Nghiên cứu ảnh hưởng của stress hormone dopamine lên các yếu tố độc lực của vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây hội chứng tôm chết sớm (early mortality syndrome (EMS)) ở đồng bằng sông cửu long, việt nam

LỜI CAM ĐOANTôi xin cam đoan, đề tài tốt nghiệp: “Nghiên cứu ảnh hưởng của stress hormone Dopamine lên các yếu tố độc lực của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng tôm chết sớm

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, đề tài tốt nghiệp: “Nghiên cứu ảnh hưởng của stress

hormone Dopamine lên các yếu tố độc lực của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng tôm chết sớm (Early mortality syndrome

(EMS)) ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam” là công trình nghiên cứu thực

của cá nhân tôi, được thực hiện trên lý thuyết và kiến thức và sự hướng dẫn củaTh.s Nguyễn Thảo Sương

Số liệu được dùng trong đề tài hoàn toàn trung thực, có nguồn gốc cụ thể, rõràng Đề tài có dùng tài liệu tham khảo được đăng tải trên sách, tạp chí, báocáo,trang web, các từ khóa liên quan đến khóa luận, đồ án trong và ngoài nước

TP.HCM, ngày 20 tháng 09 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Tô Thị Thơm

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, em đã nhận được nhiều sự giúp

đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ từ phía gia đình thầy cô và bạn bè Nhờ đó mà em đã hoànthành đồ án được như mong muốn, nay cho phép em được gửi lời cảm ơn sâu sắc vàchân thành đến:

Đầu tiên em xin cảm ơn Th.s Nguyễn Thảo Sương người trực tiếp hướng dẫn

đồ án trong thời gian vừa qua Trong suốt thời gian thực hiện, chị đã tận tình hướngdẫn, hỗ trợ cũng như truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp em giải quyết các vấn đềnảy sinh trong quá trình làm đồ án và hoàn thành đồ án đúng định hướng ban đầu

Tiếp đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến T.S Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh,Viện Nghiên cứu nôi trồng thủy sản 2, đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợicho em thực hiện tốt đồ án này Đồng thời cảm ơn các anh chị, thầy cô của ViệnNghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2, đã tạo điều kiện thuận lợi cho mượn dụng cụthí nghiệm và hỗ trợ em trong quá trình làm đồ án tại Viện

Sau đó, em xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Công nghệTP.HCM và các thầy cô khoa Công nghệ- Thực phẩm- Môi trường đã tận tình giúp

đỡ em trong suốt những năm học tại trường

Cuối cùng, em xin cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ của gia đình, bạn bè, anh chịthầy cô đã động viên

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó Chúc tất cảmọi người sức khỏe và hạnh phúc

TP.HCM, ngày 20 tháng 09 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Tô Thị Thơm

Đồ án tốt nghiệp

i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AHPNS Acute hepatopancreatic necrosis Syndrome

IHHNV Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus

TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose

WSSV White spot Syndrome Virus

FAO Food and Agricultute Organization

Bảng 3.2: Tỉ số giữa đường kính vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc làm dung

huyết, phân giải casein, phân giải chitin và đường kính khuẩn lạc có/không sự bổ sung của stress hormone

41

Bảng 3.3: Đường kính vùng di động các chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm) sau 16h

có/không bổ sung stress hormone và chất ức chế stress hormone

43

Bảng 3.4: Tổng số tôm chết sau khi số tôm trong bể chết gần 50%

45

Bảng 3.5 : Tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 8 ngày thí ngiệm cảm nhiễm với

V Parahaemolyticus có/không nuôi cấy với Dopamine và chất ức chế LED 209 45

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình1.1: Vi khuẩn V.parahaemolyticus trên môi trường TCBS, CHrom agar 5

Hình 1.2: Vi khuẩn V.parahaemolyticus 6

Hình 1.3: Bệnh EMS/AHPNS trên tôm 7

Hình 1.4: Tôm nhiễm bệnh EMS 11

Hình 1.5: Stress hormone 19

Hình 1.6: LED 209 21

Hình 1.7: Tổng sản lượng tôm nuôi trên thế giới 23

Hình 1.8: Tôm thẻ chân trắng 25

Hình 1.9: Bệnh WSSV trên tôm 26

Hình1.10 : Mô tế bào bị bệnh hoại tử cơ 27

Hình 1.11: Bệnh TSV trên tôm 28

Hình 1.12: Bệnh IHHNV trên tôm 30

Hình 2.1: Bố trí thí nghiệm 38

Hình 3.1: Khả năng di động của Vibrio parahaemolyticus ở lần lượt các nồng độ ĐC, 50µM, 100µM 41

Hình 3.2: Biểu đồ đường kính vùng di động các chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm) sau 16h 41

Hình 3.3: Biểu đồ tỉ số giữa đường kính vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc phân giải chitin và đường kính khuẩn lạc có/không sự bổ sung của stress hormone 42

Hình 3.2: Khả năng dung huyết của Vibrio parahaemolyticus ở lần lượt các nồng độ ĐC, 50µM, 100µM 43

Hình 3.3: Tỉ số giữa đường kính vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc làm dung huyết đường kính khuẩn lạc có/không sự bổ sung của stress hormone 43

Hình 3.3: Khả năng thủy phân casein của Vibrio parahaemolyticus ở các nồng độ ĐC,50µM, 100µM 44

Hình 3.4: Biểu đồ tỉ số giữa đường kính vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc phân

Hình 3.5: Đường kính vùng di động các chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm) sau 16h

có/không bổ sung stress hormone và chất ức chế stress hormone 46

Hình 3.6: Thí nghiệm 1 (N=16) tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 8 ngày thí

ngiệm cảm nhiễm với V Parahaemolyticus có/không nuôi cấy với Dopamine và chất

ức chế LED 209 48

Hình 3.7 : Thí nghiệm 2 ( N=12) tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 8 ngày thí

ngiệm cảm nhiễm với V Parahaemolyticus có/không nuôi cấy với Dopamine và chất

ức chế LED 209……… 48

Hình 3.8 : Thí nghiệm 3 ( N=20) tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 8 ngày thí

ngiệm cảm nhiễm với V Parahaemolyticus có/không nuôi cấy với Dopamine và chất

ức chế LED 209……… 49

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH ẢNH Error! Bookmark not defined LỜI MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Tình hình nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

2 4 Mục đích nghiên cứu 2

5 Phương pháp nghiên cứu 2

6 Các kết quả đạt được của đề tài 3

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

5 1.1 Vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus 5

1.1.1 Phân loại 5

1.1.2 Đặc điểm 5

1.1.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn gây bệnh Vibrio parahaemolyticus trong nuôi trồng thủy sản

7 1.1.4 Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 13

1.1.5 Quy chế biểu hiện gen độc lực 18

1.1.6 Phương pháp kiểm soát các yếu tố độc lực 20

Đồ án tốt nghiệp1.2 Stress hormone catecholamine 22

Đồ án tốt nghiệp

1.2.1 Ảnh hưởng của catecholamine lên sự tăng trưởng của vi khuẩn

22 1.3 Tôm thẻ chân trắng 23

1.3.1 Vai trò của ngành công nghiệp nuôi tôm thẻ chân trắng 23

1.3.2 Đặc điểm sinh học của tôm thẻ chân trắng 24

1.3.3 Một số bênh thường gặp trên tôm thẻ chân trắng 26

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 33

2.2 Vật liệu nghiên cứu 33

2.2.1 Hóa chất và môi trường 33

2.2.2 Dụng cụ 34

2.3 Phương pháp nghiên cứu 34

2.3.1 Nguồn mẫu phân lập 34

2.3.2 Thí nghiệm in vitro 35

2.3.3 Thí nghiệm in vivo 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Ảnh hưởng của stress hormone dopamine lên các yếu tố độc lực của Vibrio parahaemolyticus in vitro 39

3.1.1 Ảnh hưởng lên khả năng di động 39

3.1.2 Ảnh hưởng lên khả năng dung huyết, thủy phân casein và thủy phân chitin………4

0 3.3 Ảnh hưởng của stress hormone dopamine tới độc lực của Vibrio parahaemolyticus cảm nhiễm trên tôm thẻ chân trắng

44 3.3.1 Kết quả thí nghiệm LD50 44

3.3.2 Kết quả thí nghiệm challenge 45

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

4.1 Kết luận 49

4.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

có thể nói tôm thẻ chân trắng đã góp phần đáng kể vào sự nghiệp kinh tế xã hội củađất nước nói chung và Đồng bằng song Cửu Long nói riêng Đến năm 2006, nhậnthấy Đồng bằng sông Cửu Long có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển ngànhnuôi tôm thẻ chân trắng nên chính phủ quyết định đầu tư và chính thức nuôi tôm thẻchân trắng trên diện rộng mở ra một chân trời mới với đầy cơ hội và thử thách chonghành nuôi tôm ở nước ta.

Do nguồn lợi nhuận thu được từ nghề nuôi tôm là khá lớn, mặt khác quy môngày càng được mở rộng, nhưng môi trường không được vệ sinh sạch sẽ, cùng với

sự quản lý không chặt chẽ đã dấn đến tình trạng khi tôm bị nhiễm bệnh lan ra các aonuôi khác là rất nhanh, chính điều này kiến cho nghề nuôi tôm của nước ta rơi vàonhiều mối nguy phát triển không bền vững Việc làm tự phát, không đủ kiến thức vềnghề nuôi tôm như sử dụng hóa chất, kháng sinh bừa bãi, đã gây ô nhiễm môitrường sinh thái dẫn đến tôm bị bệnh chết hàng loạt như một số năm trở lại đây,thêm vào đó là việc biến đổi khí hậu toàn cầu dẫn đến sự mất cân bằng làm cho tômkhông sống khỏe mạnh và nhanh chết Chỉ trong vòng 10 năm nuôi nghề nuôi tômlại điêu đứng vì tôm thẻ chân trắng bị mắc bệnh và chết hàng loạt ví dụ như: bệnhđốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh hoại tử cơ,… đặc biệt những năm trở lại đây bệnhtôm chết sớm (Early Mortality Syndrome- EMS) hay còn được gọi là chứng hoại tửgan tụy cấp (Acute hepatopancreatic necrosis Syndrome- AHPNS) ở Đồng bằngsông Cửu Long đã gây thiệt hại lớn về kinh tế cũng như môi trường sống của tômthẻ chân trắng

Theo TS Lightner và các cộng sự nguyên nhân gây bệnh được xác định là do

chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tạo ra một độc tố mạnh làm phá hủy nhanh

mô và làm rối loạn chức năng gan tụy trong hệ thống tiêu hóa của tôm

2 Tình hình nghiên cứu

Một số nghiên cứu gần đây đã xác định rằng stress hormone catecholaminelàm gia tăng độc lực của vi khuẩn và có thể bị ức chế bằng cách sử dụng các chấtđối kháng catecholamine LED 209 (sperandio et al, 2003) Tuy nhiên nghiên cứunày là rất hiếm và cho đến nay chưa có báo cáo nào về tác dụng của stress hormone

và chất ức chế stress hormone ảnh hưởng tới độc lực của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus chủng gây bệnh EMS trên tôm thẻ chân trắng.

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Trong việc tìm kiếm nỗ lực nhằm tìm kiếm một chiến lược mới để kiểm soátbệnh EMS ở Đồng bằng sông Cửu Long Ở đề tài này, chúng tôi sẽ tập trung khảosát và tìm ra mối quan hệ giữa stress hormone Dopamine và chất ức chế stresshormone LED 209 lên độc lực của vi khuẩn VP gây bệnh tôm chết sớm trên tôm thẻchân trắng

Mục đích việc hoàn thiện các mục tiêu trên là giúp làm sáng tỏ cơ chế độc lực

của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, ngăn chặn và giảm thiểu tác động cả bệnh

EMS về sản xuất tôm thẻ chân trắng ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam

5 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp thu thập thông tin

Phương pháp thu thập thông tin bao gồm:

- Phương pháp nghiên cứu tài liệu

- Phương pháp thực nghiệm

Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu sau khi thu thập được sẽ được xử lý bằng Statgraphics Centurion

Mức khác biệt có ý nghĩa thống kê được đề nghị là p < 0.05.

6 Các kết quả đạt được của đề tài

Đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của stress hormone Dopamine (Do) lên các

yếu tố độc lực của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hôi chứng tôm chết sớm

(Early mortality syndrome (EMS)) ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam” thuđược kết quả như sau:

Thí nghiệm invitro

- Khả năng di động:

Ảnh hưởng stress hormone dopamine: thử nghiệm khả năng di động

của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở các nồng độ ĐC, 50µM,

100µM cho thấy có sự khác biệt giữa có và không bổ sung stresshormone Dopamine

Ảnh hưởng LED 209: thử nghiệm khả năng di động của vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus ở các nồng độ đối chứng (ĐC), 50µM,

LED 0.05µM LED 209 cho thấy LED 209 có sự khác biệt với đốichứng LED 209 Ở nồng độ 0.05µM không có sự khác biệt vớistress hormone dopamine

- Khả năng dung huyết, khả năng thủy phân casein, khả năng phân giải

chitin: ở cả 3 thử nghiệm này đều thấy vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

có khả năng dung huyết, thủy phân casein, phân giải casein nhưng không

có sự khác biệt quá lớn giữa các môi trường có/không bổ sung stresshormone Dopamine và chất ức chế stress hormone LED 209

Chất ức chế stress hormone LED 209: LED 209 ở nồng độ 0.1µM ởthí nghiệm 2 và 3 không thể hiện rõ tác dụng làm giảm độc lực của

VP khi thí nghiệm cảm nhiễm trên tôm thẻ chân trắng, ở nồng độ0.05µM thể hiện rõ sự khác biệt ở các thí nghiêm 1, 2, 3

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Kết cấu đồ án tốt nghiệp bao gồm: 3 chương

- Chương 1: Tổng quan tài liệu

- Chương 2: Vật liệu và phương pháp

- Chương 3: Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus

Theo phân loại của Bergey, Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, hình

que hoặc cong, kích thước 0.3-0.5x1.4-2.6 μm, được tìm thấy trong nước lợ hoặcnước mặn, khi ăn vào gây bệnh tiêu hóa ở người Chúng có khả năng di động ( diđộng bằng tiêm mao) và không sinh bào và thử nghiệm oxidase dương tính, có khả

năng phát sáng, Vibrio parahaemolyticus trên môi trường CHrom agar có màu tím hoa cà, trên môi trường TCBS thường có màu xanh ( Nguồn: Makino, K., Oshima, K., Kurokawa, K., Yokoyama, K., Uda, T., Tagomori, K., Iijima, Y., Najima, M., Nakano, M., Yamashita, A., 2003 Vibrio parahaemolyticus: a pathogenic mechanism distinct from that of V cholerae).

Hình1.1: Vi khuẩn V.parahaemolyticus trên môi trường TCBS, CHrom agar.

Các loại V.parahaemolyticus cũng có thể lây lan từ bố mẹ và ấu trùng Ví dụ

như mầm gây bệnh nên bệnh hoại tử gan cấp tính (Acute hepatopancreatic necrosisdisease- AHPND) hiện diện ở rất nhiều loai tôm và ở các giai đoạn phát triển khácnhau Điều này giải thích tại sao chúng có thể dễ dàng bùng phát, lây lan và vấn đềtiêu diện hoặc kiểm soát mầm bệnh này không hề đơn giản

Hình 1.2: Vi khuẩn V.parahaemolyticus

(Nguồn: h tt p : // a q u a n et v iet o r g / p o s t/ 6 632 6 1 / n g h i - n - c - u - v - c - i - m - s i n h - h - c - c - a - v i -

k h u - n - v i b r i o - p a r a h a e m o l y tic u s )

Vibrio parahaemolyticus được phát hiện ở ngoài biển và thường kí sinh trên

tôm, cua, cá, ốc,…và chúng phát triển được ở môi trường có 1- 8% NaCl, khôngsinh trưởng được trong môi trường không có muối Chúng không thể sống khi nhiệt

độ xuống dưới 40C, pH tối ưu sống trong môi trường 7% NaCl

Theo tổ chức FAO năm 2011, V parahaemolyticus có khoảng chịu đựng và

khoảng tối ưu như sau:

Bảng 1.1: Khoảng chịu đựng và tối ưu của Vibrio parahaemolyticus.

Loài V parahaemolyticus được cho là ký sinh trên nhiều đối tượng thủy sản

như cua, hàu, ốc,kể cả ký sinh trùng và tôm,… chúng bùng phát với điều kiện:

• Khi tảo tàn vì tảo chết là nguồn hữu cơ tốt cho vi khuẩn pháttriển

• Khi nguồn hữu cơ trong ao cao

• Khi độ mặn cao

• Khi pH cao

• Khi ao nuôi có nhiều ốc, hàu và ký sinh trùng,…

1.1.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn gây bệnh Vibrio parahaemolyticus trong nuôi

trồng thủy sản

1.1.3.1 Tình hình dịch bệnh

Hình 1.3: Bệnh EMS/AHPNS trên tôm

( Nguồn: Nguyễn Thảo Sương (2011-2013) tạp chí nghề cá Sông Mekong, Viện

Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản 2, Hồ Chí Minh)

Bệnh tôm chết sớm (Early Mortality Syndrome- EMS) hay còn được gọi làchứng hoại tử gan- tụy cấp (Acute hepatopancreatic necrosis Syndrome- AHPNS)

được xác định là bệnh do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra, cư trú trong

đường tiêu hóa của tôm và phát triển theo cơ chế khá phức tạp Bệnh xuất hiện đầutiên ở miền nam Trung Quốc năm 2009 và lan rộng ra các nước ASEAN như ViệtNam, Malaysia, Thái Lan,… gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi tôm thế giới nóichung và Châu Á nói riêng

Tình hình thế giới

Trên thế giới, EMS xuất hiện đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 2009, nhưng banđầu phần lớn những người nuôi tôm không chú ý tới bệnh này và kết quả 2 năm saudịch bệnh thật sự bùng nổ một cách nhanh chóng Điều đáng chú ý tỷ lệ tôm bị chếtgiai đoạn đầu của chu kỳ sinh trưởng do nhiễm bệnh EMS này cực kì cao Theo tổchức Nông Lương Liên hợp quốc (FAO) đối với tôm ở thời kỳ đầu ở một số trườnghợp số tôm bị chết có thể lên tới gần 100% Vào năm 2011 từ kết quả điều tra tạicác trại nuôi tôm ở các tỉnh Hải Nam, Quảng Đông, Phúc Kiến, Quảng Tây củaTrung quốc đã bị thiệt hại tới gần 80% do bệnh EMS, sau đó lan sang một số nướckhác như Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế(Panakorn, 2012)

Ở Thái Lan, lượng tôm xuất khuẩn giảm 50% trong năm 2011 so với mứctrung bình là 350.000 tấn/năm Năm 2012, kinh ngạch xuất khẩu tôm sang Mỹ củaThái lan giảm từ 27% xuống còn 23%

Ở Malaysia, bệnh EMS đã được báo cáo đầu tiên vào giữa năm 2010 ở cácbang bờ đông: Pahang và Johor Dịch bệnh EMS bùng phát dẫn đến sự sụt giảm sảnlượng tôm thẻ 70.000 MT vào năm 2012 xuống còn 40.000 MT vào năm 2011 Dựbáo sản lượng thấp vào năm 2012 với các báo cáo không xác định về bệnh EMS ởcác bang Sabah và Sarawak

Trước tình hình lo ngại về sự bùng phát của dịch bênh trên toàn cầu ngay từlúc xuất hiện dịch bệnh một số nước như Philippines, Mexico, Cộng hòaDominican, Mỹ, Nhật, đã lần lượt cấm nhập khẩu tôm hoặc thắt chặt đầu vào từcác nước bị ảnh hưởng của dịch EMS, lý do đưa ra từ các nước đó là để tránh gâythiệt hại và tránh dịch bệnh lây lan tại các quốc gia này

Theo ước tính của Liên minh nuôi trồng thủy sản toàn cầu (GAA), thiệt hại dodịch bệnh EMS gây ra đối với ngành nuôi tôm châu Á, nơi có khoảng một triệungười vẫn sống phụ thuộc vào nghề nuôi trồng thủy sản con số thiệt hại có thể lêntới 1 tỷ USD/năm Đây là một con số rất lớn đòi hỏi cần phải tìm ra biện pháp mới

để kiểm soát dịch bệnh tốt hơn, tránh gây thiệt hại cho ngành thủy sản nói chung vànuôi tôm nói riêng trên toàn cầu

(Nguồn: h tt p : // u v - vi e t n a m.c o m v n / N e ws D e t a il a s p x ?newsId=2750)

Trong nước

Ở Việt Nam vào tháng 6 năm 2011, đã có báo cáo về thiệt hại do bệnh EMSgây ra nhưng không quá lớn, ban đầu bệnh EMS xuất hiện ở 6 tỉnh gồm: TiềnGiang, Bến Tre, Kiên Giang, Sóc Trăng, Bạ Liêu và Cà Mau Bệnh EMS trên tômthẻ chân trắng thật sự bùng phát và lây lan nhanh chóng vào năm 2012 Theo thống

kê của sở nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Sóc Trăng (2012) cả nước đã ghinhận 15 tỉnh có vùng nuôi tôm nhiễm bệnh EMS với diện tích 35.245ha, năm 2013

số vùng có tôm bị nhiễm bệnh EMS lên tới con số 18 tỉnh, trong đó thiệt hại nặngnhất là Bạc Liêu với diện tích 2.174ha và Trà Vinh với diện tích 2.070 ha với tỷ lệ

tử vong có thể vượt quá 70% (Whitehead RJ , 2013)

Do tính chất phức tạp của giống vi khuẩn Vibrio, làm cho việc kiểm soát vàkhống chế mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPNS trở nên rất phức tạp và khókhăn, trực tiếp gây tổn hại đến vật chủ Hầu hết mầm bệnh vi khuẩn Vibrio sau khixâm nhập vào vật chủ chúng sẽ nhanh chóng phát triển, gia tăng mật số để bảo vệchính nó và cùng với sự phát triển của vi khuẩn là sức khỏe của vật chủ yếu đi và

dẫn đến cái chết Dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh EMS/AHPNS

không tấn công và xâm nhập vào máu của tôm thông qua các vết thương hoặc các

cơ chế xâm nhập khác Điều này giải thích lý do tại sao thuốc kháng sinh không thểngăn chặn các nhiễm trùng do EMS/AHPNS gây nên Nếu như kháng sinh khôngthể tiếp xúc với mầm bệnh ở mức độ đủ để ảnh hưởng đến nó thì kháng sinh sẽkhông thể phát huy tác dụng Mặc dù vẫn có nhiều trường hợp cần dùng đến khángsinh trong việc điều trị bệnh trên tôm, dùng kháng sinh để trị bệnh EMS/AHPNS là

một ví dụ rất điển hình về việc sử dụng kháng sinh không hiệu quả Ẩn mình trong

vỏ bọc an toàn là màng bao sinh học (biofilm), vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là

tác nhân gây bệnh EMS/AHPNS được bảo vệ trước các hóa chất về mặt lý thuyết là

có thể tiêu diệt chúng Điều này đặt ra một thách thức rất lớn đối với các cố gắngphát triển một phương pháp điều trị EMS/AHPNS

(Nguồn: h tt p : //my w e b p r o v n / d o c - l u an - v a n ?id=75615)

1.1.3.2 Biểu hiện tôm nhiễm bệnh EMS/AHPNS

Những biểu hiện của đàn tôm khi nhiễm bệnh EMS

- Giai đoạn đầu các triệu chứng bệnh thường không rõ ràng

- Tôm chậm lớn và chết ở đáy ao

- Tôm bị bệnh thường lờ đờ, nơi tấp mé, quay đảo trên mặt nước, giảm ăn vàchết sau đó

- Bào tử trống, ruột không thức ăn, gan tụy teo nhỏ của tôm bệnh

- Thân tôm có màu sắc bất thường Khi tôm chết cơ thể chuyển sang trắngđục, bệnh tập trung ở những ao thả nuôi 10-45 ngày

- Tôm có thể chết rất nhanh sau khi phát hiện bệnh 2-3 ngày

- Nhiều trường hợp ghi nhận tôm ngưng chết khi ngưng ăn và sau đó chết rấtnhanh khi cho ăn trở lại

Những biểu hiện của bệnh EMS trên cá thể tôm khi nhiễm bệnh EMS

- Gan tôm bệnh thường gặp có nhiều trạng thái khác nhau như:

Sưng to, mềm nhũn

Biến màu

Nhiều trường hợp gan bị teo nhỏ và dai

Vỏ mềm, đục cơ

- Giải phẫu mô học thường phát hiện:

Có đốm đen trên gan

Tế bào gan bị hoại tử

- Lượng chất béo dự trữ trong gan hầu như không còn

- Mẫu gan tụy bị bội nhiễm ở các mức độ khác nhau

- Kiểm tra PCR không thấy virus.

Hình 1.4: Tôm nhiễm bệnh EMS

( Nguồn: h tt p : // w ww .vi nh t h i n hb i o s t a d t c o m/vi/t h o n g- ti n - ky- t h ua t/ tr i e u - c h u n g - l a m -

- Chọn giống tốt, giống có kiểm dịch

- Thả giống với mật độ vừa phải

- Nên nuôi tôm trên bạt

- Tránh lấy trực tiếp nước biển để nuôi tôm, vì trong nước biển có chứa rấtnhiều vi sinh vật rất dễ bị lây nhiễm cho tôm

- Điều chỉnh các thông số kĩ thuật môi trường nuôi thích hợp

- Duy trì pH trong ao nằm khoảng 7.8-8.2

- Cho tôm ăn hợp lý, không nên để dư thừa, vì khi thức ăn dư thừa dễ gây ônhiễm môi trường và dễ phát sinh bệnh

- Trong quá trình nuôi hạn chế tôm bị shock, mất tảo,

- Cung cấp đầy đủ nhu cầu vitamin, acid amin và khoáng chất thiết yếu giúptôm sinh trưởng và tăng trong nhanh

- Thức ăn cho tôm nên thường xuyên trộn men tiêu hóa (men có lợi chođường ruột) nhằm mục đích hỗ trợ tiêu hóa thức ăn công nghiệp và đưa vàođường ruột tôm một lượng lớn vi khuẩn có lợi, cạnh tranh lấn át vi khuẩn

có hại theo quy luật cạnh tranh sinh tồn để tôm ít bị bệnh

- Sau 2 tuần nuôi ngoài việc dung men tiêu hóa cho tôm ăn, ta có thể dung

bổ sung sản phẩm bổ gan cho tôm ăn ngày 2 lần, mục đích bảo vệ tế bàogan tôm

- Sau 3 tuần thả tôm: bổ sung thêm các sản phẩm có lợi cho tôm như giúptôm tăng cường sức đề kháng, tăng cường miễn dịch cho tôm

- Sau 4 tuần: diệt khuẩn nguồn ao nước, mục đích làm giảm mật độ vi khuẩn

có hại trong nguồn nước

Điều trị bệnh EMS/AHPNS

Một số lưu ý trong quá trình điều trị bệnh EMS trên tôm như sau:

- Trong quá trình nuôi tôm phải thường xuyên theo dõi đàn tôm để sớm pháthiện dấu hiệu bất thường Khi xảy ra dịch bệnh, nhanh chóng lấy mẫu phân

tích nếu phát hiện cớ sự hiện diện của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở

mật độ cao trong ruột, thì phải điều trị ngay Tuân thủ tốt lịch thời vụ, quyđịnh bảo vệ môi trường vùng nuôi, tuyệt đối không xả bùn đáy và mầmbệnh chưa qua sử lý ra môi trường bên ngoài

- Có thể tăng cường oxy cho tôm trong ao nuôi bằng cách tăng cường quạtnước, máy sục khí,…

- Sau khi dùng kháng sinh trộn thêm men tiêu hóa để cung cấp vi khuẩn cólợi cho đường ruột và chất giải độc gan giúp tôm mau hồi phục bệnh

- Diệt khuẩn và làm sạch nguồn ao nước nuôi để giảm mật độ vi khuẩn gâybệnh có trong nguồn nước

1.1.4 Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

1.1.4.1 Sự bám vào tế bào

Bám vào tế bào là điều kiện đầu tiên để vi sinh vật có thể xâm nhập vào mô vàgây bệnh Người ta đã quan sát thấy các vi khuẩn thường bám trên vật rắn hoặc cáchạt để tồn tại và phát triển Bằng cách này chúng tránh được tác dụng của dòngnước

Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus thường đi theo dòng nước vào bên trong dạ

dày của tôm, và bám vào thành ruột

Khả năng bám đặc hiệu này của vi khuẩn là một yếu tố quan trọng của độc lực

Sự bám lên trên bề mặt của niêm mạc là bước đầu tiên của quá trình sinh bệnh, dẫntới việc tôm chết hàng loạt

Các yếu tố bám dính của vi sinh vật được gọi là adhesin Bản chất của chúng làpolypeptide hoặc polysaccharide

Các adhesion có bản chất polypeptide được chia thành 2 nhóm: nhóm cófimbriae và nhóm không có fimbriae Các fimbriae, hay còn gọi là các pili, là nhữngcấu trúc phụ của vi sinh vật có dạng như sợi lông trên bề mặt vi khuẩn Cácfimbriae được cấu tạo bởi nhiều p r o te i n x ếp chặt với nhau tạo nên hình dạng giốngnhư trụ xoắn ốc Thường thì chỉ có một loại protein là cấu trúc chính của một phânnhóm fimbriae tuy nhiên các protein phụ trợ khác cũng có thể tham gia vào cấu trúccủa đỉnh hoặc gốc fimbriae Đỉnh của các fimbriae có chức năng gắn với tế bào vậtchủ Các vi khuẩn Gram âm thường bám dính nhờ các fimbriae này như VP

Các yếu tố bám dính bản chất polysaccharide thường là thành phần cấu tạo củamàng tế bào, vách tế bào và vỏ vi khuẩn Teichoic acid trong vách của vi khuẩn cótác dụng như là các yếu tố bám dính Các polysaccharide (glucan và mannan) tronglớp vỏ cũng được các thụ thể của vật chủ nhận diện (receptor bổ thể 3 và mannosereceptor) nhờ đó làm tăng tính bám dính của các tác nhân này Mặc dù các tươngtác receptor-ligand nhằm tăng cường khả năng bám dính có thể chia thành hai nhómchính: tương tác protein-protein và protein-carbonhydrate, một điều quan trọng cần

nhớ là các vi sinh vật thường sử dụng rất nhiều thụ thể khác nhau của tế bào vậtchủ.

1.1.4.2 Khả năng xâm nhiễm

Khả năng xâm nhiễm là khả năng đi vào bên trong có tổ chức của cơ thể vậtchủ, nhân lên rồi sau đó lan tràn sang các vùng khác.Có thể chia quá trình xâm nhậpthành 2 loại: nội bào và ngoại bào

Xâm nhập ngoại bào

Xảy ra khi tác nhân gậy bệnh phá vỡ các rào cản của tổ chức để phát tán đi các

vị trí khác nhau trong cơ thể vật chủ nhưng bản thân chúng vẫn tồn tại bên ngoài tếbào vật chủ Cách thức xâm nhập ngoại bào là tiết ra một số enzyme nhằm phá hủycác phân tử tế bào vật chủ

Khả năng xâm nhập ngoại bào cho phép các tác nhân gây bệnh này tạo ra cácchỗ ẩn nấp trong vật chủ và tại đó chúng bắt đầu tăng sinh rồi phát tán đi khắp các

vị trí cũng như sản xuất các độc tố Các tác nhân gây bệnh xâm nhập ngoại bào cóthể đi vào trong tế bào vật chủ và sử dụng cả hai con đường xâm nhập nội bào vàngoại bào

Xâm nhập nội bào

Xảy ra khi các vi sinh vật đi vào bên trong tế bào vật chủ và sống trong môitrường nội bào Một số tác nhân gây bệnh là do vi khuẩn gram (-) có khả năng sốngbên trong tế bào Các tế bào không có chức năng thực bào hay có chức năng thựcbào đều là đích tấn công của các tác nhân này

1.1.4.4 Các enzyme

Nhiều vi khuẩn gây bệnh tạo được nhiều enzyme làm ảnh hưởng lớn tới tổchức mô của sinh vật chủ và quá trình ủ bệnh (Rasko và Sperandio, 2010)

Một số enzyme thường thấy do vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus tạo ra là:

hemolysins, protease và chitinases

Protease

Protease hay còn gọi là peptidase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắtmối liên kết peptide (-CO-NH-) trong các phân tử polypeptide Protease của vi khuẩn có thể thủy phân một loạt các phân tử protein, tiêu diệt cấu trúc ngoại bào vàđóng vai trò quan trọng trong gây bệnh Qua các quá trình tiến hóa, protease đã thích nghi với các điều kiện phức tạp trong sinh vật (thay đổi pH, môi trường khử

…) và sử dụng cơ chế xúc tác khác nhau cho chất nền thủy phân (Turk, 2006)

Dựa vào cơ chế hoạt động khác nhau mà chúng được phân loại như sau: metalloproteases, protease serine, protease cystein, collagenases, caseinases và gelatinases (Defoirdt, 2013) Nhiều tác giá đã báo cáo về sự hiện diện của protease

ở Vibrio spp Theo Lee và cộng sự (1999), protease cysteine được xác định là một yếu tố độc lực lớn của V harveyi trong khi ở một nghiên cứu khác của Teo và cộng

sự (2003), metalloprotease cũng được coi như là một độc lực yếu tố của loài này

Một độc tố gây chết người được sản xuất bởi V alginolyticus dòng Swy được phân lập từ bệnh Kuruma trên tôm sú (Penaeus japonicus) được xác định là protease mang tính kiềm (Lee và cộng sự, 1997) Trong thí nghiệm in vitro, hoạt tính

protease được sử dụng đối với môi trường thạch có bổ sung 5% Skimmilk

(caseinase) (Natral và cộng sự, 2011)

Chitinases

Chitinase (còn gọi là [poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid

glucanohydrolase]) là enzyme thủy phân kitin (thành phần vỏ ngoài của động vật

giáp xác như cua, tôm, …) thành các đơn phân oligosaccharide Vi khuẩn Vibrio có

thể sử dụng chitin rất hiệu quả bằng cách chuyển đổi chúng thành các hợp chất hữu

cơ sau đó sử dụng như là nguồn cung cấp nito và cacbon chính Chitinase sản xuất

bởi Vibrios đã được chiết xuất và định rõ đặc điểm bởi nhiều nhà khoa học

(Ohtakara và cộng sự, 1979; Murao và cộng sự, 1992) Một vài gen quy định cho

việc sản xuất chitinase ở vi khuẩn V vulnificus (Wortman, 1986), V harveyi Gil và Zyskind, 1984), V furnissii (Keyhani và Roseman, 1996), V cholerae

(Soto-(Connell và cộng sự, 1998), V parahaemolyticus và V anguillarum (Hirono, 1998)

đã được giải trình tự và đồng hóa Hoạt tính chitinase của vi khuẩn có thể đượckhảo sát bằng cách sử dụng môi trường thạch có chứa keo kitin (Defoirdt và cộng

sự, 2010)

Hemolysins

Hemolysin tác động trực tiếp lên tế bào hồng cầu, ly giải và phá vỡ tế bào

hồng cầu , giải phóng hemoglobin Ở vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, có ba gene

quy định độc tố hemolysins chính gồm: thermostable direct hemolysin (tdh), TDH- related hemolysin (trh) mã hóa các hemolysin bền nhiệt và tlh mã hóa các

hemolysin không bền nhiệt Cả hai gen tdh và trh đều nằm trên operon độc tố Vibrio parahaemolyticus toxRS (Vp-toxRS), được điều hòa bởi gen toxR có trình tự bảo

tồn cao trong loài (Nishibuchi, Kaper, 1995) Gen toxR là gen điều hòa kiểm soát sựbiểu hiện của các gen mã hóa cho các nhân tố độc lực ngoại bào quan trọng và các gen liên quan đến các độc tố khác Gen toxR có kích thướng 368 bp là gen điều hòa cho operon Vp- toxRs (Zulkifli và cộng sự, 2009) tồn tại ở tất cả các chủng VP.Gen tdh, trh lần lượt có kích thước khác nhau 250 và 251p Hầu hết ở các mẫulâm sàn có tdh hoặc trh, hoặc cả hai, trong khi gần như tất cả các mẫu từ môi trườngkhông có (Shirai và cộng sự, 1990; Suthienkul và cộng sự, 1995; Iida và cộng sự1997) hoặc có với tỉ lệ thấp 1-5% (Nishibuchi và Kaper, 1995, Robert và cộng sự,2004)

Hemolysin là ngoại độc tố, tấn công vào màng tế bào máu và làm tan tế bào.Hemolysin chuyển các ion liên kết với protein như hemolysin, transferrin,

lactoferrin thành dạng tự do Các ion này (Fe3+) sẽ liên kết với các phức chất dạng

chelator ở ngoài tế bào (Zhang và Austin, 1998) Trong nhiều trường hợp, phạm vi tấn công của hemolysin không dừng ở các tế bào hồng cầu mà còn mở rộng phạm viđến các tế bào biểu mô, tế bào thần kinh và các tế bào nhân đa

hình (polymorphonuclear) làm tăng cường độc tố và gây phá hủy các mô Kết quả của sự phân giải này là giải phóng beta-hemolysin (phân hủy hoàn toàn

hemoglobin) và alpha-hemolysin (phân hủy không hoàn toàn hemoglobin)

Hemolysin được sản xuất bởi nhiều loài vi khuẩn khác nhau, bao gồm: Escherchia coli, Pseudomonas aeruginosa và các loài Vibrio (Zhang và Austin, 1998) Với mỗi

loài, hemolysin có thể có cơ chế giống nhau hoặc khác nhau trong xâm nhiễm và gây độc

1.1.4.5 Khả năng sinh độc tố

Độc tố (toxin) bản chất là protein(các enzyme) hoặc không phải là protein ( nộiđộc tố của vi khuẩn gram âm và teichoic acid của các vi khuẩn gram dương) đượcsản xuất bởi vi khuẩn nhằm tiêu diệt các tế bào vật chủ Độc tố được tạo thành trongquá trình chuyển hóa của vi khuẩn Người ta chia làm 2 loại nội độc tố và ngoại độctố

Cấu tạo hóa học vách tế bào của vi khuẩn gram (-) là một hỗn hợp gồm glucid,lipid và protein trong đó thành phần của nội độc tố chủ yếu là thành phần lipid Acủa lớp lipopolysacarit của vách tế bào Nội độc tố chịu nhiệt độ cao, độc tính yếuhơn so với ngoại độc tố Hiện nay người ta xác định được nội độc tố của vi khuẩngram (–) có những tác động sinh học vừa có lợi choc ơ thể vật chủ kích thích đápứng miễn dịch mặt khác nó cũng có tác động gây choáng và chết

1.1.5 Quy chế biểu hiện gen độc lực

Theo các nhà khoa học quorum sensing cho phép vi khuẩn hợp tác hoạt động.Như vậy có thể định nghĩa quorum sensing là khả năng của vi khuẩn có thể liên lạc

và trao đổi thông tin để cộng tác thông qua các chất mang dấu hiệu Quorumsensing là yếu tố quan trọng đối với độc tính của vi khuẩn, nó điều kiển một số quátrình ở vi khuẩn gây bệnh phát sáng và sử dung tín hiệu quorum sensing để điềuchỉnh độc tố của nó, tùy vào điều kiện môi trường và sức khỏe vật chủ, sản xuất cácchất kháng kháng sinh và quan trọng là hình thành nên màng biofilm và các nhân tốgây độc ở vi khuẩn như các enzyme và các độc tố (Defoirdt et al, 2004; Tu andBassler, 2007; Tinh et al, 2007) Vật chất của quorum sensing có thể tự tổng hợp vàtiết ra những chất dấu hiệu chắc chắn, gọi là chất kích thích ( pheromones hayautoinducer – Al) thường là N- acyl homoserine lactones ( AHLs)

1.1.5.2 Stress hormone

Stress hormone catecholamine bao gồm chủ yếu 3 loai: epinephrine và

norepinephrine, dopamine (Lyte và Freestone, 2010; Sharaff và Freestone, 2011) Catecholamine được tổng hợp từ tyrosine và được đặc trưng bởi có một vòng

benzene với hai nhóm hydroxyl lân cận và một chuỗi bên amin đối lập (Fitzgerald,2011)

Con đường chuyển hóa cho sự tổng hợp catecholamine bắt đầu bằng L-dopa(các axit amin tyrosine và phenylalanine) được chuyển đổi → dopamine → norepinephrine → epinephrine

Hình 1.5: Stress hormone

Stress hormone tồn tại ở cả giáp xác và không xương sống (Ottaviani vàFranceschi,1995) Stress hormone Dopamine có cấu trúc 3-4dihydroxyphenethylamine là một amin được hình thành bằng cách loại bỏ mộtnhóm carboxyl từ một phân tử L- DOPA Là chất dẫn truyền thần kinh, đóng vai tròquan trọng trong bộ não và cơ thể Trong não chức năng của dopamine như mộtneurotransmitter- một chất hóa học được các tế bào thần kinh gửi tín hiệu đến các tếbào thần kinh khác, Dopamine ảnh hưởng tới khả năng di động của vi khuẩn

Ngoài hệ thống thần kinh thì Dopamine còn có trong mạch máu Trong mạchmáu Dopamine ức chế sản sinh Norepinephrine và có khả năng làm giãn mạch.Trong thận nó làm tăng bài tiết tiêu hóa và làm giảm nhu động đường tiêu hóa vàbảo vệ niêm mạc Bằng chứng gần đây cho thấy rằng stress hormone cũng được sử

dụng như yếu tố môi trường để thúc đẩy tăng trưởng và độc lực của vi khuẩn gâybệnh (Lyte, 2004).

1.1.5.3 Cơ chế phát sáng

Cơ thể tôm thẻ có khả năng phát sáng là do nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Chúng có khả năng chuyển năng lượng hóa học thành năng

lượng ánh sáng và tạo ra một thức ánh sáng khá mạnh màu lục nhạt hay lam nhạt

Sự chuyển hóa năng lượng hóa học thành ánh sáng trong sự phát sáng sinh học làmột quá trình ngược với sự quang hợp Quá trình phát sáng gắn liền với sự có mặtcủa oxy và được coi là sự oxy hóa hiếu khí nhưng không dẫn đến sự tạo thành ATP

mà dẫn đến phát sáng, Trong phát sáng do vi khuẩn, chất phát sáng ( Luciferin) làmột aldehyl chuỗi dài Ngoài ra, còn có sự tham gia của: Flavinmonoucleotid(FMN), Nicitinamid Adenin Dinucleotitd (NAD), oxy và các enzyme Luciferasexúc tác phản ứng gây ra

FMNH2 + O2 + RCHH FMN + H2O + RCOOH + Ánh sáng

Luciferase của vi khuẩn là một Heterodimer có trọng lượng phân tử khoảng80.000 bao gồm hai cấu trúc dưới phân tử là alpha và beta có trọng lượng tươngđương nhau Trung tâm hoạt động được định vị trên cấu trúc alpha

Do vi khuẩn phát sáng có nhu cầu cần Na+ để phát triển nên sự tăng hay giảmnồng độ muối đều ảnh hưởng tới khả năng phát sáng Theo Macleod (1961) chorằng NaCl ảnh hưởng tới sự hình thành enzyme Luciferase

Khảo sát cho thấy trong suốt thời gian dịch bệnh dùng nổ, VP phát sáng lênđến 90% trên tổng số vi khuẩn cư trú ở gan tụy, trong khi tôm khỏe chỉ là 50%

1.1.6 Phương pháp kiểm soát các yếu tố độc lực

Quorum quenching

Nhiều bệnh nguy hiểm xảy ra với con người và vật nuôi có nguồn gốc từ vikhuẩn Gram (-) Với việc khám phá ra hệ thống quorum sensing cùng với nhữnghiểu biết về khả năng gây bệnh của vi khuẩn đã mở ra cho các nhà khoa học hướngnghiên cứu mới về khả năng ứng dụng của quorum sensing

Cơ sở của ứng dụng này là điều khiển số lượng vi khuẩn bằng các làm nhiễu hệthống dấu hiệu của chúng Từ đó vi khuẩn không có khả năng tập trung đủ số lượng

để gây bệnh hoặc là do nhiều gen gây bệnh của vi khuẩn do bị rối loạn của hệ thống

mà không thể tổng hợp được Do vậy nếu chúng ta điều khiển được hệ thống này thì

vi khuẩn không có khả năng gây bệnh nữa

Enzyme AHL lactonase là một trong hai loại enzyme có khả năng phân hủy tínhiệu ở vi khuẩn Gram (-), N-accyl homoserine lactone (AHL) Enzyme này được

mã hóa bởi gên aiiA hiện diện ở các loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus sp Có khá

nhiều nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng gen aiiA tái tổ hợp như là một biệnpháp kiểm soát sinh học đối với các bệnh trên cây trồng có liên quan đến việc tiết raphân tử tín hiệu AHL Trong nuôi trồng thủy sản đã có nghiên cứu về sự phá hủy hệthống quorum sensing để ngăn ngừa và phòng trị dịch bệnh trong quá trình nuôi

nhiên nghiên cứu về stress hormone và chất ức chế stress hormone cho đến nay làrất hiếm.

Ngoài chất ức chế là LED 209 thì còn có: phentolamine hydrochloride,phenoxybenzamine hydrochloride, S-(-)-propanolol hydrochloride, labetalolhydrochloride, chlorpromazine hydrochloride,…

1.2 Stress hormone catecholamine

1.2.1 Ảnh hưởng của catecholamine lên sự tăng trưởng của vi khuẩn

Nghiên cứu của Lyte và Emst năm 1992 cho thấy khi nuôi cấy vi khuẩn có bổsung stress hormone trong khoảng 24h ở nồng độ thích hợp sẽ làm tăng số lượng vikhuẩn lên cấp số nhân Tuy nhiên, nếu trong nuôi cấy vi khuẩn bổ sung stresshormone với liều cao sẽ làm cho giảm số lượng vi khuẩn Cụ thể nếu sử dụngDopamine 50µM thì vi khuẩn lan ra đĩa rất nhanh trong 24h, nhưng nếu sử dụngnồng độ Dopamine 100µM thì khả năng di động của vi khuẩn chậm hơn so vớinồng độ Dopamine 50µM

Nhiều thí nghiệm in vitro cho thấy, stress hormone làm thay đổi khả năng diđộng và sự gia tăng mật độ của vi khuẩn, đẩy nhanh quá trình hình thành màng sinhhọc (bioflim) và cũng có thể làm gia tăng độc lực của vi khuẩn gây bệnh Vì thếstress hormone ảnh hưởng trực tiếp lên quá trình gây bệnh của vi khuẩn lên sinh vậtchủ Hiện tại các nghiên cứu trên thế giới về stress hormone trên vibirio là không cónhiều

Vi khuẩn Vibrio nói chung và Vibrio parahaemolyticus nói riêng là những vi

sinh vật gây bệnh quan trọng ở động vật thủy sản, đặc biệt là cá và giáp sát có độmặn cao Ngoài ra, catecholamine stress hormone còn tồn tại ở cả giáp xác và độngvật không xương sống Bước đầu tìm hiểu mối liên hệ giữa tác nhân gây bệnhVibrio, stress horme và sinh vật chủ như tôm thẻ chân trắng là căn cứ tốt để xácđịnh được chính xác cơ chế gây bệnh, nhằm tạo ra các biện pháp phòng và trị bệnhhiệu quả nhất

1.3 Tôm thẻ chân trắng

1.3.1 Vai trò của ngành công nghiệp nuôi tôm thẻ chân trắng

Ngành nuôi tôm thẻ chân trắng được đưa vào Việt Nam khoảng 10 năm,nhưng rõ ràng với ưu thế về thời gian nuôi ngắn, bán giá cao, thu nhiều lợi nhuậnhơn so với tôm sú nên có thể nói ngành công nghiệp nuôi tôm thẻ đang ngày càngphát triển và với quy mô ngày một tăng Cụ thể nếu như năm 2006 diện tích nuôitôm chỉ là 13.455ha với năng suất đạt 2.980kg/ha, chỉ sau 7 năm diện tích tăng lên41.789ha với năng suất 4.460kg/ha

Tôm thẻ chân trắng được sản xuất không chỉ làm phong phú thêm nguồn lươngthực mà nó còn có giá trị kinh tế và xuất khẩu rất tốt Thời gian gần đây nhiều nướctrên thế giới rất ưa chuộng tiêu thụ tôm thẻ, vì thế mà kim ngạch xuất khẩu tôm thẻcủa nước ta tăng mạnh và người nuôi thu lời nhiều nhờ bán được giá cao Theo Bộnông nghiệp- Phát triển nông thôn, xuất khẩu tôm năm 2013 đạt 3 tỷ USD , đây làmột con số kỉ lục của ngành nuôi tôm thẻ chân trắng ở nước ta Có thể nói ngànhnuôi tôm thẻ đóng vai trò quan trọng trong đời sống kinh tế của nước ta

Hình 1.7: Tổng sản lượng tôm nuôi trên thế giới

( Nguồn : h t t p : // u v- vi e t na m c o m.v n / N e ws D e t a il a s p x ?newsId=2750)

1.3.2 Đặc điểm sinh học của tôm thẻ chân trắng

1.3.2.1 Phân loại

Tôm thẻ chân trắng hay còn gọi là Penaeus vannamei là một dạng của tôm

panđan ( không phải Caridea) của vùng đông Thái Bình Dương thường đánh bắthoặc nuôi làm thực phẩm Tôm thẻ chân trắng là loài bản địa ở đông Thái BìnhDương từ Sonora ở Mexico đến Peru, phân loại theo Boone, 1931:

Tôm thẻ chân trắng có những đặc điểm sau:

- Tôm chân trắng vỏ mỏng có màu trắng đục nên có tên là tôm Bạc, bìnhthường có màu xanh lam, chân bò có màu trắng ngà nên gọi tôm chântrắng

- Chuỳ là phần kéo dài tiếp với bụng

- Dưới chuỳ có 2 - 4 răng cưa, đôi khi có tới 5 - 6 răng cưa ở phía bụng.Những răng cưa đó kéo dài, đôi khi tới đốt thứ hai

- Vỏ đầu ngực có gai gân và gai rất sâu rất rõ, không có gai mắt và gai đuôi,không có rãnh sau mắt, đường gờ sau chùy khá dài đôi khi từ mép sau vỏđầu ngực Gờ bên chùy ngắn, chỉ kéo dài tới gai thượng vị

- Có 6 đốt bụng, ở đốt mang trứng, rãnh bụng rất hẹp hoặc không có Gaiđuôi không phân nhánh

- Râu không có gai phụ và chiều dài râu ngắn hơn nhiều so với vỏ giáp

1.3.2.3 Phân bố

Tôm thẻ chân trắng (Bone,1931) là tôm nhiệt đới, phân bố vùng ven bờ phíaĐông Thái Bình Dương, từ biển Pêru đến phía nam Mê-hi-cô, vùng biển Equađo,

hiện tại tôm thẻ chân trắng đã được di giống ở nhiều nước Đông á và Đông Nam ánhư: Đài Loan, Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Phiippin, Malaysia.

Hình 1.8: Tôm thẻ chân trắng

1.3.2.4 Tập tính và môi trường sống của tôm thẻ chân trắng

Ở vùng biển tự nhiên, tôm thẻ chân trắng thích nghi sống nơi có bùn với độsâu khoảng 72m, có thể sống ở độ mặt 5-50‰, thích hợp ở độ mặn nước biển 28-34‰, pH= 7.7-8.3, nhiệt độ thích hợp 25-320C, tuy nhiên chúng có thể sống được ởnhiệt độ 12-280C

Tôm thẻ chân trắng thường ăn thức ăn có độ đạm cao hơn so với loài tômkhác, là một loài ăn tạp Tốc độ sinh trưởng rất nhanh Trong điều kiện tự nhiên từtôm bột đến tôm cỡ 40g/con mất thời gian khoảng 180 ngày

Trong quy thiên nhiên, tôm trưởng thành, giao hợp, sinh đẻ trong những vùng

có độ sau, độ mặn khá cao Trứng nở ra ấu trùng và vẫn loay hoay ở khu vực này.Tới giai đoạn phát triển hơn chúng bơi vào gần bờ và sinh sống ở đáy những vùngcửa sông cạn Sau 1 vài tháng, tôm con trưởng thành, chúng bơi ngược lại ra biển vàtiếp diễn cuộc sống gia hợp, sản sinh làm trọn chu kỳ Tôm thường phát triển nhanh

ở thời gian đầu, mỗi tuần có thể tăng trưởng 3g với mật độ 100cm/m2, sau khi đạtđược 20g tôm bắt đầu lớn chậm lại, khoảng 1g/tuần tôm cái thường lớn nhanh hơntôm đực

1.3.3 Một số bênh thường gặp trên tôm thẻ chân trắng

1.3.3.1Bệnh do Virus

Bệnh đốm trắng ( WSVV)

Hình 1.9: Bệnh WSSV trên tôm

Bệnh đốm trắng ( WSSV-White spot Syndrome Virus) là bệnh nguy hiểm nhất

và gây thiệt hại rất nặng nề, đặc biệt là về kinh tế, trong nghề nuôi tôm công nghiệptrên thế giới.Dịch bệnh đốm trắng đầu tiên được phát hiện tại Đài Loan-1992, TrungQuốc-1993, Nhật Bản-1994, sau đó là các nước Indonexia, Thái Lan, bangTexas( Hoa Kỳ)

Ở Việt Nam, từ năm 1999 đến nay, hiện trạng tôm bị chết và chết trên diệnrộng ở nhiều vùng nuôi tôm trọng điểm đều được báo cáo là do WSSV

Bệnh lây lan rất nhanh, mầm bệnh có độc lực rất cao, gây tỷ lệ chết rất lớntrong ao nuôi, có nhiều trường hợp gây chết toàn bộ cho ao nuôi

Theo hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12(2002), các nhà khoa học đã phânloại virus gây bệnh đốm trắng và nguyên nhân được xác định là do một giống mớiWhisspovirus thuộc họ Nimaviridae (tạp chí thông tin KHCN và kinh tế thủy sản,

số 4-2004).Virus dạng hình que, kích thước 120x275 mm, có một đuôi phụ ở đầu,kích thước 70x300 mm

Triệu chứng được xác định như sau:

- Dấu hiệu đặc trưng: xuất hiện nhiều đốm trắng dưới vỏ ( đường kính cỡ

0.5-3 mm) ở vùng mang và đốt cuối thân

- Phần phụ bị tổn thương, nắp mang phồng, có nhiều sinh vật bám ở vỏ, ốp.

- Đôi khi toan thân tôm có màu đỏ, hồng, nhợt nhạt

- Tôm thường bơi lên mặt nước hoặc bơi dạt vào bờ

Bệnh hoại tử cơ (IMNV)

Hình1.10 : Mô tế bào bị bệnh hoại tử cơ.

Năm 2002, bệnh hoại tử cơ xuất hiện lần đầu tiên ở Pernambuco, Đông BắcBraxin Bệnh do Infectious myonecrosis virus (IMNV) gây ra Tôm thẻ chân trắngđược xem là vật chủ chính của IMNV do khả năng gây chết cao ở loài tôm này(thường tỷ lệ gây chết khoảng từ 40% đến 70%) Bệnh hoại tử cơ gây chết với tỷ lệcao, đột ngột, thường xuất hiện sau khi độ mặn hay nhiệt độ môi trường thay đổiđột ngột hoặc sau khi chài tôm

Tôm nhiễm bệnh ở giai đoạn cấp tính có dấu hiệu bệnh lý như phần cơ bụng

và cơ đuôi có màu trắng đục, có thể dẫn đến hiện tượng hoại tử và đỏ ở các vùng

cơ này.Đến giai đoạn mãn tính thì tôm nhiễm bệnh chết liên tục và kéo dài trongnhiều ngày

Virus gây bệnh hoại tử cơ trên tôm có vật chất di truyền là ARN mạch đôi,không có màng bao với kích thước hệ gen 7560 bp Phân tích từ mẫu đã thu được

các nhà nghiên cứu cho thấy IMNV thuộc họ Totiviridae, giống Giardiavirus Mặc

dù dấu hiệu lâm sàng và dấu hiệu mô bệnh học của bệnh hoại tử cơ giống với bệnhtrắng đuôi trên tôm biển nhưng bệnh trắng đuôi do một loài virus khác gây ra

Ở giai đoạn ấu niên và tiền trưởng thành, tôm thẻ chân trắng rất nhạy cảm vớiIMNV.Cơ quan đích được ghi nhận khi virus tấn công thường là cơ vân, mô liênkết, tế bào máu và cơ quan bạch huyết.

IMNV có khả năng lây truyền theo chiều ngang khi tôm khỏe ăn tôm nhiễmIMNV hoặc lây lan qua nguồn nước Khả năng truyền bệnh theo chiều dọc từ bố

mẹ sang con cũng có thể xảy ra nhưng đến nay vẫn chưa xác định được là donhiễm bên ngoài trứng hay bên trong buồng trứng

Hiện nay, phương pháp tiệt trùng trứng và ấu trùng là một phương phápphòng bệnh hiệu quả tại các trại sản xuất giống.Đối với các ao nuôi tôm thịt, chọnlọc và kiểm tra con giống khỏe mạnh, sạch bệnh, không nhiễm IMNV cũng là mộtcách phòng bệnh

Hội chứng Taura (TSV)

Hình 1.11: Bệnh TSV trên tôm

Hội chứng Taura trên tôm thẻ chân trắng được mô tả lần đầu tiên vào năm

1992 tại Ecuador Bệnh do Taura syndrome virus (TSV) gây ra Tôm thẻ chân trắng

và tôm xanh Nam Mỹ (P stylirostris ) được xem là vật chủ chính của hội chứng Taura Đầu tiên, TSV được phân loại thuộc họ Piconarviridae nhưng gần đây đã được tái phân loại vào họ Dicistroviridae Hội chứng Taura gây chết với tỷ lệ cao

(thường tỷ lệ gây chết từ 40% đến 90%) và lây lan nhanh

Bệnh thường trải qua 3 giai đoạn: cấp tính, chuyển tiếp và mãn tính Ở giaiđoạn cấp tính, tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh có màu đỏ nhạt, đặc biệt là phầnđuôi.Ngoài ra, tôm còn có dấu hiệu khác như mềm vỏ và ruột rỗng.Ở giai đoạn này

tỷ lệ tôm chết cao.Sang giai đoạn chuyển tiếp, tôm có những thương tổn màu nâuđen vỏ, có thể có hoặc không có hiện tượng mềm vỏ và chuyển màu đỏ, thậm chícòn có biểu hiện hoạt động bình thường Tôm sống sót qua giai đoạn cấp tính vàmãn tính sẽ chuyển sang giai đoạn mãn tính Ở giai đoạn này, các dấu hiệu bệnh lý

có thể biến mất sau những lần lột xác nhưng tôm vẫn còn mang virus.Mặc dù tômnhiễm TSV ở giai đoạn mãn tính có thể biểu hiện bình thường nhưng khả năng chịuđựng khi độ mặn giảm kém hơn tôm khỏe

Hội chứng Taura được ghi nhận trên tất cả các giai đoạn phát triển của tômnuôi Cơ quan đích mà TSV tấn công được ghi nhận là tế bào biểu mô của các phầnphụ, vỏ, ruột trước, ruột sau và mang, hay mô liên kết, cơ quan tạo máu, cơ quanbạch huyết và tuyến râu

Để phòng bệnh hội chứng Taura trên tôm thẻ chân trắng, kiểm tra chất lượngtôm bố mẹ và con giống là phương pháp tốt nhất Bên cạnh đó, nước trước khi cấpvào ao nuôi phải được lắng lọc, quản lý tốt môi trường nước trong ao nuôi kết hợpvới việc chọn thức ăn có chất lượng bảo đảm và quan sát, theo dõi tình hình ao nuôihàng ngày cũng giúp ích cho quá trình phòng bệnh

Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV)

Hình 1.12: Bệnh IHHNV trên tôm

Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô xuất hiện lần đầu tiênvào năm 1981 ở Hawaii và nhanh chóng lây lan sang các nước châu Mỹ và châu Á.Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô do Infectious hypodermal