L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.:...29 2.6.5 Khảo sát khả năng đối kháng của sản phẩm trao đổi chất chủng Lactobacillus sp.. L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: ...31 2.6.6 Khảo
Trang 1Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
DANH MỤC VIẾT TẮT vi
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH viii
MỞ ĐẦU 1
1 Tính cấp thiết của đề tài: 1
2 Tình hình nghiên cứu: 1
3 Mục đích nghiên cứu: 2
4 Mục tiêu nghiên cứu: 2
5 Nội dung nghiên cứu: 2
6 Phương pháp nghiên cứu: 3
6.1 Phương pháp luận: 3
6.2 Phương pháp xử lý số liệu: 3
7 Kết quả đạt được: 3
Chương 1: TỔNG QUAN 4
1.1 Tổng quan về nấm sợi: 4
1.1.1 Giới thiệu chung: 4
1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra: 4
1.1.2.1 Các loài có khả năng sinh độc tố: 4
1.1.2.2 Độc tố Aflatoxin: 7
1.1.2.3 Độc tốc Patulin: 7
1.1.2.4 Độc tố Fumonisin: 8
1.1.3 Các cách khử nhiễm độc tố: 8
1.1.3.1 Phương pháp vật lý học: 8
Trang 2Đồ án tốt nghiệp
1.1.3.2 Phương pháp hoá học: 10
1.1.3.3 Phương pháp sinh học: 10
1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic: 13
1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic: 13
1.2.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus: 13
1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic: 14
1.2.2 Khả năng sinh các chất kháng khuẩn: 16
1.2.2.1 Bacteriocins: 16
1.2.2.2 Các chất có khả năng kháng khuẩn khác: 17
1.2.3 Khả năng kháng nấm và ứng dụng sản phẩm của vi khuẩn lactic: 17
1.2.3.1 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic: 17
1.2.3.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic: 19
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1 Địa điểm nghiên cứu: 21
2.2 Thời gian thực hiện: 21
2.3 Vật liệu nghiên cứu 21
2.3.1 Vật liệu: 21
2.3.2 Hoá chất và môi trường sử dụng: 21
2.3.2.1 Hoá chất: 21
2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy: 21
2.4 Thiết bị và dụng cụ: 22
2.4.1 Thiết bị: 22
2.4.2 Dụng cụ: 22
2.5 Phương pháp luận: 22
Trang 3Đồ án tốt nghiệp
2.5.1 Mục tiêu đồ án: 22
2.5.2 Nội dung: 22
2.6 Phương pháp nghiên cứu: 24
2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu: 24
2.6.2 Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá vi khuẩn Lactobacillus sp L5: 25
2.6.2.1 Nhuộm gram: 25
2.6.2.2 Nhuộm bào tử: 26
2.6.2.3 Thử nghiệm Catalase: 26
2.6.2.4 Xác định hàm lượng acid tổng: 26
2.6.2.5 Thử nghiệm khả năng lên men đường: 27
2.6.2.6 Thử nghiệm Protease: 27
2.6.2.7 Thử nghiệm Chitinase: 27
2.6.3 Khảo sát sự phát triển của các nấm chủng nấm Aspergillus spp.: 28
2.6.4 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 29
2.6.5 Khảo sát khả năng đối kháng của sản phẩm trao đổi chất chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 31
2.6.6 Khảo sát khả năng đối kháng của hợp chất thứ cấp chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 33
2.6.7 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Lactobacillus sp L5 trong bảo quản hạt: 34
2.6.7.1 Ứng dụng tạo màng bao bảo quản hạt đậu phộng: 34
2.6.7.2 Kiểm nghiệm vi sinh sản phẩm: 36
Trang 4Đồ án tốt nghiệp
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37
3.1 Khảo sát sinh lý – sinh hoá của chủng vi khuẩn lactic: 37
3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc: 37
3.1.2 Nhuộm Gram: 37
3.1.3 Nhuộm bào tử: 38
3.1.4 Thử nghiệm Catalase: 38
3.1.5 Xác định hàm lượng acid tổng: 39
3.1.6 Thử nghiệm khả năng lên men đường: 40
3.1.7 Thử nghiệm protease: 41
3.1.8 Thử nghiệm chitinase: 42
3.2 Khảo sát khả năng phát triển của các chủng nấm Aspergillus spp.: 42
3.3 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 44
3.4 Khảo sát khả năng đối kháng của sản phẩm trao đổi chất chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 46
3.4.1 Dịch ly tâm không trung hoà pH: 47
3.4.2 Dịch ly tâm trung hoà pH = 6: 49
3.5 Khảo sát khả năng đối kháng của hợp chất thứ cấp chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 51
3.5.1 Khảo sát thời gian chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 sinh hợp chất thứ cấp: 51
3.5.2 Khảo sát khả đối kháng của hợp chất thứ cấp chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 55
3.5.3 Khảo sát thành phần hoá học của cao Ethyl acetate: 58
Trang 5Đồ án tốt nghiệp
3.6 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Lactobacillus sp L5 trong
bảo quản hạt: 59
3.6.1 Ứng dụng tạo màng bao bảo vệ đậu phộng: 59
3.6.2 Kiểm tra vi sinh chất lượng của sản phẩm: 69
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75
4.1 Kết luận: 75
4.2 Kiến nghị: 75
TÀI LIỆU THAM KHẢO 76
Trang 6Đồ án tốt nghiệp
UV: Ultra Violet
TLC: Thin Layer Chromatography
EA: Ethyl Acetate
PDA: Potato Dextrose Agar
MRS: de Man, Rogosa và Sharpe
DMSO: Dimethyl Sulfoxide
VRB: Violet Red Bile
TPC: Tổng số vi sinh vật hiếu khí
PCA: Plate Count Agar
BPW: Buffered Peptone Water
Trang 7Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn 11
Bảng 1.2 Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M P Zacharof, 2012) 16
Bảng 1.3 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB (Holzapfel và cộng sự, 1995) 17
Bảng 1.4 Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) 18
Bảng 3.1 Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp L5 41
Bảng 3.2 Đường kính phát triển của các chủng nấm mốc Aspergillus spp 43
Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của Lactobacillus sp L5 44
Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm mốc của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 không trung hoà pH khi không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt .47
Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm mốc của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 trung hoà pH = 6 khi không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt 49
Bảng 3.6 Khả năng đối kháng nấm của dịch ly tâm 16 giờ, 24 giờ và 40 giờ Lactobacillus sp L5 51
Bảng 3.7 Tỉ lệ đối kháng với các chủng nấm mốc của cao ethyl acetate 55
Bảng 3.8 Kết quả thí nghiệm thành phần hoá học của cao ethyl acetate 58
Bảng 3.9 Khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy khi tạo màng bao ứng dụng trên đậu phộng 60
Bảng 3.10 Khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy gia nhiệt 100°C khi tạo màng bao ứng dụng trên đậu phộng 63
Bảng 3.11 Khả năng kháng nấm của cao Ethyl acetate khi tạo màng bao ứng dụng trên đậu phộng 66
Bảng 3.12 Kết quả kiểm nghiệm Tổng số vi sinh vật hiếu khí và Coliform 69
Trang 8Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một số loại độc tố 6
Hình 3.1 Khuẩn lạc của Lactobacillus sp L5 trên môi trường MRS Agar 37
Hình 3.2 Kết quả nhuộm gram chủng Lactobacillus sp L5 38
Hình 3.3 Kết quả nhuộm bào tử chủng Lactobacillus sp L5 38
Hình 3.4 Thử nghiệm catalase chủng Lactobacillus sp L5 39
Hình 3.5 Hàm lượng acid lactic của chủng Lactobacillus sp L5 theo thời gian 40
Hình 3.6 Kết quả lên men các loại đường chủng Lactobacillus sp L5 41
Hình 3.7 Thử nghiệm protease chủng Lactobacillus sp L5 42
Hình 3.8 Thử nghiệm chitinase chủng Lactobacillus sp L5 42
Hình 3.9 Khả năng phát triển của các chủng nấm mốc Aspergillus spp trên môi trường MRS Agar cải tiến 43
Hình 3.10 Đồ thị thể hiện sự ức chế của dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 với các chủng nấm mốc 45
Hình 3.11 Khả năng ức chế nấm mốc của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5 46 Hình 3.12 Đồ thị thể hiện tỉ lệ ức chế của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 không trung hoà pH khi gia nhiệt và không gia nhiệt 47
Hình 3.13 Khả năng ức chế nấm CĐP1 (I), ĐN2 (II), ĐN3 (III) và HCP2 (IV) của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 khi không trung hoà pH 48
Hình 3.14 Đồ thị biểu thị tỉ lệ ức chế nấm mốc của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 trung hoà pH = 6 khi không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt .49
Hình 3.15 Khả năng ức chế nấm CĐP1 (I), ĐN2 (II), ĐN3 (III) và HCP2 (IV) của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 khi trung hoà pH 50
Hình 3.16 Đồ thị thể hiện khả năng đối kháng nấm CĐP1 của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 và giá trị OD cùng hàm lượng acid lactic 53
Hình 3.17 Đồ thị thể hiện khả năng đối kháng nấm ĐN2 của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 và giá trị OD cùng hàm lượng acid lactic 53
Trang 9Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.18 Đồ thị thể hiện khả năng đối kháng nấm ĐN3 của dịch ly tâm chủng
Lactobacillus sp L5 và giá trị OD cùng hàm lượng acid lactic 54
Hình 3.19 Đồ thị thể hiện khả năng đối kháng nấm HCP2 của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 và giá trị OD cùng hàm lượng acid lactic 54
Hình 3.20 Đồ thị thể hiện sự đối kháng các chủng nấm Aspergillus spp của cao Ethyl acetate so với Trung hoà pH không gia nhiệt và gia nhiệt 100°C 56
Hình 3.21 Khả năng ức chế nấm Aspergillus spp của cao Ethyl acetate 57
Hình 3.22 Kết quả thử nghiệm Lipid của cao Ethyl acetate 58
Hình 3.23 Kết quả thử nghiệm Đường khử, Protein, Acid amin của cao Ethyl acetate 59
Hình 3.24 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy 62
Hình 3.25 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy gia nhiệt 100°C 65
Hình 3.26 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của cao Ethyl acetate 68
Hình 3.27 Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí 70
Hình 3.28 Kết quả Coliform trên môi trường VRB 71
Hình 3.29 Kết quả thử nghiệm Coliform của TN1 – NT2 (Dịch nuôi cấy và Chitosan 0,4% 72
Hình 3.30 Kết quả kiểm tra sự phát triển của nấm mốc trên môi trường MRS Agar 73
Hình 3.31 Thử nghiệm Catalase với NT1 (Canh trường nuôi cấy) và TN1-NT2 (Dịch nuôi cấy và Chitosan 0,4%) 74
Trang 10Đồ án tốt nghiệp
1 Tính cấp thiết của đề tài:
MỞ ĐẦU
Vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề xã hội cần giải quyết kịp thời để bảo
vệ sức khoẻ con người Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩmtrong không khí thường cao, là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gâynhiễm độc tố cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, gây độc cho người và gia súc,gây tổn thương gan (ung thư gan…) Tình trạng phơi nhiễm của nấm mốc ảnhhưởng đến 25% mùa màng trên toàn thế giới, làm tổn thất trung bình 418 triệu đô
và ảnh hưởng trên gia súc 472 triệu đô mỗi năm (theo Bô Nông Nghiệp Mỹ, 2009).Tại Việt Nam, mỗi năm bị ảnh hưởng khoảng 13-16% lượng nông sản tuỳ loại.Trước thực trạng đó, con người đã và luôn tìm kiếm những hoạt chất sinh họcvừa có tác dụng kháng nấm, vừa không gây hại cho cơ thể con người Một trongnhững chủng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất chính là các chủng sinh acidlactic Vi khuẩn dạng này có hoạt tính sinh học khá cao, an toàn, có khả năng tiêudiệt vi sinh vật có hại và là nguồn vi sinh vật hữu ích, duy trì hệ cân bằng vi khuẩnđường ruột
Từ những lợi ích của vi khuẩn lactic và vấn đề ngộ độ thực phẩm và hư hạinông sản do nấm mốc gây ra mỗi năm Đây là lí do chúng tôi chọn để thực hiện đề
tài “Khảo sát khả năng kháng nấm của hợp chất thứ cấp vi khuẩn lactic và ứng dụng trong bảo quản hạt đậu phộng”
Trang 11 Năm 2004, C a ss a n dra De M u y nck và công sự nghiên cứu “Khả năng khángnấm của vi khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất thứ cấp trong thựcphẩm”.
Kim Jeong Dong với “Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic
phân lập từ kimchi kháng Aspergillus fumigatus” năm 2005.
R M uñoz và cộng sự với nghiên cứu “Ngăn cản sự sản xuất độc tố của
Aspergillus nomius vsc 23 của vi khuẩn sinh acid lactic và Saccharosemyces cerevisae” năm 2010.
Ở trong nước có các công trình nghiên cứu như Chế phẩm EM bảo vệ câytrồng hay ứng dụng trong thuỷ sản, chế phẩm Sadi Bio 1 (là tên gọi của chế phẩm visinh Biomix 2) của Viện công nghệ Môi trường Việt Nam, được sản xuất từ các
chủng vi sinh vật hữu ích thuộc nhóm xạ khuẩn Streptomyces ưa ấm sinh tổng hợp
mạnh các enzym ngoại bào, có khả năng sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn
Gram âm Ngoài ra, sản phẩm còn chứa vi khuẩn Lactobacillus có tác dụng ức chế
mạnh các vi khuẩn gây bệnh Chế phẩm sinh học Sagi Bio-1 có tác dụng xử lý mùichuồng trại chăn nuôi và bãi chôn lấp chất thải
3 Mục đích nghiên cứu:
Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm sinh học bảo quản hạt từ vi khuẩn lên menlactic
4 Mục tiêu nghiên cứu:
Khảo sát khả năng ứng dụng của dịch nuôi cấy, sản phẩm trao đổi chất và hợp
chất thứ cấp của vi khuẩn Lactobacillus sp L5 trong bảo quản hạt đậu phộng.
5 Nội dung nghiên cứu:
Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus
sp L5
Khảo sát sự phát triển của các chủng nấm Aspergillus spp
Trang 12Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp
Khảo sát khả năng đối kháng của sản phẩm trao đổi chất chủng vi khuẩn
Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp
Khảo sát khả năng đối kháng của hợp chất thứ cấp chủng vi khuẩn
Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp
Ứng dụng Dịch nuôi cấy, sản phẩm trao đổi chất và hợp chất thứ cấp của vi
khuẩn Lactobacillus sp L5 trong bảo quản hạt đậu phộng.
6 Phương pháp nghiên cứu:
6.1 Phương pháp luận:
Trên cơ sở khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic đối với các nấmgây hư hỏng thực phẩm và sinh độc tố, người thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu vàtìm hiểu các tác nhân gây ức chế nấm nhiễm thực phẩm Sau khi xác định tác nhângây ức chế là hợp chất thứ cấp, sẽ trích ly thu hoạt chất và ứng dụng trong bảo quảnđậu phộng đã cảm nhiễm nấm mốc
Xác định được thời gian sinh hợp chất thứ cấp tốt nhất của chủng vi khuẩn
Lactobacillus sp L5 nuôi cấy trên môi trường MRS Agar cải tiến.
Chứng minh được cao Ethyl acetate trích ly từ dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn
Lactobacillus sp L5 có khả năng kháng nấm.
Ứng dụng thành công các dạng sản phẩm khác nhau của vi khuẩn
Lactobacillus sp L5 trong bảo quản hạt đậu phộng.
Trang 13Chương 1: TỔNG QUAN1.1 Tổng quan về nấm sợi:
1.1.1 Giới thiệu chung:
Nấm (Fungi, số ít là Fungus) là một giới trong năm giới theo hệ thống phânloại của R.H.Whittaker (1996) Nấm thuộc ngành nấm (Euphycophyta) là bộ mônnghiên cứu của nấm học (Mycology) Nấm phân bố rộng rãi trong tự nhiên (trongđất, nước, không khí, chuồng nuôi…), chúng đóng vai trò rất quan trọng trong việcđảm bảo vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên do chúng có khả năng phân giải cáchợp chất như: cellulose, protein, lipid, chitin…
Vi nấm (Micro fungi) là những nấm không có mũ nấm và có thể nhìn thấybằng mắt thường Căn cứ vào hình thái, ta chia thành hai loại là nấm men (Yeast) vànấm sợi (Filamentous fungi) còn được gọi là nấm mốc
1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra:
1.1.2.1 Các loài có khả năng sinh độc tố:
Độc tố nấm mốc (Mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khốilượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độcđối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người Điểm mấu chốt ở độc tố nấm mốc
là chúng có thể gây hại ở nồng độ thấp
Theo Nguyễn Thị Hiền (2009), trong 300 loại độc tố vi nấm đã biết, chỉ có 20loại ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, 15 loại trong số đó gây ung thư Trong suốtmột thời gian dài, chúng ta không chú ý đến khả năng gây bệnh trong thực phẩmcủa nấm mốc Cho đến những năm 1960, người ta mới khẳng định con người có thể
bị bệnh nếu ăn phải thức ăn nhiễm mốc, dù chỉ với lượng nhỏ Các loại độc tố chủ
yếu được tiết ra bởi 5 chi nấm là: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaría và Claviceps, bao gồm:
Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2),
Ochratoxin A, Stermatocystin, Acid cyclopianxoic
Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin, Penitrem A và
Acid cyclopianzoic toxin, Fumonisin, Moniliformin, Diacetocyscirpenon
Trang 14 Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon, Zearalenon, T-2
toxin
Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, Alternarion, Methyl ether
alternarion
Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà.
Những bệnh do độc tố nấm mốc (Mycotoxin) gây nên trước tiên là biểu hiệntổn thương ở gan và thận Có thể quan sát được sự xuất hiện các u gan, thoái hoá tếbào nhu mô gan, xơ hoá Ngoài ra còn có các dấu hiệu tăng ure huyết, albumin niệu
và viêm cầu thận
Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: Độc cấp tính, mãn tính, gây độtbiến và quái thai Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức nănghoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng Các độc tố vi nấm tácđộng lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thểgây tổn thương não và chết
Một số độc tố gây hội chứng chảy máu, triệu chứng ngưng kết hồng cầu hayhiện tượng tiêu máu rất nguy hiểm thường gặp ở động vật và người bị nhiễm độc tố.Mycotoxin còn làm suy yếu hệ thống miễn dịch của cơ thể Nhiều độc tố nhưaflatoxin, ochratoxin, funomisin có thể là các chất gây biến dị, ung thư, quái thai Ngoài ra, độc tố nấm mốc còn gây mất cân bằng trong chuyển hoá thức ăn và giảm
tỉ lệ sinh sản Bên cạnh đó, các dẫn xuất của chúng thường độc với hệ thần kinh vàgây tổn hại hệ thống cơ cùng rất nhiều hội chứng khác như: Bệnh ngoài da, chứngtăng sừng hoá, sảy thai…
Trang 15Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một số loại độc tố
Trang 16và phổ biến nhất (Nabil Saad, 2004).
Ở người, aflatoxin gây ngộ độc cấp tính qua đường ăn uống và nhiễm ở liềulượng cao trong thời gian ngắn Những triệu chứng cấp tính chuyên biệt bao gồm:Xuất huyết, huỷ hoại gan cấp tính, phù nề, cản trở hấp thu các chất và tử vong.Trong khi đó, nếu hấp thu ở liều lượng từ thấp đến trung bình trong một thời giandài thì khó có thể nhận biết, một số triệu chứng có thể kể đến như là chuyển hoáthức ăn kém, sụt cân, nhưng rõ nhất chính là ngộ độc mãn tính trên gan và ung thưgan
Ở động vật, các triệu chứng nhiễm độc aflatoxin được nghiên cứu thông quacác vụ nhiễm độc tự nhiên và qua thí nghiệm trên động vật Sự nhiễm độc mãn tínhaflatoxin có tính di truyền theo ba kiểu: Gây ung thư, quái thai, đột biến Hậu quảcủa việc nhiễm aflatoxin còn phụ thuộc vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinhdưỡng và mức độ tiếp xúc Chẳng hạn như động vật càng non thì khả năng mẫn cảmvới tác nhân càng cao
Aflatoxin B1 là độc tố quan trọng nhất và là chất gây ung thư nguy hiểm nhấttrong số các aflatoxin Chúng có thể tạo các khối u ở gan, thận, dạ dày và hệ thốngthần kinh
1.1.2.3 Độc tốc Patulin:
Patulin có tên gọi khác là Clavaxin, được biết đến trước tiên như là thuốc cóthể chữa trị cảm lạnh Trong quá trình sử dụng, người ta mới nhận biết được độctính của patulin Patulin là hợp chất không màu, kết tinh và tan trong nước, cácdung môi phân cực Người ta tách được patulin trên ngũ cốc, trên các sản phẩmdạng hạt và hoa quả
Trang 17Patulin là hợp chất trao đổi bậc hai do các nấm mốc Penicillinum, Aspergillus
và Bysschchlamys tạo ra Các chủng tổng hợp chủ yếu là các loài như A clavatus,
A giganteus, P exppansum, P urticae, P griceofulvum.
Patulin được coi như một độc tố có khả năng gây ung thư cho người và độngvật Gây ra hoạt tính suy giảm miễn dịch liên quan đến các chứng xung huyết, gâyloét niêm mạc, đặc biệt là niêm mạc ruột, nghiên cứu đã cho thấy patuilin còn gâythiệt hại cho DNA hay nhiễm sắc thể ở người
1.1.2.4 Độc tố Fumonisin:
Trong các độc tố về nấm mốc, mối quan tâm về fumonisin ngày càng tăng cao
Đây là độc tố mới được phát hiện gần đây do Fumonisin moniliorme tổng hợp Đây
là nhóm độc tính cao với động vật và con người
Fumonisin B1 là độc tố có độc tính mạnh nhất trong các fumonisin, chúng cóthể gây các triệu chứng nhũng não, suy gan, gây mù ở ngựa, ung thư gan ở chuột,bệnh gan ở gà, suy tim cấp ở khỉ… Cơ quan Nghiên Cứu Quốc Tế về ung thư cũng
đã xếp fumonisin B1 vào nhóm 2B – nhóm các hợp chất gây ung thư cho người.Nhiều nghiên cứu ảnh hưởng của fumonisin đến người cũng cho thấy, có sự liênquan của bệnh ung thư thực quản và việc sử dụng lương thực nhiễm fumonisin.Độc tính của fumonisin B1 liên quan mật thiết tới các hiệu ứng lên sự trao đổichất các sphingolipid, bao gồm quá trình tổng hợp mới, tích luỹ sphingolopid tự do,tăng hàm lượng các sản phẩm lipid và sphingosin Các hoạt động của fumonisinnhạy cảm với tế bào gan hơn so với tế bào thận
1.1.3 Các cách khử nhiễm độc tố:
1.1.3.1 Phương pháp vật lý học:
Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: Dùng không khí nóng thổi quanguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tácgiả nghiên cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể Nếu nhiệt độkhông khí nóng đưa vào là 100°C - 145°C ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thểgiảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb Nếu tăng nhiệt độ lên tới
Trang 18165°C có thể làm cho lượng aflatoxin B1 giảm đến 65% (Đậu Ngọc Hào và Lê ThịNgọc Diệp, 2003).
Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt
độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn Quá trình này phá hủy nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin Theo Rehana (1979)nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở120°C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến68% Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở120°C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin (Đậu Ngọc Hào
và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)
Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấpphụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bềmặt cao Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một sốpolymer hữu vô cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydratedsodium calcium alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite,clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo(nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone) Những chất này không được hấpphụ qua ruột mà được bài thải ra ngoài (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp,2003)
Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đốivới thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩmkhác có hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởngđến thành phần dinh dưỡng của thức ăn Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đãthu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol,hexan-ethanol, hexan-ethanol-nước và hexan-acetone-nước Hệ thống bao gồm 54%acetone, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhấtđược tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% -15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg.g/kg
Trang 19Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: Aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím.
Ở bước sóng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại Okonkwo (1978)nhận thấy, lượng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16%trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp,2003)
1.1.3.2 Phương pháp hoá học:
Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: Các chất oxy hóa-khử như NatriHypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2) được sử dụng để làm mất độctính của aflatoxin Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thểlàm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin Khí ozone (O3) cũng được thửnghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song cóbằng chứng là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein,vitamin
Phương pháp sử dụng các chất kiềm: Ammonium Hydroxide (NH4OH) vàNatri Hydroxide (NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vô hoạt aflatoxin Cácchất này đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tửcủa aflatoxin
Phương pháp sử dụng khí NH3: Nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả củaviệc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệtquan tâm ứng dụng hơn cả Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5%
và nhiệt độ bên ngoài là 25°C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200ppb cóthể giảm xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)
1.1.3.3 Phương pháp sinh học:
Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo
áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn làkhông thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi Vấn đề khử nhiễmaflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễmaflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương
Trang 20thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháphứa hẹn nhất.
Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được địnhnghĩa như sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấmmốc trực tiếp nhờ vi sinh vật
Bảng 1.1 Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn
Bacillus
pumilus
Aspergillus parasiticus
Sử dụng các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào, sinh ra
trong quá trình nuôi cấy B
pumilus, ức chế sự phát
triển và quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm
Asp parasiticus
C Munimbazi vàLB.Bullerman,1997
Streptomyces
sp.
Aspergillus parasiticus
Streptomyces sp tổng hợp
được aflastatin A, là hợp chất có bản chất là protein,
ức chế 1 số enzyme esterase tham gia quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm
Trang 21casei flavus đổi chất ngoại bào, sinh ra
trong quá trình nuôi cấy L.
Bacillus
subtilis B-FS06
Aspergillus flavus Hợp chất thứ cấp
B subtilis tổng hợp các
enzyme ngoại bào như
protease, chitinase, glucanase làm ức chế sự
β-1,3-phát triển của nấm Asp
flavus.
R Thakaew và cộng sự, 2013
Các loại nông sản Việt Nam được thế giới biết đến càng nhiều như lúa gạo, càphê, tiêu, điều, thanh long, vú sữa Chỉ tính riêng cà phê, Việt Nam hiện có năngsuất cao trên thế giới, 8 đến 10 tấn cà phê/hecta Để đạt được năng suất ấy, ngườinông dân phải sử dụng đến 2 tấn urê/1 ha cùng với rất nhiều phân bón hóa chất khác
và không ít các loại thuốc bảo vệ thực vật Hệ quả không chỉ nông dân phải mấtnhiều tiền vào hóa chất mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất bị tàn phá nghiêmtrọng Phương pháp sinh học sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoa họckhuyến khích sử dụng vì chúng có những ưu điểm sau:
Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồngnhư thuốc bảo vệ thực vật từ hóa chất
Trang 22 Cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, góp phần tăng năng suất và chấtlượng nông phẩm.
Tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề khángbệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loạithuốc BVTV có nguồn gốc hóa chất Tác dụng của CPSH đến từ từ chứkhông nhanh như các loại hóa chất nhưng tác dụng dài lâu
Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các phế thải sinh học, phế thải nôngnghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường
Các chủng nấm sinh độc tố sẽ không thể hình thành cơ chế kháng
1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic:
1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic:
1.2.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus:
Vi khuẩn lactic có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trong khoảng 25 - 35°C.Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫnsống được trong môi trường 10-15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền vớiNaCl, có thể sống trong môi trường từ 7 - 10% NaCl Vi khuẩn lactic có hoạt tínhprotease phân hủy protein thành peptide, acid amin, hoạt tính này ở các loài khácnhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn
Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạnghình cầu và hình que, đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μg/kg.m.Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kíchthước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μg/kg.m Trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thànhchuỗi Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài
Bảng phân loại khoa học giống Lactobacillus:
Trang 23Các loài Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và
thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bàitiết và hệ sinh dục người Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩmchức năng cũng có chứa các vi khuẩn này
Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum.
Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao
đổi chất của carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm:
Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, được gọi là Thermobacterium,
cófructose-1,6-diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không cóphosphoketolase Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưngkhông lên men được pentose, chúng phát triển ở 45°C
Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng được gọi là Streptobacterium (có
FDPaldolase và cảm ứng phosphoketolase) Tuy nhiên, hexose là lên menđồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic
Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có
phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cảhexose và pentose lên men dị hình
1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic:
Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vikhuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau
Nhu cầu dinh dưỡng cacbon: Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiềuloại carbohydrate từ các monosaccharide (glucose, fructose) và cácdisaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide
Trang 24(tinh bột, dextrin) Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp nănglượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổnghợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,
Nhu cầu dinh dưỡng nitơ: Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồnnitơ khác nhau Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được cácchất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng
và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men,trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone…
Nhu cầu về vitamin: Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trìnhtrao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa
số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậycần bổ sung vào môi trường các loại vitamin
Nhu cầu các chất hữu cơ khác: Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩnlactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các base nitơhay các acid hữu cơ Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độsinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nayngười ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phầnmôi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic
Nhu cầu các muối vô cơ khác: Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy
đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tốkhoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan Đặcbiệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo chức năng hoạt độngcủa enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào
Nhu cầu dinh dưỡng oxy: Vi khuẩn lactic có khả năng sống được trong môitrường có oxy hay không có oxy Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinhkhối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí
Trang 251.2.2 Khả năng sinh các chất kháng khuẩn:
dysgalaciae Enterococcus feacalis Propionibacterium acne Streptococcus mutans
L acidphilus spp. Acidophin CH5 Vi khuẩn gram dương
L plantarum spp. Plantaricin EF, Plantaricin W,Plantaricin JK, Plantaricin S
Pediococcus Carnobacteria Clostiridia
Trang 26Leuconostoc
Listeria monocytogenes Enterococcus feacalis
L casei spp. Lactocin 705 Listeria monocytogenes
Acid acetic Nấm men, nấm, vi khuẩn gây thối rửa
H2O2 Sinh vật gây bệnh, đặc biệt trong thức ăn giàu protein
Hệ thống lactoperoxidase với H2O2 Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản
phẩm làm từ sữa)
Reuterin (3-OH- propoonaldehyde) Nấm mốc, nấm men
1.2.3 Khả năng kháng nấm và ứng dụng sản phẩm của vi khuẩn lactic:
1.2.3.1 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic:
Khả năng đối kháng của các vi khuẩn lactic liên quan đến sự ức chế của các
vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất
Trang 27ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995) Khả năng kháng nấm và các thành phần
ức chế đã được tìm thấy và công nhận trong nhiều nghiên cứu Hoạt động kháng
nấm của L coryniformis ổn định khi bị ở nhiệt độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson
và Schnurer, 2001)
Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuấtmột loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như
L plantarum và L sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính
kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998) Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học(biopreservative) duy nhất - Nisin có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của
vi khuẩn acid lactic
Bảng 1.4 Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men
(Corsetti và cộng sự, 1998)
4-hydroxy-phenyllacticacid 3-phenyllacticacid Lactobacillus plantarum21B
mevalonolactone Lactobacillus plantarum VTTE-78076
Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-,
formic-and n- valeric acid
Lactibacillus sanfranciscensis CB1
Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai
cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus
Trang 28NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng
cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996)
Chi Lactobacillus thường được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất Các
chủng kháng nấm được phân lập từ các sản phẩm khác nhau như bột nhào chua(Corsetti và cộng sự, 1996), thức ăn ủ chua (Magnusson và Schnurer, 2001), phômai và sữa (Roy và cộng sự, 1996)
Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính axit
và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh Đa số các chất kháng nấm đượcxác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chấtproteinaceous, acid béo hydroxyl,…
1.2.3.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic:
Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạttính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứngdụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụngrộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:
Thực phẩm: Chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng nhưcường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm chothực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tínhchất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng vềtính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu
và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặcgiảm nồng độ muối
Công nghiệp: Vi khuẩn lactic là nguồn để lên men sản xuất acid lactic, đemlại nguồn thu hàng tỷ đô vì đây là chất được sử dụng rất rộng rãi ở nhiềulĩnh vực khác nhau
Y học: Chữa các bệnh đường ruột, cải thiện hệ tiêu hoá…
Nông nghiệp và môi trường: Vi khuẩn lactic hạn chế sự phát triển của nấm
Fusarium, chế phẩm EM có vai trò cải tạo đất và không gây ô nhiễm.
Trong bảo quản thực phẩm, có rất nhiều phương pháp được sử dụng, chẳng
Trang 29hạn như gia nhiệt, thay đổi pH, sử dụng các chất hoá học… Các phương pháp nàyđều được ghi nhận là có hiệu quả cao, tuy nhiên lại gây ảnh hưởng đến môitrường, sức khoẻ con người Các bacteriocins của vi khuẩn lactic có thể ức chế vikhuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học, đặc biệt là trong bảo quản thựcphẩm do chúng có độ an toàn và có hoạt tính cao (José Luis Parada, 2007) Chẳnghạn như Lacticin 3147 ức chế vi khuẩm gram dương và ngăn cản sự phát triển các
vi khuẩn không mong muốn trong phô mai, Pediocin PA-1 có khả năng ức chế
Listeria spp., Nisin có khả năng kháng lại các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm và
đây cũng là bacteriocin thương mại duy nhất được FDA cho phép sử dụng,Nisaplin – một dạng sản phẩm chứa 2,5% Nisin được sử dụng ở hơn 50 quốc giatrong bảo quản thực phẩm Một dạng chế phẩm từ bacteriocins của vi khuẩn lactic
là BioProfit gồm Lactobacillus rhamnosus LC 705 và Propionibacterium freudenreichii JS dùng để bảo quản các loại thực phẩm từ sữa (Khurana và cộng
sự, 2007)
Tuy nhiên, các bacteriocins lại không có tác dụng cao khi được sử dụng riêng
lẻ, chính vì thế mà cần có các kỹ thuật hay kết hợp với các chất khác để làm tănghoạt tính của chúng Chẳng hạn như Sodium acetate hay Sodium lactate sẽ làmtăng hoạt tính của bacteriocin Lactocin 705 (José Luis Parada, 2007)
Một trong những ứng dụng hiện đang được chú ý của bacteriocins từ vikhuẩn lactic đó chính là tạo bao bì sinh học, bảo vệ thực phẩm khỏi các nguy cơgây hư hỏng (José Luis Parada, 2007) Các bacteriocins sẽ dần được giải phóngtrên bề mặt màng bao và thực hiện chức năng sinh học của mình Có rất nhiềucách để tổng hợp bao bì sinh học từ bacteriocins, chẳng hạn như phun, ngâm hayđóng gói trong các bao bảo quản Một trong những cách là kết hợp trực tiếpbacteriocin với polymer, chẳng hạn như cho Nisin kết hợp với polymer sinh học.Một cách khác đó chính là tạo lớp màng bao từ bacteriocin hay hấp thụ bacteriocinlên bề mặt màng bao bằng polymer sinh học (Deegan L.H, 2006)
Trang 30Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Địa điểm nghiên cứu:
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ SinhHọc-Thực Phẩm-Môi Trường trường Đại Học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh
2.2 Thời gian thực hiện:
Đề tài được thực hiện từ 16/05/2016 đến 07/08/2016
2.3 Vật liệu nghiên cứu
Chitosan từ cơ sở sản xuất Hùng Tiến
Hạt đậu phộng mua từ chợ Thị Nghè, quận Bình Thạnh, thành phố Hồ ChíMinh
2.3.2 Hoá chất và môi trường sử dụng:
2.3.2.1 Hoá chất:
Các hoá chất dùng để pha môi trường MRS - broth, MRS cải tiến và PDA.Các hoá chất dùng để pha các loại thuốc thử: Thuốc thử Lugol, thuốc thử Bromophenol blue (BPB), thuốc thử Phenolphthalein
NaOH 0,1N, NaOH 2N
Dimetylsulfoxide (DMSO)
Cồn 96°, 70°
Nước cất
2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy:
Môi trường MRS broth, MRS agar cải tiến để nuôi cấy vi khuẩn lactic
Trang 31Môi trường PDA để nuôi cấy các chủng nấm mốc.
Môi trường PCA, VRB, EC Broth dùng kiểm tra vi sinh vật
Tủ sấy (Memmert Germany)
Máy ly tâm (Tuttligen Germany)
Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA)
Pipet thuỷ tinh 5ml, 10ml, 20ml, pipetman 100 - 1000µl
Que cấy, que trang, kẹp gấp thạch, que đục lỗ thạch, đèn cồn, eppendorf 1ml,ống falcon 50ml
Bông thấm nước, bông không thấm nước, giấy lọc, giá đỡ ống
2.5 Phương pháp luận:
2.5.1 Mục tiêu đồ án:
Khảo sát khả năng ứng dụng của dịch nuôi cấy, sản phẩm trao đổi chất và hợp
chất thứ cấp của vi khuẩn Lactobacillus sp L5 trong bảo quản hạt đậu phộng
2.5.2 Nội dung:
Hoạt hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 và các chủng nấm Aspergillus
spp
Trang 32Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp
Khảo sát khả năng đối kháng của sản phẩm trao đổi chất chủng vi khuẩn
Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp
Khảo sát khả năng đối kháng của hợp chất thứ cấp chủng vi khuẩn
Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp
Ứng dụng dịch nuôi cấy, sản phẩm trao đổi chất và hợp chất thứ cấp của vi
khuẩn Lactobacillus sp L5 trong bảo quản hạt đậu phộng.
Trang 332.6 Phương pháp nghiên cứu:
2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu:
Quy trình được thực hiện như sơ đồ sau:
Khảo sát khả năng phát triển Khảo sát hình thái, sinh hoá
Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn với nấm mốc
Khảo sát khả năng đối kháng nấm của sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn LAB
Khảo sát khả năng kháng nấm của
dịch trong sau ly tâm vi khuẩn
lactic khi không trung hoà pH gia
nhiệt nhiệt và không gia nhiệt
Khảo sát khả năng kháng nấmcủa dịch trong sau ly tâm vikhuẩn lactic khi trung hoà pH 6gia nhiệt và không gia nhiệt
Khảo sát khả năng đối kháng nấm của hợp chất thứ cấp của vi khuẩn lactic
Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong
bảo quản hạt đậu phộng
Trang 342.6.2 Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá vi khuẩn Lactobacillus sp L5:
Khẳng địnhchủng thuần khiết
Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loài vi khuẩn kháctrong quá trình bảo quản Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm nàynhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng
Chủng vi khuẩn lactic L5 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth và ủ ở37°C trong 24 giờ Sau đó, tiến hành cấy chuyển trên MRS Agar và ủ 1 ngày ở37°C sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát đặc điểm nuôi cấy
2.6.2.1 Nhuộm gram:
Mục đích: Xác định vi khuẩn thuộc gram dương hay gram âm
Tiến hành: Dựa theo phương pháp Hucker cải tiến và sử dụng dịch nuôi cấysau 24 giờ
Kết quả: Vi khuẩn gram dương bắt màu tím, gram âm bắt màu hồng
Trang 352.6.2.2 Nhuộm bào tử:
Mục đích: Vì vi khuẩn Lactobacillus không sinh bào tử và do tế bào chất của
bào tử và tế bào chất bắt màu khác nhau Phương pháp này nhằm loại bỏ các vi
khuẩn sinh bào tử như Bacillus spp hay Clostridium spp.
Tiến hành: Phương pháp Schaeffer – Fulton
Kết quả: Bào tử bắt màu lục, tế bào bắt màu hồng
2.6.2.3 Thử nghiệm Catalase:
Mục đích: Xác định vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase
Tiến hành: Dùng H2O2 nhỏ trực tiếp lên khuẩn lạc 18-24 giờ Quan sát kết quả.Kết quả: Vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase nếu xuất hiệt bọt khí sủibọt mạnh và nhanh, âm tính khi không có hiện tượng xảy ra
2.6.2.4 Xác định hàm lượng acid tổng:
Mục đích: Xác định hàm lượng acid tổng bằng phương pháp quy về acid lactic
để xác định hàm lượng acid lactic sinh ra từ chủng vi khuẩn lactic thử nghiệmnhằm Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể định lượng bằng dung dịch kiềmchuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử Phenolphatalein
Tiến hành: Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên nuôi cấy vi khuẩn, thêm 2 – 3giọt Phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiệnmàu hồng nhạt Sử dụng máy đo pH để chuẩn độ đến khi pH đạt 8,0 và ghi kết quả.Kết quả: Hàm lượng acid tổng được quy về acid lactic như sau:
Trong đó: V1 – Thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml)
K - Hệ số đổi ra acid tương ứng, với acid lactic là 0,009
V2 – Thể tích dịch nuôi cấy đem đi chuẩn độ (ml)
Trang 362.6.2.5 Thử nghiệm khả năng lên men đường:
Mục đích: Kiểm tra khả năng lên men các loại đường khác nhau của vi khuẩn Tiến hành: Môi trường MRS Broth lần lượt thay thế đường glucose thành cácloại đường cần kiểm tra Sau đó phối vào ống nghiệm có ống durham có Phenol red,hấp khử trùng và cấy vi khuẩn vào, ủ ở 37°C trong 24 giờ và quan sát
Kết quả: Dương tính khi môi trường đục, chuyển vàng và có hay không sinhkhí trong ống durham Kết quả âm tính khi môi trường trong, không sinh hơi
2.6.2.6 Thử nghiệm Protease:
Mục đích: Xác định khả năng tiết enzyme protease phân huỷ cơ chất casein Tiến hành: Đĩa petri được phối môi trường gồm casein 1% bổ sung 2% agar đãđược hấp khử trùng Đục lỗ đĩa thạch và bơm dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic vào các
lỗ Sau đó ủ ở 37°C trong 24-48 giờ và đo đường kính vòng phân giải
Kết quả: Vi khuẩn có khả năng phân huỷ casein khi xung quanh lỗ có vòngphân giải, nếu không có thì xung quanh lỗ, môi trường vẫn sẽ đục
Kết quả: Vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme chitinase khi môi trườngxung quanh tạo quầng sáng không bắt màu thuốc thử Lugol
Trang 372.6.3 Khảo sát sự phát triển của các chủng nấm Aspergillus spp.:
Chủng nấm mốc Aspergillus spp.
Tăng sinh trong môi trường MRS Broth
Đĩa petri MRS agar cải tiến
37°C, 72 giờ
Đo đường kính tăng trưởng của nấm
Các chủng nấm Aspergillus spp phân lập từ hạt đậu phộng (CĐP1), hạt đậu
nành (ĐN2, ĐN3), hạt cà phê (HCP2) được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh khoaCông Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường trường đại học Công Nghệ HồChí Minh, người thực hiện tiến hành kiểm tra sự phát triển của các chủng nấm, vìchủng nấm mốc cần khoẻ mạnh để làm đề tài
Chủng nấm mốc được cấy điểm sang đĩa môi trường PDA đã được hấp khửtrùng và ủ ở 37°C trong vòng 72 giờ
Sau đó dùng que đục, đục lỗ thạch nấm và chuyển từ môi trường PDA sangmôi trường MRS Agar cải tiến, ủ ở 37°C trong vòng 72 giờ
Tiến hành đo đường kính vòng phát triển của nấm
Trang 382.6.4 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.:
Các chủng nấm lần lượt được đục từ môi trường PDA đã cấy trước đó 3 ngày
và đặt vào tâm đĩa Ủ ở 37°C trong 24 giờ
Hút 0,1ml dịch của dịch nuôi cấy Đĩa đối chứng âm không bơm dịch và Đối chứng dương bơm dịch Nystatin trong DMSO nồng độ 1g/50ml tương ứng0,9996445mg Nystatin/50ml DMSO
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và ủ ở 37°C trong 72 giờ Sau đó đo đường kínhvòng nấm và tính tỉ lệ kháng nấm
Trang 39Công th ứ c tính tỉ lệ kháng n ấ m:
Trong đó: Dđối chứng – Đường kính vòng nấm đĩa đối chứng (mm)
Dthí nghiệm – Đường kính vòng nấm đĩa thí nghiệm (mm)
Trang 402.6.5 Khảo sát khả năng đối kháng của sản phẩm trao đổi chất chủng
Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.:
Gia nhiệt 100°Ctrong 15 phút
Khônggianhiệt
Chủng
nấm mốc
trên PDA
Đục lỗ