Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long

2.3.2 Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm...482.3.3 Phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long ...49 2.3.4 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào c

Khảo sát khả năng đối kháng củả các chủng nấm Trichodermả với nấm gấy bệnh đốm trăng

trên cấy Thảnh long

Nguyễn Thị Bích Tuyễn

Nguyễn Thị Hai (giang viễn hướng dẫn)

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG .vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU .1

1 Lý do chọn đề tài .1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu .2

4 Đối tượng nghiên cứu 3

5 Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp .3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5

1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp .5

1.1.1 Phân loại .5

1.1.2 Các chủng nấm Trichoderma spp đã được phân lập 5

1.1.3 Đặc điểm hình thái .8

1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 10

1.1.5 Cơ chế kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng 11 1.1.6 Mối liên hệ giữa khả năng đối kháng nấm gây bệnh thực vật và hoạt động

1.1.7 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma spp trên thế giới và ở

Việt Nam 18

1.1.8 Ứng dụng của Trichoderma spp trong nông nghiệp 21

1.2 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long 24

1.2.1 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum 24

1.2.2 Khái quát về bệnh đốm trắng trên Thanh long 25

1.2.3 Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum 26

1.2.4 Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm trắng trên thanh long 32

1.3 Thực trạng về phế phẩm Thanh long và ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ sinh học 34

1.3.1 Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long tại Việt Nam 34

1.3.2 Sản xuất và sử dụng phân compost 34

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .41

2.2 Vật liệu 41

2.2.1 Nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh 41

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 41

2.2.3 Hóa chất 42

2.2.4 Các loại môi trường 42

2.3 Phương pháp nghiên cứu .45

2.3.1 Sơ đồ tổng quát nội dung thí nghiệm 46

Giải thích sơ đồ 46

2.3.2 Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm 48

2.3.3 Phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long 49

2.3.4 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma

50

2.3.5 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long 52

2.3.6 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều kiện trong chậu 54

2.3.7 Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh của chế phẩm Trichoderma ngoài đồng ruộng 5

5 2.3.8 Thử nghiệm ủ phân compost từ cành thanh long của nấm Trichoderma 57

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 60

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61

3.1 Kết quả phân lập nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long 61

3.2 Kết quả khảo sát một số đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của các chủng nấm Trichoderma spp. .63

3.2.1 Đặc điểm hình thái của các chủng Trichoderma phân lập 63

3.2.2 Đặc điểm sinh trưởng 75

3.2.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma spp sau 2 ngày nuôi cấy 78

3.3 Khảo sát khả năng sinh đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây

3.5 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều kiện

trong chậu 89

3.6 Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh của chế phẩm Trichoderma ngoài đồng ruộng .92

3.7 Thử nghiệm ủ phân compost từ cành thanh long của chủng nấm Trichoderma asperellum 95

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 98

4.1 Kết luận 98

4.2 Kiến nghị 99

TÀI LIỆU THAM KHẢO 100

PHỤ LỤC 1

Phụ lục A Bảng số liệu thô 1

A.1 Tốc độ tăng tưởng của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày .1

A.2 Đường kính trung bình vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma sau 2 ngày 3

A.3 Đường kính trung bình vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma sau 2 ngày 5

A.4 Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày đối kháng invitro. .7

A.5 Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp sau 4 ngày đối kháng invitro. .9

A.6 Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp sau 6 ngày đối kháng invitro. .11

A7 Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp sau 7 ngày đối kháng invitro.

13Phụ lục B: Hình ảnh 16

B1 Hình thái đại thể của các chủng nấm Trichoderma spp sau 2 ngày nuôi cấy trên

môi trường PDA

16

B2 Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) và chitin (cm) của các chủng

Trichoderma 2NSC 18 B3 Kết quả khảo sát khả năng sinh đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm

gây bệnh đốm trắng trên thanh long 25B4 Lô thí nghiệm và lô đối chứng trong thử nghiệm hiệu lực phòng trừ bệnh của chế

phẩm Trichoderma ngoài đồng ruộng 30

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma 5

Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí 37

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Trichederma asperellum

54

Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái của chủng nấm phân lập được và nấm Neoscytalidium dimidiatum theo mô tả bởi Crous & Slippes (2006) 61

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của các chủng Trichoderma phân lập 62

Bảng 3.3 Đường kính tản nấm Trichodema spp (cm) sau 2 ngày nuôi cấy 75

Bảng 3.4 Đường kính vòng phân giải cellulose của các chủng Trichodema spp 78

Bảng 3.5 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichodema spp 80

Bảng 3.6 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với Neoscytalidium dimidiatum 82

Bảng 3.7 Chiều dài và khối lượng thanh long trong từng công thức sau 30 ngày thử nghiệm 90

Bảng 3.8 Tình hình bệnh đốm trắng thanh long ở các công thức 94

Bảng 3.9 Kết quả phân tích hàm lượng carbon, hàm lượng nitơ tổng của nguyên liệu ban đầu và 15 ngày sau ủ 94

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum 5

Hình 1.2 Hình thái đại thể của một số chủng Trichoderma spp 9

Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên khuẩn nấm gây bệnh Rhizoctonia solan 13

Hình 1.4 Ức chế sự phát triển của nấm Pythiumultimum bởi chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma harzianum 16

Hình 1.5 Một số chế phẩm sinh học từ Trichoderma spp 21

Hình 1.6 Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose 35

Hình 1.7 Hợp chất cao phân tử Cellulose 35

Hình 3.1 Hình thái đại thể của chủng nấm gây bệnh đốm trắng sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 60

Hình 3.2 Hình thái vi thể của chủng nấm bệnh: (a) Sợi nấm, (b) Bào tử 61

Hình 3.3 Hình thái đại thể của chủng nấm Trichoderma T3, T22 và T26 sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 77

Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải cellulose của chủng Trichoderma.T22, TC15 và TC6 79

Hình 3.5 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng Trichoderma T22, T3 và TC7

82

Hình 3.6 Đĩa nấm đối chứng Neoscytalidium dimidiatum ở 2,4,6,7NSC 86

Hình 3.7 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm

Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 2,4,6,7 NSC 86

Hình 3.8 Sợi nấm Trichoderma T3 tấn công Neoscytalidium dimidiatum dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100X 86

Hình 3.9 Kết quả giải trình tự gen 18S 87

Hình 3.10 Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm Trichoderma spp

87

Hình 3.11 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều kiện trong chậu 88

Hình 3.12 Kết quả thử nghiệm ở điều kiện trong chậu 89

Hình 3.13 Tỷ lệ bệnh của thanh long trong từng công thức 30 ngày sau tưới 90

Hình 3.14 Sinh viên thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm Trichoderma asperellum ngoài đồng ruộng 92

Hình 3.15 Cây thanh long ở công thức đối chứng và thí nghiệm 93

Hình 3.16 Cành thanh long bị nhiễm bệnh ở công thức đối chứng (a) và thí nghiệm (b) 93

Hình 3.17 Thanh long trước khi ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm 95

Hình 3.18 Thanh long ở công thức đối chứng 15 ngày sau ủ 95

Hình 3.19 Thanh long ở công thức thí nghiệm 15 ngày sau ủ 96

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây Thanh long (Hylocereus undulatus Haw) thuộc họ xương rồng có nguồn gốc

ở các vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia Đây là cây ăn quả nhiệt đới, thích hợpkhí hậu nắng nóng, chịu hạn tốt nhưng không chịu úng, sau khi trồng một năm cây bắtđầu cho quả Cây Thanh long thích hợp với nhiều chân đất như đất xám, đất phù sa, đất

đỏ và đất phèn, quả có nhiều chất dinh dưỡng nên có hiệu quả kinh tế cao do giá báncao và có giá trị xuất khẩu Trên thế giới, Thanh long đã và đang là cây ăn quả quantrọng đem lại hiệu quả kinh tế lớn cho nhiều nước như Đài Loan, Thái Lan, Malaysia,Trung Quốc,…

Thanh long được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam khoảng 100 năm nay,nhưng mới được đưa lên thành hàng hóa từ những năm 1980 Thanh long gồm có 3loại: ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ và ruột trắng vỏ vàng nhưng phổ biến ở Việt Nam

là hai giống ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ

Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thích hợp cho cây Thanh longsinh trưởng phát triển tốt Theo Cục Bảo vệ thực vật (Bộ Nông nghiệp - Phát triển nôngthôn), trên cả nước hiện trồng khoảng 33.600 ha cây thanh long thương phẩm Trong

đó, tại tỉnh Bình Thuận có 24.000 ha, Long An có 5.400 ha và tỉnh Tiền Giang trồng4.200 ha (năm 2014) [39]

Tuy nhiên, nhiệt độ cao lượng mưa lớn cũng là điều kiện thuận lợi cho các vi sinhvật phát triển và gây hại Trong quá trình sinh trưởng, Thanh long bị gây hại bởi một số

loại dịch hại như kiến, bọ xít, ruồi vàng, bệnh thối đầu cành (Alternaria sp), bệnh đốm nâu trên cành (Gleosporium agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành (Sphaceloma sp) và gần đây là bệnh đốm trắng do nấm gây ra.

Bệnh đốm trắng mới phát hiện tại nước ta từ tháng 6 năm 2013, gây hại trên thân,quả và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch Bệnh gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng pháttriển của cây, làm giảm năng suất, chất lượng quả ở các vùng sản xuất Thanh long tậptrung như Bình Thuận, Tiền Giang Đặc biệt, các vết đốm tồn tại trên quả đã làm giảmgiá trị thương phẩm Các nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên cây Thanh long ở ViệtNam hầu như rất ít Xuất phát từ thực trạng trên, việc nghiên cứu tìm hiểu tình trạngdịch bệnh đặc biệt là bệnh đốm trắng trên cây Thanh long là vấn đề rất quan trọng đượccác nhà chuyên môn, tổ chức trong nước và quốc tế quan tâm Theo Võ Thị Thu Oanh(2015), nấm gây bệnh đốm trắng thanh long có trong đất, việc lây lan cũng bắt đầu từđất và nguồn nấm bệnh trên cành, quả Hiện vẫn chưa có giải pháp quản lý bệnh hiệuquả, việc phòng trừ bệnh đốm trắng thanh long chủ yếu dựa vào biện pháp hóa học đểphun lên cây, nhưng hiệu quả không cao Hơn nữa, dư lượng thuốc bảo vệ thực vậttrong sản phẩm là rào cản lớn nhất để xuất khẩu thanh long ra các thị trường khó tínhnhư EU, Mỹ, Nhật Xuất phát từ tình hình trên, sinh viên tiến hành thực hiện đề tài:

“Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm gây

bệnh đốm trắng trên cây Thanh long”, nhằm tìm ra biện pháp an toàn để quản lý tác

nhân này.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm kiếm các chủng Trichoderma spp có khả năng phòng trừ nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long Đồng thời bổ sung các chủng mới cho bộ sưu tập nấm Trichoderma spp của phòng thí nghiệm Công

nghệ sinh học trường đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh

3 Nội dung nghiên cứu

– Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long

– Xác định khả năng sinh trưởng của chủng nấm Trichoderma spp

– Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm Trichoderma spp – Tuyển chọn chủng Trichoderma spp có khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây hại trên thanh long, từ đó đánh giá khả năng

phòng trừ bệnh trên đồng ruộng

– Xử lí các phế phẩm thanh long bằng phương pháp ủ compost

4 Đối tượng nghiên cứu

- Các dòng nấm đối kháng thuộc chi Trichoderma.

- Bệnh đốm trắng thanh long

- Cây trồng: Thanh long

5 Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp

“Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm

gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long” có tất cả 3 chương gồm:

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU: Giới thiệu tổng quan về nguồn gốc, phân

bố, tình hình sản xuất, tiêu thụ và thực trạng canh tác cây thanh long ở Việt Nam Qua

đó, trình bày các đặc điểm sinh học cũng như triệu chứng, thiệt hại của nấm bệnh

Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên cây thanh long Từ đó, đưa ra các kết quả

nghiên cứu và ứng dụng của các biện pháp sinh học trong nông nghiệp, nổi bật là nấm

Trichoderma spp trong quản lý bệnh hại trên cây thanh long, cụ thể như khả năng

phân hủy chất hữu cơ hay những cơ chế đối kháng với nấm bệnh cây trồng

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP: Trình bày về vật liệu và phương

pháp nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu bao gồm phần trình bày về thời gian và địa điểmtiến hành đề tài, nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh Phương pháp nghiên cứu

tập trung ở nấm bệnh, cũng như đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma

spp đối với nấm bệnh bằng phương pháp sử lý số liệu thống kê SAS

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trình bày kết quả phân lập nấm bệnh

Neoscytalidium dimidiatum Qua đó, đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma với nấm bệnh trên cây thanh long đã được phân lập.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp.

1.1.1 Phân loại.

Chi Trichoderma được mô tả bởi Christiaan Hendrik Persoon năm 1794, nhưng

các nguyên tắc phân loại vẫn khó xác định Theo truyền thống, hệ thống phân loạithường dựa vào sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và

quá trình sinh sản bào tử vô tính Năm 1801, Persoon đã xác định Trichoderma thuộc

1.1.2 Các chủng nấm Trichoderma spp đã được phân lập

Kubicek và Harman (1998) đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma, ông cho rằng tùytừng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau [6]

Tên loài Đặc điểm Hình ảnh

Trichoderma

atroviride

Đại thể: Khuẩn lạc phát triển nhanh,

đạt 8 - 9cm sau 14 ngày nuôi cấy ở

20 0C, sợi nấm trong suốt, vách dày,trơn láng rộng 2 - 14µm Bào tử màuxanh, có hình cầu méo hoặc bầu dụcđường kính từ 4 - 12µm, khi nấm giàthường mất màu hay màu vàng nhạthoặc xám, bào tử già phát ra mùihương dừa (Kubicek và Harman,1998) [6]

Trichoderma

hazianum

Đại thể: Môi trường có nhiệt độ từ

15 - 350C, pH: 3,7 - 4,7 rất thíchhợp cho sự phát triển của nấm(Dosmch và Gams, 1980) Khuẩnlạc phát triển nhanh, đường kínhkhoảng 9cm sau 5 ngày nuôi cấy ởnhiệt độ 200C Bào tử đính có hìnhcầu méo đến bầu dục ngắn, màuxanh lục, vách trơn láng, kích thước(2,7 - 3,2)x(2,5 - 2,8)µm

Sinh hóa: Là loài nấm rất phổ biến

trong đất (cook và baker, 1983), nảymầm tốt nhất trong môi trường mùncưa có độ ẩm khoảng 30% (Domsch

và Gams,1980) [5]

Trichoderma

koningii

Đại thể: Khuẩn lạc có đường kính

3 - 5cm sau 5 ngày nuôi cấy ởnhiệt độ 200C, bào tử có hình trụngắn, vách trơn láng, kích thước(3,0 - 4,8)x(1,9 - 2,8)µm

Sinh hóa: Hiện diện nhiều ở lớp

đất mặt, nhưng ở độ sâu 120cmvẫn có sự hiện diện của loài nấmnày Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ

từ 260C trở lên tùy theo nguồn gốccủa loài, pH: 3,7 - 6,0 [6]

Trichoderma

hamatum

Đại thể: Đường kính khuẩn lạc đạt

7 cm khi nuôi cấy 5 ngày ở 200C.Bào tử màu xanh lục, trơn, dạngelip, có kích thước khác nhau tùytheo chủng (Domsch vàGams,1980)

Sinh hóa: Nhiệt độ 240C và pH: 3,7

- 4,7 là những điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển của

Trichoderma hamatum và chúngphát triển chậm lại ở 00C (Domsch

(4-1983) [6].

Sinh hóa: Có thể sử dụng cả hainguồn nitrogen đơn giản và phứctạp Khi Trichoderma tăng trưởngtrên nguồn cacbonhydrate như lànguồn cacbon cho dinh dưỡng thìammonium được sử dụng tốt hơn lànitrate (Danielson và Davey, 1973)[19]

1.1.3 Đặc điểm hình thái [9].

Hình 1.2 Hình thái đại thể của một số chủng Trichoderma spp [38].

Sinh thái học của Trichoderma cho chúng ta biết sự phân bố của chúng trong đất Nấm Trichoderma có khu vực phân bố rất rộng, chúng hiện diện khắp nơi trong đất,

trên vỏ cây mục nát Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ củacây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ Khi quan sát hạch nấm hay chồi

mầm của nhiều loại nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma (Klein và Eveleigh,1998) Sự phân bố và điều kiện môi trường sống của các loài Trichoderma có liên hệ mật thiết với nhau Nhìn chung các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất trung

tính hoặc kiềm

Cành bào tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phânnhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn Bào tử thường có màu xanh, đơn bào hìnhtrứng, tròn, elip hoặc hình oval tùy từng loài Bào tử đính ở đỉnh của cành Bào tử củahầu hết các loài có hình elip, 3 – 5 x 2 – 4 µm (L/W=1,3), bào tử hình cầu (L/W < 1,3)rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài Đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5µm

Khuẩn lạc Trichoderma tăng trưởng rất mạnh đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 9

cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 250C (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998) Chúngphát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác), chúng cũngtồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%) Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm và khảnăng này mất dần đi Điều này có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học

của Trichoderma.

Bào tử phân sinh của Trichoderma có khả năng kháng nấm cao và liên quan đến

hiện tượng làm giảm khả năng kháng nấm trong đất Độ nhạy của đất kháng nấm đượccông bố trên đất trung tính, đất kiềm chua và acide Các bào tử phân sinh kháng nấmnhiều hơn hậu mô bào tử, sợi nấm ít kháng nấm hơn bào tử phân sinh Thiết lập quần

thể và hiện tượng nảy mầm trong đất: VSV trong đất hoạt động phụ thuộc vào nhiềuloại chất nền trong đất, có nhiều phương pháp xác định khác nhau Khi sợi nấm non(chưa có bào tử) vào đất chịu ảnh hưởng nhiều bởi thành phần môi trường đất Bào tửsinh sôi nảy nở và thiết lập quần thể cân bằng trong đất (mật độ duy trì cân bằng trongđất từ 9 – 36 tuần sau khi cấy nấm vào đất).

Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà Trichoderma harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng.

Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của

Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên

Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học

1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp nguồn carbon và nitrogen Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là

monosaccharide, disaccharide, polysaccharide…NH3 là nguồn đạm mà nấm

Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên trong môi trường nuôi cấy Trichoderma người ta

thường bổ sung NH3, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường

có nhiều dinh dưỡng Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng

sinh trưởng của Trichoderma [28].

trưởng được ở 350C Một số ít phát triển tốt ở 400C Trichoderma phát triển tốt ở đất có

độ pH từ 3,5 – 7,0 nhưng không thể phát triển trong điều kiện pH < 3,5 và phát triển tốt

ở pH trung tính [16]

Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau Ví dụ: Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong môi trường có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum

thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí hậu

ấm áp

Ánh sáng có tác động sâu sắc trên nhiều loại nấm bằng cách ảnh hưởng đến quátrình sống đa dạng của chúng, chẳng hạn như: tác động đến tốc độ tăng trưởng, quátrình chuyển hóa, sắc tố, và sự chuyển hóa Tác động của ánh sáng trên nấm đã là chủ

đề được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và bàn luận (Kubicek và Harman, 1998) Quátrình hình thành bào tử được cảm ứng theo hai con đường khác nhau: thiếu dinh dưỡng

hoặc ánh sáng Khi khuẩn lạc của Trichoderma viride phát triển trong cảm ứng tối do

thiếu dinh dưỡng, hình thành bào tử màu xanh đậm và bắt đầu khuếch tán từ trung tâmcủa khuẩn lạc, tại đó chất dinh dưỡng đã bị sử dụng hết Mặt khác, việc hình thành bào

tử được cảm ứng bởi các xung ánh sáng tạo điều kiện cho các khuẩn lạc phát triểntrong tối, trước khi để chiếu sáng [26]

1.1.5 Cơ chế kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng

Trichoderma được sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại các loài nấm gây hại như: Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytisspp.

và Fusarium spp.…gây bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam quýt, sầu

riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như lúa, hồ tiêu, bắp, đậu, cà rốt, cà chua[1]

Nấm Trichoderma spp đối kháng với nấm bệnh bằng nhiều cơ chế khác nhau: ký

sinh, tiết kháng sinh để tiêu diệt nấm bệnh và cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh nơisống với nấm bệnh [29]

1.1.5.1 Cạnh tranh.

Dinh dưỡng có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của VSV Thiếu

dinh dưỡng là được coi là nguyên nhân gây chết rất phổ biến Trichoderma cạnh tranh

khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết dưỡngchất một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores)

Ngoài ra, Trichoderma còn cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Botrysis spp và Sclerotina spp gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khỏe) Nấm Trichoderma sử

dụng những mô già và mô chết của cây chủ làm nguồn dinh dưỡng, bằng cách đó nấm

Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp và Sclerotina spp [18].

Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium

spp do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào

tử Pythium spp (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Pythium spp bằng cách sử dụng dịch tiết của cây vì thế mà các bào

tử Pythium spp không thể nảy mầm Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây

bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương,

do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh [18]

Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn carbon, nitơ và yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng khác với nấm bệnh T harzianum có thể kiểm soát nấm Botrysis cinerea (gây

bệnh trên nho) bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh tạinhững vùng bị nhiễm (Gullino, 1992) Sivan và Chet (1989), đã chứng minh rằng sự

cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T harzianum sử dụng để kiểm soát nấm bệnh F oxysporum [26].

1.1.5.2 Kí sinh [11].

Là hiện tượng "giao thoa sợi nấm" Trước tiên sợi nấm Trichoderma vây xung

quanh sợi nấm gây bệnh cây, sau đó các sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm Cuối cùng nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh làm thủng màng ngoài của

nấm bệnh, gây nên sự phân huỷ các chất nguyên sinh trong sợi nấm bệnh Những

nghiên cứu chi tiết gần đây bằng kính hiển vi điện tử về vùng "giao thoa sợi nấm" cho

thấy cơ chế chính của hiện tượng ký sinh ở nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh là sự xoắn của sợi nấm Trichoderma quanh sợi nấm vật chủ, sau đó xảy ra hiện tượng thủy phân thành sợi nấm vật chủ, nhờ đó mà nấm Trichoderma xâm nhập vào bên trong sợi

nấm vật chủ Điều này dẫn đến hiện tượng chất nguyên sinh ở sợi nấm vật chủ bị phárối từng phần hoặc hoàn toàn

Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên khuẩn nấm

gây bệnh Rhizoctonia solani [22]

Cuối cùng, nguyên sinh chất bị mất đi và sợi nấm vật chủ bị phá vỡ, giải phóng

các sợi nấm đang sinh sản của nấm Trichoderma Một điều quan trọng cho sự ký sinh của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh cây là các bao tử của nấm Trichoderma sau

khi mọc mầm tạo thành sợi nấm phải tiếp xúc được với nấm vật chủ và phải hình thànhđược thể giác bám Thể giác bám này sẽ bám chắc và xâm nhập vào trong thành tế bào

của nấm vật chủ Tỷ lệ ký sinh sẽ tăng lên khi tăng sự tiếp xúc trực tiếp của nấm

Trichoderma với nấm vật chủ.

1.1.5.3 Tiết kháng sinh [9].

Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp xúc và ký

sinh đã làm cho nấm bệnh chết Tuy nhiên, ở những điểm không có sự tiếp xúc của

nấm Trichoderma với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh.

Howell (1987), thấy rằng những chủng T virens đột biến mất khả năng ký sinh

nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh có hiệu quả kháng nấm bệnh

Rhizoctonia solani tương đương với chủng tự nhiên Kết quả này đã chỉ ra rằng ký sinh

không là cơ chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể Sự sinh kháng

sinh cũng là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma Nó là một

trong những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học Những kháng sinh này có thể ứcchế mạnh sự sinh trưởng của những vi sinh vật khác

Khả năng sinh kháng sinh của các loài, các chủng không giống nhau Chúng gồm:– Gliotoxin: chất kháng sinh này được R Weindling và O Emerson mô tả năm

1936 do nấm T lignorum sinh ra Gần đây được xác định lại là do nấm T virens sinh

ra Chất gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm

(Ascochyta, Botrytis, Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia…).

– Steroids (viridin): Đây là chất kháng sinh thứ cấp do nấm Trichoderma tạo

thành trong hoạt động của chúng Chất kháng sinh này được phát hiện năm 1945.Viridin độc hơn rất nhiều so với gliotoxin và là một độc tố thực vật, có hiệu lực như

một loại thuốc diệt cỏ, giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử nấm, được sản xuất từ T virens.

– Trichodermin và Dermadin: Ở Nhật Bản năm 1975, Atsushi, Shunsuke đã pháthiện được hai chất kháng sinh Trichodermin và Dermadin có trong dịch nuôi cấy loài

T koningii và T aureoviride.

Cho tới nay đã phát hiện được nhiều kháng sinh khác do Trichoderma sinh ra có

liên quan tới khả năng đối kháng của chúng như pyridine, anthraquinones, butenolides,

isonitrin D và F, trichorzianines, furanone do T harzianum sinh ra; các kháng sinh gliovirin, viridian, viridiol và valinotricin do T virens sinh ra.

Các chất trao trao đổi thứ cấp được sản sinh từ Trichoderma là bao gồm một loạt

các hợp chất hóa học Theo Ghisalberti và Sivasitham param (1991), chúng có thểđược phân loại như sau: (i) các chất kháng sinh dễ bay hơi như 6-pentyl - α – pyrone(6PP), (ii) các hợp chất hòa tan trong nước như heptelidic acid hoặc koningic acid, (iii)peptaibol Chất kháng sinh peptaibols là một chuỗi các oligopeptides của 12-22aminoacid có chứa nhiều α - aminoisobutyric acid, N-acetylated tại N-terminus và chứa

một amino alcohol (Phenol hoặc Trypol) tại C-terminus do T polysporum, harzianum, koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình

thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sựphát triển của mầm bệnh, và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh

Francesco Vinale và các cộng sự (2008), đã khảo sát khả năng đối kháng của

Trichoderma từ việc tiết kháng sinh để ức chế sự phát triển của các chủng nấm bệnh Ông sử dụng chất kháng sinh được tiết ra từ T harzianum bổ sung vào môi trường nuôi cấy của chủng Pythium ultimum Kết quả ông thu được là: ở đĩa (1) môi trường có chứa kháng sinh 6PP được tiết ra từ chủng T harzianum, ức chế sự phát triển của chủng Pythium ultimum [23].

Hình 1 4 Ức chế sự phát triển của nấm Pythiumultimum bởi chất kháng sinh được tiết

ra từ Trichoderma harzianum [9].

1.1.5.4 Tăng khả năng kháng của thực vật.

Ngoài khả năng bảo vệ giúp thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn

trong đất, nhiều loài trong chi Trichoderma được bổ sung vào đất còn có khả năng kích

thích cơ chế tự bảo vệ thực vật chống lại virus, vi khuẩn, nấm Trong trường hợp này,

các nấm Trichoderma đóng vai trò là những nhân tố mẫn cảm với rễ, kích thích hệ rễ miễn dịch chủ động và bị động ở thực vật Nấm Trichoderma còn có tác dụng tạo điều

kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển trong đất, kích thích sự tăng trưởng vàphục hồi bộ rễ, đồng thời có khả năng phân giải chất xơ, chitin, ligin… trong các phếthải hữu cơ thành các chất dinh dưỡng tạo điều kiện cho cây trồng hấp thu dễ dàng[41]

Các chủng đặc trưng của nấm thuộc chi Trichoderma xâm nhập vào mô rễ, sau

đó bắt đầu làm một loạt các thay đổi và hình thái và hóa sinh trong cây, điều này được

xem như là phản ứng phòng vệ của cây Khi bón T harzianum vào rễ cây đậu cho thấy rằng giảm được từ 25% - 100% mốc xám trên lá do Botrytis cinerea gây ra Các nhà khoa học đã sử dụng T harzianum T39 và chất benzothiadiazol để kiểm tra khả năng chống chịu Botrytis cinerea của cây cà chua, và thấy rằng chủng T harzianum T39

ngăn cản sự phát triển của nấm bệnh ngay ở giai đoạn đầu và giảm đến 30% tổn thương

cho cây (Audenaert et al., 1998) Theo Yedidia et al (1999), thì sự kích hoạt hệ thống phòng vệ của cây có liên quan đến rễ cây được xử lí với T harzianum T-203 Những rễ

được bổ sung chủng T 203 cho thấy hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase, cellulase vàperosidase cao hơn so với đối chứng không xử li trong 72 giờ Còn những cây dưa leođược xử lí với 2,6- dichloroisonicotinic acid, một chất cảm ứng cho hệ thống phòng vệcủa thực vật, cho thấy cũng có những phản ứng diễn ra nhưng không giống với khi xử

lí bằng T harzianum Theo Khan et al ,(2001) thì T hamatum chủng 382 kích ứng hệ thống kháng của cây cà chua đối với bệnh thối rễ và bạc lá do Phytophthora gây ra

[18]

1.1.6 Mối liên hệ giữa khả năng đối kháng nấm gây bệnh thực vật và hoạt động enzyme chitinase của Trichoderma spp [15]

Trichoderma spp có khả năng phân giải vách tế bào nấm Harran (2004) đã khảo

sát cơ chế phân tử của enzyme phân giải liên quan đến hoạt động kiểm soát sinh học

của Trichoderma harzianum Sự thủy phân vách tế bào nấm chủ yếu dựa vào hoạt tính

của enzyme chitinase, glucanase và protease Sau khi bám và quấn quanh nấm bệnh,sợi nấm của nấm kí sinh tạo lỗ hổng trên vách của sợi nấm ký chủ Màu sắc của sợinấm ký sinh thay đổi và phát huỳnh quang mạnh bởi sự kết hợp của fluoresceinisothiocyanat với lectin gắn vào chitotriose hoặc với calcoflour White Cả phức hợpnày được gắn với B – glucan và oligomer N – acetyl – D – glucosamine Hiện tượngnày được nhận định do enzyme phân giải được tiết ra tại vị trí tiếp xúc bởi

Trichoderma harzianum khi phân hủy vách của Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii Nếu có sự hiện diện của cycloheximid, hiện tượng đối kháng bị ngăn chặn và

hoạt tính của enzyme bị suy giảm Hoạt tính của enzyme chitinase cũng được tìm thấy

khi Trichoderma tấn công Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii trong môi trường

đất

T harzianum có khả năng tấn công lên nấm bệnh thì tiết B – 1,3 – glucanase và

chitinase nhiều hơn những chủng không có khả năng tấn công nấm bệnh, khả năng đối

kháng của Rhizoctonia solani khi bị T harzianum tấn công cũng đã được nghiên cứu Sợi nấm T harzianum khi xâm chiếm vào hạch của Sclerotium rolfsii và tạo lỗ trên bề

mặt của hạch này, cuối cùng làm thay đổi hình dạng và làm biến mất tế bào chất củanó

Các chủng Trichoderma khác nhau tùy thuộc vào hoạt tính enzyme thủy phân

được để tấn công sợi nấm của các loại nấm bệnh

1.1.7 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma spp trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.7.1 Trên thế giới

Cho tới nay có khoảng 30 nước đã có những nghiên cứu sử dụng nấm

Trichoderma để trừ bệnh hại cây trồng (Nga, Mỹ, Đức, Hunggari, Ấn Độ, Thái Lan,

Philippin…) cho khoảng hơn 150 loài vi sinh vật gây bệnh trên hơn 40 loại cây trồng

Ở Nam Mỹ, người ta dùng nấm T.harzianum phòng trừ các nấm Pythium spp và R solani gây bệnh chết héo đậu và củ cải (Chet và cộng sự,1981) Ở Ấn Độ, hiệu quả ức chế bệnh do R Solani gây trên khoai tây của nấm T harzianum đạt tới 89,1% Ở Thái Lan, sử dụng nấm T.viride phòng trừ bệnh thối thân cà chua do nấm S.rolfsii: tỷ lệ cây

sống đạt 91,7%; trong khi đó ở đối chứng chỉ đạt 61,9% Ở Philippin, nấm

T.harzianum làm giảm đáng kể tỷ lệ bị bệnh do nấm R.Solani ở đậu xanh: tỷ lệ bị bệnh khi dùng T.harzianum là 14-19%; đối chứng là 79-86% (Davide, 1991).

Theo Buimistru (1997), Elad và cộng sự (1980), Udaidulaev và cộng sự (1979),

Wu W S (1996) dùng chế phẩm Trichoderma spp có tác dụng phòng trừ bệnh hại

cây trồng, làm giảm tỷ lệ cây bị bệnh rõ rệt, chế phẩm nấm đối kháng nấm

Trichoderma sp có thể giúp cây khỏe hơn, tăng sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh,

tác dụng kích thích sinh trưởng đối với cây.

Nghiên cứu của Diby và cộng sự, 2003 đã ghi nhận nấm Trichoderma harzianum IISR - 1369, 1370 được phân lập từ vùng rễ của cây hồ tiêu có khả năng

kích thích sinh trưởng và hạn chế được bệnh chết nhanh cây hồ tiêu do nấm

Phytophthora capsici gây nên Khi sử dụng chế phẩm hỗn hợp giữa nấm Trichoderma harzianum IISR - 1369 với vi khuẩn Pseudomonas fluorescens IISR - 11 cho hiệu quả

phòng trừ đạt 63%, cao hơn so với đối chứng là 36% [25]

Năm 2010, Vinit Kumar Mishra đã chọn được 10 chủng Trichoderma để đối kháng với Pythium aphanidermatum bằng phương pháp đồng nuôi cấy [29].

Năm 2011, Th Kamala và S Indira đã chọn được 21 chủng Trichoderma để đối kháng với Pythium aphanidermatum cũng bằng phương pháp đồng nuôi cấy Và ông cũng đã thử nghiệm thành công 4 chủng nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh Pythium aphanidermatum ở điều kiện nhà lưới [32].

1.1.7.2 Tại Việt Nam

Tuy chỉ mới được nghiên cứu khoảng 20 năm tại Việt Nam nhưng Trichoderma

spp đã có ảnh hưởng rất lớn trong lĩnh vực nông nghiệp Với việc sử dụng chế phẩm

Trichoderma đã làm giảm đáng kể các nấm gây bệnh như: Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Phytophthora spp., Pythiumaphanidermatum và Rhizoctonia bataticola Việc sử dụng chế phẩm này đạt hiệu quả cao hơn thuốc diệt nấm và duy trì

lâu hơn Ngoài ra còn làm giảm rủi ro về sức khỏe, chi phí và thiệt hại về môi trường

do tập quán sử dụng thuốc hóa học gây ra Hiện nay, đã có những nỗ lực để mở rộng

sản phẩm thương mại Trichoderma và đã được phát triển bởi các trường đại học, các

viện nghiên cứu và các công ty phân bón [9]

Một số đề tài nghiên cứu về nấm Trichoderma ở Việt Nam:

Tác giả Trần Thị Thuần và cộng sự (2004), đã tiến hành phân lập từ các nguồn

khác nhau và xác định khả năng ức chế của nấm Trichoderma đã thu thập, kết quả cho thấy các loài nấm Trichoderma có hiệu quả ức chế cao từ 67,7 - 85,5% đối với các nấm gây bệnh như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fusarium spp , Aspergillus spp.[-

6]

Năm 2006, Huỳnh Văn Phục với đề tài nghiên cứu “ Khảo sát tinh đối kháng của

nấm Trichoderma spp đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúa và bắp” Kết quả thu được là phân lập được 17 dòng nấm Trichoderma spp có khả năng đối kháng tốt với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum [9].

Theo Trần Kim Loang và cộng sự (2008), sử dụng chế phẩm Trico-VTN (gồm

Trichoderma virens và Trichoderma asperellum) với nồng độ 0,3 – 0,4% mỗi tháng một lần, hạn chế được sự phát triển và gây hại của bệnh do nấm Phytophthora trên cây tiêu

và ca cao trong điều kiện vườn ươm [17]

Hồng Châu, 2009 cho rằng nấm Trichoderma giúp thúc đẩy tiến trình phân giải

chất hữu cơ nhanh hơn được dùng để ủ phân chuồng, phân xanh sẽ rút ngắn thời gianhoai mục [4]

Năm 2010, Trần Nguyên Hà với đề tài “Sử dụng các chủng Trichoderma để điều

khiển sinh học các tác nhân gây bệnh trên cây trồng ở Việt Nam” kết quả là phân lập

được 7 chủng Trichoderma từ một số cây trồng ở Việt Nam có khả năng kiểm soát tốt

các loài nấm bệnh Nhóm nghiên cứu Nguyễn Văn Hòa, Nguyễn Ngọc Anh Thư thuộc

viện cây ăn quả miền nam đã phân lập được 3 chủng nấm Trichoderma cho hiệu quả đối kháng tốt với nấm Phytophthora và Fusarium Hiệu quả sản phẩm được kiểm tra trên cây ăn quả và cây hoa được kiểm chứng bằng số khuẩn lạc của nấm Fusarium có trong 1g đất sau khi tưới nấm Trichoderma giảm rất nhiều so với đối chứng và so với

trước khi tưới [9]

Theo các tác giả Phạm Ngọc Dung và cộng sự (2012), sử dụng nấm đối kháng

Trichoderma Asperellum trong phòng trừ nấm Phytophthora spp gây hại trên cây cao

đã được một nhóm tác giả thuộc Viện Bảo vệ Thực vật nghiên cứu Trong điều kiện

phòng thí nghiệm nấm Trichoderma Asperellum có khả năng phòng trừ bằng ký sinh sợi nấm đạt hiệu quả là 100% đối với nấm Phytophthora Botryosa và nấm Phytophthora Citrophthora Khả năng phòng trừ bằng chất kháng sinh bay hơi đạt hiệu quả là 84,8 – 93,4% đối với nấm Phytophthora Botryosa và đạt hiệu quả là 90,4 – 91,8% đối với nấm Phytophthora Citrophthora Các nguồn khác có khả năng ức chế nhưng với hiệu quả thấp hơn (70,3 – 85,9) Nấm Trichoderma asperellum có khả năng đối kháng cao với nấm Phytophthora spp gây bệnh trên cao su bằng ký sinh trực tiếp sợi nấm và chất

kháng sinh bay hơi Đồng thời nấm này có hoạt độ các enzyme phân giải như Cellulase,Chitinase, β-Glucanase cao [10]

Hình 1.5 Một số chế phẩm sinh học từ Trichoderma spp.

1.1.8 Ứng dụng của Trichoderma spp trong nông nghiệp

Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ, Viện Lúa Đồng bằng SôngCửu Long, Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy

hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng Sông

Cửu Long và Đông Nam Bộ Các nghiên cứu cho ta thấy:

1.1.8.1 Khả năng kiểm soát bệnh cây

Nhiều chủng nấm Trichoderma có khả năng kiểm soát các loài nấm gây bệnh cho cây trồng Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với các loại nấm gây bệnh thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium [2].

Các loài nấm Trichoderma nói chung phát triển trong môi trường tự nhiên trên bề

mặt của rễ cây, do đó có tác dụng kiểm soát sinh học với một số bệnh trên rễ gây ra bởituyến trùng và nấm, nó còn giúp tái tạo, phục hồi các rễ bị tổn thương do tuyến trùng

hoặc rệp sáp gây ra Nấm Trichoderma còn tạo ra các chất có hoạt tính tương tự như

“thuốc kháng sinh”, có tác dụng kìm hãm sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh

đồng thời Trichoderma còn ký sinh các loài nấm gây bệnh, tiết ra các enzyme phân hủy

chúng [13]

Ngoài ra nấm Trichoderma phòng trừ được các bệnh trên lá do loài nấm này kích

thích bộ rễ tổng hợp chất đề kháng để chống lại các tác nhân vi sinh vật xâm nhập, cácchất đề kháng này từ rễ di chuyển đến các bộ phận phía trên của cây [2]

Những phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số chủng nấm Trichoderma có

khả năng hoạt hóa cơ chế tự bảo vệ của thực vật, từ đó những chủng nấm này cũng cókhả năng kiểm soát những bệnh do các tác nhân khác ngoài nấm

1.1.8.2 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng

Nấm Trichoderma kích thích sự tăng trưởng và phát triển của bộ rễ Trichoderma

bám vào những vùng rễ cây như những sinh vật cộng sinh khác Nó tiết ra đất nhữngchất kích thích để rễ cây ăn sâu xuống lòng đất, làm cho rễ cây khỏe hơn và tăng khảnăng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ, tạo thành một lớp thành bảo vệ vùng rễ

tránh sự xâm nhập của nấm bệnh, làm giảm khả năng nhiễm bệnh nhờ Trichoderma

bám vào các đầu rễ cây, tăng khả năng ra hoa, thụ phấn, tăng trọng lượng quả và chiềucao của cây, tăng năng suất cây trồng

Hiện nay, một chủng nấm Trichoderma đã được phát hiện có khả năng tăng số

lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất) Những rễ sâu này giúp các loài cây nhưbắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán [2]

1.1.8.3 Khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan.

Lợi dụng khả năng phân hủy cellulose, phân giải lân của nấm Trichoderma mà trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân hủy hữu cơ được nhanh chóng Sử dụng chế phẩm Trichoderma ủ phân hữu cơ để

bón cho cây trồng sẽ giúp tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất Phân giải nhanhcác chất hữu cơ thành dạng dễ tan, cung cấp dinh dưỡng cho cây, phòng một số nấmbệnh gây hại cho cây trồng, chất lượng phân cao hơn

Chế phẩm nấm Trichoderma được sử dụng để xử lý giúp phân hủy rơm rạ, sau đó

được dùng phối hợp với phân lân sinh học như dạng phân hữu cơ Phân hữu cơ đượcbón riêng rẽ hoặc phối hợp với phân vô cơ (NPK) trên nền sét nặng Kết quả nghiêncứu hai năm trên giống lúa IR64 cho thấy: nếu bón liên tục 100% phân hữu cơ chonăng suất tăng hơn so với đối chứng là 13,58% và nếu bón kết hợp 50% phân hữu cơvới 50% phân vô cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 22,46% Khi bón100% phân hữu cơ thì côn trùng và bệnh khô vằn xuất hiện trể hơn và ít gây hại chocây lúa và quần thể vi sinh vật đất ổn định hơn, có chiều hướng gia tăng hơn so với bón100% phân vô cơ (Lưu Hồng Mẫn và cộng sự, 2001) [14] Với những hiệu quả mà chế

phẩm Trichoderma mang lại, bà con nông dân nên sử dụng chế phẩm sinh học thay cho

việc dùng các loại phân bón hóa học để cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng,góp phần bền vững môi trường đất canh tác nông nghiệp

1.2 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây

Thanh long

1.2.1 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum

Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử, cành bào tử, kích thước bào tử và hình tháitản nấm dựa vào khóa phân loại của Ellis (1976) đã xác định tác nhân gây bệnh đốm

trắng trên Thanh long là do nấm Scytalidium dimidiatum (B Sutton & Dyko, 1989), hiện nay nấm còn được gọi tên là Neoscytalidium dimidiatum (Crous & Slippers, 2006)

Loài: Neoscytalidium dimidiatum

N dimidiatum thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), Ascomyta có cơ thể sinh

dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, một tế bào thường có mộtnhân, đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyên hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạo thành

cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục chứa nhiều nhân hay một nhân Vách tế bào cấu tạobằng chitin hay glucan, đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoại sinh trên đất, trong nước, trêncạn, thực vật, động vật, một số lại ký sinh gây bệnh trên thực vật, động vật, người, gâynên những thiệt hại lớn Ascomyta sinh sản dinh dưỡng bằng sự chia đôi tế bào nảychồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng dày, sinh sản vô tính bằng bào tử đính(conidia) và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi Các bào tử khác tính (+,-) sợi nấm đơnbội, phân nhánh thành hệ sợi nấm hình thành các cặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh

chất, hình thành sợi sinh túi đa bào, sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân

lưỡng bội rồi giảm nhiễm tạo thành bào tử túi Chu trình sống của Ascomyta gồm 3 giai

đoạn: giai đoạn đơn bội, giai đoạn song hạch và giai đoạn lưỡng bội, trong đó giai đoạn

đơn bội chiếm ưu thế Một số Ascomyta hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả

thể mở lỗ và quả thể hở

1.2.2 Khái quát về bệnh đốm trắng trên Thanh long [36]

Bệnh đốm trắng hay còn gọi là bệnh đốm nâu, tắc kè, bệnh ma là những tên gọikhác nhau mà bà con nông dân trồng Thanh long ở Bình Thuận, Tiền Giang và Long

An đặt cho một loại dịch hại mới phát sinh, gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất

và chất lượng trái Thanh long và có xu hướng ngày càng phát triển và lây lan rộng trêndiện lớn, ảnh hưởng đến xuất khẩu

Khi gặp điều kiện thời tiết thuận lợi, các vết bệnh phát triển lan rộng ra, liên kếtnhau thành từng mãng lớn làm sần sùi bề mặt cành, trong một số trường hợp bệnh gâythối từng mảng lớn

Trên quả: Bệnh tấn công và gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của quả,đặc biệt ở giai đoạn sau trổ hoa và giai đoạn chuẩn bị chín Triệu chứng bệnh gây hại

trên quả cũng tương tự như trên cành và những quả nhiễm nặng thì không thể bán được.

 Tác nhân: Do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra.

 Điều kiện phát sinh:

Bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh vào mùa mưa (tháng 5 đến tháng 11dương lịch) Nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển từ 30-350C và ẩm độ càng cao tạođiều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan nhanh

 Nguồn bệnh và sự lây lan:

Ở điều kiện ngoài đồng, bệnh thường tồn tại trong đất, tán cây, xác bả thực vật cótrên vườn hoặc trên cành, trái bị bệnh không được tiêu hủy

Bào tử nấm bệnh lây lan chủ yếu qua hom giống, cành và quả thanh long bị bệnh,qua gió, dòng nước chảy và qua dụng cụ cắt tỉa

1.2.3 Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum

1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

Thanh long là cây ăn quả phổ biến và được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới Vìvậy, việc nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm đang được quan tâm, đã có rấtnhiều nghiên cứu về tình hình bệnh hại trên Thanh long Thanh long bị gây hại bởi một

số bệnh như bệnh thối đầu cành (Alternaria sp), bệnh đốm nâu trên cành (Gleosporium agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành (Sphaceloma sp) Tuy nhiên những năm gần đây Thanh long lại bị gây hại nặng bởi nấm Neoscytalidium dimidiatum đây là

một bệnh có ảnh hưởng lớn đến năng suất chất lượng sản phẩm gây thiệt hại lớn chongười trồng Thanh long Trước vấn đề cấp thiết trên, nhiều nhà khoa học trên thế giới

đã nghiên cứu tìm hiểu về nấm N.dimidiatum.

Theo báo cáo đầu tiên về nấm N dimidiatum trên cây có múi tại Italya (G Polizzi

và cs, 2008) [27] vào tháng 9 năm 2008 một căn bệnh mới đã được phát hiện và chú ý

ở phía Sicily, Italy trong vườn cây có múi (cam ngọt (Citrus sinensis (L.) Osbeck cv.Tarocco Scires) 2 tuổi đã xuất hiện một bệnh mới với triệu chứng điển hình là chồikém phát triển và thối trên thân, cành, gốc ghép, vết thối chảy gôm

Trong một thời gian ngắn xuất hiện khối bào tử của nấm màu đen dưới lớp vỏ cây

và trên bề mặt vết thối Sau khi phân lập trên môi trường PDA, xác định nấm có đặc

điểm giống nấm Scytalidium với các đặc điểm như sợi nấm màu nâu phân nhánh có

vách ngăn, bào tử hình trứng, elip, đỉnh tròng có 0-2 vách ngăn, màu nâu Sau khi phânlập tiến hành kiểm tra bằng phương pháp PCR, DNA được chiết suất từ sợi nấm sau đó

sử dụng các mồi V9G và ITS4 để khếch đại operon rRNA hạt nhân kéo dài đầu 3’ củagen 18S rRNA, các miếng đệm bên trong sao chép, gen rRNA 5.8S, và một phần củakết thúc 5’ của gen 28S rRNA Sau khi phân tích trình tự DNA trên cơ sở đặc điểm

hình thái và các dữ liệu phân tử, bệnh đã được xác định là do nấm N.dimidiatum gây ra.

Bệnh đã được kiểm tra lại bằng phương pháp lây nhân tạo trên cây cam ngọt 2 tuổi

Theo báo cáo đầu tiên về nấm N.dimidiatum và N.novaehollandiae trên cây xoài tại Australia của ( J D Ray, T Burgess anh V M Lanoiselet 2010) N.dimidiatum là

loài nấm có phạm vi phân bố và có nhiều ký chủ: cây dương mai, hạt sung, vả, cây có

múi, chuối, mận, và nhiều cây trồng khác ở Mỹ (Farret al 1980) N.dimidiatum còn

gây hại trên xoài (Reckhaus 1987) và nhất là trên Thanh long (Brown 2012)

N.dimidiatum gây nên các triệu chứng như héo cành, chết mầm, thối, chảy gôm và làm cây chết Yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm N.dimidiatum là

độ ẩm (Punithalingam and Waterson 1970; Reckhaus 1987; Elshafie and Ba-Omar2001)

N.dimidiatum được báo cáo lần đầu tiên tại Australia liên quan đến bệnh chết

mầm của xoài (2010) Tại Australia đã tiến hành khảo sát về sức khỏe cây trồng do Bộ

nông nghiệp và thực phẩm Tây Australia kết hợp với kiểm dịch viên Australia thựchiện Tháng 8 năm 2008 trong cuộc khảo sát này các nghiên cứu đã tiến hành phân lậpcác triệu chứng chết mầm trên cây xoài và rễ cây sung, sau khi tiến hành phân lập đãphát hiện nguyên nhân gây bệnh làm chết mầm, thối rễ, thối cây…là do nấm

Neoscytalidium spp gây ra Neoscytalidium spp tiếp tục được phân lập và tiến hành giải trình tự một phần DNA của từng vùng ITS kết qủa xác định là do Neoscytalidium gây

ra Trong cuộc khảo sát, N.dimidiatum cũng được phân lập từ các mẫu xoài lấy tại

Derby, trong tháng 9 năm 2008, Broome vào tháng 9 năm 2008 và Đảo Bathurst,Northen Territory vào tháng 10 năm 2008 Sau khi phân lập, các nhà khảo sát đã tiếnhành lây bệnh nhân tạo và tái phân lập theo quy tắc Kock đã thu được kết quả tốt Tiếnhành kiểm tra lại các chủng thu thập với các cuộc điều tra trước (2005) các nhà khảo

sát đã phát hiện rằng N.dimidiatum đã xuất hiện và gây hại tại Australia trong thời gian

dài trước đó (phân lập từ cây có múi (Torula dimidiate 1914)) Theo báo cáo này, yếu

tố nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển gây hại của bệnh

Trước đây N.dimidiatum có nhiều tên gọi khác nhau như: Fusicoccum dimidiatum, Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea,

…(Crous et ai 2006)

Theo nghiên cứu của Mohd và ctv 2013 viện nghiên cứu sở nông nghiệp, Đạihọc quốc gia Đài Loan, Trung Quốc, vào tháng 9 năm 2009 và 2010 bệnh đốm trắng đãxuất hiện ở một số cây Thanh long tại Đài Loan Triệu chứng của bệnh là các vết nhỏ,

tròn, vết bệnh lõm, màu cam Bệnh được xác định do nấm N.dimidiatum gây ra.

Năm 2008, 2009 nấm N.dimidiatum đã phát hiện trên các quả Thanh long trồng ở Malaysia N.dimidiatum đã gây ra triệu chứng như chấm tròn nhỏ, thối và sau đó mục

nát Mẫu bệnh đã được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở 250C trong

7 ngày Nấm thu được nuôi cấy trên môi trường PDA , nấm có quả cành màu đen,đường kính 90 mm, hình elip, hình trứng, hình que hoặc hình tròn trong pha lê có 2

vách ngăn DNA chiết từ sợi nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA thực hiện phảnứng khếch đại sử dụng mồi ITS4 và ITS5 Cuối cùng thực hiện lây bệnh nhân tạo để sosánh đánh giá bệnh.

Đến tháng 7 năm 2011 bệnh đốm trắng trên Thanh long đã được phát hiện ởTrung Quốc với các đặc điểm là có nhiều vết nhỏ đốm nâu nhỏ hơn các vết bệnh banđầu, các vết này lan rộng và hình thành các vùng rộng lớn gây chết hoại Nấm đượcnuôi cấy trên môi trường thạch đường khoai tây (PDA) và ủ ở 280C trong 3 ngày Saukhi phân lập tiến hành phản ửng PCR (phản ứng khếch đại gen), DNA được chiết suât

từ sợi nấm đã được nuôi cấy trong 7 ngày sử dụng Kit DNAsecure thực vật, miếng đệmghi chép nội bộ (ITS) khu vực của rDNAs từ phân lập được khếch đại bởi mồi ITS1 vàITS4

Đến năm 2012, Brown đã công bố báo cáo đầu tiên về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây hại trên Thanh long tại tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc.

1.2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước:

Hiện nay tại Việt Nam có rất ít thông tin về nấm gây bệnh đốm trắng trên câyThanh long, chỉ có thông tin nghiên cứu của Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền nam

(2011) rằng bệnh đốm trắng do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra Nấm này còn

có tên khác là Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea,… bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh và mùa mưa, nhiệt độ thích

hợp cho nấm phát triển từ 20-300C Ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi chobệnh tấn công và lây lan mạnh Bệnh lây theo gió và nguồn nước nhiễm bệnh Quatheo dõi thấy bệnh hại nặng ở những vùng có mực nước ngầm cao, những vườn vệ sinhkém, rậm rạp và bị che mát nhiều, vườn sử dụng nhiều phân đạm hay phân bón phânchuồng chưa ủ hoai, vườn sử dụng nhiều chất kích thích tăng trưởng hay vườn bónthiếu trung vi lượng đều có tỉ lệ bệnh cao hơn bình thường và khi có bệnh thì khó