Khảo sát đột biến gen ret trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình

LỜI CAM ĐOANEm xin cam đoan nội dung trình bày trong đồ án tốt nghiệp với đề tài “Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình” là thành quả

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN RET TRÊN CA LÂM SÀNG

U SẮC BÀO TUYẾN THƯỢNG THẬN

MANG TÍNH GIA ĐÌNH

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS.BS Đỗ Đức Minh Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Mỹ Hiền MSSV: 1515100017 Lớp: 15HSH01

TP Hồ Chí Minh, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan nội dung trình bày trong đồ án tốt nghiệp với đề tài “Khảo sát

đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia

đình” là thành quả nghiên cứu trên cơ sở số liệu thực tế và được thực hiện dưới sự

hướng dẫn trực tiếp của giáo viên hướng dẫn

Mọi tham khảo trong đồ án này đều được trích dẫn rõ ràng nguồn gốc

Mọi sao chép vi phạm quy chế của nhà trường em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Mỹ Hiền

– Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp.HCM đã tận tình giảng dạy và truyềnđạt những kiến thức, lòng nhiệt huyết cũng như niềm đam mê nghiên cứu cho emtrong suốt thời gian học tập tại trường.

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS.BS Đỗ Đức Minh, người thầy, người anh đã tậntình hướng dẫn em các thông tin về lâm sàng, về kiến thức sinh học phân tử trongsuốt thời gian làm đồ án

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các anh chị ở Trung tâm Ysinh học phân tử - Đại học Y Dược Tp HCM đã luôn quan tâm, tạo mọi điều kiệnthuận lợi để em hoàn thành khóa luận này Thời gian học hỏi và làm việc trong môitrường thân thiện, luôn nhận được sự giúp đỡ cũng như góp ý nhiệt tình của anh chị

ở Trung tâm là khoảng thời gian quý báu, mang lại cho em thêm nhiều kiến thức vàkinh nghiệm trong quá trình làm việc

Và trên hết, con xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới gia đình Cảm ơncha, mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng con khôn lớn, luôn bên cạnh động viên, ủng hộ,dõi theo bước đường con đi

Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Mỹ Hiền

Đồ án tốt

nghiệp

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1

1

1

G

ớ

2

1

1

1

B

ể

4

1

1

1

2

B

ất

5

1

1

3

H

ộ

8

1

3

H

ộ

8

1

1

4

C

ấ

10

1

5

C

á

13

1

1

5

P

h

13

1

1

5

K

ỹ

15

1

6

C

ơ

16

1

1

CHƯƠN

G 2: ĐỐI

2

2

2

Đ

ối

17

MEN2 Đa u tuyến nội tiết loại 2

MRI Chụp cộng hưởng từ (Magnetic resonance imaging)

NCBI National Center For Biotechnology Information

RNA Ribonucleic acid

SNP Điểm đa hình nucleotide đơn (Single Nucleotide Polymorphisms)VHL Hội chứng Von Hippel-Lindau

Đồ án tốt

nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Trình tự mồi xuôi và mồi ngược dùng cho phản ứng PCR 21

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 27

Bang 2.3: Cac thông số điên di DNA bằng gel agarose 28

Bảng 2.4: Thành phần trong một phản ứng cycle sequencing .32

Bảng 2.5: Thành phần hỗn hợp tủa DNA 33

Bảng 3.1: Kết quả đo nồng độ nucleic acid trong mẫu 35

Bảng 4.1: Kết quả giải trình tự phát hiện SNP tại exon 11, 13 [1] 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết 5

Hình 1.2: Bé trai 4 tuổi có biểu hiện điểm hạt cà phê và tàn nhang 8

Hình 1.3: Vị trí gen RET trên nhiễm sắc thể số 10 10

Hình 1.4: Cơ chế phân tử của đột biến gen RET 12

Hình 1.5: Hình kí xạ tự ghi kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide 14

Hình 1.6: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tự dùng bản gel polyarylamide .15

Hình 2.1: Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân 18

Hình 2.2: Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase 26

Hình 2.3: Các chu kỳ của PCR 26

Hình 2.4: Mô tả quá trình tinh sạch sản phẩm PCR 30

Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm các exon 10, 11,13, 14 - 15,16 36

Hình 3.2: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 11) với trình tự chuẩn 39

Hình 3.3: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 13) với trình tự chuẩn 39

Hình 3.4: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 11) với trình tự chuẩn 40

Hình 3.5: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 13) với trình tự chuẩn 40

Hình 3.6: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 11) với trình tự chuẩn 41

Hình 3.7: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 13) với trình tự chuẩn 41

Hình 3.8: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 11) với trình tự chuẩn 42

Hình 3.9: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 13) với trình tự chuẩn 42

Hình 3.10: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 11) với trình tự chuẩn 43

Hình 3.11: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 13) với trình tự chuẩn 43

biến dòng mầm gây bệnh ở 1 trong số 14 gen gây bệnh gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A [5,9,11] Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm

sàng, bệnh nhân PPGLs cần được thăm khám và kiểm tra di truyền cho người thân

để sàng lọc di truyền gây bệnh Xuất phát từ thực tiễn trên nhóm tiến hành đề tài

“Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận

mang tính gia đình” bằng cách sử dụng phương pháp mô tả hàng loạt ca, với mục

tiêu cụ thể:

- Giải trình tự 6 exon gen RET (exon 10,11,13,14,15,16)

- Phân tích kết quả giải trình tự gen dựa trên dữ liệu ngân hàng gen NationalCenter For Biotechnology Information (NCBI)

Đồ án tốt nghiệp gồm có 4 chương:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Đối tượng – Vật liệu – Phương pháp

Chương 3: Kết quả – Bàn luận

Chương 4: Kết luận – Kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tủy thượng thận nằm ở trung tâm của mỗi tuyến thượng thận bao gồm các tế bàothần kinh nội tiết (chromaffin) sản xuất và giải phóng epinephrine (adrenaline) vàomáu để đáp ứng với kích hoạt của hệ thống thần kinh giao cảm Neuroblastoma (unguyên bào thần kinh) và pheochromocytomas (PCCs) là hai loại u quan trọng nhấtphát sinh từ tủy thượng thận Cả hai loại u này cũng có thể phát sinh từ các vị tríngoài tuyến thượng thận, cụ thể trong vùng cận hạch của chuỗi giao cảm [17].

U sắc bào tuyến thượng thận bao gồm u lành tính hoặc ác tính của thượng thận.Một trong số đó được chú ý đến do sản xuất thừa hormones nội tiết Ung thư thượngthận là sự hiện diện của các khối u ác tính ở tuyến thượng thận, bao gồm u nguyênbào thần kinh, ung thư biểu mô vỏ thượng thận (adrenocortical carcinoma) và một

số u tế bào ưa crôm thượng thận (PGLs) [1] Hầu hết u tế bào ưa crôm và tất cả các

u tuyến thượng thận là những khối u lành tính, không di căn hoặc xâm lấn các môlân cận, nhưng có thể gây ra vấn đề sức khỏe đáng kể bởi sự mất cân bằnghormones

Sự phổ biến của PPGLs ở bệnh nhân tăng huyết áp trong phòng khám ngoại trúnói chung dao động từ 0,2 - 0,6% Ở trẻ em bị tăng huyết áp, sự phổ biến củaPPGLs là khoảng 1,7% Gần 5% bệnh nhân PCCs có khối u thượng thận tình cờđược phát hiện trên hình ảnh giải phẫu Nghiên cứu khám nghiệm tử thi cho thấykhối u không được chẩn đoán trong 0,05 - 0,1% bệnh nhân [9]

PCCs sản xuất, tích trữ và tiết CATE Hầu hết PCCs tiết cả epinephrine vànorepinephrine và sự tiết này không liên quan đến kích thích thần kinh Ngoài ra,PCCs còn tiết các hormones khác như adrenocorticotropic hormone, somatostatin,

calcitonin, oxytocin và vasopressin Nhiều công trình nghiên cứu về PPGLs đã đúckết quy luật số 10 của bệnh lý này, đó là: 10% xảy ra ở trẻ em, 10% ác tính, 10%ngoài thượng thận và 10% không chức năng [11].

PCCs có ở mọi lứa tuổi, có thể độc lập hoặc liên kết với một hội chứng ung thư

di truyền, chẳng hạn như đa u thần kinh nội tiết (Multiple endocrine MEN) loại 2A và 2B, u xơ thần kinh (neurofibromatosis) loại 1 (NF1), hoặc hộichứng Von Hippel-Lindau (VHL) Chỉ có 10% PCCs thượng thận ác tính, phần cònlại là lành tính [21] Chẩn đoán xác định bằng đo nồng độ của các chất chuyển hóaCATE trong nước tiểu Hầu hết PCCs được điều trị ban đầu với các thuốc khángadrenergic, phẫu thuật được sử dụng để loại bỏ khối u khi bệnh nhân ổn định

neoplasma-1.1.2 Nguyên nhân

U sắc bào tuyến thượng thận có thể xuất hiện đơn lẻ (các khối u đặc, một bên và

u ở trong vùng thượng thận) hoặc có tính chất gia đình (điển hình cũng ở tủy thượngthận nhưng thường nhiều ổ và ở cả 2 bên), ở hai nghiên cứu lớn, tần suất u tủythượng thận có tính chất gia đình chiếm khoảng 30% và thường nằm trong bệnhcảnh của hội chứng di truyền trội nhiễm sắc thể thường Những bất thường di truyềnphối hợp với u tủy thượng thận có thể là nguyên nhân do đột biến gen sinh ung thư

như RET hoặc gen ức chế u như VHL hoặc NF1 Khuyến cáo sàng lọc di truyền cho

những bệnh nhân được chẩn đoán u tủy thượng thận trước 20 tuổi, u thượng thận 2bên, đa u cận hạch, hay cho những bệnh nhân có tiền sử gia đình có người mắc utủy thượng thận hay u cận hạch [22]

Vì PCCs xuất phát từ vùng tủy thượng thận, các khối u này giải phóng không liêntục một lượng các CATE có tác dụng sinh học gây ra các triệu chứng co mạch vớităng cả huyết áp tâm thu, tâm trương và tăng nhịp tim Trong tế bào ưa crôm,norepinephrine và epinephrine được chuyển hóa bởi enzyme O-methyl transferasethành các dẫn xuất O-methyl tương ứng lần lượt là normetanephrine vàmetanephrine Vì chuyển hóa CATE trong khối u độc lập với sự tình trạng giảiphóng CATE (CATE có thể được giải phóng từng lúc hoặc với tỷ lệ thấp), địnhlượng các chất chuyển hóa của CATE ở huyết tương và ở nước tiểu có độ nhạy cao

Đồ án tốt

nghiệp

hơn và đóng vai trò căn bản trong chẩn đoán u tủy thượng thận [22]

Ngoài ra, môi trường ô nhiễm, chế độ ăn uống không khoa học, hút thuốc lá, sử dụng

rượu bia trong thời gian dài,… cũng làm tăng nguy cơ ung thư tuyến thượng thận

1.1.3 Biểu hiện

- Triệu chứng lâm sàng thường có: đánh trống ngực, nhức đầu, ra nhiều mồ hôi,kèm theo tăng huyết áp (lúc này triệu chứng trên sẽ có độ nhạy 91%, độ đặc hiệu94%)

- Tiết nhiều CATE có thể dẫn đến suy tim, phù phổi, loạn nhịp và xuất huyết nội sọ

Tuy nhiên triệu chứng nổi trội nhất vẫn là tăng huyết áp Tăng tiết CATE làmcho bệnh nhân loạn nhịp tim Các cơn kịch phát thường kéo dài dưới 1 giờ và có thể

bị thúc đẩy bởi phẫu thuật, thay đổi tư thế, tập thể dục, mang thai [22]

1.1.4 Xét nghiệm chẩn đoán

Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm sàng khuyến cáo:

- Xét nghiệm sinh hóa ban đầu: đo huyết tương metanephrines tự do hoặcmetanephrines phân đoạn niệu, lấy mẫu máu bệnh nhân theo hướng dẫn của tài liệutham khảo, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng: phổ khối lượng hoặc phát hiện điệnhóa Đề nghị những bệnh nhân có kết quả xét nghiệm là dương tính cần được theodõi mức độ tăng giá trị và biểu hiện lâm sàng [9]

- Hình ảnh học: chụp cắt lớp vi tính (CT), chụp MRI ở bệnh nhân có di căn, sửdụng 123 I-metaiodobenzylguanidine (MIBG) ghi xạ hình, sử dụng 18 F-fluorodeoxyglucose (18 FFDG) chụp cắt lớp phát xạ [9]

- Kiểm tra di truyền: thử nghiệm di truyền tại các phòng thí nghiệm uy tín vớinhững bệnh nhân nghi ngờ đột biến dòng mầm và được tư vấn sau khi có kết quả[9]

1.1.5 Điều trị

- Cắt bỏ hoàn toàn khối u

- Điều chỉnh chế độ ăn uống có nhiều natri và chất lỏng để điều hòa việc tiếtCATE gây ra co huyết khối để ngăn chặn hạ huyết áp nghiêm trọng sau khi loại bỏkhối u

1.2 Bất thường di truyền

Cứ 3 ca PPGLs thì có 1 ca là do nguyên nhân di truyền và chủ yếu là do đột biến

dòng mầm tại 1 trong số 14 gen gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A

[9]

Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết

Có thể nghi ngờ 6 bệnh khác nhau về gia đình có biểu hiện lâm sàng: bệnh NF1,MEN2, VHL, ung thư biểu mô tế bào thận với đột biến SDHB [13], khối u car-ney(u tuyến thượng thận, khối u hạch dạ dày, chondroma phổi) và hội chứng Carney-Stratakis (u tuyến tụy và sarcomas dạ dày) [14]

Các hội chứng MEN2 và VHL thường được đặc trưng bởi các dấu hiệu lâm sàng

riêng biệt hướng tới việc kiểm tra các gen RET và VHL Phát hiện đột biến gen NF1

rất phức tạp mặc dù xét nghiệm có sẵn trong các phòng xét nghiệm trực tuyến, việcchẩn đoán xác định hội chứng chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng [12]

Đồ án tốt

nghiệp Tuy nhiên, một số bệnh nhân có đột biến gen NF1 và một số báo cáo về PPGLs

đều có đặc điểm tương đồng [4, 6] Những phát hiện này cho thấy tầm quan trọngcủa việc

điều tra về dấu hiệu lâm sàng có thể xảy ra của một đột biến cơ bản ở tất cả các bệnh nhân PPGL.

Với bệnh gia đình (di truyền) việc phát hiện nguyên nhân gây bệnh giúp tư vấn

di truyền chẩn đoán, điều trị sớm các thành viên khác trong gia đình

*Theo tờ báo của Hiệp hội Mỹ về việc quản lý bệnh Ung thư tuyến giáp dạng tuỷ

[16]

Nhóm bệnh MEN2A có đến 95% bệnh nhân đột biến gen RET ở codon 609, 611,

618 và 620 ở vị trí exon 10 hoặc codon 630, 634 của exon 11

Hầu như tất cả bệnh nhân có biểu hiện u tuyến giáp dạng tuỷ và một số ít bệnhnhân mắc bệnh PCCs hoặc u tuyến cận giáp, thường phụ thuộc vào đột biến đặc

trưng của RET.

Ví dụ như đột biến RET ở codon 634 khiến nguy cơ mắc PCCs cao và tăng theo

Khoảng 75% trường hợp MEN2B riêng lẻ và bệnh nhân bị ảnh hưởng bởi đột

biến ở gen RET, 25% trường hợp xảy ra có liên quan đến di truyền trong gia đình Với những bệnh nhân đột biến ở gen RET, có đến 95% bệnh nhân bị đột biến ở

exon 16 (codon M918T) và 5% ở exon 15 (codon A883F)

Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh MEN2B phổ biến ở độ tuổi 20 cho đến 30

Tại Bệnh viện Chợ Rẫy (2005 – 2010), theo khảo sát ở 74 bệnh nhân về đặc điểm

Đồ án tốt

nghiệp

lâm sàng và cận lâm sàng các trường hợp u sắc bào tuỷ thượng thận, chúng tôi nhậnthấy rằng độ tuổi mắc bệnh trung bình từ 40 – 49 tuổi (chiếm 39,2%) Đặc điểmthường gặp ở các khối u được thống kê như sau:

· U bên phải: thường nhỏ hơn u bên trái và có kích thước khoảng 5,38 ± 3,65 cm

· U ở cả 2 bên: 3 ± 0,82 cm và nhỏ hơn so với những trường hợp chỉ có 1 u (6,02

± 4,19 cm)

Một công trình khảo sát các yếu tố di truyền liên quan PCCs cho thấy:

- Khảo sát trên 2499 đối tượng trong khoảng thời gian 10 năm (2001 – 2010), có

1620 trường hợp riêng lẻ và 879 trường hợp liên quan đến di truyền gia đình[5]

- Trong 363 trường hợp riêng lẻ (22,4%) có 269 đột biến ở hệ gen SDHx (137 – SHDB, 100 – SDHD, 30 – SHDC, 2 – SHDA), 64 đột biến xảy ra ở gen VHL, 23 – RET và 7 – TMEM127 [5].

- Xét theo tỷ lệ 363/1620 trường hợp đột biến riêng lẻ (22,4%; 23,5% là các bệnh

nhận bị hội chứng NF1) Các gen SDHB, SDHD và gen VHL là những gen đột biến xảy ra ở phần lớn các bệnh nhân, mà trong đó đột biến SDHB chiếm 37,7%; 27,5%

ở SDHD; 17,6% ở VHL; 8,26% ở SDHC; 6,3% ở RET; 1,93% ở TMEM127 và 0,55% ở SDHA Không phát hiện đột biến ở gen SDHAF2 [5].

- 137 bệnh nhân đột biến gen SDHB (119 đột biến điểm, bao gồm: đột biến thay

thế, nhân đôi, cắt hoặc chèn 1 điểm nhỏ và 18 trường hợp đột biến vùng) [5]

- Ở gen VHL có 64 bệnh nhân (63 trường hợp đột biến điểm và 1 đột biến vùng).

- Bệnh nhân mang gen đột biến SDHD có 100 người (95 trường hợp đột biến

điểm và 5 trường hợp đột biến vùng)

- Đột biến SDHC có 30 bệnh nhân (25 trường hợp đột biến điểm và 5 trường hợp

· Đột biến gen RET – 1,42%

· Đột biến gen TMEM127 – 0,43%

· Đột biến gen SDHA – 0,12%

1.3 Các bệnh và hội chứng liên quan

1.3.1 Hội chứng NF1

NF1 là một rối loạn di truyền đa chức năng được đặc trưng bởi các phát hiện về

da, đặc biệt là các điểm hạt cà phê và tàn nhang, do loạn sản xương và do sự pháttriển của hệ thống khối u thần kinh lành tính và ác tính, đáng chú ý nhất là các môthần kinh lành tính [17]

Hình 1.2: Bé trai 4 tuổi có biểu hiện điểm hạt cà phê và tàn nhang

1.3.2 Hội chứng VHL

Hội chứng VHL có liên quan đến PCCs PCCs thường không gây ung thư, chúng

có thể không gây triệu chứng, nhưng trong một số trường hợp, chúng có liên quanđến nhức đầu, các cơn hoảng loạn, đổ mồ hôi quá nhiều hoặc huyết áp cao nguy

Đa u tuyến nội tiết thường liên quan đến khối u ở ít nhất hai tuyến nội tiết, khối ucũng có thể phát triển ở các cơ quan và mô khác Những sự tăng trưởng này có thểkhông ung thư (lành tính) hoặc ung thư (ác tính) Nếu khối u trở thành ung thư, tìnhtrạng có thể đe dọa tính mạng [19].

Các đột biến gen MEN1 gây ra nhiều loại đa u tuyến nội tiết loại 1 Gen này mã

hóa cho việc sản xuất một protein gọi là menin Menin hoạt động như một chất ứcchế khối u, có nghĩa là nó giữ cho tế bào không tăng trưởng và phân chia quá nhanhhoặc phân chia không kiểm soát được Mặc dù chức năng của menin không rõ ràng,nhưng nó có thể tham gia vào chức năng khác của tế bào như sao chép và sửa chữaDNA và điều chỉnh hoạt động của các gen khác Khi đột biến làm vô hiệu hóa cả

hai bản sao của gen MEN1, menin không còn khả dụng để kiểm soát sự tăng trưởng

và phân chia tế bào, sự mất mát của protein này làm cho các tế bào phân chia quánhiều, dẫn đến sự hình thành các khối u đặc trưng của đa u tuyến nội tiết loại 1 [19,23]

Dấu hiệu phổ biến nhất của đa u tuyến nội tiết loại 2 là một dạng ung thư tuyếngiáp được gọi là ung thư tuyến giáp dạng tủy Một số người bị rối loạn này cũngđồng mắc PCCs dẫn đến cao huyết áp Đa u tuyến nội tiết loại 2 được chia thành baphân típ: loại 2A, loại 2B và ung thư tuyến giáp dạng tủy mang tính gia đình(FMTC) Những phân nhóm này khác nhau về dấu hiệu, triệu chứng đặc trưng vànguy cơ của các khối u cụ thể Ví dụ, cường giáp xảy ra chỉ ở loại 2A và ung thưtuyến giáp là đặc điểm duy nhất của FMTC Các dấu hiệu và triệu chứng của đa utuyến nội tiết loại 2 là tương đối phù hợp trong bất kỳ một gia đình nào [19, 23]

Các đột biến trong gen RET gây ra đa u tuyến nội tiết loại 2 Gen này mã hóa cho

việc sản xuất một protein liên quan đến tín hiệu trong tế bào Protein RET kích hoạtcác phản ứng hóa học hướng dẫn tế bào phản ứng với môi trường của chúng, ví dụ

bằng cách phân chia hoặc sinh trưởng Các đột biến trong gen RET kích hoạt chức

năng báo hiệu của protein, có thể kích hoạt sự tăng trưởng và phân chia tế bào khikhông có các tín hiệu từ bên ngoài tế bào Sự phân chia tế bào không kiểm soátnày có thể dẫn đến sự hình thành các khối u ở các tuyến nội tiết và các mô khác [19,23]

1.4 Cấu trúc, đột biến, chức năng của gen RET

Gen RET được tìm thấy sau khi gây nhiễm dòng tế bào nguyên bào sợi 3T3 với DNA lấy từ các tế bào lymphoma của người Gen RET nằm trên nhiễm sắc thể số

10, nhánh dài, vùng 1, băng 1, băng phụ 2 (10q11.2) và gồm 20 exon [10, 20]

Hình 1.3: Vị trí gen RET trên nhiễm sắc thể số 10

Sự nối ghép tự nhiên của gen RET tạo ra 3 dạng đồng phân khác nhau của

protein RET: RET51, RET43 và RET9 chứa 51, 43 và 9 Aa trong đuôi C cuốicùng của chúng [10]

RET là protein xuyên màng Mỗi protein được chia thành ba miền: một miềnngoại bào N với bốn lần lặp đi lặp lại giống như cadherin (là một protein 2thành phần, phần bên trong tế bào gắn với khung xương của tế bào và phần bênngoài tế bào là polypeptide có 5 đồng phân gắn kết với nhau) và một vùng giàuCystein, một miền màng xốp kẽm và một miền tyrosine kinase nội bào, được chia

ra bởi sự chèn thêm

27 Aa Trong miền tyrosine kinase nội bào, có 16 Tyrosines (Tyrs) trong RET9 và

18 trong RET51 Tyr1090 và Tyr1096 chỉ có ở dạng đồng vị RET51 [10, 15]

Đồ án tốt

nghiệpMiền ngoại bào của RET chứa chín vị trí N-glycosyl hóa Protein RET được

glycosyl hóa hoàn toàn được báo cáo có trọng lượng phân tử là 170 kDa mặc dùkhông rõ ràng là nó có cấu tạo nên trọng lượng phân tử này liên quan [10].

Gen RET mã hóa sản xuất một protein liên quan đến tín hiệu trong tế bào Protein

này dường như rất cần thiết cho sự phát triển bình thường của một số loại tế bàothần kinh, bao gồm hệ thống thần kinh tự trị, thần kinh ruột non Protein RET cũngcần thiết cho sự phát triển bình thường của thận và sản sinh ra tinh trùng (sự hìnhthành tinh trùng)

Protein RET có một đầu của protein nằm trong màng tế bào và đầu còn lại nằmngoài màng tế bào Chính vị trí này của protein cho phép nó tương tác với các yếu

tố cụ thể bên ngoài tế bào và nhận các tín hiệu giúp tế bào phản ứng với môi trườngcủa nó Khi các phân tử kích thích sự phát triển và tăng trưởng (các yếu tố tăngtrưởng) gắn với protein RET, một chuỗi các phản ứng hóa học phức tạp bên trong tếbào được kích hoạt Những phản ứng này chỉ dẫn cho tế bào trải qua những thay đổinhất định, chẳng hạn như phân chia hoặc trưởng thành để có các chức năng đặc biệt

Đột biến gen RET được biết là gây ra một dạng đa u tuyến nội tiết loại 2 Đa u

tuyến nội tiết thường liên quan đến sự phát triển của các khối u ở hai hoặc nhiềutuyến sản sinh hormones của cơ thể, được gọi là tuyến nội tiết Những khối u này cóthể không ung thư hoặc ung thư Đa u tuyến nội tiết loại 2 được chia thành ba phântíp: loại 2A, loại 2B, và carcinoma tuyến giáp dạng tủy mang tính chất gia đình.Những phân típ này được phân biệt bằng các dấu hiệu và triệu chứng đặc trưng vànguy cơ của các khối u đặc biệt [18]

Hầu hết các đột biến gen RET gây ra đa u tuyến nội tiết loại 2 làm thay đổi

protein RET (thông qua thay đổi trình tự amino acid (Aa)) Loại 2A thường xuấtphát từ đột biến thay thế Aa Cysteine bằng Arginine ở codon 634 (Cys634Arg hoặcC634R) Hơn 90% các trường hợp loại 2B là do đột biến thay thế Aa Methioninebằng Threonine ở codon 918 (Met918Thr hoặc M918T) Một số thay thế Aa có thểgây ra carcinoma tuyến giáp dạng tủy mang tính chất gia đình [5,9]

Thụ thể tyrosine kinase là một protein xuyên màng, trong điền kiện tự nhiên cácthụ thể này được kích hoạt khi có sự phối hợp của các đồng thụ thể (co-receptor) để

Đồ án tốt

nghiệp

tiến hành chuyển nhóm phosphate của phân tử Aa Tyrosine cao năng thành cácphân tử đặc hiệu phục vụ chuyển hóa năng lượng cho hoạt động sống bình thường.Khi bị đột biến gen, các thụ thể này hoạt động không kiểm soát, sinh ra các bệnh và

có thể là ung thư [10]

Hình 1.4: Cơ chế phân tử của đột biến gen RET

Gen RET mã hóa cho thụ thể tyrosine kinase là thành phần của yếu tố dẫn xuất dòng tế bào thần kinh (GDNF) có nguồn gốc tín hiệu ngoại bào, đột biến gen RET

có liên quan đến sự phát triển của nhiều loại ung thư ở người, bao gồm phình đạitràng bẩm sinh (H i r s c h s p r u n g d i s e ase ) , ung thư phổi, ung thư tuyến giáp, đa utuyến nội tiết loại 2A và 2B, tăng hồng cầu và tăng sản cận tử cung và một số ungthư khác [10]

khác nhau trong họ GFRα (GFRα1, GFRα2, GFRα3, GFRα4) có hoạt động ràngbuộc cụ thể đối với một GFL cụ thể Khi tạo phức GFL-GFRα, phức hợp sau đó sẽkết hợp hai phân tử của RET, gây ra trans-autophosphorylation các dư lượngTyrosine cụ thể trong miền tyrosine kinase của mỗi phân tử RET Tyr900 vàTyr905 trong vòng lặp kích hoạt (vòng lặp A) của miền kinase đã được chứngminh là các vị trí tự quang phổ bằng quang phổ khối Phosphoryl hóa Tyr905 ổnđịnh cấu hình hoạt tính của kinase, do đó dẫn đến sự tự phospho hóa các dư lượngTyrosine khác, chủ yếu nằm trong vùng đuôi C của phân tử [3, 15].

1.5 Các phương pháp giải trình tự

1.5.1 Phương pháp hóa học

Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh ra phương pháp hóa học để giảitrình tự một đoạn DNA Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự của Maxam vàGilbert khó thực hiện vì phải xác định nhiều thông số cho thí nghiệm Vì vậy, hiệnnay người ta sử dụng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội [21]

đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí nàychính là nơi để dNTP kế tiếp được gắn vào Nhờ vậy trong ống phản ứng có các

và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi và từ cácvạch này giải trình tự của đoạn DNA [21].

Hình 1.5: Hình kí xạ tự ghi kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide

1.5.3 Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer)

Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sảnsinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạchđiện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser Cấu tạocủa một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chủ yếu, đó là: Phần điện di với gelpolyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di Phần điện di polyacrylamide cóthể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel Phần phát hiện vạch điện di lànhững con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó Nguyên tắc hoạtđộng của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi quachùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắtcảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ [21] Từbiểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứngvới các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA (hình 1.6)

Hình 1.6: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tự dùng bản gel polyarylamide

Với các máy thế hệ mới sau này, người ta có thể dùng bốn màu huỳnh quangkhác nhau để đánh dấu bốn loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thựchiện được chi trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên mộthàng mà không cần phải trên bốn hàng khác nhau như trước đây Nếu dùng điện dimao quản thì tùy thuộc vào số mao quản có thể chạy một lần mà người làm thínghiệm có thể có số mẫu cho mỗi lần chạy nhiều hay ít [21]

1.5.4 Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới-454 Pyrosequencing

Kỹ thuật pyrosequencing 454 được sáng tạo đầu tiên bởi Pål Nyrén và MostafaRonaghi của Viện Kỹ thuật Stockholm, Thụy Điển năm 1996

Kỹ thuật này được phát triển bởi công ty 454 Life Science, là một hệ thống giảitrình tự DNA hai bước có độ tương đồng cao với dung lượng lớn hơn rất nhiều sovới hệ thống giải trình tự Sanger Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý “giải trình tựbằng tổng hợp” bao gồm khởi động một sợi DNA được giải trình tự, và giải trìnhsợi DNA bổ sung bằng phản ứng của enzyme Đây là một hệ thống được kết hợpvới việc khuếch đại số lượng lớn các đoạn DNA kèm cùng pyrosequencing dung

Đồ án tốt

nghiệp

khối lớn trong các giếng picotiter Nguyên lý “giải trình tự bằng việc tổng hợp”cũng dựa trên việc nhận biết các pyrophosphate (PPi) được giải phóng trong quátrình gắn nucleotide, tạo ra một tín hiệu ánh sáng, hiệu quả hơn kỹ thuật kết thúcchuỗi bằng dideoxynucleotide [7]

1.6 Cơ sở dữ liệu và phần mềm phân tích trình tự nucleotide

sở dữ liệu gen của tổ chức National Center For Biotechnology Information (NCBI).Trong đó, NCBI là cơ sở dữ liệu thường được lựa chọn vì quy mô lớn và phổ biếnrộng rãi NCBI có giao diện liên kết đơn giản, dễ sử dụng với khả năng lưu trữ, tìmkiếm, so sánh và tính toán nhanh chóng

1.6.2 Phần mềm phân tích trình tự nucleotide

Công cụ CLC Sequence Viewer: Được thiết kế vào năm 2005 với tên gọi ban đầu

là CLC Free WorkBench bởi các nhà khoa học của CLC Bio Năm 2008, phần mềmnày được đổi tên lại thành CLC Sequence Viewer Đây là phần mềm hỗ trợ chophép người sử dụng dễ dàng thực hiện những phân tích dữ liệu trình tự DNA,ribonucleic acid (RNA) và protein như: sắp gióng cột các trình tự, nhận biết vị trícắt giới hạn của các enzyme, phân tích biểu hiện gen, thiết kế mồi, sao chép phân

tử, phân tích phát sinh loài, kết hợp với quản lý dữ liệu theo thứ tự [8]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

Đồ án tốt

nghiệp

2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả hàng loạt ca được thực hiện trong thời gian từ 02/2017 đếntháng 05/2017 tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân đã được chẩn đoán u sắc bào tuyến thượng

thận, những bệnh nhân này đồng ý tham gia nghiên cứu khảo sát đột biến gen RET.

Mẫu thí nghiệm là 2 ml máu EDTA của người trong một gia đình gồm: 2 chị emgái và 2 người con gái của họ và một mẫu không phải là người trong gia đình này

Cha bệnh nhân có 2 người vợ:

Người vợ thứ 1: có 8 con chung, trong số này có 1 người con trai đột tử ở tuổi

30 (không rõ nguyên nhân), 1 người con trai đã phẫu thuật cắt khối u thượng thận 2bên (không rõ chẩn đoán) và 1 người con gái có khối u thượng thận trái đã đượcphẫu thuật nhưng đã qua đời do đột quỵ

Người vợ thứ 2: Có 2 người con gái bao gồm bệnh nhân và chị gái Người chịgái đã phẫu thuật khối u thượng thận hai bên và bị đột quỵ sau khi phẫu thuật

- Xét nghiệm sinh hóa:

Catecholamin niệu/24h: (thể tích nước tiểu 2300 ml/24 h)

Adrenalin: 7,6 µg (bình thường <20 µg)

Noradrenalin: 199 µg (bình thường <90 µg)

Dopamin: 278,3 µg (bình thường <600 µg)

Metanephrine máu: 758 pg/ml (bình thường <90 µg/ml)

Cortisol máu (sau test Dexa liều thấp 1 mg qua đêm): 87,25 nmol/l

Siêu âm tuyến giáp: nhân giáp 18x9 mm FNA: lành tính.

- Hình ảnh học:

CT scan: kết quả cho thấy khối u thượng thận phải 5x5cm

Sau mổ, kết quả giải phẫu bệnh: pheochromocytomas

Chẩn đoán sau phẫu thuật: U sắc bào tuyến thượng thận phải(pheochromocytomas)

- Xét nghiệm di truyền:

Bệnh nhân không có biểu hiện lâm sàng các hội chứng MEN2A, NF1 và VHLnên chúng tôi tiếp cận theo sơ đồ khuyến cáo của Hội Nội tiết Hoa Kỳ Theokhuyến cáo này, bệnh nhân có tăng tiết noradrenalin và khối u ở thượng thận nên

sẽ ưu tiên gen VHL.

Tuy nhiên, được sự hỗ trợ tư vấn, nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát gen

RET đầu tiên ở exon 10, 11, 13, 14, 15, 16 của gen và đã phát hiện bệnh nhân bị đột

biến c.1900T>C (p.Cys634Arg), một đột biến thường gặp gây ra hội chứngMEN2A

Bệnh nhân có tiền căn gia đình có tính chất nghi ngờ cao nên đã được tư vấn vàchỉ định xét nghiệm di truyền cho những người thân trực hệ

- Thiết bị điện di (khay, lược)

- Bình tam giác thủy tinh

- Ống đong

Thiết bị:

- Máy lắc rung (vortex) - Micro ONE, Milipore

- Máy ly tâm eppendorf 5415 R (Eppendorf, Mỹ)

- Cân kỹ thuật

- Lò vi sóng

- Máy điện di Mupid – EXU (Advance, Nhật Bản)

- Máy soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản)

- Máy PCR Mastercycler Pro AG 6325 (Đức)

- Máy giải trình tự ABI 3500 Genetic analyzer (Appied Biosystems, Mỹ)

- Tủ mát (Sanyo, Nhật Bản)

- Máy đo nồng độ DNA Nano Drop 2000/2000c (Mỹ)

2.3.2 Hóa chất

Hóa chất tách chiết: sử dụng bộ kit tách máu QIAGEN DNA Mini Kit

Thành phần bộ kit: QIAamp Mini Spin Columns, Collection tubes (2ml),QIAGEN Protease (proteinase K), Ethanol (96 – 100%) và Buffers: AL, AW1,AW2, AE

Hóa chất PCR:

- Nước cất khử ion

- dNTPs (mỗi loại 2,5 mM) Hòa tan trong nước có pH 7 - 9

- Mồi xuôi, mồi ngược