vào sự có mặt của oxy Phưomg trình tóm tắt quá trình lên men đồng hình như sau:

C6H120 6 + 2ADP + 2Pi -ỳ 2CH3CHOHCOOH + 2ATP

Trong quá trình lên men dị hình, do thiếu hai enzyme chủ yếu của con đường EMP là aldolase và triozophosphat - merisoase nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải glucose xảy ra theo con đường pp (Pentose - Phosphat) [6] Quá trình chuyển hóa trizophosphat thành acid lactic giống như lên men đồng hình Sản phẩm của quá trình lên men lactic dị hình ngoài acid lactic chiếm 40%, còn có các sản phẩm khác như acid succinic (10%), ethanol (20%), acid acetic (10%) và các chất khí (20%) [7] Phưomg trình tóm tắt quá trình lên men dị hình như sau:

Qua quá trình lên men lactic, chất lượng cũng như số lượng của các protein, vitamin, khoáng chất trong thực phẩm tăng đáng kể trên cùng một trọng lượng khô, giúp hệ tiêu hóa hoạt động tốt hon, chất dinh dưỡng từ thực phẩm được hấp thu tốt hơn [2]

Sữa chua là thức ăn được chế biến bằng cách lên men sữa dưới tác dụng của vi khuẩn lactic Trên thế giói, có trên 400 loại sữa chua khác nhau [7] Tùy theo mục đích sản xuất mà sữa chua được phân loại dựa theo hàm lượng chất béo như cao, trung bình hoặc thấp; theo tính chất vật lý như dạng bột khô, đông lạnh, bán rắn hoặc dạng lỏng; theo hương vị như hương vị tự nhiên, bổ sung hoa quả hoặc hương liệu; theo vi sinh vật sống được bổ sung như probiotic hay các vi sinh vật điều trị; theo phương pháp sản xuất như chế biến trước hay sau quá trình lên men [7]

Sữa chua chứa các thành phần chính là protein, chất béo, carbohydrate, các khoáng chất và vitamin thiết yếu, giúp tăng cường sức khỏe cho người sử dụng Các

lọi ích của sữa chua được chứng minh rõ ràng vào cuối những năm 1800 đầu những năm 1990 bởi nhiều nghiên cứu, quan sát và giải thích của Moro và Metchnikoff Một số lợi ích của sữa chua đến sức khỏe con người có thể kể đến như bổ sung các chất dinh dưỡng, điều hòa trao đổi chất đường ruột, phòng ngừa và điều trị nhiều bệnh về hệ tiêu hóa, tăng khả năng kháng khuẩn và nâng cao hệ miễn dịch của cơ thể [7].

Trong sản xuất truyền thống, những vi khuẩn lactic thường được sử dụng để bảo quản sữa Trong quy mồ công nghiệp, sữa chua được sản xuất với những kĩ thuật tiên tiến đã hạn chế được sự xâm nhiễm các vi sinh vật không mong muốn làm ảnh hưởng chất lượng sản phẩm so với phương pháp truyền thống Ngày này, với sự phát triển của công nghệ, các sản phẩm sữa chua đã được phân bố ổn định trong thị trường, người tiêu dùng càng quan tâm hơn đến các sản phẩm có giá trị chức năng

bổ sung vào khẩu phần ăn hằng ngày

1.2 Giống Lactobacillus và Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus thuộc nhóm vi khuẩn lactic (Lactobacillaceae), thường có dạng

hình que, Gram dương, không hình thành bào tử, không chứa sắc tố, catalase âm

tính và vi hiếu khí Lactobacillus là một trong những lợi khuẩn quan trọng chiếm ưu

thế trong hệ sinh thái đường ruột, nhất là trong ruột non

Nhu cầu dinh dưỡng cơ bản của Lactobacillus bao gồm:

- Nhu cầu dinh dưỡng carbon, Lactobacillus sử dụng được rất nhiều loại

carbohydrate nhờ quá trinh lên men đồng hình và dị hình giúp xây dựng cấu trúc tế bào, sinh ra các acid hữu cơ, các acid amin làm nguồn cung cấp năng lượng

5

- Nhu cầu dinh dưỡng nitơ, phần lớn Lactobacillus không thể sinh tổng hợp

được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Các acid amin có thể được đồng hóa dưới dạng peptit nhờ vào tác dụng của enzyme protease ngoại bào hay nội bào

- Nhu cầu vitamin rất cần cho sự sinh trưởng của Lactobacillus, các vitamin bị

ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ nuôi cấy, lượng C02ban đầu, pH và thế oxy hóa khử của môi trường

- Nhu cầu về các muối khoáng, các họp chất vô cơ đa lượng và vi lượng như đồng, natri, kali, photpho, lưu huỳnh rất cần thiết cho quá trình sống của

Lactobacillus, đặc biệt là sắt, mangan và magie có tác động tích cực đến sự phát triển của Lactobacillus.

- Các chất hữu cơ khác như acid acetic, acid oleic và acid citric cũng có những ảnh hưởng nhất định đến tốc độ sinh trưởng của Lactobacillus [9].

Ngoài nhu cầu về dinh dưỡng cơ bản, sự phát triển của Lactobacillus còn bị

ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường sống như nhiệt độ, pH môi trường, sự trao đổi oxy, nồng độ đường hay nồng độ NaCl:

- Đa số Lactobacillus sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 5°c - 45°c, nhiệt

độ sinh trưởng tối ưu từ 20°c - 40°c Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều

ảnh hưởng đến kết cấu và chức năng của tế bào vi khuẩn

- Hoạt động của Lactobacillus, đặc biệt là hệ enzyme của chúng, chịu tác động

mạnh của sự thay đổi pH môi trường Giá trị pH tối ưu cho sinh trưởng của

Lactobacillus là pH 5.6 đến pH 6.2, sau quá trình lên men, pH môi trường

khoảng từ pH 3.2 đến pH 3.5.

- Tùy thuộc vào đặc điểm sinh lý của mỗi loài và mỗi giai đoạn phát triển khác

nhau mà nhu cầu oxy của Lactobacillus là khác nhau, tuy nhiên, phần lớn Lactobacillus hoạt động tốt trong điều kiện hiếu khí.

- Nồng độ đường trong môi trường lên men tỉ lệ thuận với hàm lượng acid lactic sinh ra Tuy nhiên, khi nồng độ đường tăng quá cao sẽ gây co nguyên

sinh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào, từ đó, hàm lượng acid lactic giảm.

- Nồng độ NaCl ảnh hưởng đến cấu trúc màng tế bào chất của vi khuẩn và gây

ức chế sinh trưởng của Lactobacillus khi nồng độ NaCl lớn hom hoặc bằng

5% [7, 9]

Năm 1847, Lactobacillus được công nhận là vi khuẩn lên men tạo acid lactic

an toàn để sử dụng trong dược phẩm và thuốc thú y và những năm cuối thế kỉ 19,

Lactobacillus được chứng minh sự an toàn trong chế biến thực phẩm [9] Một số chủng Lactobacillus được sử dụng trong lên men truyền thống ở Việt Nam và trên thế giới như Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum,

Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi dùng với số lượng thích họp sẽ mang lại những lợi ích sức khỏe cho cơ thể chủ [5] Năm 1907, Elie Metchnikoff đã

đạt giải Nobel khi chứng minh được việc tiêu thụ Lactobacillus qua các sản phẩm

sữa lên men sẽ hạn chế các nội độc tố của nhiều vi sinh vật đường ruột [10]

Lactobacillus được công nhận là probiotic, được bổ sung trong thực phẩm hằng

ngày Những lợi ích cho sức khỏe của chúng được thể hiện thông qua khả năng hỗ

trợ hệ thống tiêu hóa của con người Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum giúp tăng cường hệ lợi khuẩn, có vai trò quan trọng trong

việc tăng cường chức năng đường ruột [5, 11]

Hệ tiêu hóa ngoài vai trò hấp thụ các chất dinh dưỡng, còn đóng vai trò là cơquan miễn dịch của cơ thể, là hệ thống bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lạicác tác nhân gây bệnh xâm nhiễm Hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột chứa từ 1013đến 1014 vi sinh vật, với 1000 đến 1150 loài cùng chung sống [5, 12] Dựa vào sựtác động đối với hệ tiêu hóa, hệ vi sinh vật đường ruột được chia thành ba nhóm

chính bao gồm lợi khuẩn như Lactobacillus và Bifidobacteria, vi khuẩn gây bệnh

như Clostridia và một số vi khuẩn khác thuộc Bacteroides trung tính, không có lợicũng như có hại Khi hệ sinh thái mất cân bằng, các vi khuẩn gây hại phá hủy biểu

mô đường ruột, làm cho thành đường ruột mỏng đi dẫn đến giảm sự hấp thụ cácchất dinh dưỡng, chúng sản sinh ra các cơ chất gây độc, làm suy yếu hệ thống miễndịch, làm tăng chu trình tế bào và tiêu tốn năng lượng cơ thể Các lợi khuẩn như

7

probiotic với những đặc điểm sinh lý giúp tăng khả năng cạnh tranh vói vi khuẩn gây hại, sẽ cân bằng hệ vi sinh vật, bảo vệ bề mặt của đường tiêu hóa chống lại các

vi sinh vật xâm nhiễm, điều hòa hệ miễn dịch của cơ thể, hỗ trợ hấp thu các chất dinh dưỡng và tổng họp các protein, vitamin [12]

Trong nhiều nghiên cứu cho thấy, khi cho những bệnh nhân rối loạn tiêu hóa

sử dụng probiotic chứa thành phần vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum và Bifidobacterium breve sẽ làm gia tăng số lượng của Lactobacillus và giảm số lượng của Escherichia coli trong ruột, giảm thời gian di chuyển qua ruột của Salmonella Còn khi cho bệnh nhân bị bệnh bạch cầu sử dụng sản phẩm chứa Bifidobacterium và Lactobacillus acidophilus, hệ vi khuẩn đường

ruột và nấm men sẽ được phục hồi Trong khi sử dụng thuốc chữa trị bệnh bạch cầu

sẽ làm chết một số vi sinh vật có lợi trong đường ruột [4]

Probiotic giúp phòng ngừa và chữa trị bệnh tiêu chảy, nhiễm trùng trong cơ

thể Khi sử dụng Lactobacillus rhamnosus dưới dạng sữa lên men hoặc dạng đông

khô thì khoảng 95% trẻ em giảm triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy trong một ngày và không còn tiêu ra máu sau ngày thứ hai chữa trị Những bệnh nhân nhiễm trùng

đường hô hấp và đường niệu thường có lượng Candida ở trong phân cao (mật độ

105 CFU/g phân) Khi bệnh nhân uống Bifidobacterium, số lượng Candida giảm

đáng kể và sự nhiễm trùng cũng giảm [5] Các chủng probiotic khác nhau có những tác động khác nhau lên môi trường đường ruột, lên chức năng của hàng rào biểu mô

và niêm mạc [13]

Các Lactobacillus trong chế phẩm probiotic còn có khả năng kháng các dòng

tế bào gây ung thư thông qua việc làm giảm các enzyme nitroreductase, azoreductase là những tác nhân hoạt hóa chất tiền ung thư thành chất gây ung thư trong cơ thể [4] Khi cho bệnh nhân ung thư cổ tử cung và bệnh nhân ung thư bàng

quang sử dụng Lactobacillus casei SMrota với liều lượng thích họp, sẽ giúp tăng

quá trình thoái hóa khối u ữong điều trị phóng xạ, giúp kéo dài sự sống, ngăn chặn

sự suy giảm các tế bào bạch cầu, đồng thời, ngăn chặn sự tái phát của khối u [5] Các nghiên cứu năm 2012 được tổng họp bởi Makrides đã cho thấy khả năng điều

hòa miễn dịch toàn diện của Lactobacillus Chế phẩm sinh học probiotic có thể

được sử dụng như chất phụ trợ trong hóa trị liệu ung thư hứa hẹn hướng phòng ngừa

và hỗ trợ điều trị ung thư Probiotic cũng có vai trò quan trọng trong công tác phòng chống ung thư đại tràng [13]

Bên cạnh đó, probiotic còn có khả năng ngăn chặn bệnh tiểu đường và bệnh cao huyết áp Kết quả nghiên cứu trên chuột cho thấy, khi cho chuột sử dụng

Lactobacillus casei sẽ làm giảm tỷ lệ tiểu đường của chuột bệnh nhưng không gây ảnh hưởng trên chuột bình thường Lactobacillus rhamnous và Lactobacillus gasseri giúp điều hòa hoạt động điều tiết hormone, cải thiện các bệnh về chuyển

hóa lipid [5]

Đặc biệt, năm 1993, Kaizu và cộng sự đã phát hiện ra hoạt tính kháng oxy hóa

của Lactobacillus, vói khả năng ức chế hon 70% hoạt động oxy hóa Dịch nuôi cấy Lactobacillus delbrueckii bảo vệ được tế bào Caco-2 bị tổn thương do H20 2 [5, 13] Lactobacillus plantarum C88 có khả năng khử gốc hydroxyl lên đến 53.05% và khả

năng sống sót đến 30% trong môi trường lmM H20 2 trong 8 giờ, cải thiện tình trạng

stress oxy hóa do D - galactose trên chuột Sữa dê lên men bởi Lactobacillus plantarum và Lactobacillus paracasei chống lại sự phát triển của dòng tế bào ung

thư HeLa Những thử nghiệm in-vitro cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa từ

Lactobacillus helveticus ức chế các dòng tế bào ung thư như HepG-2, BGC-823 và

HT-29 [5] Ngoài ra, việc bổ sung các peptide từ sữa chua cũng giúp tăng hàm lượng chất kháng oxy hóa nội sinh trong cơ thể, gây chết tế bào ung thư mà không làm ảnh hưởng đến các tế bào bình thường [14, 15]

Hoạt tính kháng oxy hóa tạo ra bởi các chủng Lactobacillus giúp phòng chống

ung thư và giảm các bệnh lý liên quan đến stress oxy hóa Vì vậy, tăng hoạt tính kháng oxy hóa trong thực phẩm nói chung và sữa chua nói riêng đang ngày càng được quan tâm nghiên cứu

1.2.2 Vỉ khuẩn Lactobacillus acidophilus

1.2.2.1 Đặc điểm sình lý cửa Lactobacillus acidophilus

Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được Moro phân lập đầu tiên vào năm

1900 từ phân su của trẻ sơ sinh Sau đó, Lactobacillus acidophilus được phân loại

và mô tả các đặc điểm về trao đổi chất cũng như chức năng của chúng trong thực

9

phẩm Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình que, kích

thước (0,6 - 0,9)pm X (1,5 - 6,O)|0.m, đứng riêng rẽ, xếp theo cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn, không di động, không tạo bào tử, không sinh độc tố [7, 16] Phương

thức sinh sản của Lactobacillus acidophilus là chia đôi hay trực phân Mặc dù chỉ sinh sản cận hữu tính nhưng Lactobacillus acidophilus vẫn có biến đổi di truyền

trong tế bào thông qua tái tổ họp di truyền [17] Theo Bergey, vi khuẩn

Lactobacillus acidophilus được phân loại như sau [8]:

Bộ: Eubacteriales

Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus có khả năng lên men đồng hình và dị hình,

trong đó những loài lên men đồng hình chiếm ưu thế hơn Các vi khuẩn này sống

chủ yếu trong ruột, miệng và âm đạo Lactobacillus acidophilus có phản ứng

catalase và chuyển hóa nitrat thành nitrit âm tính, chúng có khả năng lên men cả đường lactose, glucose, sucrose, maltose và mannose [17]

Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn hiếu khí, chịu nhiệt, chúng có thể sống

trong điều kiện nhiệt độ lên đến 45°c Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của

Lactobacillus acidophilus là 37°c, pH tối ưu cho sự tăng trưởng dao động trong

khoảng pH 5.5 đến pH 6 [7].

Môi trường nuôi cấy chuẩn cho Lactobacillus acidophilus thường phải rất giàu

acid amin và vitamin như peptone, trypton, dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt bò, ngoài ra còn chứa sorbitol, monooleate, sodium acetate và muối magie kích thích sự

tăng trưởng Môi trường MRS là môi trường chọn lọc Lactobacillus Trên môi

truờng thạch MRS, khuẩn lạc có đường kính từ 2mm đến 5mm, dạng tròn, lồi, màu trắng đục, vành đều và không sinh chất tạo màu Trong môi trường thạch sâu, khuẩn lạc nhỏ và có hình dạng không ổn định Trong môi trường thạch nghiêng, khuẩn lạc

có màu trắng đục, hơi khô và phát triển giới hạn theo vết cấy [7]

1.2.2.2 Đặc tính probiotic của vỉ khuẩn Lactobacillus acidophilus

Tương tự như các vi khuẩn Lactobacillus, hoạt động probiotic của Lactobacillus acidophilus thông qua các cơ chế phân tử là khả năng cạnh tranh loại

trừ, đối kháng vi khuẩn và điều chỉnh miễn dịch của chủ thể [18]

Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinh vật Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật đường ruột là cạnh tranh

vị trí bám dính Lactobacillus acidophilus có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô

ruột, chống lại sự loại bỏ của nhu động ruột Chúng cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật gây bệnh

như Escherichia coli, Salmonella, Campylobacteria Ngoài ưu thể cạnh tranh vị trí, Lactobacillus acidophilus ừong quá trinh sinh trưởng, phát triển sẽ cạnh tranh

nguồn cơ chất quan trọng cho phát triển của các vi khuẩn có hại Khi tiêu thụ

monosaccharide, Lactobacillus acidophilus đã cạnh tranh nguồn dinh dưỡng chính,

ức chế khả năng phát ữiển của vi khuẩn gây bệnh viêm đại tràng Clostridium difficile, đồng thời bất hoạt thụ thể gây độc tố của chúng [18].

Cùng với cơ chế cạnh tranh loại trừ, Lactobacillus acidophilus còn có hoạt

tính kháng khuẩn gây ức chế và tiêu diệt các vi khuẩn có hại, tạo nên sự cân bằng hệ

sinh thái đường ruột Lactobacillus acidophilus có khả năng chống lại nhiều vi

khuẩn gây bệnh khác nhau, tạo vòng kháng khuẩn từ lOmm đến 16mm và khả năng bền vững với 40 loại kháng sinh Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như sản sinh ra các chất bacteriocin, làm giảm độ pH bỏi tạo ra các acid hữu cơ hay làm giảm độc tố Do bản chất protein, không gây độc và

dễ dàng điều khiển bởi các enzyme phân hủy protein nên việc sử dụng bacteriocin

an toàn hơn các kháng sinh tổng họp Đối vói các sản phẩm thực phẩm, các

bacteriocin và các họp chất tương tự bacteriocin được sản xuất bởi Lactobacillus acidophilus được xem là chất ức chế tự nhiên, được sử dụng để tăng thời hạn sử dụng của sản phẩm thay thế cho các chất bảo quản hóa học [19] Lactobacillus acidophilus có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn gây viêm loét dạ dày Helicobacter pylori cả trong thí nghiệm in-vitro và in-vivo [20].

Trong quá trình sinh trưởng, phát triển trong ruột, Lactobacillus acidophilus

giúp tăng khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng, khử các chất có khả năng gây ung

11

thư, tổng hợp nhiều loại vitamin thiết yếu, kích thích điều hòa hệ miễn dịch, tăng khả năng đề kháng cho cơ thể vật chủ Trong một nghiên cứu ở những trẻ em bị tiêu chảy, Rotavirus nhân lên trong tế bào hình trụ, làm cho phần đỉnh của nhung mao bị

bào mòn dẫn đến một phần màng nhầy của ruột bị phá hủy Sử dụng Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus reuteri sẽ làm giảm một nửa số trẻ em bị nhiễm

Rotavirus và giúp tăng cường hệ thống miễn dịch nhờ cảm ứng tạo kháng thể Immunoglobulin A (IgA) của cơ thể [4] Nhiều thí nghiệm được thực hiện bởi các

nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón Lactobacillus acidophilus sẽ tăng cường hoạt động của các protein liên kết giúp giảm sự hình thành các vết loét trên ruột Lactobacillus acidophilus cũng giúp giảm tác động của các tác nhân dị ứng lên cơ thể thông qua

cải thiện chức năng thành ruột, phân hủy chất gây dị ứng, kích thích IgA [21]

Lactobacillus acidophilus ngoài các đặc tính có lợi của một probiotic điển

hình, chúng còn có các đặc tính đặc trưng riêng cho loài giúp cải thiện các bệnh lý

cơ thể Đối với những người thiếu men phân giải đường lactose, đặc biệt là trẻ sơ sinh và người cao tuổi, khi sử dụng sữa động vật và các sản phẩm từ sữa động vật, đường lactose không được tiêu hóa sẽ chuyển xuống ruột già dẫn đến hội chứng đau

bụng, đầy hơi và tiêu chảy Enzyme ß - galactosidase do Lactobacillus acidophilus

tạo ra, giúp phân giải lactose thành glucose và galactose, giúp người sử dụng có thể tiêu hóa và hấp thu được các dinh dưỡng từ sữa động vật [4] Năm 2010, Ismail và cộng sự khi khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon lên quá trình tổng hợp enzyme

lactase ở Lactobacillus acidophilus trên môi trường MRS, hoạt tính enzyme lactase

thu được khi sử dụng “acid whey” là 12.29U/g, “sweet whey” là 9.83Ư/g và lactose

là 8.6U/g [22]

Cholesterol là thành phần quan trọng của màng tế bào và là tiền chất để tổng họp vitamin D và nhiều loại hormone trong cơ thể Trong một ngày, trung bình cơ thể người tổng họp khoảng 8mg cholesterol và dùng 4mg cholesterol để tổng hợp muối mật, vì vậy, bất kì lượng cholesterol nào được đưa vào cơ thể cũng trở nên dư thừa và gây hại cho cơ thể Cholesterol dư thừa là nguyên nhân chính gây xơ vữa động mạch vành, gây ra chứng đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, suy tim và đột quỵ

[23] Các Lactobacillus acidophilus có khả năng khử cholesterol trong cơ thể theo

cơ chế gắn cholesterol lên màng tế bào, ức chế sự tạo thành cấu trúc micellce của cholesterol, tiết enzyme thủy phân muối mật bile salt hydrolase, đồng thòi kích thích sự phát triển của các vi khuẩn đường ruột khác cũng có khả năng khử

cholesterol Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus casei giúp giảm cholesterol trong cơ thể Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus plantarum làm giảm

cholesterol và tryglyceride trong máu và tăng cường hệ lợi khuẩn đường ruột [5]

Chủng Lactobacillus acidophilus K301 giúp điều chỉnh nồng độ mRNA và protein

của các gen, làm giảm lượng cholesterol trong máu và mở ra tiềm năng điều trị cho bệnh xơ vữa động mạch [23]

Đặc biệt, Lactobacillus acidophilus còn có khả năng tạo ra các chất kháng oxy

hóa là các polysaccharide ngoại bào, phản ứng vói các tác nhân gây stress oxy hóa

trong cơ thể Các nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus sẽ được trình bày cụ thể trong mục 1.4.

Trong sản xuất các sản phẩm probiotic, việc lựa chọn chủng giống đóng vai trò hết sức quan trọng nhằm tạo ra sản phẩm có chất lượng cảm quan tốt hoặc không gây ảnh hưởng đến cảm quan của sản phẩm Chủng probiotic phải có khả năng sống sót qua quá trình sản xuất và ổn định trong quá trình bảo quản sản phẩm Để được thương mại hóa trong chế biến thực phẩm probiotic, các chủng vi khuẩn

Lactobacillus acidophilus phải đáp ứng các tiêu chuẩn probiotic của FAO [24] Ba

tiêu chí cơ bản của quá trình sàng lọc chủng probiotic bao gồm tiêu chí an toàn, tiêu

chí chức năng và tiêu chí kỹ thuật Lactobacillus acidophilus có nguồn gốc từ

người, các thử nghiệm in-vitro và in-vivo cho kết quả an toàn cho người sử dụng

[7] v ề tiêu chí chức năng, Lactobacillus acidophilus sử dụng phải có khả năng

chống chịu điều kiện pH thấp của dịch dạ dày, nồng độ muối mật trong ruột non và khả năng kháng khuẩn Lượng probiotic cần có trong sản phẩm tại thời điểm tiêu thụ ít nhất là 106 CFƯ/ml đến 107 CFU/ml để đạt được những lợi ích cho sức khỏe người sử dụng Mật độ tế bào probiotic thỏa mãn theo tiêu chuẩn probiotic trong sản phẩm sữa chua là 108 CFU/ml [25]

1.3 Quá trình oxy hóa và quá trình kháng oxy hóa trong cơ thể

Quá trình oxy hóa là phản ứng giữa nguyên tử oxy và các electron chưa ghépcặp Các gốc tự do là các dẫn xuất dạng khử của oxy (ROS) và nito (RNS) Đây là

13

những nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử có tính oxy hóa mạnh, có khả năng phản ứng với nhiều họp chất trong tế bào Các ROS thường gặp như anion superoxyde (0 2 ), hydrogen peroxyde (H20 2), gốc hydroxyl (OH ) và các RNS thường gặp như oxyde nitrice (NO'), peroxynitrite (ONOO ) là sản phẩm của các quá trình chuyển hóa sinh học cơ bản của cơ thể Các ROS và RNS cũng được tạo

ra từ các nguồn ngoại sinh là các hóa chất, khói thuốc, thuốc an thần hoặc các bức

xạ mặt trời [5, 26]

Trong cơ thể sinh vật, ROS và RNS được khống chế ở mức độ vừa phải nhờ các chất kháng oxy hóa có bản chất enzyme (catalase, superoxyde dismutase, glutathione peroxydase, ) và các chất kháng oxy hóa không có bản chất enzyme

(vitamin c , vitamin E, tocopherol, peroxidase) được bổ sung hoặc tạo ra từ hệ thống

kháng oxy hóa Hệ thống kháng oxy hóa trong cơ thể hoạt động theo bốn con đường

là tạo phức làm mất khả năng xúc tác của các kim loại chuyển tiếp, làm gián đoạn các phản ứng lan truyền, làm giảm nồng độ các ROS và RNS [26]

Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa quá trình oxy hóa và quá trình kháng oxy hóa trong cơ thể Nguyên nhân có thể do các chất oxy hóa tăng cao, hệ thống kháng oxy hóa suy giảm hoặc các tiền chất kháng oxy hóa nội sinh không đủ đáp ứng nhu cầu cơ thể Các ROS và RNS tăng vượt mức sẽ gây nên các quá trình thoái hóa tế bào như quá trình lipid màng tế bào, protein, enzyme và DNA Các tế bào và

mô bị tổn thương sẽ dẫn đến các bệnh lý như tiểu đường, béo phì, tim mạch, thoái hóa thần kinh, lão hóa và ung thư [27] Đối với hệ tiêu hóa nói riêng, các phản ứng oxy hóa khử liên tục gây tổn thương niêm mạc ruột, làm xuất hiện các triệu chứng viêm mãn tính như viêm loét dạ dày, viêm đại tràng, Mối liên hệ giữa stress oxy hóa và bệnh tật được trình bày tổng quát qua sơ đồ hình 1.1 [5] Với điều kiện môi trường ngày càng ô nhiễm, các rối loạn chuyển hóa này sẽ ngày càng tăng, gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe và chất lượng cuộc sống của con người

Từ nhu cầu cân bằng chuyển hóa trong cơ thể, nhiều nghiên cứu và ứng dụng chất kháng oxy hóa tổng họp đã được thực hiện, tuy nhiên, chúng có một số tác dụng phụ như nguy cơ tổn thương gan và tạo ra các chất ung thư Vì vậy, các họp chất tự nhiên có hoạt tính kháng oxy hóa, không gây hại cho cơ thể là định hướng phát triển cho việc ứng dụng chất kháng oxy hóa trong thực phẩm

Hình 1.1 Mối liên hệ giữa stress oxy hóa và bệnh lý trong cơ thể.

Chất kháng oxy hóa chiết xuất từ thực vật làm tăng khả năng kháng oxy hóa của huyết tương và làm giảm nguy cơ mắc một số bệnh như ung thư, tim mạch và đột quỵ [29] Tuy nhiên, chúng thường tồn tại dưới dạng liên kết vói các phân tử khác, vì vậy hoạt tính kháng oxy hóa không cao Nhiều công trình nghiên cứu đã

cho thấy quá trình lên men của Lactobacillus phân cắt các liên kết này, qua đó hàm lượng họp chất có tính kháng oxy hóa tăng lên Lactobacillus plantarum phân cắt

liên kết glucoside giữa họp chất phenolic và các phân tử đường, giải phóng các

phenolic tự do [5] Đậu nành lên men bởi Lactobacillus vói enzyme ß -

galactosidase, thủy phân liên kết glucoside giữa isoflavone và phân tử đường, giải phóng từ 83.9% đến 98.4% isoflavone làm tăng hoạt tính kháng oxy hóa trong sản phẩm hơn so với sữa đậu nành không lên men [30]

Trong các sản phẩm lên men sữa, các Lactobacillus còn phân cắt các protein

sữa nhờ hoạt tính enzyme protease, tạo thành các peptide ngắn có hoạt tính sinh học như khả năng kháng khuẩn, giảm Cholesterol, kích thích miễn dịch và hoạt tính

kháng oxy hóa [28] Các peptide ngắn khoảng 5 đến 11 amino acid kị nước, vói tínhkhử cao, có thể loại bỏ các gốc tự do, bắt giữ các gốc lipid peroxyl và các ion kimloại [5] Vì vậy, khi lựa chọn chủng giống trong sản xuất sữa lên men, chủng

15

Lactobacillus có khả năng phân giải protein càng cao, càng giải phóng nhiều

peptide, giúp tăng hoạt tính kháng oxy hóa trong sữa [31]

Ngoài ra, các Lactobacillus ngoài quá trình lên men đường tạo thành acid

lactic, chúng còn tổng họp nên các exopolysaccharides (EPS) có hoạt tính kháng oxy hóa EPS là các polysccharide ngoại bào, liên kết lỏng lẻo với bề mặt tế bào hoặc tiết ra môi trường bên ngoài, là rào chắn giúp tế bào chống lại stress acid thấp nhờ giảm sự vận chuyển H+ vào trong tế bào Các EPS này giúp nâng cao sức khỏe như tăng lượng chất kháng oxy hóa nội sinh, cải thiện trí nhớ, ngăn chặn sự chết của các tế bào đại thực bào và chống viêm [5, 32, 33]

Trong quá trình lên men, tùy thuộc vào vi sinh vật lựa chọn làm giống, thành phần của môi trường tăng trưởng và các yếu tố tăng trưởng, điều kiện chế biến bao gồm nhiệt độ và thời gian lên men mà các EPS thu nhận được và hoạt tính kháng

oxy hóa của chúng là khác nhau Các chủng Lactobacillus có họat tính kháng oxy hóa cao như Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei và Lactobacillus helveticus Hỗn hợp EPS được thu nhận và tinh sạch sau quá trình lên men của Lactobacillus helveticus MB2-1 với đon phân từ glucose,

galactose, mannose là khác nhau, đồng thòi hoạt tính kháng oxy hóa của chúng cũng khác nhau, phụ thuộc vào từng giai đoạn lên men [5]

Những chất kháng oxy hóa được Lactobacillus tổng họp trong quá trình lên

men cho thấy có tiềm năng của chúng trong việc nghiên cứu và thương mại hóa các sản phẩm, thực phẩm chức năng giàu hoạt tính kháng oxy hóa

1.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus

Hoạt tính kháng oxy hóa của các vi khuẩn Lactobacillus đã được nghiên cứu

từ những năm đầu thế kỉ 21 Tuy nhiên, các nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa

của Lactobacillus acidophilus mới được quan tâm trong những năm gần đây.

Năm 2011, tác giả Wu và cộng sự đã tiến hành lên men sữa gầy bổ sung dịch

chiết khoai lang tím ựpomoea batalas) bằng các chủng vi khuẩn lactic như Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii và Lactobacillus gasseri

Khoai lang tím chứa nhiều dinh dưỡng cần cho cơ thể như vitamin, khoáng chất, chất xơ và đặc biệt là anthocyanin có hoạt tính kháng oxy hóa Hàm lượng

anthocyanin và hoạt tính kháng oxy hóa thu được sau lên men không những cao hơn

so vói dịch chiết ban đầu mà đồng thời còn giúp ngăn chặn sự chết của các tế bào đại thực bào Nghiên cứu này đã cho thấy tiềm năng để phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng khác nhau từ sữa lên men [33]

Năm 2012, tác giả Zubaidah và cộng sự khi tiếp tục các nghiên cứu từ năm

2010 đã tiến hành so sánh hoạt tính kháng oxy hóa trong cám gạo và sữa tách béo

lên men bỏi Lactobacillus plantarum B2, Lactobacillus plantarum J2, Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus casei Kết quả cho thấy, cả bốn chủng vi khuẩn LAB

đều giúp tăng hoạt động kháng oxy hóa trong các sản phẩm lên men Trong đó, hoạt

tính kháng oxy hóa trong sữa tách béo lên men sử dụng Lactobacillus acidophilus

là 30.42% tăng cao hơn Lactobacillus plantarum B2 là 28.48%, sử dụng Lactobacillus casei tăng cao hơn Lactobacillus plantarum J2 tương ứng là 30.13%

và 29.19% [34, 35]

Cũng trong năm 2012, một thử nghiệm ngẫu nhiên, độc lập của Ejtahed và cộng sự được tiến hành trên những bệnh nhân bị bệnh tiểu đường type 2 được sử

dụng sữa chua bổ sung Lactobacillus acidophilus so với nhóm đối chứng chỉ được

sử dụng sữa chua thông thường Kết quả sau sáu tuần, bệnh nhân sử dụng sữa chua

Lactobacillus acidophilus đã giảm hàm lượng glucose trong máu, tăng hoạt động

của enzyme Superoxide dismutase và glutathione peroxidase hơn so với nhóm còn lại Probiotic đóng vai trò thực sự quan trọng trong hoạt động kháng oxy hóa của cơ thể bệnh nhân [36]

Năm 2013, tác giả Mousavi và cộng sự đã khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa

trong nước ép quả lựu lên men bởi Lactobacillus plantarum và Lactobacillus acidophilus Sau 48 giờ lên men, mật độ vi khuẩn đạt 3.9.108 CFƯ/ml, lượng acid

citric lên men giảm và hoạt tính chất kháng oxy hóa tăng đáng kể (p<0,05) so với

nước ép ban đầu Trong đó, Lactobacillus acidophilus cải thiện hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn so với sử dụng Lactobacillus plantarum Kết quả của nghiên cứu này

cho thấy rằng quá trình lên men bằng vi khuẩn probiotic sẽ làm tăng lợi ích sức khỏe của nước ép quả lựu ban đầu [37]

Cũng trong năm 2013 này, tác giả Amdekar và cộng sự đã tiến hành nghiêncứu lâm sàng trên chuột, nhằm đánh giá khả năng chống viêm của các EPS sinh ra

17

bởi Lactobacillus casei và Lactobacillus acidophilus Hoạt tính kháng oxy hóa từ

hai chủng vi khuẩn này giúp giảm stress oxy hóa trong hoạt dịch (p<0,0001), giảm

số điểm viêm khớp (p<0,05) và chống lại các collagen gây ra viêm khóp (p<0,05) hiệu quả hơn so với sử dụng thuốc chống viêm Indomethacin [32]

Năm 2014, nghiên cứu của Ghany và cộng sự được tiến hành để đánh giá hoạt

tính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus trong việc chống ung thư biểu mô

Ehrlich Ascites Carcinoma (EAC) Các họp chất EPS hóa học và EPS của

Lactobacillus acidophilus cho kết quả tương đương trong việc ức chế sự tăng sinh

của các tế bào EAC Với 700pg/ml EPS bổ sung, khả năng xâm nhập của EPS trong

cả hai trường họp vào các dòng tế bào EAC là tương đương (99% và 93%) EPS

được sản xuất bỏi Lactobacillus acidophilus cho thấy hiệu quả chống ung thư mạnh

mẽ trong cơ thể [13]

Nhiều nghiên cứu ứng dụng hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus trong thực phẩm được tiến hành trong năm 2015 Papademas và cộng

sự trong nghiên cứu so sánh khả năng probiotic của hai chủng vi khuẩn trong lên

men sữa, kết quả cho thấy Lactobacillus acidophilus tạo vòng kháng khuẩn đối vói Salmonella typhimurium lớn hơn Lactobacillus fermentum Đồng thời, sau 24 giờ, hoạt tính kháng oxy hóa khi lên men sữa bằng Lactobacillus acidophilus (65.4 ± 4.7 pmol/ml) cao hơn Lactobacillus fermentum (46.0 ±5.1 pmol/ml) [38].

Năm 2015, Low cùng cộng sự nghiên cứu đánh giá chất lượng, hoạt tính kháng

oxy hóa của kem probiotic Lactobacillus acidophilus được làm bằng đường tinh

luyện sucrose và đường chưa tinh luyện fructose ở nồng độ 15%, 18% và 21%

(w/w) Kem đường fructose 18% cho khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilus cao nhất Hoạt tính kháng oxy hóa của kem đường fructose có xu

hướng cao hơn so với kem đường sucrose Tuy nhiên, không có sự khác biệt cảm quan giữa kem probiotic với các mức đường khác nhau [39]

Năm 2016, tác giả Hougaard và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp

chất polyphenolic và peptide lên sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus khi nuôi cấy trên môi trường Brain - Heart - Infusion và de Man -

Rogosa - Sharpe Kết quả khi bổ sung các chất kháng oxy hóa giúp giảm hình thành

các gốc tự do, thúc đẩy sự phát triển và tăng hoạt tính probiotic của vi khuẩn

Lactobacillus acidophilus [40].

Từ tiềm năng kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus, nhiều nghiên cứu

đã được thực hiện nhằm tăng hiệu suất thu EPS và hoạt tính kháng oxy hóa của

EPS Trong nghiên cứu của Qi Liu năm 2016, một chủng đột biến Lactobacillus acidophilus có hàm lượng EPS cao được sàng lọc bằng đột biến hóa học (0.2%

diethyl sulfate) Các điều kiện nuôi cấy là 0.6ml/l Tween 80, dipotassium hydrogen phosphate 3.6g/l và tratodium citrate 4.1g/l, năng suất EPS tối đa thu được là 3.96 ± 0.08g/l Các điều kiện khai thác là nồng độ cồn 70%, tỷ lệ thu hồi 1:3.6 và thòi gian chiết 31 giờ, năng suất chiết EPS tối đa là 1.48 ± 0.23g/l Sau quá trình tối ưu, EPS của các chủng đột biến đạt 5.12 ± 0.73g/l, cao hom 3.8 lần so với đối chứng chỉ đạt1.05 ± 0.06g/l [41] Các kết quả đã chỉ ra rằng, quá trình sàng lọc và tối ưu giúp tăng đáng kể sản lượng EPS, hứu hẹn một quy mô công nghiệp lớn hom

Năm 2016, tác giả Nazari cùng cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa

nội bào và ngoại bào của Lactobacillus acidophilus bằng phưomg pháp khử Fe3+ Kết quả cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus tăng đáng

kể sau 24 và 72 giờ, giúp hạn chế các tổn thưomg tế bào do stress oxy hóa [42] Cũng trong năm này, Deepak và cộng sự đã chứng minh các EPS thu nhận từ

Lactobacillus acidophilus có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư

Đến nay, các nghiên cứu đã đi sâu hom vào việc so sánh hoạt tính kháng oxy

hóa của Lactobacillus acidophilus vói các chủng vi khuẩn khác trong từng sản

phẩm thực phẩm Tháng 1 năm 2018, Ronghao Chen đã tiến hành các thí nghiệmxác định những thay đổi của sản phẩm, đặc biệt là hoạt tính kháng oxy hóa trong

quá trình lên men nước ép đu đủ của hai chủng Lactobacillus acidophilus và

19

Lactobacillus plantarum Nước ép sau lên men bằng hai chủng vi khuẩn này có

những thay đổi tương tự về pH và hàm lượng đường sau 48 giờ Một lượng lớn các họp chất thơm và acid hữu cơ được tạo ra, đặc biệt là acid lactic tương ứng là 543.18mg/100ml và 571.29mg/100ml Những kết quả phân tích hoạt tính kháng oxy hóa theo bốn phương pháp cho thấy quá trình lên men nước ép đu đủ bằng

Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus plantarum có thể cải thiện dinh dưỡng

và hiệu quả sử dụng của sản phẩm [44]

Tháng 2 năm 2018, Padghan và cộng sự đã bổ sung sữa chua Dahi NCDC-167

(BD4) và sữa chua kết họp Dahi NCDC-167 (BD4), Lactobacillus acidophilus

NCDC-15 trong chế độ ăn của chuột bạch tạng Kết quả cho thấy, các enzyme kháng oxy hóa trong chuột tăng Đồng thòi, hiệu quả kháng oxy hóa của sữa chua

sử dụng Lactobacillus acidophilus cao hơn nhiều so với sữa chua chỉ sử dụng Dahi

NCDC-167 (BD4) [45]

Tóm lại, sự mat cân bằng oxy hóa là nguyên nhân gây ra các bệnh lý trong cơ thể Các vi khuẩn đường ruột, đặc biệt là Lactobacillus có vai trò quan trọng trong việc chống lại quá trình oxy hóa và tăng cường hệ miễn dịch cơ thể Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn probiotic thông dụng trong lên men thực phẩm, cải thiện dinh dưỡng và hiệu quả sử dụng của thực phẩm Các vi khuẩn này

có khả năng sinh chất kháng oxy ngoại bào, hoạt tính kháng oxy hóa tương tự chất kháng oxy hóa tổng hợp, có phần hiệu quả và an toàn hơn trong việc giảm stress oxy hóa, ức chể tể bào ung thư, kháng khuẩn và chổng viêm Ngoài ra, các chất kháng oxy hóa trong môi trường nuôi cấy giúp thúc đẩy sự phất triển và tăng cường các hoạt tính probiotic của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus.

Các sản phẩm từ sữa, đặc biệt là sữa chua đã trở thành thực phẩm bỗ sung thông dụng trong bữa ăn hằng ngày bởi những lợi ích toàn diện cho sức khỏe Lactobacillus acidophilus là giống khởi động đã được dùng trong sản xuất sữa chua theo quy mô công nghiệp Lactobacillus acidophilus cho thấy tiềm năng trong

sử dụng làm giống khởi động quá trình lên men tạo thực phẩm chức năng probiotic giàu hoạt tính kháng oxy hóa.

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Các khảo sát được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thuộc

bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian thực hiện thí nghiệm từ tháng 01 năm 2017 đến tháng 12 năm 2017

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu bao gồm bộ bốn chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus (BK1, BK2, BK3 và BK4) có nguồn gốc từ giống vi sinh vật chuẩn

thuộc bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học Bách khoa - Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh

2.3 Vật liệu và hóa chất

2.3.1 Dụng cụ và thiết bị

Các dụng cụ thí nghiệm vi sinh phổ biến trong phòng thí nghiệm được sử dụng như ống nghiệm, đĩa Peữi, đèn cồn, que cấy vòng, que cấy trải, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống đong, pipet và pipetman

Các thiết bị phục vụ nghiên cứu bao gồm:

- Bể điều nhiệt Sanofi aventis BHS - 2

- Cân điện tử Sartorius CP 2202 s và Boeco

- Kính hiển vi quang học Olympus

- Máy đo quang phổ CT - 2200 spectroiphotometer

- Máy lắc ổn nhiệt Stuart SI 150

- Máy ly tâm Hettich zentrifugen Mikro 22 R

- Máy phá vỡ tế bào bằng siêu âm

- Nồi hấp tiệt trùng Hirayama HV85

2.3.2 Hóa chất

Các hóa chất phục vụ nghiên cứu bao gồm:

- Hóa chất nhuộm Gram gồm crystal violet, lugol, alcohol 90% và fucshin

- Hóa chất dùng trong thí nghiệm khảo sát khả năng khử cholesterol của

Lactobacillus acidophilus gồm KOH 33%, ethanol 95%, hexane, nước cất

hai lần, 0 - phthalaldehyde và H2S 0 4

- Hóa chất dùng trong thí nghiệm khảo sát khả năng sinh acid lactic của

Lactobacillus acidophilus gồm NaOH 0.2N (8g NaOH ữong 1000ml nước

cất hai lần) và phenolphtalein 1% (O.Olg phenolphtalein trong 10ml ethanol 95%)

- Hóa chất dùng trong thí nghiệm khảo sát tổng năng lực khử của

Lactobacillus acidophilus bao gồm:

+ Đệm phosphate 0.2M (71.7g Na2HP04.12H20 , 27.8g NaH2P 0 4 trong 1000ml nước cất hai lần, pH 6.6)

+ Kali ferricyanid 1% (lO.lg/1 K3[Fe(CN6)] trong 1000ml nước cất hai lần).+ Tricloacetic acid - TCA 10% (lOg CCI3COOH trong 100ml nước cất hai lần)

+ Sắt (III) clorua 0.1% (1.67g FeCl3.6H20 trong lOOOml nước cất hai lần).+ Acid ascorbic sigma 1.5% (0.015g C6H80 6 trong lml nước cất hai lần)

- Hóa chất dùng trong thí nghiệm khảo sát khả năng khử gốc tự do của

Lactobacillus acidophilus bao gồm:

+ DPPH 0.8mM (19.72mg DPPH trong 200ml ethanol 95%)

+ Acid ascorbic sigma 1% (0.015g C6H80 6 trong 1ml nước cất hai lần)

+ Ethanol 95%

2.3.3 Môi trường nuôi cấy vỉ sinh vật

Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°c

trong 15 phút và bảo quản ở nhiệt độ phòng, thòi gian sử dụng trong vòng 14 ngày

[MT01] Môi trường MRS - Broth dùng để nhân giống, nuôi cấy và khảo sát

Lactobacillus acidophilus.

[MT07] Môi trường Nutrient Broth - Agar dùng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

của Lactobacillus acidophilus và giữ giống Bacillus cereus ATCC 11778, thành

phần tương tự như [MT06], bổ sung 15% agar

23

[MT08] Môi trường Lysogeny Broth

ATCC 8739

[MT09] Môi trường Lysogeny Broth

khuẩn của Lactobacillus acidophilus 1

thành phần tương tự như [MT08], bổ S I

ể tăng sinh và nuôi cấy Escherichia coli

pH 7.4

Agar dùng để khảo sát hoạt tính kháng

L giữ giống Escherichia coli ATCC 8739,

g 15% agar

[MT10] Môi trường sữa tươi tiệt trùng Vinamilk dùng để lên men tạo sản phẩm sữa

chua bởi Lactobacillus acidophilus.

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm trong đề tài được bố trí tổng quát theo sơ đồ hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

2.4.1 Khảo sát các đặc tính của Lactobacillus acidophilus

2.4.1.1 Khảo sát đặc tính sinh học

Mục đích khảo sát đặc tính sinh học để kiểm tra tính thuần và hình dạng vi khuẩn, khảo sát đường cong sinh trưởng của vi khuẩn, từ đó lựa chọn thời điểm thu nhận sinh khối cao nhất cho quá trình lên men

a Quan sát đại thể

Nguyên tắc: Vi khuẩn LAB khi phát triển trong môi trường MRS sẽ hình thành các dạng khuẩn lạc đặc trưng cho loài

Tiến hành thí nghiệm: Lactobacillus acidophilus được nuôi cấy trong [MT01],

ủ ở nhiệt độ 37°c trong 48 giờ, quan sát và nhận xét các đặc điểm hình thái, màu

sắc, kích thước, tính chất bề mặt của khuẩn lạc, chọn lọc khuẩn lạc đặc trưng

b Quan sát vi thể

Nguyên tắc: Quan sát tế bào vi khuẩn theo phương pháp nhuộm Gram của Hans Christan Gram (1884) [8]

Tiến hành thí nghiệm: Lactobacillus acidophilus được nuôi cấy trong ống

nghiệm chứa [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°c trong 24 giờ, cố định vết bôi vi khuẩn và

nhuộm thuốc nhuộm theo thứ tự gentian, lugol, rửa bằng alcohol 90° và nhuộm

fucshin, quan sát tiêu bản với vật kính dầu xioo và ghi nhận khả năng bắt màu

Gram của vi khuẩn

c Khảo sát đường cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus

Nguyên tắc: Quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật ở điều kiện nuôi cấy tĩnh gồm bốn pha là pha lag, pha log, pha cân bằng và pha suy vong Trong lên men, tùy mục đích sử dụng để lựa chọn thời điểm ngưng nuôi cấy vi sinh vật

Tiến hành thí nghiệm: Nhân giống cấp 1, thể tích cấy 10% trong ống nghiệm

chứa 10ml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°c trong 24 giờ Nhân giống cấp 2, thể tích cấy 10% trong bình tam giác chứa 100ml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°c, đo mật độ quang

OD610 sau mỗi 2 giờ Dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị mật độ quang OD610 và mật độ vi khuẩn (log (CFU/ml)) Từ đó suy ra mật độ vi khuẩn (log

25

(CFU/ml)) tương ứng với giá trị mật độ quang OD610 tại mỗi thời điểm, vẽ đường

cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus [42]

Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo công thức sau:

Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình trên ba đĩa Petri

Lactobacillus acidophilus, từ đó lựa chọn chủng vi khuẩn cho các thí nghiệm sau.

a Khảo sát khả năng chịu môi trường acid dạ dày nhân tạo (SGJ)

Nguyên tắc: Theo phương pháp của Zhou và cộng sự (2009) [43], dựa vào khả năng chịu pH thấp và khả năng tồn tại sau thòi gian tiêu hóa ở dạ dày của các chủng

Lactobacillus acidophilus.

Tiến hành thí nghiệm: Nhân giống cấp 1, thể tích cấy 10% trong ống nghiệm

chứa 10ml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°c trong 24 giờ Nhân giống cấp 2, thể tích cấy 10% trong bình tam giác chứa 50ml [MT03], ủ ở nhiệt độ 37°c, đo mật độ quang

OD610 tại các thời điểm 0 phút, 30 phút, 60 phút và 90 phút Mau đối chứng là 10%

vi khuẩn trong 50ml [MT01]

Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn (log (CFU/ml))

b Khảo sát khả năng chịu nồng độ muối mật 0.3% (SIF)

Nguyên tắc: Theo phương pháp của Shokryazdan và cộng sự (2014) [47], dựa vào khả năng chịu muối mật và khả năng tồn tại sau thời gian tiêu hóa ở ruột non

của các chủng Lactobacillus acidophilus. Vi khuẩn di chuyển ữong hệ tiêu hóa từ

dạ dày đến ruột non, là nhưng nơi có pH thấp, YÌ vậy, thí nghiệm này được thiết kế

ở pH thấp nhằm mô phỏng gần với môi trường thực tế

Tiến hành thí nghiệm: Nhân giống cấp 1, thể tích cấy 10% trong ống nghiệm

chứa lOml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°c trong 24 giờ Nhân giống cấp 2, thể tích cấy 10% trong ống nghiệm chứa lOml [MT04], ủ ở nhiệt độ 37°c, đo mật độ quang

OD610 tại các thời điểm 0 giờ, 2 giờ và 4 giờ Mầu đối chứng là 10% vi khuẩn trong 50ml [MT01]

Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn (log (CFU/ml))

c Khảo sát khả năng khử cholesterol

Nguyên tắc: Theo phương pháp của Noh và cộng sự (1997) [48], định lượng cholesterol còn lại trong môi trường và khả năng sống sót của vi khuẩn

Tiến hành thí nghiệm: Nhân giống cấp 1, thể tích cấy 10% ữong ống nghiệm

chứa lOml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°c trong 24 giờ Nhân giống cấp 2, thể tích cấy 10% trong ống nghiệm chứa lOml [MT05] ở nhiệt độ 37°c trong 150 phút Ly tâm

dịch nuôi cấy 4000 vòng trong 20 phút, ủ lml dịch ly tâm với lml KOH 33% và

2ml ethanol ở nhiệt độ 60°c trong 15 phút Bổ sung 3ml hexane, vortex Tiếp tục

thêm 2ml nước cất, vortex Hòa tan lml lóp hexane vào 2ml O-phthalaldehyde trong

10 phút, thêm 0.5ml H2S 0 4, vortex Mau đối chứng là môi trường [MT05] không chứa vi khuẩn Đo mật độ quang OD550 nm

Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng cholesterol (pg/ml) trong môi trường và mật độ

vi khuẩn (log (CFU/ml))

d Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

Nguyên tắc: Theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Papademas và cộng sự (2015) [38], hoạt tính ức chế vi khuẩn chỉ thị của các chủng probiotic được biểu hiện khi đường kính vòng vô khuẩn rộng từ 2mm so với lỗ thạch

Tiến hành thí nghiệm: cấy 10% giống trong ống nghiệm chứa lOml [MT01], ủ

ở nhiệt độ 37°c trong 24 giờ Trải 100|a.l Bacillus cereus ATCC 11778 nuôi cấy 12

giờ trên đĩa Petri chứa 15ml [MT07], đục giếng thạch đường kính 5mm Bổ sung

50pl giống Lactobacillus acidophilus vào giếng thạch, ủ ở nhiệt độ 4°c trong 15

27

phút để dịch huyền phù tế bào khuếch tán trong giếng và ủ ở nhiệt độ 37°c trong 24

giờ để vi khuẩn phát triển Tiến hành tương tự với Escherichia coli ATCC 8739 trên đĩa Petri chứa 15ml [MT09] Mau đối chứng là [MT01] không chứa vi khuẩn

Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng vô khuẩn xuất hiện xung quanh giếng thạch D - d (mm)

e Khảo sát khả năng sinh acid lactic

Nguyên tắc: Theo phương pháp chuẩn độ Thomer [44], dựa vào phản ứng giữa acid lactic và dung dịch NaOH 0.2N, làm đổi màu thuốc thử phenolphthalein 1% từ không màu sang màu hồng nhạt

Tiến hành thí nghiệm: Nhân giống cấp 1, thể tích cấy 10% trong ống nghiệm

chứa 10ml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°c trong 24 giờ Nhân giống cấp 2, thể tích cấy 10% trong bình tam giác chứa 100ml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°c Pha loãng 10ml

giống trong 20ml nước cất hai lần, thêm 1 - 2 giọt phenolphthalein 1%, tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.2N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt, bền trong 1 phút Mau đối chứng là [MT01] không chứa vi khuẩn

Chỉ tiêu theo dõi là hàm lượng acid lactic trong môi trường (£a), được tính bằng độ Thomer (°T) theo công thức sau:

Ea = (V - v0).0.9

Trong đó: V là số mililit NaOH 0.1N dùng để trung hòa 10ml dịch nuôi cấy

Vo là số mililit NaOH 0.1N dùng để trung hòa 10ml dịch đối chứng

2.4.1.3 Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa

Mục đích: Hoạt tính kháng oxy hóa sẽ được xác định thông qua khả năng khử ion Fe3+ trong phân tử K3[Fe(CN)6] và khử ion H+ trong gốc tự do DPPH Từ đó, lựa chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng oxy hóa cao cho các thí nghiệm tiếp theo

a Xác định tổng năng lực khử

Nguyên tắc: Theo phương pháp của Lee-Wen Chang và cộng sự (2002), năng lực khử tỉ lệ thuận với độ hấp thu ánh sáng [49]

Tiến hành thí nghiệm: Nhân giống cấp 1, thể tích cấy 10% trong ống nghiệm

chứa lOml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°c trong 24 giờ Nhân giống cấp 2, thể tích cấy 10% trong bình tam giác chứa 20ml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°c trong 24 giờ Tiến

hành ly tâm dịch nuôi cấy vi khuẩn với 4000 vòng trong 20 phút

Thí nghiệm tổng năng lực khử của dịch ngoại bào: Hòa 2.5ml dịch ly tâm với

2.5ml đệm phosphate 0.2M và 2.5ml K3[Fe(CN6)] 1%, ủ ở nhiệt độ 50°c trong 20 phút Bổ sung 2.5ml CCI3COOH 10%, ly tâm 650 vòng trong 10 phút Hòa 5ml

dịch ly tâm với 5ml nước cất hai lần và lml FeCl3 0,1% Mau đối chứng âm là môi trường [MT01] không chứa vi khuẩn, mẫu đối chứng dương là acid ascorbic

Thí nghiệm tổng năng lực khử nội bào: Tế bào thu được sau ly tâm được hòa với 2.5ml [MT01], phá tế bào bằng sóng siêu âm trong 1 phút Tiến hành thí nghiệm với 2.5ml dịch phá tế bào tương tự thí nghiệm của dịch ngoại bào

Chỉ tiêu theo dõi: tổng năng lực khử theo độ hấp thụ quang OD700

b Xác định khả năng khử gốc tự do

Nguyên tắc: Theo phương pháp của Li và cộng sự (2012), khả năng khử gốc tự

do tỉ lệ nghịch với độ hấp thu ánh sáng [44]

Tiến hành thí nghiệm: Nhân giống cấp 1, thể tích cấy 10% ữong ống nghiệm

chứa lOml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°c trong 24 giờ Nhân giống cấp 2, thể tích cấy 10% trong bình tam giác chứa 20ml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°c Dịch nuôi cấy vi

khuẩn được ly tâm 13000 vòng trong 5 phút

Thí nghiệm khả năng khử DPPH của dịch ngoại bào: Hòa 40pl dịch ly tâm với

460pl ethanol 95% và 1.5ml DPPH 0.8mM, ủ tối ở nhiệt độ 37°c trong 30 phút

Mầu đối chứng âm là môi trường [MT01] không chứa vi khuẩn, mẫu đối chứng dương là acid ascorbic Đo độ hấp thụ quang OD517 của mẫu

Thí nghiệm khả năng khử DPPH nội bào: Tế bào thu được sau ly tâm được hòa với 40pl [MT01] và 460pl ethanol 95%, phá tế bào bằng sóng siêu âm trong 1

phút, thêm 1.5ml DPPH 0.8mM, ủ tối ở nhiệt độ 37°c trong 30 phút.

Chỉ tiêu theo dõi là hiệu suất khử gốc tự do (AA %) được tính theo công thức sau:

29

AA = (Ablank i4mẫu) 100%

' ^blank '

Trong đó: Ablank là độ hấp thụ quang OD517 của mẫu đối chứng âm

Am|u là độ hấp thụ quang OD517 của mẫu cần xác định

2.4.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối Lactobacillus acidophilus

giàu hoạt tính kháng oxỵ hóa

2.4.2.1 Sàng lọc yếu tố chỉnh

Mục đích: Môi trường [MT01] được thay thế bởi nguồn đường khác là sucrose Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến mật độ vi khuẩn và hoạt tính kháng oxy hóa, lựa chọn nồng độ sucrose phù họp cho các thí nghiệm tiếp theo

Tiến hành thí nghiệm: Nhân giống cấp 1, thể tích cấy 10% ừong ống nghiệm

chứa 10ml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°c trong 24 giờ Nhân giống cấp 2, thể tích cấy

10% trong bình tam giác chứa 50ml [MT01], thay đổi nồng độ đường sucrose là

6%, 8% và 10%, ủ ở nhiệt độ 37°c Đo mật độ quang OD610 sau mỗi 2 giờ.

Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn (log (CFU/ml))

2.4.2.2 Tối ưu hóa hai hàm mục tiêu

Mục đích: Khảo sát điều kiện lên men phòng thí nghiệm là pH môi trường, nhiệt độ lên men và thời gian lên men, từ đó tối ưu hóa hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Y1 và hoạt tính kháng oxy hóa Y2

Tiến hành thí nghiệm:

Bước 1: Chọn thông số tối ưu hóa và các yếu tố ảnh hưởng

- Yếu tố cố định: tỷ lệ giống cấy 10%

- Chỉ tiêu theo dõi: Hàm mục tiêu Yi là mật độ quang (OD6 io ) của dịch nuôi cấy tương ứng vói mật độ vi khuẩn (log (CFU/ml)) Tương tự, hàm mục tiêu

Y2 là mật độ quang (OD700) của dịch nuôi cấy tương ứng với hoạt tính kháng

oxy hóa là tổng năng lực khử Ba yếu tố ảnh hưởng được khảo sát là pH môi

trường Zi, nhiệt độ nuôi cấy z 2 và thòi gian nuôi cấy Z3.

Bước 2: Xác định mức cơ sở, khoảng biến thiên và mức biến thiên của các yếu

tố ảnh hưởng

Xác định mức trên, mức dưới, mức cơ sở và các khoảng biến thiên của các yếu tố ảnh hưởng

Khoảng biến thiên theo trục Zj là: Ả j = — (j = 1, 2, 3)

Bước 4: Tiến hành thí nghiệm tại tâm, thí nghiệm cánh tay đòn và thu nhận các giá trị thực nghiệm

Bước 5: Xác định phương trình quy hoạch thực nghiệm

- Phương trình hồi quy có dạng:

Y = bo + b jX j + b2X2+ b3X 3 + bi2X3X2 + b j3X jX 3 + b23X2X3 + bj23XjX2X3

- Các hệ số hồi quy ¿j được tính theo công thức sau:

b _ Ỉ Ề i X i b _ Z f a Ị ( X i X k -)Yt

Trong đó: bQ, blf b2, b3 là các hệ số bậc một của phương trình hồi quy

¿12» ¿13, ¿23» ¿123 là các hệ Số tương tác của các cặp yếu tố

X1,X2,X 3 là các biến độc lập

- Phương sai tái hiện Sth đối với 3 thí nghiệm tại tâm (thí nghiệm 9, 10, 11)

được suy ra theo công thức:

E L i M - 7 ° f

Trong đó: là giá trị y tại tâm thực nghiệm

y° là giá trị trung bình y tại tâm thực nghiệm

n - 1 là bậc tự do của phương sai tái hiện

31