Nhân giống cây sâm dây (codonopsis javanica) (blume) hook f ) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây trong ống nghiệm ...26 3.1.1.. Ản

Trang 1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TỐNG XUÂN HOA

NHÂN GIỐNG CÂY SÂM DÂY

(Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2014

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TỐNG XUÂN HOA

NHÂN GIỐNG CÂY SÂM DÂY

(Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Trang 3

và hoàn thành luận văn.

Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Thị Thúy Hường, Trại Thực nghiệm Sinh họcthuộc Viện Công nghệ Sinh học đã hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình tiếnhành thí nghiệm

Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuật viênTrần Thị Hồng (Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Khoa Sinh -KTNN - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên) Tôi xin chân thành cảm ơn

sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôithực hiện quá trình nghiên cứu

-Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình cùng bạn bè đã động viên, khuyếnkhích, giúp đỡ tôi, luôn quan tâm và là chỗ dựa cho tôi trong suốt quá trình họctập và hoàn thành luận văn

Thái nguyên, tháng 8 năm 2014

Tác giả luận văn

Tống Xuân Hoa

Trang 4

2 h t t p : / / www l r c - tn u e d u v n /

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Mọi trích dẫntrong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luậnvăn là trung thực và chưa được ai công bố

Thái nguyên, tháng 8 năm 2014

Tác giả luận văn

Tống Xuân Hoa

Trang 5

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây Sâm dây 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Sâm dây 3

1.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật 9

1.2.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro 9

1.2.2 Quy trình nhân giống in vitro 12

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 14

1.3.1 Auxin 15

1.3.2 Cytokinin 16

1.4 Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở trong nước và ngoài nước 17

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.1.1 Vật liệu 21

2.1.2 Hoá chất, thiết bị 21

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

Trang 6

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

Trang 7

h t t p : / / www l r c - tn u e d u v n /

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 21

2.2.2 Phương pháp xử lí và tính toán số liệu 24

2.2.3 Điều kiện thí nghiệm 25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây trong ống nghiệm 26

3.1.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm 26

3.1.2 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây trong ống nghiệm 29

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây trong ống nghiệm 30

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa các chất thuộc nhóm Cytokinin với IBA đến hiệu quả nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm .32

3.3.1 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm 32

3.3.2 Ảnh hưởng kết hợp giữa Kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm 33

3.3.3 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP, kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm 35

Trang 8

h t t p : / / www l r c - tn u e d u v n /

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu iv

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây con trong vườn ươm

37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 44

Trang 9

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Trang 10

Sâm dây (sau 4 tuần và 8 tuần) 27

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi

Sâm dây (sau 4 tuần và 8 tuần) 29

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây (sau 8 tuần)

31

Bảng 3.4 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh

trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây (sau 8 tuần) 32

Bảng 3.5 Ảnh hưởng kết hợp giữa Kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh

trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây (sau 8 tuần) 34

Bảng 3.6 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP, kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự

sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây (sau 8 tuần) 35

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây Sâm dây in

vitro trong vườn ươm (sau 4 tuần) 38

Trang 11

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cây Sâm dây 3 Hình 3.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của

chồi Sâm dây (sau 8 tuần) 27

Hình 3.2 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng

của chồi Sâm dây (sau 8 tuần) 30

Hình 3.3 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây (sau 8 tuần)

31

Hình 3.4 Ảnh hưởng kết hợp của BAP và IBA đến khả năng nhân chồi và sự

sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm (sau 8 tuần) 33

Hình 3.5 Ảnh hưởng kết hợp của kinetin và IBA khả năng nhân chồi, sự sinh

trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm (sau 8 tuần) 34

Hình 3.6 Ảnh hưởng kết hợp của BAP , kinetin, IBA đến khả năng nhân chồi

và sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm (sau 8 tuần) 36

Hình 3.7 Cây Sâm dây đưa ra môi trường tự nhiên (sau 4 tuần)

38

Trang 12

Mặc dù có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, đa dạng và kinhnghiệm sử dụng dược liệu làm thuốc của nhân dân ta đã có từ xa xưa, nhưngnguồn tài nguyên đó đang ngày càng suy giảm nghiêm trọng, đa số các câythuốc quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng Nguyên nhân là do sự khai thácmột cách ồ ạt, không có kế hoạch và chưa chú ý đến việc tái sinh, bảo vệ rừnglàm nguồn cây thuốc Việt Nam bị tàn phá nhanh và cạn kiệt.

Sâm dây hay còn gọi là Đảng sâm là loại dược liệu quý được đưa vàosách đỏ Việt Nam từ năm 1996 Công dụng của Sâm dây đã được nghiên cứu

và được y học dân tộc đưa vào các bài thuốc chữa bệnh Sâm dây là một

vị thuốc có rất nhiều công dụng chữa bệnh và phòng ngừa bệnh, giúp cho cơthể khỏe mạnh và đề kháng tốt Đông y coi Sâm dây là nhân sâm của ngườinghèo vì có mọi công dụng của nhân sâm nhưng lại rẻ tiền hơn Vì thế việcdùng Sâm dây trở nên phổ biến rộng rãi, đáp ứng được nhu cầu sử dụng gầnnhư không giới hạn trong y học dân tộc Tuy nhiên, nạn tàn phá rừng làmnương rẫy quá mức trong tự nhiên làm cho vùng phân bố của cây Sâm dây

bị thu hẹp nhanh

chóng, có nguy cơ cạn kiệt Vì vậy, việc bảo tồn cây Sâm dây là cần thiết

Trang 14

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được môi trường nhân giống cây Sâm dây trong ống nghiệm

- Xác định được giá thể đưa cây ra trồng ngoài môi trường tự nhiên

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởngthuộc nhóm Cytokinin lên khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi câySâm dây trong ống nghiệm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi cây Sâmdây trong ống nghiệm

- Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của các chất kích thích sinhtrưởng thuộc nhóm Cytokinin với IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinhtrưởng của chồi và khả năng ra rễ của cây Sâm dây trong ống nghiệm

- Nghiên cứu giá thể và các điều kiện thích hợp để đưa cây ra môitrường tự nhiên

Trang 15

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây Sâm dây

1.1.1 Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Sâm dây

Cây Sâm dây có tên khoa học là Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,

tên thường gọi: Đảng sâm, Vú chó, Kim tiền báo, Thổ đảng sâm, Đảng sâmnam, cây Đùi gà, Mằn rầy cấy (Tày), Cang hô (Mèo)

Sâm dây thuộc Chi Codonopsis.

Họ Hoa chuông (Campanulaceae)

Bộ Hoa chuông (Campanulales)

Lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida)

Ngành Hạt kín (Magnoliophyta) Giới Thực vật (Plantae) [13], [16].

(Nguồn: cơ sở tài nguyên của Viện dược liệu ( ht t p :// w ww v ienduo c l i e u.org v n /)[32].

Hình 1.1 Cây Sâm dây

Sâm dây thường mọc ở ven rừng, nương rẫy đã bỏ hoang lâu ngày, trảng cỏ tranh ở độ cao khoảng 700m trở lên đối với các tỉnh phía bắc và

độ cao

Trang 16

1.300m đối với các tỉnh phía nam Sâm dây là loài cây ưa ẩm, ưa sáng, có thểchịu bóng, ưa mọc nơi đất tốt, nhiều mùn

Trang 17

Ở Việt Nam, Sâm dây mọc rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc nước

ta Trước đây có nhiều ở một số tỉnh Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, YênBái, Tuyên Quang và một số ít ở Cao Bằng và Lạng Sơn.Ở các tỉnh phía Nam,Sâm dây tập trung ở cao nguyên Langbiang (Tỉnh Lâm Đồng) và xung quanhchân núi Ngọc Linh (Đắc Glay - Kon Tum) và Quảng Nam - Đà Nẵng

[5]

Trong 44 loài thuộc chi Codonopsis Việt Nam có 2 loài được mô tả và dùng làm thuốc với tên Đảng sâm Thứ nhất là loài Codonopsis pilosula (Đảng

sâm leo, Phòng Đảng sâm, Đảng sâm bắc) còn gọi là Rầy cấy, Mần cấy

Codonopsis pilosula mọc tự nhiên ở những vùng rừng ẩm thấp miền núi Đông

Bắc và Tây Bắc Việt Nam, ở Lạng Sơn, Cao Bằng và khu Tây Bắc Thứ hai là loài

Codonopsis javanica Blume (Đảng Sâm, Kim tiền báo, Thổ Đảng Sâm, Đảng

Sâm nam) còn có tên là cây Đùi gà, Mằn rày cáy (Tày), Cang hô (mèo), cónhiều ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Sơn La, Lai Châu, Yên Bái Ở miền núi người dântộc đã trồng xen Sâm dây với ngô mang lại hiệu quả cao [4]

Sâm dây là loại dây leo thảo, sống nhiều năm Toàn cây có nhựa mủtrắng, nhất là bộ phận non và lá Rễ củ hình trụ dài, phân nhánh, nạc Lá mọcđối, có cuống, phiến lá mỏng, hình tim hoặc gần hình trứng, dài 2,0cm - 5,0cm,rộng 1,5cm - 3,5cm, mép lá khía răng cưa, mặt trên lá màu xanh nhạt, mặtdưới màu trắng xanh Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, hình chuông, màu trắng, hoặchơi vàng, họng có vân tím Lá đài 5, hình mác nhọn Tràng hoa chia thành 5thùy tam giác nhọn Nhị 5 Bầu 5 ô Quả nang, có núm, khi chín màu tím đen.Hạt nhiều, nhỏ, màu vàng nâu [16]

1.1.2

a)

-

Trang 18

- 70 cm

Trang 19

Ngoài ra có thể trồng Sâm dây bằng đầu củ (sau khi thu hoạch rễ củ, bỏdây, cắt lấy phần đầu củ làm giống) Cây có thể lụi vào mùa đông hoặc mùakhô (đối với các tỉnh phía nam) Đến mùa xuân hoặc đầu mùa mưa, từ gốcmọc lên 1 - 2 chồi và sinh trưởng rất nhanh [16].

Trang 20

Trang 21

- [28]

[6],

,

[6], [28]

1.1.3 Một số thành phần hóa học và giá trị dược liệu của cây Sâm dây

1.1.3.1 Một số thành phần hóa học của cây Sâm dây

Nghiên cứu trên cây Sâm dây ở trong nước chủ yếu là về phân tíchthành phần hóa học và các tác dụng dược lý của vị thuốc quý này Năm 2002,

công trình “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của vị thuốc đảng sâm Việt Nam” của Hoàng Minh Chung và Phạm Xuân Sinh là nghiên cứu đầu

tiên công bố các thành phần hóa học của cây Sâm dây Việt Nam Bằng một sốphương pháp định tính và định lượng trên các mẫu củ sâm sống và cao sâm,nhóm tác giả đã mô tả đặc điểm thực vật của cây Sâm dây mọc ở Sa Pa và cácthành phần có trong rễ Sâm dây khô và tươi đó là: đường khử, acid amin, chấtbéo và saponin; thành phần và hàm lượng của các loại acid amin có trong r

ễ Sâm dây [3]

Cũng chính hai tác giả Hoàng Minh Chung và Phạm Xuân Sinh cũng đãcông bố kết quả những nghiên cứu về hợp chất saponin có trong Sâmdây Loại saponin chủ yếu là saponin triterpenoid, hàm lượng saponin vàokhoảng

Trang 22

3,12% Ngoài ra, nhóm tác giả cũng đã công bố về hàm lượng đường khử

Trang 23

khoảng 14,6% đối với các mẫu cây sống, và 29,5% đối với các mẫu đã qua chế biến [3].

1.1.3.2 Giá trị dược liệu của cây Sâm dây

Từ xa xưa, trong y học cổ truyền, lang y đã biết dùng củ sâm phơi khô đểdùng trong các bài thuốc chữa bệnh, bồi bổ sức khỏe Ngày nay, với sự pháttriển của khoa học, con người đã biết tách chiết riêng những thành phần cótính chất dược trong củ sâm tạo thành thuốc Công nghệ tách chiết hoạt chất

đã giúp cho việc không phải sử dụng nguyên củ sâm cùng những thành phầnkhông có công dụng chữa bệnh cũng như bồi bổ sức khoẻ

Các loài sâm nói chung cũng như Sâm dây nói riêng chứa rất nhiều hoạtchất sinh học Các hoạt chất này có nhiều tính chất dược và được sử dụngnhiều để làm thuốc Trong các loài sâm thường chứa các hoạt chất như:terpen, acid amin, hợp chất glycosid, vitamin, các nguyên tố khoáng, alkaloid

và hợp chất saponin là hoạt chất chính tạo nên những công dụng của nhânsâm [3]

Củ sâm đất có tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng, làm long đờm , nhưngvới liều cao có thể gây nôn mửa và ra nhiều mồ hôi Dân gian thường lấy củsâm đất ngâm rượu uống; lá nấu canh ăn giúp giải nhiệt cơ thể, làm mát gan.Canh rau sâm đất ăn có vị ngọt, hơi chua giống như rau mồng tơi, nhưngkhông có nhớt Sâm đất có các tác dụng trị liệu, như trong chứng viêmkhớp nó giúp giảm viêm sưng và giảm đau Sâm đất còn giúp giảm táo bón.Dùng sâm đất giúp giảm cơn ho và suyễn; dùng cho một số trường hợp namgiới bất lực Sâm đất được dùng nhiều trong những bệnh về da như ghẻ; dùnglàm bài thuốc trị giun sán; dùng trong bệnh sỏi thận, viêm thận; giải độc chogan Bộ phận dùng toàn cây (phần thân trên mặt đất) và rễ: Lá có vị hơi đắng,cay; tính lạnh, có ít độc (gây nôn nếu dùng liều cao) Rễ có vị ngọt, cay,

Trang 24

tính mát Công dụng: thanh nhiệt (hạ sốt), lợi niệu, giải độc Chủ trị, toàn câychữa tiểu đường dạng

2 Rễ dùng chữa đau răng, đau bụng, cảm mạo, bệnh gan, cao huyết áp, tiểu đường, nhiễm trùng đường tiểu [5], [13]

Trang 25

Đối với các hệ cơ quan trong cơ thể, Sâm dây có tác dụng chống mệt mỏi

và tăng cường sự thích nghi của cơ thể đối với môi trường nhiệt độ cao Đốivới hệ tiêu hóa, Sâm dây có tác dụng tăng cường trương lực của hối tràng vàcường độ co bóp càng tăng nếu tăng nồng độ thuốc Đối với hệ tim mạch: làmtăng cường độ co bóp của tim, tăng lượng máu cho não, chân và nội tạng Đốivới máu và hệ thống máu: tác dụng làm tăng số lượng hồng cầu, huyết sắc tố,làm giảm số lượng bạch cầu, làm tăng nhanh máu đông khô mà không có tácdụng tán huyết Ngoài ra, Sâm dây còn có tác dụng hạ huyết áp, tăngcường miễn dịch của cơ thể, có tác dụng kháng viêm, giảm ho, kháng khuẩn…[13],[31]

Các bài thuốc y học cổ truyền có sử dụng Sâm dây

(1) Trị phế hư, ích phế khí, tỳ vị hư yếu, khí huyết đều suy, không cósức, ăn ít, khát, tiêu chảy lâu ngày, thoát giang

(2) Trị trung khí suy nhược, ăn uống kém, ỉa chảy do tỳ hư, vàng da dohuyết hư, tiêu ra máu, rong kinh

(3) Trị thiếu máu, gầy ốm, bệnh bạch huyết, bệnh ở tụy tạng

(4) Trị hư lao, nội thương, trường vị trung lãnh, hoặc tả lỵ lâu ngày, khísuyễn, phiền khát, phát sốt, mồ hôi tự ra, băng huyết, các chứng thai sản

Một số đơn thuốc có sử dụng Sâm dây

(1) Chữa cơ thể suy yếu, mệt mỏi: Dùng Sâm dây 15 - 30g, sơn dược (củmài), đại táo (táo tàu), mỗi thứ 9 - 15g, sắc nước uống trong ngày

(2) Chữa ho do yếu phổi: Dùng Sâm dây tươi 30g, bách bộ 9g, sắc nướcuống trong ngày

(3) Chữa sản phụ thiếu sữa: Dùng Sâm dây, đương quy, mỗi thứ 10 15g, hầm với thịt gà ăn Hoặc dùng Sâm dây, trái vẩy ốc (tức “quả xộp”), mỗi

-vị 30g, sắc uống

Trang 26

(4) Chữa khí hư: Dùng Sâm dây, rễ bùng bục, mỗi thứ 15g, hải phiêu tiêu(mai cá mực) 24g, rễ rau dền gai 30g, sắc nước uống mỗi ngày trong một tháng.

Trang 27

(5) Chữa trẻ nhỏ đái dầm: Dùng Sâm dây 20 30g, thịt lợn nạc 50 100g, hầm chín ăn (uống nước canh, ăn thịt)

-(6) Chữa trẻ nhỏ cam tích: Dùng Sâm dây 15g, thịt lợn nạc 50 – 70g,cùng hầm chín, chia ra ăn trong ngày [13], [31]

1.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật

Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là một trong những ứng dụng chính

của công nghệ tế bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân cácđiểm sinh trưởng hoặc các mô phân sinh trong cây Theo các công trìnhnghiên cứu thì chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sự ổn định về ditruyền, tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp xử lý nhiệt

để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [1]

Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng nhằm phục vụ các mục đích sau:(1) Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu của côngtác chọn giống

(2) Duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giốngcác loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, câycảnh, cây dược liệu…

(3) Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách li tái nhiễm kết hợp với việclàm sạch bệnh virus

(4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây tự nhiên có đặcđiểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sản xuấthạt lai

(5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trongngân hàng gen [1],[27]

1.2.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro

Ngành công nghiệp nhân giống in vitro phát triển và mở rộng trong

những năm gần đây do yêu cầu về chất lượng cây giống tăng lên nhanh chóng

Trang 28

trên toàn thế giới nhằm phục vụ những dự án trồng lại rừng, sản xuất lươngthực, thực phẩm, thức ăn gia súc, nông nghiệp và bảo vệ môi trường toàncầu

Trang 29

Vì nhân giống in vitro có những ưu điểm lớn mà không một loại hình nhân

giống nào có được

Thứ nhất: Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản

xuất Trong phần lớn các trường hợp công nghệ in vitro đảm bảo một tốc độ

nhân nhanh, từ một cây trong vòng 1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây

thế giới sau 6 tháng nhân giống được 10 vạn cây khoai tây

Thứ hai: Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ Trong

Thứ ba: Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh

vì vậy đảm bảo các giống sạch bệnh

Thứ tư: Thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển (một thùng40.000 cây dâu tây cũng chỉ nặng 15kg); việc bảo quản cây giống giữ ở nhiệt độ

Thứ năm: Sản xuất quanh năm, quá trình sản xuất có thể được vận hànhtrong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm [21]

Các phương thức nhân giống in vitro được ứng dụng đó là nuôi cấy mô

phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng; tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận kháccủa cây và nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đã đem lại khả năng nhân giốngcây trồng ở quy mô lớn, kể cả các đối tượng khó nhân giống bằng phươngpháp thông thường, hệ số nhân giống cao, tiết kiệm vật liệu giống, cho ra sảnphẩm đồng nhất về mặt di truyền Nguyên liệu nuôi cấy sạch bệnh cho sảnphẩm hoàn toàn sạch bệnh, khả năng tái tạo, phục hồi nguồn gen có nguy cơbiến mất trong tự nhiên [21]

Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng:

Theo Lê Trần Bình (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấyđược tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp

Trang 30

của đỉnh sinh trưởng [1] Nhưng trong thực tế, việc nuôi cấy các mẫu vậtnhư vậy

Trang 31

rất khó thành công Người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục đích nuôi cấy làlàm sạch virus cho cây trồng Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởngđược tiến hành phổ biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía,đỉnh sinh trưởng được tách với kích thước từ 5-10 mm [21]

Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tươngquan giữa độ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền củachồi vì thông thường nếu độ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn địnhcủa chồi cũng giảm Nhưng xét hiệu quả kinh tế nuôi cấy thì khi độ lớn củachồi tăng, hiệu quả kinh tế sẽ giảm và khi độ lớn của chồi giảm, hiệu quả kinh

tế sẽ tăng Do vậy phải kết hợp giữa các yếu tố để tìm ra phương thức lấy mẫutối ưu Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ phát triển thànhmột hay nhiều chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ đầy đủ[21]

Nếu xét về nguồn gốc của các cây nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinhtrưởng có 3 khả năng: Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn), cây phát triển

từ chồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi mới phát sinh Tuy nhiên, trongthực tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh

Có 2 phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh nuôi cấy đó là:+ Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu ở các đối tượng 2 lá mầm nhưkhoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc, nhưng có cả ở cây một lá mầm nhưdứa sợi, mía…

+ Phát triển cây qua giai đoạn dẻ hành (protocorm)

Chủ yếu gặp ở các đối tượng đơn tử diệp (1 lá mầm) như phonglan, dứa, huệ Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm và cácprotocorm có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triểnthành cây hoàn chỉnh Bằng phương thức này, trong một thời gian ngắnngười ta có thể thu được hàng triệu cá thể Do đó đem lại hiệu quả nuôi cấy

Trang 32

lớn như ở phong lan vì có phương thức sinh sản qua dạng dẻ hành(protocorm) nên nhân giống vô tính hoa lan đạt được thành công lớn vàđược ứ ng dụng rộng

Trang 33

rãi Nhờ đó mà hoa Cymdium vốn đắt trở nên có giá phải chăng và đượcnhiều người ưa chuộng

Gần đây phương thức này cũng đã bắt đầu được áp dụng có kết quả ởcác cây ăn quả và cây lâm nghiệp, trong đó có cây quý như cà phê, táo, lê, câythông, bồ đề… Tổng số có trên 30 chi khác nhau đã được nuôi cấy thành công

Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây:

Vì tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lại của cơ thể

thực vật đều có thể thực hiện cho việc nhân giống in vitro được Các bộ phận

đó là: Đoạn thân ở các đối tượng như thuốc lá, cam, chanh… mảnh lá ở thuốc

lá, cà chua, bắp cải cuống lá ở Nacissus; các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa mì… và nhánh củ ở tỏi, hành…

Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo:

Trong mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnhtrực tiếp từ mẫu vật ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây

mà cây cũng khá đồng đều về mặt di truyền Tuy nhiên, trong nhiều trườnghợp mô nuôi cấy không tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô sẹo Tế bào

mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Do đónhất thiết phải sử dụng các mô sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp mớithu được cây tái sinh đồng nhất Thông qua giai đoạn mô sẹo có thể thu đượcnhững cây sạch virus [14], [21], [26]

1.2.2 Quy trình nhân giống in vitro

Theo Đỗ Năng Vịnh (2005) quy trình nhân giống in vitro gồm các giai

đoạn sau [26]:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng

của cây mẹ ban đầu nên giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây

Trang 34

mẹ thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao Sau đó chọn cơ quan

để lấy

Trang 35

mẫu thường là mô non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non… Mô chọn đểnuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạchbệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị Tùytheo điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3 - 6 tháng [26]

Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy, giai đoạnnày được tiến hành theo các bước:

(1) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy

(2) Cấy mẫu vật đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn

môi trường nhân tạo (giai đoạn này còn gọi là cấy mẫu in vitro).

Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được nuôitrong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau một thờigian nhất định, từ mẫu nuôi cấy sẽ bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặccác cơ quan hoặc các phôi vô tính Giai đoạn này yêu cầu 2 - 12 tháng hoặc ítnhất

4 lần cấy các mảnh [26]

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống quyết định hiệu quả của quátrình nuôi cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy Khimẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi và các phôi vôtính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất.Người ta cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy.Thành phần và điều kiện môi trường cần được tối ưu hóa nhằm đạt được mụctiêu nhân nhanh Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường trongkhoảng 1 - 2 tháng tùy loài cây Tỉ lệ nhân nhanh khoảng 2 - 8 lần sau 1 lầncấy chuyển Nhìn chung giai đoạn này thường kéo dài 10 - 36 tháng Giai đoạnnhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu Ví dụ,

Trang 36

từ một đỉnh sinh trưởng của một cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nênnhân lên 2000

- 3000 chồi sau 7 - 8 lần cấy chuyển để tránh biến dị soma Đối với các cây

Trang 37

khác như mía, hoa cúc, phong lan sau 1 năm có thể nhân lên 1.000.000 chồi

từ cây mẹ ban đầu [26]

Giai đoạn 4: Tạo rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tựsinh, nhưng thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môitrường khác để kích thích tạo rễ Ở một số loài khác thì chồi sẽ tạo rễ khi đượcchuyển trực tiếp ra đất Thông thường giai đoạn này cần 2 - 8 tuần [26]

Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn đầu, cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòngthí nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên, giai đoạn này quyết định khả

năng ứng dụng của quy trình nhân giống in vitro Đối với một số loài có thể

chuyển cây ra đất khi cây chưa có rễ, nhưng đối với đa số các loài cây trồng thìchỉ sau khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra ngoài vườnươm Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu cần đượcchăm sóc đặc biệt Vì cây được chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sangvườn ươm với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần đáp ứng cácyêu cầu: Che cây non bằng nilon bao phủ và có hệ thống phun sương cung cấp

độ ẩm và làm mát cây; giá thể cây trồng có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợpnhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển… Giai đoạn này thường đòi hỏi

4 - 16 tuần [26]

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng

trong nuôi cấy mô thực vật

Ngoài các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung mộthoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rấtcần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan Tuyvậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô,hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hòa

Trang 38

sinh trưởng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhómauxin và nhóm cytokinin [9], [12]

Trang 39

Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn vàchủ yếu ở đỉnh chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thựcvật như lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổnghợp (IBA, NAA, 2,4-D…) [2], [12].

Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tớihàng loạt các quá trình sinh lý: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kíchthích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ, auxin có cácảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chíncủa quả, sự ra hoa…Do hoocmon thực vật tác động lên sinh trưởng thông quamối tương quan nồng độ giữa các loại hoocmon khác nhau, nên các quá trìnhtrên đây không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hoocmon khác Tùythuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứngkhác nhau đối với auxin Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lýauxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sựgiãn nở của vách tế bào [2], [12]

Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài hợp chất

đã được sử dụng từ rất lâu trong nông nghiệp Chỉ một thời gian ngắn sau khiIAA được tìm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành một hợpchất có giá trị Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễdàng bị phân hủy thành các hợp chất mất hoạt tính dưới ảnh hưởng của ánh

Trang 40

sáng và vi sinh vật Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự hìnhthành rễ của

Định dạng
Số trang	100
Dung lượng	3,04 MB