Nghiên cứu mã vạch di truyền cá tra (pangasianodon hypopthalmus) bằng chỉ thị sinh học phân tử cytochrome b

hiện được mục đích này, gen ty thể COI, cytochrome b,… là những chỉ thị đầytriển vọng cho định danh các loài và đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứuDNA mã vạch.. Kỹ thuậtnhận dạng c

Đ ồ á n t ố t n g hiệ p G V H D: T r ầ n N g u y ễ n Ái H

ằ ng

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do bản thân thực hiện và khôngsao chép dưới bất kỳ hình thức nào Các số liệu trong đề tài có nguồn gốc rõràng, tuân thủ đúng nguyên tắc Kết quả trình bày trong đề tài được thu thậptrong quá trình nghiên cứu là trung thực và chưa từng được công bố trước đây.này

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung khoa học của đề tài nghiên cứu

TP.Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015

Sinh viên thực hiện đồ án

Huỳnh Long Anh

LỜI CẢM ƠN

Không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp

đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác Trong suốt quátrình thực tập và nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu mã vạch di truyền cá Tra

(Pangasianodon hypopthalmus) bằng chỉ thị sinh học phân tử cytochrome b” đến

nay, em đã nhận rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của Quý Thầy Cô, gia đình, anh,chị, bạn bè

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi đến Quý Thầy Cô của trường Đại họcCông Nghệ Tp HCM nói chung, các Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học – ThựcPhẩm – Môi Trường nói riêng đã tận tình dạy dỗ, giúp em hoàn thiện kiến thức,các kỹ năng chuyên môn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trìnhhọc tập

Em xin gửi đến Ths Trần Nguyễn Ái Hằng, Ths Bùi Thị Liên Hà, kỹ sư

Lê Ngọc Thùy Trang cùng các anh chị của phòng thí nghiệm Di truyền phân tử,Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II lời cảm tạ sâu sắc vì đã tạo mọi điềukiện thuận lợi, trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt em trong suốt quá trình thực tập vànghiên cứu đề tài

Xin cảm ơn toàn thể các bạn trong lớp 11DSH01 đã đóng góp ý kiến, giúp

đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Lời cảm ơn con xin gửi đến Ba Mẹ và gia đình thân yêu đã luôn yêuthương, đùm bọc con, là điểm tựa vững chắc và niềm tin của con trong suốt cuộcđời

Bước đầu đi vào thực tế tìm hiểu nghiên cứu khoa học, kiến thức của emcòn nhiều hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ Do vậy, không tránh khỏi những thiếusót, kính mong nhận được sự góp ý của Quý Thầy Cô để kiến thức của chúng emngày càng hoàn thiện hơn và rút ra được những kinh nghiệm bổ ích cho quá trìnhhọc tập và làm việc sau này

Xin kính chúc các thầy cô của trường Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minhdồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý của mình Đồng kínhchúc các Thầy Cô, anh chị của phòng thí nghiệm Di truyền phân tử, Viện Nghiên

Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II luôn dồi dào sức khỏe và đạt được nhiều thànhcông tốt đẹp trong cuộc sống

TP.Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 8 năm 2015

Sinh viên thực hiện đồ án

Huỳnh Long Anh

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN

i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

vii MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về cá Tra (Pangasianodon hypophthamus)

3 1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm chung 3

1.1.2.1 Đặc điểm sinh học 3

1.1.2.2 Đặc điểm sinh thái và môi trường sống 3

1.1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng 4

1.1.2.4 Đặc điểm sinh sản 4

1.1.3 Tình hình nuôi và thương mại cá Tra ở Việt Nam 5

1.2 Các phương pháp định danh cá da trơn

7 1.3 Phân loại bằng sinh học phân tử (barcoding)

9 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .

12 2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu….……… 12

2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

12 2.1.1 Hóa chất thí nghiệm 12

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 12

2.4.1 Phương pháp thu mẫu 15

2.4.1.1 Mẫu cá Tra 15

2.4.1.2 Mẫu cá da trơn khác 15

2.4.2 Phương pháp định danh 15

2.4.2.1 Phương pháp định danh bằng hình thái 15

2.4.2.2 Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử 17

2.4.3 Phương pháp thu và bảo quản mẫu phục vụ cho PCR 17

2.4.4 Phương pháp chạy PCR 18

2.4.4.1 Khái niệm 18

2.4.4.2 Nguyên tắc của phản ứng PCR 20

2.4.5 Phương pháp tách chiết DNA 23

2.4.6 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 25

2.4.6.1 Chuẩn bị agarose gel 25

2.4.6.2 Đặt mẫu DNA vào giếng 25

2.5 Bố trí thí nghiệm 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Thu mẫu cá Tra và các loài cá da trơn khác 28

3.2 Định danh bằng hình thái học 28

3.2.1 Định danh cá Tra tự nhiên (Pangasius hypophthalmus) 29

3.2.2 Định danh cá Hú (Pangasius conchophilus) 31

3.2.3 Định danh cá Basa (Pangasius bocourti) 32

3.2.4 Định danh cá Vồ Đém (Pangasius larnaudiei) 33

3.2.5 Định danh cá Xác Sọc (Pangasius macronemus) 35

3.2.6 Định danh cá Bông Lau (Pangasius krempfi) 36

3.2.7 Định danh cá Vồ Cờ (Pangasius sanitwongsei) 38

3.3 Kết quả tách chiết DNA 40

3.3.1 Mẫu cá Tra chọn giống của Viện II 40

3.4 Định danh bằng sinh học phân tử 41

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi cytochrome b 41

3.4.2 Thí nghiệm 2: Kiểm định tính ổn định của phản ứng PCR 42

3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát kích thước sản phẩm PCR của cá Tra và 6 mẫu cá da trơn 43

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 Kết luận 45

4.2 Kiến nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DNA : Deoxyribonucleic acid

ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long

EDTA : Ethylene diaminetetra acetic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Chỉ tiêu định danh hình thái 16

Bảng 2.2: Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR 22

Bảng 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 22

Bảng 2.4: Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA 24

Bảng 3.1: Số lượng và kí hiệu mẫu cá 28

Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 41

Bảng 3.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 42

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cá Tra (Pangasius hypophthalmus) 3

Hình 1.2: Ty thể mtDNA 9

Hình 2.1: Thang chuẩn 1kp 14

Hình 2.2: Thang chuẩn 50 bp 14

Hình 2.3: Phản ứng PCR 21

Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tách chiết DNA 23

Hình 2.5: Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel 26

Hình 2.6: Sơ đồ quy trình nghiên cứu 27

Hình 3.1: Cá Tra 29

Hình 3.2:Bong bong kéo dài qua lỗ hậu môn 30

Hình 3.3:Răng khẩu cái và răng lá mía nối với nhau thành hình vòng cung

30 Hình 3.4: Cá Hú 32

Hình 3.5: Cá Basa 33

Hình 3.6: Cá Vồ đém 34

Hình 3.7:Cá Xác sọc 36

Hình 3.8: Cá Bông lau 37

Hình 3.9: Cá Vồ cờ 39

Hình 3.10: Kết quả chạy điện di trên gel của mẫu cá Tra chọn giống của Viện Thủy sản II 40

Hình 3.11: Kết quả tối ưu phản ứng PCR 41

Hình 3.12: Kết quả chạy điện di 43Hình 3.13: Kết quả điện di 7 mẫu cá da trơn 44

hiện được mục đích này, gen ty thể (COI, cytochrome b,…) là những chỉ thị đầy

triển vọng cho định danh các loài và đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứuDNA mã vạch

Ngoài ra khi thị trường toàn cầu cho ngành thủy sản và các sản phẩm nuôitrồng thủy sản được mở rộng, dán nhãn sai của các sản phẩm này đã trở thànhmột mối quan tâm ngày càng tăng trong lĩnh vực an toàn thực phẩm Kỹ thuậtnhận dạng các loài cá Tra bằng phương pháp sinh học phân tử giữ tiềm năng,đánh giá chính xác nhanh chóng các dán nhãn sản phẩm trên thị trường thế giới

Do đó đề tài: “Nghiên cứu mã vạch di truyền cá Tra (Pangasianodon hypopthalmus) bằng chỉ thị sinh học phân tử cytochrome b”giúp giải quyết

những khó khăn trên

2 Mục tiêu nghiên cứu

 Phân loại chính xác cá Tra (P hypophthalmus).

 Xác định được bộ chỉ thị phân tử cytochrome b nhằm kiểm định cá Tra (P.

hypophthalmus) có độ tin cậy > 95%.

3 Nội dung nghiên cứu

 Thu mẫu cá Tra và các loài cá da trơn khác thuộc họ cá Tra

 Định danh bằng hình thái học

 Định danh bằng sinh học phân tử

 Tối ưu phản ứng PCR

 Kiểm định tính ổn định của phản ứng PCR

 Bước đầu thử nghiệm định danh trên cá Tra

4 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Đồ án gồm các chương:

 Chương 1: Tổng quan tài liệu

 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

 Chương 3: Kết quả và thảo luận

 Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cá Tra (Pangasius hypophthamus)

và da nên chịu đựng được môi trường nước thiếu oxy hòa tan

Họ cá Tra (Pangasiidae) thuộc bộ cá da trơn hay cá nhéo (silurformes),

phân bố tương đối rộng từ Tây Nam Á và bao gồm một số loài có kích thước

lớn Các loài cá thuộc họ Pangasiidae được nhiều khoa học trên thế giới

quan tâm từ rất lâu do thịt ngon và đặc biệt có giá trị kinh tế cao

1.1.2.2 Đặc điểm sinh thái và môi trường sống

Cá có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chấthữu cơ, oxy hòa tan thấp, có thể nuôi với mật độ cao và có thể sống được ởvùng nước lợ (nồng độ muối 15oC, nhưng chịu nóng tới 39oC

Cá Tra phân bố tự nhiên ở lưu vực sông Mê Kông và được coi là cá bảnđịa của Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan Ở Việt Nam, cá bột và cágiống vớt được chủ yếu trên sông Tiền, cá trưởng thành thấy nhiều trong các

ao nuôi và ít khi tìm thấy trong tự nhiên Cá Tra có thân dài, không vẩy, màusắc đen xám trên lưng, bụng hơi bạc, miệng rộng và có 2 đôi râu dài Cá sốngchủ yếu trong nước ngọt, có thể chịu đựng được nước phèn với pH >= 5, ítchịu đựng được nhiệt độ thấp dưới 15oC nhưng có thể chịu nóng tới 39oC

1.1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng

Cá Tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, lúc còn nhỏ cá tăngnhanh về chiều dài Cá ương trong ao sau 2 tháng đạt chiều dài từ 10 – 12

cm, có khối lượng khoảng 14 – 15 g Từ khoảng 2,5 kg trở đi, mức tăngtrọng lượng nhanh hơn nhiều so với chiều dài cơ thể Cá nuôi trong ao 1 nămđạt từ 1 - 1,5 kg/con (năm đầu), những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn,

có khi đạt tới 5 - 6 kg/năm tuỳ thuộc môi trường sống và sự cung cấp thức ăncũng như loại thức ăn có hàm lượng đạm nhiều hay ít

Cá con thích ăn mồi tươi sống, có thể ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp.Khi lớn cá Tra ăn tạp, thiên về động vật và dễ chuyển đổi thức ăn Trong aonuôi, cá Tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn, kể cả thức ăn bắtbuộc như: mùn, bã hữu cơ, cám, rau, phân hữu cơ, động vật đáy,… do vậykhi nuôi trong ao, năm đầu tiên cá có thể đạt 1 – 1,5 kg/con, những năm tiếptheo cá tăng trọng nhanh hơn Cá Tra đực thành thục ở tuổi thứ 2 và cá cáithành thục ở tuổi thứ 3 trở lên Cá Tra không có cơ quan sinh dục thứ cấpnên khó phân biệt đực cái bằng hình thái

1.1.2.4 Đặc điểm sinh sản

Cá Tra không sinh sản trong ao nuôi, cá có tập tính di cư sinh sản trênnhững khúc sông có điều kiện sinh thái phù hợp Trong tự nhiên chỉ gặp cáthành thục trên sông ở địa phận của Campuchia và Thái Lan Ở Việt Nam, cáTra cũng không có bãi sinh sản tự nhiên Cá sinh sản ở Campuchia, cá bộttheo dòng nước về Việt Nam

Tuổi thành thục của cá Tra đực ở tuổi thứ 2 và cá Tra cái ở tuổi thứ 3.

Cá Tra không có cơ quan sinh dục phụ, nếu chỉ nhìn hình dáng bên ngoài thìkhó phân biệt được cá đực và cá cái Ở thời kì thành thục, tuyến sinh dục ở

cá đục phát triển lớn gọi là buồng tinh hay tinh sào, ở cá cái gọi là buồngtrứng hay noãn sào Mùa vụ sinh sản của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5– 7 âm lịch hàng năm Trọng lượng cá thành thục lần đầu từ 2,5 – 3 kg

Trong sinh sản nhân tạo, có thể nuôi thành thục sớm và cho cá đẻ sớmhơn trong tự nhiên (từ tháng 3 dương lịch hàng năm), cá Tra có thể tái phátdục 1 – 3 lần trong một năm

1.1.3 Tình hình nuôi và thương mại cá Tra ở Việt Nam

Từ trước những năm 1970, kỹ thuật nuôi còn hạn chế thì nghề nuôi cáTra còn rất mới Nguồn cá giống trước đây hoàn toàn phụ thuộc vào việc vớt

cá giống ngoài tự nhiên với sản lượng cá bột mỗi năm dạt khoảng 500 – 800triệu con Tuy nhiên, do biến động của điều kiện môi trường và sự khai thácquá mức của con người, sản lượng bột cá ngày càng suy giảm đáng kể, ngàynay chỉ đạt 15 – 25 % so với giai đoạn trước Ở nước ta, nghiên cứu sinh sảnnhân tạo cá Tra được bắt đầu năm 1978 và hiện nay đã có thể chủ động giảiquyết vấn đề số lượng con giống cho nghề nuôi cá Tra

Trong nhiều năm gần đây, cá Tra liên tiếp là một trong những mặt hàngxuất khẩu chủ lực thủy sản Việt Nam, góp phần vào sự tăng trưởng của xuấtkhẩu thủy sản nói riêng và nền kinh tế đất nước nói chung Cá Tra được nuôitập trung tại khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) với sản lượng cáTra nuôi đến hàng trăm nghìn tấn Hình thức nuôi rất đa dạng, từ dạng ao nuôiquy mô nhỏ đến các quy mô lớn (quy mô công nghiệp) Các hệ thống nuôi cáTra chính ở ĐBSCL là: ao đất, bè nỗi và nuôi đăng quầng ở vùng nước tựnhiên Sự phát triển của hệ thống nuôi bè và nuôi đăng quầng đã giảm dầntheo thời gian do mô hình nuôi này kém hiệu quả kinh tế như cá nuôi chậmlớn, tỷ lệ sống thấp, sự bùng phát dịch bệnh thường xuyên và sự ô nhiễmnước Vì vậy nuôi cá Tra trong bè và đăng quầng phát triển chỉ trong khoảngthời gian ngắn từ năm 2000 đến 2004 Cho đến nay phương pháp nuôi cá Tra

trong ao đang được xem là thành công trong hệ thống nuôi thủy sản ở ViệtNam Các tỉnh nuôi cá Tra với sản lượng cao phục vụ xuất khẩu có thể kể đến

là vùng ĐBSCL bao gồm: An Giang, Đồng Tháp, Tiền Giang, Cần Thơ, VĩnhLong, Bến Tre, Hậu Giang, Sóc Trăng, Trà Vinh, Kiên Giang và 2 tỉnh TâyNinh và Quảng Nam với tổng diện tích nuôi 5509 ha (năm 2011) và dự kiếnđến năm 2020 có thể đạt đến 13000 ha Trong đó Cần Thơ, An Giang vàĐồng Tháp là vùng nuôi cá Tra lớn nhất cả nước, sản lượng cá Tra chiếm trên

75 % so với tổng sản lượng cá Tra cả nước

Nuôi cá Tra thực sự phát triển nhanh từ năm 2000 do sản phẩm đượcxuất khẩu sang các nước ngày càng nhiều, mang lại hiệu quả cao và cá Tra đãtrở thành một mặt hàng chiến lược quan trọng, góp phần đưa Việt Nam trởthành nước đứng thứ 6 thế giới về xuất khẩu thủy sản, thứ 5 về nuôi trồng(Dương Tiến Thể, 2009)

Năm 2011, đã có trên 230 doanh nghiệp tham gia xuất khẩu cá Tra, sảnlượng đạt khoảng 1,2 triệu tấn, chiếm 30 % tổng kim ngạch xuất khẩu cảnước, giá trị xuất khẩu đạt 1,856 tỷ USD, tăng gần 26,5 % so với năm 2010.Một số thị trường xuất khẩu cá Tra lớn ở Việt Nam: thị trường EU là thịtrường tiêu thụ chính, thị trường Mỹ, thị trường Mehico, thị trường ASEAN,Trung Quốc và Hồng Kông

Việt Nam đang đối mặt với hàng rào thuế quan, sự thay đổi của thịtrường và nhiều chính sách về an toàn thực phẩm từ các nước nhập khẩu.Cuối năm 2010, cá Tra Việt Nam bị các thành viên của quỷ quốc tế bảo vệthiên nhiên (WWF) ở 6 nước EU (Đức, Áo, Thùy Sỹ, Bỉ, Na Uy và ĐanMạch) chuyển từ “danh sách da cam” (sản phẩm có thể cân nhắc sử dụng)sang “danh sách đỏ” (sản phẩm không nên sử dụng) Sau hơn 1 tháng kể từbuổi ký kết biên bản thỏa thuận hợp tác phát triển cá Tra Việt Nam theohướng bền vững, WWF ở các nước EU đã cho cá Tra Việt Nam ra khỏi danhsách đó Tuy nhiên, điều đó đã làm ảnh hưởng đến hình ảnh cá Tra Việt Namtrên thị trường thế giới

Xuất khẩu cá Tra Việt Nam cũng đang đứng trước gian lận thượng mại

do một số công ty Việt Nam câu kết với nước ngoài làm mất uy tín của cá Tratrên thị trường quốc tế, tình trạng bán phá giá lẫn nhau để giành hợp đồng, sựcạnh tranh không lành mạnh làm trầm trọng thêm tình trạng mất cân đối cung– cầu, ảnh hưởng tới chất lượng, hiệu suất kinh doanh

1.2 Các phương pháp định danh cá da trơn

1.2.1 Phân loại bằng hình thái

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về phân loại và định dạng họ cá Tra

(Pangasiidae) còn ít, gồm các công trình định loại của một số tác giả: Mai Đình Yên et al (1992), Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993) Các

tác giả trên đều dựa vào số lượng các tia vây, hình dạng các tia vây, thân vàmiệng, hình dạng và số lượng răng để định danh một số loài cá thuộc họ

Pangasiidae với 14 loài với tên Việt như sau: Pangasianodon hypophthalmus

- Cá Tra nuôi, Pangasius – Cá Tra xiêm, Helicophagus waandersii – Cá Tra chuột, Pangasianodon gigas – Cá Tra dầu, Pangasius kunyit – Cá Tra nghệ,

Pangasius micronema – Cá Tra, Pangasius macronema – Cá Xác Sọc, Pangasius larnaudii – Cá Vồ Đém, Pangasius sanitwongsei – Cá Vồ Cờ, Pangasius bocourti – Cá Basa, Pangasius pleurotaenia – Cá Xác Bầu, Pangasius conchophilus – Cá Hú, Pangasius polyuranodon – Cá Dứa, Pangasius krempfi – Cá Bông Lau Trong đó, có 6 loài cá da trơn được xem là

phổ biến và có giá trị kinh tế là: cá Tra nuôi, cá Basa, cá Xác sọc, cá Vồ đém,

cá Hú, cá Bông lau (Cohen, 2009)

Năm 2009, tác giả Phạm Đình Văn đã điều tra thành phần loài và xâydựng bộ mẫu về các loài cá có giá trị kinh tế, đặc biệt là các giống, loài trong

họ cá Tra (Pangasiidae), theo tác giả, họ cá Tra có thân tương đối dài, phần

bụng tròn hoặc có lườn bụng, miệng ở mút mõm hoặc dưới Răng nhọn trênhai hàm, xương lá mía và xương khẩu cái mọc thành dãy ghép liền hoặc khôngghép liền với các hình dạng khác nhau; cá biệt các loài không có răng Trong

14 loài ghi nhận này, đặc biệt có loài cá Tra nghệ P kunyit mới xác nhận gần đây tại An Giang (Vương Học Vinh et al, 2012) Theo tác giả cá Tra nghệ P.

kunyit có 2 đặc điểm có thể phân biệt với cá da trơn khác là trên hai nắp mang

có vết hình rẻ quạt và vi lưng cá có tia vi cứng luôn dựng thẳng đứng, khôngnằm sát xuống mặt lưng ngay cả khi chúng ta dùng tay áp sát vào

Theo tác giả Roberts và Vilenciennes (1991), họ cá Tra (Pangasiidae) vùng Đông Nam Á gồm có hai giống: giống Helicophagus Bleeker, 1858 và giống Pangasius Valemciennes, 1940 có 19 loài Sau đó tác giả Rainboth (1996) đã bổ sung thêm 2 giống mới là: Pangasianodon Chevey, 1930 và

Petropagasius Flowe, 1937 Một nghiên cứu nữa của Rainboth (1996) nghi

vấn về giống Pseudolais như là một giống độc lập và được coi là một phân giống của Pangasius Theo Wikipedia tiếng Pháp, họ Pangasiidae có ba giống: Sinopangasius (1 loài), Helicophagus (3 loài) và Pangasius (27 loài) Tuy nhiên theo vài tài liệu cùa FishBase, giống và loài Sinopangasius được coi là từ đồng nghĩa của Pangasius kempfi (cá Bông lau).

Như vậy, có thể phân loại họ Pangasius có hai giống và giống Pangasius

có 24 loài Các loài hoặc dưới loài thuộc giống Pangasius có hình thái rất

giống nhau, gây nhiều khó khăn trong việc phân loại trong thời gian vừa qua

Chẳng hạn đối với cá dứa, Pangiasius polyuranodon Bleeker 1931, việc phân

loại chủ yếu dựa trên hình dạng cơ thể, số lượng râu, răng lá mía, răng khẩucái, vị trí lỗ mũi, vị trí sắc tố xuất hiện và các đặc điểm ở bụng (Smith, 1945).Các loài cá Tra đặc trưng bởi sự kết hợp của bóng hơi, răng vòm miệng, vây,lược mang và màu sắc mẫu (Roberts và Vidthayanon, 1991; Vidthayanon vàRoongthongbaisuree, 1993)

Phân loại họ Pangasiidae cũng như các họ khác còn dựa trên sự khác

biệt về giải phẫu bộ máy Weber (Nelson, 1967; Burgess, 1989) và giả thuyếtnày đã được chấp nhận rộng rãi Bộ máy weber là một cấu trúc giải phẫu kếtnối bóng hơi với hệ thống thính giác khi nó được phát triển đầy đủ trong cơthể cá trưởng thành, các yếu tố của bộ máy đôi khi được gọi chung là cácxương nhỏ Weber (FishBase, 2007) Các chỉ tiêu hình thái để tách giống

Pangasianodon ra khỏi giống Pangasius là miệng có dạng trước (terminal

mouth), có 8 – 9 tia vi ngực; loài P gigas có 7 tia vi lưng và không có lược mang (gill rakers), trong khi loài P hypophthalmus có 6 tia vây lưng và lược

mang rất phát triển Theo Roberts và Vidthayanon (1991), các giống

Pangasianodon Chevey, 1930, Pteropangasius Fowler, 1937 và Sinopangasius Chang and Wu, 1965 là các đồng danh (synonyms) của giống Pangasius.

Mặc dù phân loại hình dựa vào hình thái học đạt được những kết quả

nhất định đối với họ Pangasiidae, nhưng không phải lúc nào cũng có các kết

quả chính xác Trong nhiều trường hợp, hình thái bị giới hạn do ảnh hưởngcủa điều kiện sống, hoặc sản phẩm cần phân loại ở dạng chế biến,… Việc xácđịnh trở nên khó khăn hoặc thậm chí không thể Do đó, phát triển các phươngpháp mới để xác định loài nhanh và chính xác là điều cần thiết

1.2.2 Phân loại bằng sinh học phân tử

1.2.2.1 Ty thể

Hình 1.2: Ty thể mtDNA

Mặc dù hầu hết DNA được chứa trong NST nằm trong nhân, ty thể cũng

có một số ít DNA riêng (được biết đến như DNA ty thể hay mtDNA)

Ty thể là những cấu trúc nằm bên trong tế bào, chuyển hóa năng lượng từthức ăn thành dạng tế bào có thể sử dụng được Mỗi tế bào chứa đựng hàngtrăm đến hàng ngàn ty thể, nằm lơ lửng trong tế bào chất xung quanh nhân

Cytochrome b nằm ở vị trí giữa ubiquinon và cytochrom c Nó có khối

lượng phân tử vào khoảng 17.000 (monomer) và có khuynh hướng tự ngưng tụmạnh mẽ để tạo thành dạng trùng hợp cao phân tử với khối lượng có thể lêntới trên 4 triệu cytochrome b liên kết rất chặt chẽ với màng trong ty thể

Cytochrome b nằm trong phức hợp III (ubiquinon-cytochrom reductase): có khối lượng tiểu phần vào khoảng 300.000 (protein + lipid) và

c-có 6 đến 8 chuỗi polypeptid cấu thành Trong đó, hai hay ba chuỗi polypeptid

có chứa cytochrome b, một chuỗi chứa cytochrom c 1 và một chuỗi chứa trungtâm sắt-lưu huỳnh-protein; một chuỗi polypeptid có thể liên kết với atimycin

và các chuỗi còn lại chưa rõ chức năng Protein của cytochrome b rất kỵ nước

và người ta cho rằng: chất truyền điện tử này cũng giống như ubiquinon là

định vị giữa lớp lipid kép của màng trong ty thể

DNA ty thể gồm 37 gen, tất cả đều là tiềm năng cho chức năng bìnhthường của ty thể Ba mươi gen điều khiển sinh tổng hợp enzyme phosphorylhóa oxi hóa Những gen còn lại điều khiển tổng hợp những phân tử gọi làRNA vận chuyển (tRNA) và RNA ribosome (rRNA), những chất hóa học thânthiết với DNA Ba loại phân tử RNA này giúp lắp ráp khuôn tổng hợp aminoacid hình thành protein có chức năng Trong số 37 gen của ty thể, trình tự

COI, cytochrome b, tRNA được xem là những trình tự gen ổn định, có khả

năng sử dụng cho việc định danh bằng sinh học phân tử

1.2.2.2 Sử dụng gen ty thể cho việc định danh các loài thủy sản

COI thuộc hệ gen ty thể thường được sử dụng trong các nghiên cứu quan

hệ di truyền, phân loại và giám định các loài Lợi ích từ việc sử dụng vùng genCOI là đoạn trình tự ngắn để có thể giải trình tự một cách nhanh chóng vàkhông tốn kém Thêm vào đó, trật tự nucleotit trong đoạn COI có tính bảo tồnrất cao nên lợi thế trong việc xác lập nên các bộ mã vạch di truyền cho nhiềuloài động vật, trong đó có cá Gene COI tham gia vào quá trình vận chuyểnelectron trong giai đoạn hô hấp của vi sinh vật Theo đó, các gene được sửdụng cho nghiên cứu mã vạch được tham gia vào các phản ứng chìa khóa của

sự sống: dự trữ năng lượng (khi cần giải phóng nó để tạo thành ATP) Do đó,

các vùng trình tự thay thế đã được đề xuất sử dụng làm mã vạch DNA chonhóm này.

Bên cạnh COI, trình tự của cytochrome b và 16s RNA (16S) thuộc gen

ty thể (mtDNA) cũng nằm trong số các chỉ thị di truyền được sử dụng rộng rãinhất cho việc nhận dạng các loài cá (Kochzius, 2009; Telatchea, 2009), kiểmsoát thủy sản (Marko, 2004) và định danh loài (Kochzius, 2003)

Cơ sở dữ liệu đã được thiết lập, có chứa trình tự cytochrome b hoànchỉnh ( ww w f i s h Tr a c e o r g), cho phép xác định, phân loại mẫu dựa trên một

trình tự cytochrome b của mẫu Các nghiên cứu xác định các loài sử dụng

cytochrome b có thể kể đến là nghiên cứu trên cá bẹt, cá cơm, cá chình và

nhiều loài cá biển khác (Teletchea et al., 2005; Santaclara và et al., 2006) Do

mức độ tương đồng giữa các loài đa dạng cao và các loài cá có độ đa dạng

thấp, trình tự cytochrome b có thể thể hiện đột biến và cho phép phân biệt các loài có liên quan chặt chẽ với nhau (Mackie et al., 1999; Aranishi et al.,

2005a) Một số nghiên cứu cũng đã sử dụng vùng gen của mtDNA mã hóa chocytochrome b và chuỗi tRNA lân cận (tRNA Glu – cyt b) để phát hiện các loài

như cá bơn, cá tuyết, cá tầm và cá hồi (Wolf et al., 1999; Sanjuan và Comesana 2002; Akasaki et al., 2006).

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

 Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Di truyền phân tử, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II (116 Nguyễn Đình

Chiểu, Phường Đakao, Quận 1, TP Hồ Chí Minh)

 Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ 1/2015 đến 7/2015

 Bộ DNA mix (Promega)

 Bộ DNA maker (BIOLINE)

 Cân điện tử MS 204.

 Máy vortex

 Máy khuấy từ gia nhiệt

 Máy cất nước siêu sạch

 Máy hút và tủ cấy vô trùng (Astec Microflow)

 Máy ly tâm lạnh

 Máy PCR (BIO-RAD)

 Bộ thiết bị điện di (BIO-RAD)

 Thiết bị chụp ảnh gel điện di (BIO-RAD)

 Lò vi sóng (Electrolux – Thụy Điển)

 Tủ mát (4oC), tủ âm (- 25oC) (Sanyo – Nhật)

 Bể điều nhiệt

2.3 Hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR

Các hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR (đệm, MgCl2, dNTPs, enzyme Taq

DNA polymerase, enzyme Pfu DNA polymerase…) của hãng Promega (Mỹ)

2.4 Hóa chất sử dụng để chạy điện di

Gel agarose dạng bột Promega (Mỹ), TBE 0,5X, Dung dịch màu tải mẫu6x (dịch nạp mẫu) chứa 30 % glycerol, 0,25 % bromophenol blue (BPB) và0,25 % xylencyanol (XC); Ethidium bromide

Thang sử dụng cho DNA

Hình 2.1: Thang chuẩn 1kp Thang sử dụng cho sản phẩm PCR

Hình 2.2: Thang chuẩn 50 bp

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp thu mẫu

2.5.1.1 Mẫu cá Tra

 Quần đàn tự nhiên: thu mẫu tại hai nhánh sông Tiền và sông Hậu

 Quần đàn sản xuất: thu mẫu cá bố mẹ từ trại sản xuất giống thuộcĐồng bằng sông Cửu Long

 Số lượng: 30 mẫu cá tự nhiên, 30 mẫu cá sản xuất

2.5.2.1 Phương pháp định danh bằng hình thái

Dựa theo các nghiên cứu về hình thái học của Tyson et al (1991), Ferrari (2007), Vương Học Vinh et al.,(2012), Trương Thủ Khoa (1993) là

cơ sở cho việc phân loại cá Tra và một số cá da trơn khác trong họ

Pangasiidea.

Bảng 2.1: Chỉ tiêu định danh hình thái theo Trương Thủ Khoa (1993)

Chỉ tiêu Cá Tra Cá Hú Cá Basa Cá vồ

đém

Cá Xácsọc

Cá Bônglau

M (g): Khối lượng toàn thân (g)

L (cm): Chiều dài toàn thân

Lo (cm): Chiều dài tiêu chuẩn của cá

H (cm): Chiều cao thân lớn nhất

T (cm): Chiều dài đầu

O (cm): Đường kính mắt

OO (cm): Khoảng cách hai mắt

D: Số tia vây lưng

A: Số tia vây hậu môn

P: Số tia vây ngực

V: Số tia vây bụng

Tiến hành lập tỉ lệ:

Dài cuống đuôi

Cao cuống đuôi

2.5.2.2 Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử

Khuếch đại gen cytochrome b được thực hiện với cặp mồi được sử

dụng là: L14735 (5 "-AAA AAC CAC CGT TGT TAT TCA ACT A-3") vàH15149ad (5 "-GCI CCT CAR AAT GAY ATT TGT CCT CA-3") của LiLian Wong (2011) Kích thước của sản phẩm PCR trên cá Tra theo tác giả là

từ 416 – 436 bp, sau đó dùng phần mềm tin sinh học để đánh giá sự khác biệt

Từ đó, đưa ra phương pháp định danh cá Tra

2.5.3 Phương pháp thu và bảo quản mẫu phục vụ cho PCR

Cá rửa sạch, cắt lấy vây đuôi, rửa lại vây đuôi bằng ethanol 96 % và chovào ống fancol 1,5 ml có chứa ethanol 70 % để bảo quản Chú ý phải luôn đểmẫu ngập trong ethanol 70 %

Mẫu vây đuôi được cắt và bảo quản trong ethanol 70 % ở 4oC Tiếnhành thay ethanol định kỳ và luôn bảo đảm mẫu ngập hết trong ethanol

2.5.4 Phương pháp chạy PCR

2.5.4.1 Khái niệm

PCR là phương pháp khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một

cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một

lượng DNA mẫu rất nhỏ Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạodòng DNA rất đơn giản và hiệu quả Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạnDNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ được thu nhận từ DNA mẫu

Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR

Mẫ u DNA:

Mẫu DNA sẽ được ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượngnghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau Đối với DNA thực vậtthường được ly trích từ mô lá, DNA động vật thường được ly trích từ máu,long, mô, …

Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cầncao, tuy nhiên để thu được kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sựtinh khiết

Số lượng DNA cần cho một phản úng PCR vào khoảng 5 – 10 ng Nồng

độ DNA có thể xác định được nhờ đo OD (mật độ quang) ở bước sóng260nm Khi DNA tinh khiết, lượng DNA được tính theo công thức:

1 OD260nm = 50 ng/ µl (đối với DNA sợi kép)

1 OD260nm = 40 ng/ µl (đối với DNA sợi đơn)

P r i m er ( mồ i ) :

Là một đoạn nucleotide có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cầnkhuếch đại Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F-primer (mồi xuôi) và R-primer (mồi ngược)

Cặp primer sẽ quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR, nếu primerđược thiết kế đúng thì đoạn DNA đích mới được khuếch đại chính xác

d N T Ps ( d A T P, d T T P, d C T P, d G T P ) :

Nồng độ dNTPs thường được sử dụng là 20 – 200 µM Nồng độ cáohơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh” Bên cạnh đó, sự cân bằng trongthành phần các dNTPs cũng ảnh hưởng đến phẩn ứng PCR Thông thường thì

nồng độ của các dNTPs sẽ là như nhau Sự mất cân bằng trong thành phầncác dNTPs sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase.

Nồng độ dNTPs thích hợp cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vàonồng độ Mg2+, nồng độ primer, số chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sảnphẩm được khuếch đại Vì thế, nồng độ dNTPs tối ưu cho từng phản ứngphải được xác định qua thực nghiệm

D un g d ịch b u ff e r :

Tạo môi trường tối ưu nhất cho Taq polymerase hoạt động.

T a q po l y m e r as e :

Ban đầu, khi chưa sử dụng enzyme Taq polymerase người ta phải thêm

DNA polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA polymerase cần choquá trình tổng hợp DNA nhưng không chịu được nhiệt độ lớn hơn 900C ở

giai đoạn biến tính tách hai sơi của phân tử DNA Năm 1988, Taq

polymerase được phát hiện, đây là một loại DNA polymerase bền với nhiệt,

được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng Với enzyme này thì chỉ cần cho một lần Taq polymerase là được.

Nồng độ Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0,5 – 5 đơn

vị/100µl dung dịch phản ứng Nếu nồng độ quá cao, những sản phẩm khôngmong muốn có thể xuất hiện làm sai lệch kết quả Nếu nồng độ quá thấp thì

sẽ không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo lượng sản phẩm PCR theo ý muốn

Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một

nucleotide loại A vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quantrọng trong việc tạo dòng (TA – cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắnkết xảy ra ở đầu tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation) Ngoài ra có thể

làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu, …

I o n k i m l o ạ i M g 2 + :

Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động.

2.5.4.2 Nguyên tắc của phản ứng PCR

Phản ứng PCR thường được thực hiện qua 25 – 35 chu kỳ Mỗi chu kỳbao gồm các bước: denature (biến tính DNA), annealing (gắn mồi),extension (kéo dài)

Giai đoạn denature (biến tính DNA): thường được tiến hành ở nhiệt

độ từ 94 – 98oC, trong 40 – 60 giây (thời gian có thể dài hoặc ngắn hơn tùytheo độ dài của DNA mẫu) Đây là bước làm biến tính DNA mẫu từ sợi képthành sợi đơn dưới tác dụng của nhiệt độ bằng cách phá vỡ các liên kếthydro

Giai đoạn annealing (gắn mồi): 50 – 60oC trong 30 giây Đây là bướcprimer gắn đặc hiệu vào sợi DNA đích (lúc này ở dạng sợi đơn) Nhiệt độgắn mồi tùy thuộc vào độ dài của từng cặp primer

Giai đoạn extension (kéo dài): 72oC, 30 – 90 giây tùy thuộc độ dài

DNA đích Đây là bước kéo dài primer nhờ hoạt động của Taq polymerase.

Ở nhiệt độ 72oC, hoạt động của Taq polymerase sẽ đạt hiệu quả tối ưu.

Sau 25 – 35 chu kỳ, phản ứng tiếp tục giai đoạn ủ ở 72oC trong 5 – 20phút để hoàn thiện các sản phẩm

Hình 2.3: Phản ứng PCR

Primer Rcyt b 25pM 0,4 0,5pM

-Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Bảng 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian